CN115820757B - 枸杞bahd酰基转移酶的编码基因和蛋白的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因、蛋白及应用。所述枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因包括LcSpmHT和LcSHT。本发明在体外实验中，发现枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSpmHT具有催化地骨皮甲素的作用，枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSHT具有催化地骨皮甲素和N¹,N¹⁰‑bis(dihydrocaffeoyl)Spermidine合成的作用；本发明建立了体外酶促反应体系，为未来工业化生物合成地骨皮甲素奠定了应用基础，也为地骨皮乙素代谢途径的解析奠定了基础。

Description

枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因和蛋白的应用

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSpmHT及其蛋白在催化地骨皮甲素合成中的应用、以及一种枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSHT及其蛋白在催化地骨皮甲素或N¹，N¹⁰-二(二氢咖啡酰基)亚精胺(N¹,N¹⁰-bis(dihydrocaffeoyl)Spermidine)合成中的应用。

背景技术

枸杞是茄科(Solanaceae)枸杞属(LyciumL.)落叶灌木，是起源较古老的植物种类之一，主要分布于温带和亚热带地区(Levin et al.,2011)。经济价值较高的主要有三个种中华枸杞(Lycium chinenseMill.)，宁夏枸杞(Lycium barbarumL.)和黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)。枸杞属物种在我国分布广泛，适应力极强，从强光照的青藏高原到弱光照的四川盆地，从干旱半干旱的西北地区到高温高湿的西南、东南地区皆有分布。其适应的土壤类型有沙漠，沼泽，盐碱地、碱性黏土、酸性红黄壤和酸性腐殖土等。枸杞的经济价值很高，除果实外，根皮、叶、花均可入药。《本草纲目》记载：“春采枸杞叶，名天精草；夏采花，名长生草；秋采子，名枸杞子；冬采根，名地骨皮。”

酚胺也被称为苯酰胺或羟基肉桂酸酰胺(HCAAs)，是酚酸与胺的结合物。已知的主要胺部分包括邻氨基苯甲酸、芳香单胺、脂肪族多胺和胍丁胺，而根据共轭胺部分的不同，酚胺可以分为不同的亚组。在植物中酚胺是一种广泛存在的次级代谢产物，通常作为生殖器官和种子中的主要酚类组成，作为代谢中间产物或者终产物，酚胺在植物发育和防御方面有着较为特异的功能。枸杞中富含酚胺，而其不同的药用部位，主要酚胺化合物也有差异，果实中主要是二咖啡酰精胺或二咖啡酰亚精胺及其糖基化衍生物，叶片主要是二咖啡酰亚精胺异构体；而根皮中主要是二氢咖啡酰精胺类物质(Xiao et al.,2019；Zhou etal.,2016；Potterat O.,2010)。

地骨皮是中国传统中药，2015版《中华人民共和国药典》记载，地骨皮(CortexLycii)为茄科植物枸杞Lycium chinense Mill.或宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥根皮。其味甘，性寒，归肺、肝、肾经。具有凉血止血、清热退蒸、清泄肺热、清热滋阴、清热解毒的功效(中国药典，2015)。枸杞根皮富含酚胺类物质，目前已报道的酚胺类物质已有20多种(陆礼和等，2021；刘建飞等，2021)。地骨皮甲素和乙素不仅是主要的酚胺类物质，也是地骨皮的特征性化合物，有研究认为地骨皮甲乙素可以作为地骨皮质量评价的指标之一(Li etal.,2014)。

Funayama等(1980)首次从枸杞(L.chinense)的干燥根皮中分离得到具有降血压活性的成分，经波谱及化学方法测得该化合物的结构是由2分子二氢咖啡酸通过酰胺键与1分子精胺对称结合而成的直链化合物，其结构式为C₂₈H₄₂N₄O₆，分子量为530.663，命名为地骨皮甲素(Kukoamine A，KUA)，别称苦柯胺A(Funayama et al.,1980)。药理学研究发现KUA具有良好的降血糖，抗氧化，抗炎，神经保护和提高免疫力的作用；还是一种trypanothione还原酶(TryR)的潜在选择抑制剂(Ponasik et al.,1995)，TryR是一种病原性锥虫寄生虫存活的关键酶，因此KuA在开发抗寄生虫剂方面意义重大。良好的生物活性，使得地骨皮甲素在保健品开发和临床应用方面潜力巨大。这就使得其生物合成至关重要，但第一个难点就是对枸杞地骨皮甲素的代谢途径知之甚少。

虽然目前对枸杞地骨皮素的生物合成途径研究较少，但植物中酚胺代谢途径的研究是较为明晰的。茄子中酚胺的合成位于苯丙烷途径和胺代谢的十字路口。苯丙烷途径中从苯丙氨酸开始经过一系列酶合成了酚酸，并在4CL酶的作用下得到了相应的羟基肉桂酰辅酶A。而酰基转移酶能够将羟基肉桂酰基与多胺缩合(Peng et al.,2019)。综上，两大类酶：4香豆酸：辅酶A连接酶(4CL)和酰基转移酶(Acyltransferase)可能参与枸杞地骨皮素生物合成。

植物中使用酚类化合物作为受体或供体分子的酰基转移酶家族有BAHD酰基转移酶家族。该家族酶以首次鉴定的四种生化特征的酶命名，使用酰基-CoA硫酯作为供体分子，结合方式有两种，羟基缩合和氨基缩合。目前尚未有BAHD酰基转移酶被报道具有合成地骨皮甲素(KukoamineA)的功能。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因和蛋白的应用。

