CN116024242B

CN116024242B - 柚子中他汀类次生代谢物Melitidin合成途径关键基因及其应用

Info

Publication number: CN116024242B
Application number: CN202211270841.5A
Authority: CN
Inventors: 罗杰; 沈双欠; 王守创; 杨君; 刘贤青
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2022-10-17
Filing date: 2022-10-17
Publication date: 2024-04-12
Anticipated expiration: 2042-10-17
Also published as: CN116024242A

Abstract

本发明公开了一种柚子中他汀类次生代谢物Melitidin合成途径关键基因及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明公开了一种柚子中他汀类次生代谢物Melitidin合成途径的关键基因，包括CgAT1、CgAT2、CgUGT1、CgUGT2和Cg1,2RhT基因，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.14‑18所示。本发明利用柚子自然群体进行了基于代谢物的全基因组关联研究(GWAS)，筛选并确定了5个关键基因。通过体外酶活和植物转基因等方法验证了关键基因的生物学功能，并且在烟草中实现了Melitidin异源的生物合成，为研究和利用Melitidin提供了新的思路和重要基因资源。

Description

柚子中他汀类次生代谢物Melitidin合成途径关键基因及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及一种柚子中他汀类次生代谢物Melitidin合成途径关键基因及其应用。

背景技术

柑橘(Citrus reticulata Blanco)为芸香科柑橘属植物，是世界上最重要的水果和园艺作物之一，也是人类日常生活中营养物质获取的主要来源。常见的柑橘类品种包括柚子、甜橙、柑橘和柠檬等，其果实含有丰富的对人类健康有益的生物活性物质，如萜类化合物、黄酮类化合物、维生素等，具有较强的抗氧化、抑菌、抗炎、抗癌及预防心血管疾病等功效。挖掘柑橘中重要的生物活性物质，解析其代谢合成途径以及遗传与分子机制，对柑橘营养品质的改善和新品种的培育具有重要的指导意义。

植物苯丙素(Phenylpropanoids)是一类由苯丙氨酸衍生的具有生理活性的次生代谢产物，如类黄酮、酚酸、香豆素等生物活性成分，在植物发育和防御中具有重要的作用。苯丙素对人类健康有许多有益的功能，包括抗癌和抗炎特性。柑橘以含有大量苯丙素而备受关注，其果实中的类黄酮是人类饮食中的主要获取方式之一，也是食品和制药行业中原料的主要来源。Melitidin(naringenin 7-(2″-α-rhamnosyl-6″-(3″″-hydroxy-3″″-methylglutaryl)-β-glucoside))是柑橘中特有的甲基戊二酰类黄酮衍生物，对3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)有竞争性抑制作用，被认为是抗胆固醇药物的重要候选活性物质。然而，Melitidin在植物体内的代谢合成途径尚未完全解析，相应的关键基因未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种柚子中他汀类次生代谢物Melitidin合成途径关键基因及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明筛选确定了Melitidin合成途径的关键基因，并在烟草中构建了Melitidin的生物合成途径，为研究该代谢物作为候选药物提供了新的思路和资源。

本发明具体公开了柚子来源的他汀类次生代谢物Melitidin的代谢合成途径，并且在柚子1、2和9号染色体上分别发现并鉴定了控制Melitidin生物合成的结构基因，包括2个酰基转移酶(CgAT1和CgAT2)和3个糖基转移酶(CgUGT1、CgUGT2和Cg1,2RhT)，同时通过体外酶活力测定、拟南芥中基因稳定超表达转化、烟草中超量表达等手段证明了这5个基因参与Melitidin的生物合成。发明人通过实验证明Melitidin有抑制胆固醇合成和癌细胞增殖的双重活性，并且进一步利用新发现的基因和拟南芥中的AtHMGS基因在烟草中构建了Melitidin的生物合成途径，实现了该他汀类次生代谢物的全途径合成，为研究该代谢物作为候选药物提供了新的思路和资源。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种柚子中他汀类次生代谢物Melitidin合成途径的关键基因，包括CgAT1、CgAT2、CgUGT1、CgUGT2和Cg1,2RhT基因，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.14-18所示。