实现上述发明目的技术方案包括如下。

本发明的第一方面，提供了一种枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSpmHT在催化地骨皮甲素合成中的应用，所述LcSpmHT基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、或所述LcSpmHT基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二方面，提供了一种枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSpmHT在催化地骨皮甲素合成中的应用。

本发明的第三方面，提供了一种枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSHT在催化地骨皮甲素或N¹，N¹⁰-二(二氢咖啡酰基)亚精胺(N ¹,N¹⁰-bis(dihydrocaffeoyl)Spermidine)合成中的应用，所述LcSHT基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、或所述LcSHT基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第四方面，提供了一种枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSHT在催化地骨皮甲素或N¹，N¹⁰-二(二氢咖啡酰基)亚精胺合成中的应用。

本发明的第五方面，提供了一种插入有枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSpmHT的过表达载体在催化地骨皮甲素合成中的应用。

本发明的第六方面，提供了一种插入有枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSHT的过表达载体在催化地骨皮甲素或N¹，N¹⁰-二(二氢咖啡酰基)亚精胺合成中的应用。

本发明的第七方面，提供了一种转化有枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSpmHT的转化细胞在催化地骨皮甲素合成中的应用。

本发明的第八方面，提供了一种转化有枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSHT的转化细胞在催化地骨皮甲素或N¹，N¹⁰-二(二氢咖啡酰基)亚精胺合成中的应用。

本发明的第九方面，提供了一种体外合成地骨皮甲素的方法，该方法包括：在枸杞4-香豆酸：辅酶A连接酶蛋白和枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSpmHT或LcSHT的催化作用下，将二氢咖啡酸和精胺催化合成地骨皮甲素。

本发明的第十方面，提供了一种体外合成N¹,N¹⁰-bis(dihydrocaffeoyl)Spermidine的方法，该方法包括：在枸杞4-香豆酸：辅酶A连接酶蛋白和枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSHT的催化作用下，以二氢咖啡酸和亚精胺为底物催化合成N¹，N¹⁰-二(二氢咖啡酰基)亚精胺。

本发明从中华枸杞中克隆得到两个中华枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSpmHT和LcSHT，在体外实验中，发现枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSpmHT具有催化地骨皮甲素的作用，枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSHT具有催化地骨皮甲素和N¹，N¹⁰-二(二氢咖啡酰基)亚精胺合成的作用；本发明建立了体外酶促反应体系，为未来工业化生物合成地骨皮甲素奠定了应用基础，也为地骨皮乙素代谢途径的解析奠定了基础。

附图说明

图1为本发明实施例2中枸杞BAHD酰基转移酶L的编码基因LcSpmHT和LcSHT的PCR电泳图。

图2为本发明实施例3中枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSpmHT和LcSHT的聚丙酰胺凝胶电泳图，其中，M：蛋白marker；T：全蛋白；S：上清；P：沉淀；F：流穿液；W：洗脱的杂蛋白；E1:洗脱的目的蛋白；E2：脱盐浓缩后的目的蛋白。

图3为本发明实施例4中枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSpmHT体外酶促合成地骨皮甲素的HPLC分析图；其中，DCA为二氢咖啡酸，DCACoA为二氢咖啡酰辅酶A，NC为LcSpmHT蛋白煮沸失活的负对照。

图4为图3中LcSpmHT酶活产物P1的质谱图。

图5为图3中LcSpmHT酶活产物P4的质谱图。

图6为本发明中地骨皮甲素及N¹,N¹⁰-bis(dihydrocaffeoyl)Spermidine生物合成途径原理图。

图7为本发明实施例4中枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSHT以精胺和亚精胺为酰基受体的体外酶促反应的HPLC分析图；其中，DCA为二氢咖啡酸，DCACoA为二氢咖啡酰辅酶A，NC为LcSHT蛋白煮沸失活的负对照。

图8为图7中LcSHT以精胺为酰基受体的酶活产物P1和P2的二级质谱图。

图9为图7中LcSHT以亚精胺为酰基受体的酶活产物P1和P3的二级质谱图。

图10为本发明实施例5中酶促反应体系中不同4CL：BAHD的使用比例时的HPLC色谱图和KUA的合成速率；其中，A为HPLC色谱图；B为KUA的合成速率图。

图11为本发明实施例5中以LcSpmHT为BAHD酶的酶促反应条件优化实验结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

在本发明的一些实施例中，公开了一种枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSpmHT和LcSHT在催化地骨皮甲素合成中的应用，所述LcSpmHT基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、或所述LcSpmHT基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述LcSHT基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、或所述LcSHT基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSHT在催化N¹,N¹⁰-bis(dihydrocaffeoyl)Spermidine合成中的应用，所述LcSHT基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、或所述LcSHT基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。

SEQ ID NO.1

ATGAAGGATCCAACGCAAGTCAAAATCTTGTCCAAAAGCCTCATAAAACCATCATCACCAACACCAAACCACCTCAAAAATTACAAGTTATGTTTCTTTGATCAAGTGGCTGACACAGTACACATACCTCTTGTTCTTTTCTATCCTCATTGTAACAATAACTCAAAAAATGAAGAGCTCGAAGAGTCCTTGTCGAGGGTTTTAACCCATGCTTACCCTTTAGCCGGTAGATTCAGTACAGAAGATGAATCCACTGTTCTGTGTCTCGATCAAGGTGTAACTTACATAAAAGCAACGGTCAATTGTAAGCTCGACGATTTTCTCCAACAAACAAAAGAAGACCTTGATCCAGTATTGTCATTTTGGCCTCAAGGTATTATGGATGTGGACGAGACGAATATATTCGTCATGCCACTTATGGTTGTGCAAGTCACAACGTTCGAATGTGGTGGCCTAGCTCTAGGTTTTAGCTGTGCACACCCTGCTATGGATGGATTCACGGCTTTCACATTCATTTACGAATGGGCCAAAGTGTGCAAATTTGGAACTCCTTGTAAGGAGATCAACAACTTCATGAGCTTCAATTTGGGAACTCTTTTCCCTGTCAAGGATTTAACTGCCATTCTTGAGCCTCCTATTAATGAAGGCAAACGTCCAAAATCTAAGTTGGTTGCGAGAAAGTTTGTATTCGAGGAAGCTGCAATATCAAGGCTCAGAGAGAAATTTGATTCAGAAGGTTTGAGTTTCAAACCTTCACGAGTTGAGATGATAACAGCACTTCTCTGGAGGTCTCTAATCCGTGCAGCTGGAGCTGGAAATCCGCATTTGAAACGGTCTATAATGGCCTTTCCATTTAACTTGCGCGGTAAGGTTTTAGCTTTTCCTGAAATTGCATACTCTTTTGGGAATTTAATCATTGAAATTCCTATAAGATTTGAACATGATGATGAGACAAAGATGGAGTCGTTGCATCACATTGTAAAACTAATAAGAGAGACAGTTCAAGAGACTACGAGTTACTGTGCCAAAAGTACTCCAGATGAGATAGCTTCTCTTGTTGTCAACTTATACAAGGATAGTTATTCTGGATTAGAATGGGGAGGAAACAATGAAATTGTGAATTTCACAAGCTCAAGTCTATGCAGGTTTCCCATACATAAAGTTGATTTTGGTTGGGGAAAACCAAGTTTAATGCATTTTGGCTCACGGCATAGTCAAGTGTTTTGGTTATATGATACAGAATGTGAAACTAGCATTGCTGTGCAAATAGATTTGGAGGAAAAGTACATGAACTCCTTCGTCCGTGACCAAGATATCACGGATTTTGCTAAATTTTAG

SEQ ID NO.2

ATGGTAGTTGAAATCTTGTCCACTAAGTTCATAAAACCATCTTCACCAACTCCAAATCAACTCCAAAGTTACAAGTTATCTTTCTTTGATCAAATAGCTGATGAAGCACATTTGCCTCTTGTTCTTTTCTATCCTCCTACCAACAATACTGATTATGCAGCTCATGAAGAACAATTTGAACAATCCCTTTCTAGAATTTTAACCCATGTTTACCCAATTGCTGGCAGATTTACCGAGGATGACTCGATAAACTGCCAGGACCAAGGGGTTAAATTTGTAAAAGCCAAGGTAAATAGTAAGCTCAATGAATTTCTTGAGAAAGCACACAAAGATGTCAACCTTGCATTGCTTTGTTGGCCTAAAGATACTTGGAATGTGGATGAGAGTAACATACTCAACATGCCAATTGTCATTGTGCAAATCACGGAATTCGAGTGTGGTGGCTTGGCTCTATCTATGAGCCACGCACACACAGCCATGGATGGTTTCACAACTTTCACTTTTATTAACGAGTGGACTAAAGTGTGCAAATTGGAGATTGCTGCAGAGAAGATCGATTTCTTGAGCTTTAATTTGCCTGACGTTTTCCCATCGAGAGATTTATCGAAACTTCTCTTGCCTCGTTGTCCCCAGGAAGATCGTGTGGACGCTAAATTAGTAGCCAAAAGGCTATACATCAATGAGGATTCCATTTCAAGGCTCAGAAAAGAAGTCGGAGATATATGCTTTAAGCCCTCAAGAGTTGAAATGATCATAGCACTCCTATGGAGGTCTTTGATCCGTGCTTCAGAAAAGAAACATGGGCATCTGAGACGTTCCCTAATAGGTGTCCCAATAAACATGCGCCCTAAGCTGATTTCGTTACCTCAAGTAGAAAAATCTTTTGGGAATCTTGTAATTGACGCCCCTGTAAAATTTGTACCCGGAGAGAACAACATGGAGTTGAAGACTTTTGTTACGTTGATTCGTGATACGGTGAAGAAAACTATAAGCGCGTGTGACAAGACTTCACCAGACGATGTAGTGGCTGCAGTGGCAAATTTATATAATGGAAGTTTCATATCACCCGAATGGGGAGGAAGTGATGAAGTTGACATGTACACAAGTTCAAGTTTGTGTAGGTTTCCTATACAAGAGGCTGATTTTGGTTGGGGAAAACCATGTTTGATGCATTTTGGGTCAAGGCATAATCAGTGTTGCTGGTTGTATGATGCAGAATGTGGCAATGGGATTTGTGTGCAAATGGACTTGAAGGAAGCCAATGTGCAATTATTTGAATGTGAAGATGATATCAAGGCTTTCTTTGAGTTTTAG

在本发明的另一些实施例中，公开了一种枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSpmHT和LcSHT在催化地骨皮甲素合成中的应用，所述枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSpmHT的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSHT的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSHT在催化N¹,N¹⁰-bis(dihydrocaffeoyl)Spermidine合成中的应用，所述枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSHT的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.3