进一步地，所述关键基因编码的蛋白氨基酸序列依次如SEQ ID NO.19-23所示。

本发明还提供一种根据上述的关键基因在促进植物体内合成他汀类次生代谢物Melitidin中的应用。

进一步地，通过上调CgAT1、CgAT2、CgUGT1、CgUGT2和Cg1,2RhT蛋白表达水平，促进Melitidin的合成。

进一步地，促进所述Melitidin合成的途径为：CgUGT1和/或CgUGT2蛋白催化柚皮素和葡萄糖反应合成柚皮素-7-O葡萄糖，柚皮素-7-O葡萄糖与Cg1,2RhT蛋白反应生成柚皮苷，之后CgAT1和/或CgAT2蛋白以HMG-CoA和柚皮苷为底物，合成Melitidin。

本发明还提供一种植物中合成Melitidin的方法，包括将CgAT1、CgAT2、CgUGT1、CgUGT2、Cg1,2RhT和AtHMGS基因导入受体植物的步骤；所述CgAT1、CgAT2、CgUGT1、CgUGT2和Cg1,2RhT基因的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.14-18所示。

进一步地，将基因导入受体植物的过程为：分别将所述CgAT1、CgAT2、CgUGT1、CgUGT2、Cg1,2RhT和AtHMGS基因连入植物表达载体，获得表达目的基因的重组载体，再将重组载体转入受体植物中，得到转基因植物，所述转基因植物中合成Melitidin。

进一步地，所述转基因植物中合成Melitidin是根据上述Melitidin合成的途径进行合成。

进一步地，通过农杆菌介导法将重组载体转入受体植物中。

本发明公开了以下技术效果：

本发明对各种柑橘种质资源进行了比较代谢组分析，解析了Melitidin的代谢途径及其在不同类型柑橘中的含量差异。随后，利用柚子自然群体进行了基于代谢物的全基因组关联研究(GWAS)，筛选了3个主要的遗传位点，确定了5个候选基因。通过体外酶活和植物转基因等方法验证了基因的生物学功能，并且在烟草中实现了Melitidin异源的生物合成。进一步通过细胞活性实验验证了Melitidin具有抑制胆固醇合成和癌细胞增殖的双重活性，为研究和利用Melitidin这种独特的天然活性成分提供了新的思路和重要基因资源。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为柚子中Melitidin生物合成途径示意图；

图2为本发明通过GWAS筛选定位到5个候选基因的Melitidin含量的全基因组关联分析结果；

图3为重组蛋白CgUGT1和CgUGT2的体外HPLC色谱图；

图4为烟草叶片中瞬时过表达CgUGT1和CgUGT2基因的类黄酮苷及其衍生物的积累；

图5为CgUGT1和CgUGT2基因在拟南芥中过表达转基因株系的表达量分析结果；

图6为CgUGT1和CgUGT2转化拟南芥的超量表达植株三周苗叶片中类黄酮苷及其衍生物的积累；

图7为CgAT1和CgAT2的体外酶活实验和烟草瞬时转化验证；A为CgAT1和CgAT2蛋白催化HMG-CoA和柚皮苷的色谱峰图，反应为三次独立重复的结果；B为体外酶活实验的产物鉴定，上部分为产物的二级质谱碎片信息，下图为Melitidin标准品的二级质谱碎片信息；C为烟草中瞬时转化验证CgAT1和CgAT2的催化活性结果；