MKDPTQVKILSKSLIKPSSPTPNHLKNYKLCFFDQVADTVHIPLVLFYPHCNNNSKNEELEESLSRVLTHAYPLAGRFSTEDESTVLCLDQGVTYIKATVNCKLDDFLQQTKEDLDPVLSFWPQGIMDVDETNIFVMPLMVVQVTTFECGGLALGFSCAHPAMDGFTAFTFIYEWAKVCKFGTPCKEINNFMSFNLGTLFPVKDLTAILEPPINEGKRPKSKLVARKFVFEEAAISRLREKFDSEGLSFKPSRVEMITALLWRSLIRAAGAGNPHLKRSIMAFPFNLRGKVLAFPEIANSFGNLIIEIPIRFEHDDETKMESLHHIVKLIRETVQETTSYCAKSTPDEIASLVVNLYKDSYSGLEWGGNNEIVNFTSSSLCRFPIHKVDFGWGKPSLMHFGSRHSQVFWLYDTECETSIAVQIDLEEKYMNSFVRDQDITDFAKF*(*表示终止)

SEQ ID NO.4

MVVEILSTKFIKPSSPTPNQLQSYKLSFFDQIADEAHLPLVLFYPPTNNTDYAAHEEQFEQSLSRILTHVYPIAGRFTEDDSINCQDQGVKFVKAKVNSKLNEFLEKAHKDVNLALLCWPKDTWNVDESNILNMPIVIVQITEFECGGLALSMSHAHTAMDGFTTFTFINEWTKVCKLEIAAEKIDFLSFNLPDVFPSRDLSKLLLPRCPQEDRVDAKLVAKRLYINEDSISRLRKEVGDICFKPSRVEMIIALLWRSLIRASEKKHGHLRRSLIGVPINMRPKLISLPQVEKSFGNLVIDAPVKFVPGENNMELKTFVTLIRDTVKKTISACDKTSPDDVVAAVANLYNGSFISPEWGGSDEVDMYTSSSLCRFPIQEADFGWGKPCLMHFGSRHNQCCWLYDAECGNGICVQMDLKEANVQLFECEDDIKAFFEF*(*表示终止)

应当理解，在不影响所述中华枸杞BAHD蛋白结构和活性的前提下，对上述中华枸杞BAHD蛋白的氨基酸序列进行各种取代、缺失或增加一个或多个氨基酸，或末端修饰，也属于本发明的保护范围。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种插入有枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSpmHT的过表达载体在催化地骨皮甲素合成中的应用。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种插入有枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSHT的过表达载体在催化地骨皮甲素或N¹,N¹⁰-bis(dihydrocaffeoyl)Spermidine合成中的应用。

所述表达载体通过将上述中华枸杞LcBAHD的编码基因有效地连接到表达载体上获得，所述表达载体包括病毒载体(包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体)、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌体或人工染色体(包括细菌人工染色体BAC、噬菌体P1衍生的载体PAC、酵母人工染色体YAC或哺乳动物人工染色体MAC)；作为优选的，所述表达载体为质粒；更为优选的，所述质粒为pCold-TF。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种转化有枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSpmHT的转化细胞在催化地骨皮甲素合成中的应用。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种转化有枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSHT的转化细胞在催化地骨皮甲素或N¹,N¹⁰-bis(dihydrocaffeoyl)Spermidine合成中的应用。

所述转化细胞包括细菌细胞、真菌细胞(包括酵母菌)或植物细胞；其中所述细菌细胞包括埃希氏菌属、农杆菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属或葡萄球菌属。作为优选地，所述细菌细胞为大肠杆菌(如BL21(DE3))。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种体外合成地骨皮甲素的方法，该方法包括：在枸杞4-香豆酸：辅酶A连接酶蛋白和枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSpmHT或LcSHT的催化作用下，以二氢咖啡酸和精胺为底物催化合成地骨皮甲素。本发明中所述枸杞4-香豆酸：辅酶A连接酶蛋白具有能催化二氢咖啡酰辅酶A形成的功能，可参考以下实施例1～3的方法制备而得。

在其中一些实施例中，所述枸杞4-香豆酸：辅酶A连接酶蛋白和枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSpmHT的质量比为1～5:1，优选质量比为1.5～2.5:1。

在其中一些实施例中，所述催化反应的反应体系pH5～10，反应温度为25℃～45℃，反应时间为30min～120min；作为优选地，反应体系pH7.8～8.2，反应温度为34℃～36℃，反应时间为50min～70min。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种体外合成N¹,N¹⁰-bis(dihydrocaffeoyl)Spermidine的方法，该方法包括：在枸杞4-香豆酸：辅酶A连接酶蛋白和枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSHT的催化作用下，以二氢咖啡酸和亚精胺为底物催化合成N¹,N¹⁰-bis(dihydrocaffeoyl)Spermidine。本发明中所述枸杞4-香豆酸：辅酶A连接酶蛋白具有能催化二氢咖啡酰辅酶A形成的功能，可参考以下实施例1～3的方法制备而得。

在其中一些实施例中，所述枸杞4-香豆酸：辅酶A连接酶蛋白和枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSHT的质量比为1～5:1，优选质量比为1.5～2.5:1。

在其中一些实施例中，所述催化反应的反应体系pH5～10，反应温度为25℃～45℃，反应时间为30min～120min；作为优选地，反应体系pH7.8～8.2，反应温度为34℃～36℃，反应时间为50min～70min。

本发明下列实施例中所用的材料、试剂、载体和试剂盒等，如无特殊说明，均可从公司通过商业途径购到。所述PCR扩增反应Marker购自全式金生物公司(目录号BM101-01)，PCR扩增反应高保真酶购自TaKaRa公司(目录号R045B)，PCR扩增反应Taq酶购自TSINGKE公司(目录号TSE005)，Infusion连接酶购自CISTRO公司(目录号E0201S)，蛋白电泳实验所用Marker购自TSINGKE公司(目录号TSP021)，限制性内切酶都购自NEB公司。所述用到的大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)感受态均为采用本领域公知方法制备。实验中涉及的化合物标准品构自上海源叶生物公司。

以下结合具体实施例和附图对本发明进一步的说明。

实施例1枸杞全长cDNA文库的构建

取一年生中华枸杞根，使用RNA提取试剂盒HiPure Plant RNA Mini Kit(Magen公司，目录号：R4151-03C)提取根总RNA，使用核酸分析仪检测RNA浓度并跑电泳验证RNA质量，之后取总RNA进行反转录反应，使用反转录试剂盒PrimeScript^TMII 1st Strand cDNASynthesis Kit(TaKaRa公司，目录号：6210A)。

具体操作步骤如下：

1、RNA提取

(1)、用液氮将中华枸杞根研磨成细小的粉末。称取50～100mg粉末至2ml预冷的离心管中，立即加入750μl BufferPRC1/β-ME至样品中，高速涡旋15～30秒打散样品。

(2)、55℃短暂水浴5分钟。室温，14,000x g离心5分钟。

(3)、把gDNA过滤柱装在2ml收集管中。转移700μl上清液转移至过滤柱中。13,000xg离心2分钟，弃去gDNA过滤柱。

(4)、加入0.5倍体积无水乙醇或等倍体积的BufferPRC2至滤液中，移液枪吸打3～5次，把HiPure RNAMini Column装在2ml收集管中。转移≤700μl混合液至柱子中。12,000xg离心30秒，倒弃滤液，把柱子装回收集管中。(若混合液超过700μl)转移剩余混合液至柱子。12,000x g离心60秒，倒弃滤液，把柱子装回收集管中。

(5)、加入500μl Buffer RW1至柱子上。10,000x g离心60秒，倒弃滤液，把柱子装回收集管。

(6)、加入500μl Buffer RW2至柱子中，12,000x g离心60秒。倒弃滤液，把柱子装回收集管。

(7)、12,000x g离心2分钟。将柱子转移至1.5ml离心管。加入50μl RNase FreeWater至柱子膜中央。室温静置2分钟。12,000x g离心1分钟。弃去柱子，把RNA保存于-80℃。

2、RNA反转录为cDNA

(1)、在Microtube中配制表1所示反应混合液。

表1

试剂	使用量
		OligodTPrimer(50μM)	1μ
dNTPMixture(10mMeach)	1μl
		模板RNA	TotalRNA：5μg以下
RNasefreedH2O	Upto10μl

(2)、65℃保温5min后，冰上迅速冷却。

(3)、在上述Microtube管中配制表2反转录反应液，总量为20μl。

表2

(4)、缓慢混匀，按下列条件进行反转录反应：42℃30min，95℃5min(酶失活)后，冰上冷却。

3、获得的cDNA使用核酸分析仪测浓度并保存在-20℃，实施例2LcSpmHT和LcSHT基因的克隆及过表达载体的构建

以中华枸杞根cDNA(稀释至约100ng/ul)为模板，根据已有的中华枸杞基因组序列设计正向和反向引物，克隆中华枸杞中LcSpmHT和LcSHT基因的CDS序列，所述引物如表3所示。

表3

利用DNA高保真酶(High-Fidelity DNAPolymerase)进行PCR扩增，PCR反应体系如下：cDNA模板：2μl；正向引物F:10uM；反向引物R：10uM；PrimeStar Mix:25μl；ddH₂O：up to50ul；反应条件：94℃：5min；98℃：30s，58℃：30s，72℃：1min 30s；72℃：5min，16℃：∞；其中，98℃：30s，58℃：30s，72℃：1min 30s这三步34个循环。

将50μl PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示，LcSpmHT基因CDS区域片段大小为1388bp；LcSHT基因CDS区域片段大小为1314bp。切胶回收目的条带，可使用DNA凝胶回收试剂盒(Axygen公司，目录号：AP-GX-250G)。

所得LcSpmHT基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示，其所编码蛋白的氨基酸序列如SED ID NO.3所示；LcSHT基因的CDS序列如SEQ ID NO.2所示，其所编码蛋白的氨基酸序列如SED ID NO.4所示。

使用Fast DNAAssembly Mix同源重组克隆酶，将以上获得的LcSpmHT和LcSHT基因的目的片段与经Sal I和Kpn I双酶切的原核表达载体pCold-TF质粒进行连接，55℃连接15min。连接液转化感受态DH5α。培养12h后从Amp抗性的LB板上挑取单克隆，以pCold-TF质粒的引物pCold-TF-F为正向引物和基因反向引物LcSpmHT-R/LcSHT-R为反向引物做菌液PCR鉴定，PCR反应体系如下：模板：1μl；pCold-TF-F:10uM；LcSpmHT-R/LcSHT-R：10uM；T5Mix:5μl；ddH₂O：3μl；总反应体系10μl。反应条件：94℃：5min，98℃：30s，55℃：30s，72℃：1min 30s，72℃：5min，16℃：∞；其中，98℃：30s，55℃：30s，72℃：1min 30s这三步34个循环。条带大小符合预期的单克隆摇菌提质粒后送测序(pCold-TF-F/R为测序引物)。

测序正确即构建得到LcSpmHT、LcSHT基因的原核表达载体，分别命名为pCold-TF-LcSpmHT质粒和pCold-TF-LcSHT质粒。

实施例3工程菌诱导表达

1、蛋白表达

利用化学转化法将原核表达载体pCold-TF-LcSpmHT质粒和pCold-TF-LcSHT质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，37℃培养过夜，次日从Amp抗性的板上挑取单克隆到1ml LB(50mg/LAmp)液体培养基中37℃，200rpm培养12h后按照1:100比列接种与400ml LB(50mg/LAmp)液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀值为0.6-0.8，加入0.4mM IPTG后在冰水混合物中冰浴30min，之后在15℃，150rpm摇床中培养12-14h。