图8为在烟草中实现Melitidin生物合成的示意图；

图9为烟草叶片中多个不同基因组合的LC-MS检测结果；

图10为Melitidin降低胆固醇和抑制癌细胞活性的生物活性验证结果；A为不同浓度的Melitidin对HMGR酶活的抑制评估，以Naringin为参照；B为Melitidin对肝癌细胞Hep3B和PLC的活力有不同的影响，以DMSO和Naringin为对照；附图C为Melitidin对正常细胞系LO2活力的影响，以DMSO和pravastatin为参照；所示值为4次重复的平均值。

具体实施方式

实施例1Melitidin代谢合成途径的解析和结构基因的发现

发明人对来自世界各地的154份柚子材料进行代谢组的测定，对Melitidin在群体中的含量进行统计分析，推测了Melitidin的生物合成途径，如图1所示，其中Naringenin：柚皮素；Naringenin-7-O-Glc：柚皮素-7-O葡萄糖；Naringin：柚皮苷。并进行全基因组关联分析(GWAS)，结果发现Melitidin分别与1号、2号和9号染色体上的一个遗传位点存在着显著的关联，表明这三个遗传位点区域内存在调控Melitidin合成的候选基因，在这些基因中我们发现了CgAT1、CgAT2、CgUGT1、CgUGT2和Cg1,2RhaT(见图2)，各基因全长序列的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-5所示，推测CgAT1、CgAT2、CgUGT1、CgUGT2和Cg1,2RhaT基因可能控制Melitidin的生物合成。因Cg1,2RhaT基因功能已经被之前的研究报道，(参见“Themolecular and enzymatic basis of bitter/non-bitter flavor of citrus fruit:evolution of branch-forming rhamnosyltransferases under domestication”(Frydman et al.,The Plant Journal,2013)，本研究中不再重复验证其酶活功能。

实施例2 Melitidin代谢合成基因(CgAT1、CgAT2、CgUGT1和CgUGT2)的克隆及载体构建

发明人采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)从已经测序的柑橘品种叶片提取总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录试剂盒Supermix(购自北京全式金公司)将其反转录合成cDNA，反应条件：42℃30min，80℃5s，获得的cDNA为扩增基因的模板。

发明人首先针对各个候选基因设计了引物(如表1所示)，CgAT1、CgAT2、CgUGT1、CgUGT2和Cg1,2RhaT基因cDNA序列依次如SEQ ID NO.14-18所示，其编码的蛋白氨基酸序列依次如SEQ ID NO.19-23所示。因构建不同载体的需要，在引物前添加不同的接头使用：(1)在引物上加接头6p-1F-5’-TTCCAGGGCCCCTGGGATCC-3’和6p-1R-5’-CAGTCAGTCACGATGCGGCCGC-3’分别扩增各候选基因。将扩增获得的PCR产物通过同源重组克隆技术连入pGEX-6p-1载体，筛选阳性克隆并测序确认。(2)在引物上加接头attB1-5’-AAAAAGCAGGCTTA-3’和attB2-5’-AAAAAGCAGGCTTA-3’分别扩增各候选基因，将扩增获得的PCR产物通过Gateway克隆技术的BP反应连入pDonr207入门载体，筛选阳性克隆并测序确认，获得目的基因全长cDNA，再通过Gateway克隆技术的LR反应烟草瞬时表达载体pEAQ-HT-DEST2以及基因超量表达载体pCAMBIA1302。PCR反应条件：95℃预变性2min；94℃10s，60℃30s，72℃2min，35个循环；72℃延伸5min。

表1扩增候选基因cDNA所使用的引物

实施例3 CgAT1、CgAT2、CgUGT1和CgUGT2基因的原核表达及融合蛋白纯化

原核表达及融合蛋白纯化方法如下：首先将实施例2中得到的PGEX-6p-1阳性菌落挑入培养基中培养。通过IPTG诱导表达、破碎蛋白、离心得到粗蛋白。再通过GST纯化柱和洗脱液纯化蛋白。