2、蛋白纯化

4℃下离心收集菌体，用30mL预冷的Lysis buffer重悬(收集重悬菌液为全蛋白T)，在冰上操作，再加入300ul PMSF(10mM)后用200W超声破碎，开3s，关3s共计破碎30min。将破碎后的菌体在4℃低温下离心，4000xg，15min(分别收集沉淀P和上清S)，取上清过0.45um亲水聚醚砜滤膜(PALL公司，目录号：PN4614)。将过滤后的上清液加入含有1mlNi-NTA填料的蛋白纯化柱中，200rpm,4℃孵育1h，使蛋白结合在Ni-NTA填料上。

在冰上进行蛋白纯化步骤，先将蛋白液流出(收集流穿液F)，之后使用30mM咪唑的wash buffer洗脱杂蛋白(收集洗脱液为W)。再用含有250mM咪唑的Eulationbuffer洗脱带有His标签的目的蛋白，用考纳斯亮蓝检测蛋白，颜色变蓝开始接取，直到颜色不再变蓝(收集目的蛋白洗脱液为E1)。

将收集的目标蛋白液加入10KDa的超滤离心管，4000x g,4℃离心10～30min，当蛋白液只剩1ml后加入1ml Desaltbuffer在进行离心，重复3-4次，最后一次加入1Mm DTT。

收集浓缩脱盐后的目的蛋白，每200ul分装于1.5mL离心管中(收集浓缩脱盐的蛋白为E2)，使用Bradford法测蛋白浓度。蛋白贮存在-80℃备用。

3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白

将蛋白样品稀释到合适浓度，加入5x SDS-PAGE loadingbuffer，在沸水中煮10min，12000rpm离心1min后即可取用10uL跑SDS-PAGE胶电泳，开始阶段，电压调到80V，待Marker分离后将电压调高至120V。当样品的溴酚蓝迁移至PAGE胶底部时，即可停止电泳；电泳结束后，小心取下凝胶，放入考马斯亮蓝R250染色液中，放置于摇床上，室温染色2h以上。染色完成后，将凝胶取出置于脱色液中，摇床上脱色12h，期间更换脱色液数次。

结果如图2所示，结果表明，LcSpmHT融合蛋白在分子量约为104.0KDa处，出现一条明显的特异蛋白质表达条带，与理论值一致(图2中的A)；LcSHT融合蛋白在分子量约为103.1KDa处，出现一条明显的特异蛋白质表达条带，与理论值一致(图2中的B)。

实施例4体外酶活功能检测

1、体外酶活反应

测定已纯化的LcSpmHT和LcSHT的体外酶活功能，底物包括二氢咖啡酸(DCA)，咖啡酸(Caffeic acid，CA)，阿魏酸(Ferulic acid，FA)，肉桂酸(Cinnamic acid，CIN)和p-香豆酸(p-coumaric acid，p-CO)。多胺受体包括精胺(SPM)和亚精胺(SPD)。

酶活反应体系为(200μL)：50MmTris-HCL(pH 8.0)，0.5MATP，0.5MMgCl₂，500uM底物，500uM酚酸(DCA，CA，FA，CIN，p-Co)，500uM多胺(SPM和SPD)，5-20ug Lc4CL，5-20ugLcSpmHT。以加入CoA开始计时，35℃反应1h，加入等体积甲醇终止反应。以100℃失活10min的蛋白(NC)作为反应体系的负对照。反应液过0.22um的尼龙有机滤膜后进行HPLC或UGPLC-MS/MS分析。

上述酶蛋白Lc4CL的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

SEQ ID NO.11

ATGCCTATGGAGACCGAAACAAAGCAATCAGTAGATATAATCTCTGAAACAAAGCAATCAGAAGATATAATCTCTGAAACAAAGCAATCAGGAGATATAATCTTTCGATCAAAACTCCCTGATATTTATATCCCTAATCATCTACCGTTACATTCTTATTGTTTCGAAAACATTTCGGAGTTTAGTTCCCGTCCTTGTTTAATTGATGGTGCAAATGAACAAATCTACACTTACGCTGAAGTTGAACTCACTTCAAGAAAAGTTGCAGTTGGTCTTAACAAACTGGGGATCCAACAAAAGGACACCATCATGATCCTGTTACCAAATTCCCCTGAATTTGTGTTTGCTTTTATGGGCGCATCGTATCTTGGAGCCATTTCTACAATGGCTAATCCTATGTTTACTCCTGCAGAGGTTGTAAAGCAAGCCAAAGCCTCAAGTGCTAAGATTATAATCACTCTAGCGTGTTATGTGGGCAAAGTTAAGGACTATGCAATTGAAAATGATGTCAAGGTAATTTGCATTGATACTGCACCAGAAGGCTGTCTCCATTTCTCCGAATTGACTCAATCGAACGAACACGACATTCCTGAGGTGAAAATCCAGCCAGACGACGTCGTAGCTCTACCGTATTCCTCAGGGACCACGGGGCTACCAAAAGGGGTGATGTTAACACACAAAGGATTAGTCACGAGTGTTGCACAACAAGTTGATGGTGAAAATGCCAACTTGTATATGCACAGTGAGGATGTGTTGATGTGTGTGTTGCCTTTGTTCCATATTTACTCCCTCAACTCTATTTTGCTATGTGGATTGAGAGTCGGAGCAGCGATATTGATTATGCAAAAATTCGACATTGTTCCGTTTTTGGAGTTAATACAAAAGTATAAGGTGACAATTGGGCCATTTGTACCACCAATTGTTCTGGCAATTGCTAAGAGTCCGTTAGTTGATGACTATGATCTTTCGTCAGTAAGGACAGTTATGTCTGGCGGTGCTCCATTAGGAAAGGAACTTGAAGACGCTGTTCGAATCAAATTCCCTAACACTAAACTTGGTCAGGGATATGGAATGACGGAAGCAGGGCCAGTATTGGCAATGTGTTTGGCATTTGCAAAAGAACCTTTTGAGATCAAATCAGGTGCATGTGGAACTGTCGTGAGAAATGCAGAGATGAAAATTGTGGATCCAGATACGGGTTGCTCTCTGCCCCGTAACCAACCCGGTGAGATTTGCATTAGAGGTGACCAGATCATGAAAGGTTACCTGAATGATCCGGAGGCCACGACGAGAACAATAGACGAAGAAGGATGGTTACACACCGGCGACATTGGGCTCATCGACAATGATGACGAGCTTTTCATTGTGGACCGGTTGAAAGAATTGATAAAATATAAAGGATTTCAAGTGGCACCTGCCGAGCTTGAAGCTCTTCTAGTCAACCATCCCAATATTTCTGATGCTGCTGTTGTCCCAATGAAAGATGAGCAAGCAGGAGAAGTTCCAGTGGCTTTTGTTGTCAGGTCAAATGGATCCACAATTACTGAGGATGAAGTCAAGGATTTCGTCTCGAAGCAGGTAATATTTTATAAGAGAATAAAGCGTGTATTTTTCGTGGAGACAGTACCCAAAGCTCCGTCAGGAAAAATTCTTAGAAAGGATTTGAGAGCTAGATTGGCTGCTGGTGTTCCAAATTAA

SEQ ID NO.12

MPMETETKQSVDIISETKQSEDIISETKQSGDIIFRSKLPDIYIPNHLPLHSYCFENISEFSSRPCLIDGANEQIYTYAEVELTSRKVAVGLNKLGIQQKDTIMILLPNSPEFVFAFMGASYLGAISTMANPMFTPAEVVKQAKASSAKIIITLACYVGKVKDYAIENDVKVICIDTAPEGCLHFSELTQSNEHDIPEVKIQPDDVVALPYSSGTTGLPKGVMLTHKGLVTSVAQQVDGENANLYMHSEDVLMCVLPLFHIYSLNSILLCGLRVGAAILIMQKFDIVPFLELIQKYKVTIGPFVPPIVLAIAKSPLVDDYDLSSVRTVMSGGAPLGKELEDAVRIKFPNTKLGQGYGMTEAGPVLAMCLAFAKEPFEIKSGACGTVVRNAEMKIVDPDTGCSLPRNQPGEICIRGDQIMKGYLNDPEATTRTIDEEGWLHTGDIGLIDNDDELFIVDRLKELIKYKGFQVAPAELEALLVNHPNISDAAVVPMKDEQAGEVPVAFVVRSNGSTITEDEVKDFVSKQVIFYKRIKRVFFVETVPKAPSGKILRKDLRARLAAGVPN*(*表示终止)

2、酶活产物分析

HPLC分析：仪器：LC-2030C，SHIMADZU公司；色谱柱：AQ-C18(4.6x250nm，5um，SHIMADZU公司)。柱温为40℃，进样量为10μL，流速为1mL/min。梯度洗脱条件为：0.15％三氟乙酸-水(A)、色谱级甲醇(B)(0～10min，20～22％B；10～35min 22％B；35～40min，22～100％B；40～45min 100％B；45～45.01min100～20％B；45.01～55min 20％B)。

以DCA为底物的检测波长为UV 280nm，以CA，FA和p-CO为底物的检测波长为UV322nm，以CIN为底物的检测波长为UV 303nm。酶活产物的鉴定通过比对KukoamineA标品的保留时间以及紫外波长。

LC-MS分析

为了确定反应产物，用LC-MS进一步分析。使用超高效液相色谱质谱连用仪(UHPLC-MS)(Orbittrap Elite,Thermo公司)，UHPLC色谱柱为HSS T3 coloum(2.1x 100mm，1.8μm，Thermo公司)。

UHPLC条件为：A相0.1％甲酸-水、B相为MeCN，柱温30℃，进样量为1uL，流速为0.4ml/min，梯度洗脱条件为：0-5min，20-22％B；5-10min，22％B，10-15min，22-100％B；15-18min，100％B；18-18.1min，100-20％B；18-23min，20％B。

质谱条件：正离子模式，分辨率为60,000，质荷比扫描条件为100-1000，点喷雾离子源(ESI)参数如下：加热温度设为300℃和毛细管温度为275℃，鞘气流速和辅助气体流速分别设置为35和10，碰撞能量为3.20kV。

LcSpmHT酶活结果

LcSpmHT酶的体外酶活反应如图3所示，当以DCA为底物，SPM为酰基受体，负对照实验(LcSpmHT+Lc4CL-NC)中LcSpmHT被煮沸失活，Lc4CL能够催化DCA生成DCACoA，而LcSpmHT未被失活的反应中，DCACoA都被消耗了，同时有四个新产物生成，其中P4的保留时间与地骨皮甲素标准品一致。进一步对反应中的产物进行LC-MS鉴定，如图4所示，在正离子模式下P1化合物的分子离子峰为367，二氢咖啡酰基的分子质量为164，精胺分子质量为202，P1的分子量显示在精胺上加上了一个二氢咖啡酰基，其二级质谱(MS2)的碎片有：293,222,123；如图5所示，P4化合物的分子离子峰为531，其二级质谱(MS2)的碎片有：367(一个二氢咖啡酰基断裂)，293，222，165(二氢咖啡酰基)。与地骨皮甲素标品的离子碎片一致。且生成的P1显著高于P4。