具体步骤：(1)小摇：从皿上挑阳性菌落到摇菌瓶，加入6mL已加入对应抗生素的LB(抗性一般均为氨苄西林)，37℃摇床培养过夜/8h，直到摇混；(2)大摇：在超净台中(提前灭菌至少15min)向有LB(250mL)的大三角瓶中加入250μL抗生素，再按1:50的比例加入小摇菌液(250ml LB/5mL菌液)，封口，做好标记，大摇床37℃，220rpm培养2-3h，直到菌液浑浊；(3)诱导表达：表达GST/his标签蛋白时，按1:10000的比例向三角瓶中加入1M的IPTG(蛋白表达诱导剂)，25μL，在大摇床中16℃，180rpm培养14-16h；(4)收菌：离心机4℃，5000rpm，离心8min；(5)重悬：向每瓶中加入50mL Lysis buffer涡旋至没有菌块；(6)破细胞：向每管菌液中加入50μL的PMSF蛋白酶抑制剂，10μL还原剂β-巯基乙醇，用细胞破碎仪破碎蛋白；(9)纯化融合蛋白：于4℃离心，10000rpm，1h，收集上清液并转入纯化柱中，过滤两次后用Lysisbuffer冲洗杂蛋白，然后用谷胱甘肽缓冲液(GST)洗脱靶蛋白，并分装保存于-80℃。

所用试剂和培养基的配制：

(1)主要溶液配方：

1)LB培养基的配制

胰蛋白胨10g；酵母粉5g；NaCl 10g；室温下溶解并用蒸馏水定容至1000mL，封口高温灭菌。

2)IPTG配方

称取1.19g IPTG，溶于5mL水中，溶解后过滤除菌，分装保存于-20℃冰箱。

3)Lysis buffer配方

称取NaCl 23.37g，量取1M Tris-HCL(pH＝7.4)50mL，加水定容到1L。

4)谷胱甘肽缓冲液配方

称取还原型谷胱甘肽0.092g，溶于20mL Lysis buffer中，加入300μL 1M NaOH调节pH至8.0左右。

实施例4 Melitidin代谢合成基因(CgAT1、CgAT2、CgUGT1和CgUGT2)体外酶活测定

具体步骤：1.为了验证两个编码酰基转移酶的候选基因CgAT1和CgAT2的功能，发明人使用实施例3中纯化的蛋白进行体外酶活测定。蛋白体外酶活反应体系是20μL，CgAT1和CgAT2依次以终浓度为1mM的HMG-CoA和柚皮苷为底物，500ng纯化重组蛋白(同时设置GST标签蛋白为负对照)，1M Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5)，1M MgCl₂，在37℃孵育2h后，加入80μL预冷的甲醇终止反应。将反应物通过4℃12000rpm离心10min，得到的上清用LC-MS(LCMS-8060，日本岛津公司)分析，检测结果表明反应产物出现明显的色谱峰并且保留时间和碎裂模式与对应标准品相同(见图7A)，图7A结果显示，重组蛋白CgAT1和CgAT2催化HMG-CoA和柚皮苷合成Melitidin。图7B为体外酶活实验的产物鉴定，上部分为产物的二级质谱碎片信息，下部分为Melitidin标准品的二级质谱碎片信息。

2.为了验证2个编码糖基转移酶的候选基因CgUGT1和CgUGT2的功能，发明人使用实施例3中纯化的蛋白进行体外酶活测定。UGT蛋白体外酶活反应体系是20μL，CgUGT1和CgUGT2依次以终浓度为1mM的柚皮素为底物，供体为UDP-葡萄糖，600ng纯化重组蛋白(同时设置GST标签蛋白为负对照)，1M Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5)，1M MgCl₂，在37℃孵育3h后，加入60uL预冷的甲醇终止反应。将反应物通过4℃12000rpm离心10min，得到的上清用LC-MC(LCMS-8060，日本岛津公司)分析，检测结果表明反应产物出现明显的色谱峰并且保留时间和碎裂模式与对应底物标准品相同(见图3，CK为GST蛋白阴性对照)，结果显示CgUGT1和CgUGT2催化柚皮素和UDP-葡萄糖反应，生成Naringenin-7-O-Glc。