以上酶活结果显示，Lc4CL催化DCA生成DCACoA，而LcSpmHT能够将1-2个DCACoA加到精胺分子上，最终生成地骨皮甲素。反应公式如图6所示。

LcSHT酶活结果

LcSHT酶的体外酶活反应如图7所示，当以DCA为底物，以SPM为酰基受体，与负对照实验相比，有两个新产物生成，P1(红色)和P2(红色)，其中P2(红色)的保留时间与地骨皮甲素标准品一致；当以SPD为酰基受体时，与负对照实验相比，有两个新产物生成，P1(蓝色)和P2(蓝色)，蓝色P1与红色P1的保留时间一致。因无标品对新产物进行鉴定，于是对酶活产物进行LC-MS鉴定，如图8所示，在正离子模式下红色P2化合物的分子离子峰为531，其二级质谱(MS2)的碎片有：367，293,222和165；与LcSpmHT产物P4以及地骨皮甲素标准品一致。

以SPD为酰基受体的产物如图9所示，蓝色P2质荷比为474，其二级质谱(MS2)的碎片包括310(一个二氢咖啡酰基断裂)，293，222，165和123；与文献报导的一个酚胺类化合物N¹,N¹⁰-bis(dihydrocaffeoyl)Spermidine离子碎片完全一致。

以上酶活结果显示，LcSHT不仅能够将2个DCACoA加到精胺分子上，生成地骨皮甲素；也能够催化2个二氢咖啡酰基结合到亚精胺上，进而生成N¹,N¹⁰-bis(dihydrocaffeoyl)Spermidine，反应公式如图6所示。

实施例5酶底物多样性分析

LcBAHD除了使用DCACoA为酰基供体，还尝试了其他羟基肉桂酰辅酶A，以及两种多胺(SPM和SPD)为酰基受体。酶活结果见表4.

表4

从表4结果可知，LcSpmHT对多种酰基供体具有活性，但只对酰基受体精胺具有活性；而LcSHT只能够使用二氢咖啡酰辅酶A作为酰基供体，对精胺和亚精胺都具有活性。底物多样性分析发现两种LcBAHD酶都能够催化二氢咖啡酰辅酶A与精胺结合产生地骨皮甲素，但对于其他底物的催化活性具有明显差异。

实施例6体外酶促反应条件的优化

本实施例选用LcSpmHT作为LcBAHD来优化酶促反应条件以提高地骨皮甲素的产量。

反应条件：Lc4CL:LcBAHD的质量比(5:1，4:1，2:1，1.5:1，1:1)；酶蛋白Lc4CL的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示。

反应体系pH值：5.0，6.0，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，10.0

反应温度：25-45℃

反应时间：0-120min

结果如图10～11，从图10可知，Lc4CL和LcBAHD的比值能够显著影响KUA的产量，Lc4CL:LcBAHD最优的质量比为2:1。pH值8.0和35℃分别为反应体系的最佳pH和反应温度，酶的催化效率在30min内显著提高，KUA在60min内生成速率更快，积累量最大。

综上，Lc4CL和LcBAHD双酶体外酶促反应生成地骨皮甲素的最优反应条件是：pH8.0,35℃反应60min。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSpmHT在催化地骨皮甲素合成中的应用，所述LcSpmHT基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、或所述LcSpmHT基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSpmHT在催化地骨皮甲素合成中的应用，所述枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSpmHT的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSHT在催化地骨皮甲素或N ¹ ，N ¹⁰ -二(二氢咖啡酰基)亚精胺合成中的应用，所述LcSHT基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、或所述LcSHT基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.一种枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSHT在催化地骨皮甲素或N ¹ ，N ¹⁰ -二(二氢咖啡酰基)亚精胺合成中的应用，所述枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSHT的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.插入有枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSpmHT的过表达载体在催化地骨皮甲素合成中的应用，其特征在于，所述LcSpmHT基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、或所述LcSpmHT基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.插入有枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSHT的过表达载体在催化地骨皮甲素或N ¹ ， N ¹⁰ -二(二氢咖啡酰基)亚精胺合成中的应用，其特征在于，所述LcSHT基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、或所述LcSHT基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

7.转化有枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSpmHT的转化细胞在催化地骨皮甲素合成中的应用，其特征在于，所述LcSpmHT基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、或所述LcSpmHT基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

8.转化有枸杞BAHD酰基转移酶的编码基因LcSHT的转化细胞在催化地骨皮甲素或N ¹ ， N ¹⁰ -二(二氢咖啡酰基)亚精胺合成中的应用，其特征在于，所述LcSHT基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、或所述LcSHT基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

9.一种体外合成地骨皮甲素的方法，其特征在于，该方法包括：在枸杞4-香豆酸：辅酶A连接酶蛋白和枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSpmHT或LcSHT的催化作用下，以二氢咖啡酸和精胺为底物催化合成地骨皮甲素；所述枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSpmHT的氨基酸序列如SEQID NO.2所示、或所述枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSHT的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

10.一种体外合成N ¹ ，N ¹⁰ -二(二氢咖啡酰基)亚精胺的方法，其特征在于，该方法包括：在枸杞4-香豆酸：辅酶A连接酶蛋白和枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSHT的催化作用下，以二氢咖啡酸和亚精胺为底物催化合成N ¹ ，N ¹⁰ -二(二氢咖啡酰基)亚精胺；所述枸杞BAHD酰基转移酶蛋白LcSHT的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

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