实施例5 Melitidin代谢合成基因(CgAT1、CgAT2、CgUGT1和CgUGT2)烟草瞬时表达

烟草瞬时表达方法如下：首先将实施例2中得到的阳性克隆pEAQ-HT-DEST2质粒测序正确后，转入农杆菌中，再通过注射菌液，将农杆菌转入烟草叶片进行表达。

具体步骤：(1)烟草培养：培养条件为22℃、16h光照/8h黑暗光周期，待第4-5叶片完全展平后，选择长势一致的植株进行实验；(2)制备侵染菌液：分别挑取CgAT1、CgAT2、CgUGT1和CgUGT2的农杆菌单菌落，接种到500μL LB培养基(含50ug/mL卡那霉素，50ug/mL利福平)中，28℃，220rpm下培养培养20-24h，转接200ul菌液于5mL LB培养基(含50ug/mL卡那霉素，50ug/mL利福平)中，在28℃、220rpm摇床培养至OD₆₀₀＝2.0左右，10000rpm常温离心2min收集菌体，用烟草缓冲液进行菌体重悬，最后将侵染菌液放置于28℃摇床振荡3h；(3)注射烟草：拿准备好的1mL的注射器，去掉针头，选取出口光滑的注射器吸入菌液，用手按住叶片，从叶片反面注射，使农杆菌渗透进去。给每株打过的烟草做好标记，可在叶片上圈出农杆菌渗透的区域，并选取转化缓冲液打烟草做对照；(4)注射后的烟草培养：注射后黑暗处理24h，之后将烟草置于22℃，光/暗周期16/8h的培养箱内继续培养24-48h。(5)取样：剪取农杆菌渗透区域的叶片，放在已称重的装有钢珠的离心管中，做好标记，迅速放置液氮中；(6)代谢样提取：使用研磨机研磨成粉末，每个样品称量0.1g左右，加入万倍体积的70％甲醇(如0.1g加入1mL)，涡旋振荡混匀，放置于冰上，每隔10min涡旋一次，共三次，而后保存于4℃5h以上，再涡旋后进行离心，吸取上清液进行过滤灭菌后即可使用液相色谱-质谱联用仪LC-MS进行代谢样的检测，检测方法为本课题组前期开发的广泛靶向代谢组学方法，具体方法参见专利“一种利用LC/MS/MS高效鉴别植物次生代谢产物的方法CN201010562426.8”，检测结果如图4，其中每个基因检测了独立的三个瞬时超表达家系(OX-1、OX-2和OX-3)。结果显示超表达CgUGT1和CgUGT2不仅能够催化柚皮素和与UDP-葡萄糖的7-O-糖基化修饰反应生成柚皮素-7-O葡萄糖，也能够催化黄酮的5-O-糖基化(如chrysin和apigenin)、黄酮醇的3-O-糖基化(如kaempferol和quercetin)的糖基化修饰，说明这两个基因在体内功能的多效性。图7C为烟草中瞬时转化验证CgAT1和CgAT2的催化活性结果，实验结果进一步证实，CgAT1和CgAT2蛋白可以催化HMG-CoA和柚皮苷合成Melitidin。

所用试剂配制：

烟草缓冲液配方如下表：

表2

成分	母液浓度	终浓度	备注	100mL
					MES	0.5M	10mM	pH5.7	2mL
MgCl₂	1M	10mM		1mL
					AS	100mM	200μM		200μL
				Add ddH₂O至100mL

实施例6拟南芥超量表达植株的构建和检测

拟南芥超量表达植株构建方法如下：利用农杆菌转染法将超量表达载体pCAMBIA1302导入拟南芥野生型植株中，获得基因超量表达的拟南芥转基因植株。转化方法采用成熟的蘸花转化法，用农杆菌侵染拟南芥花序，利用授粉受精过程，将农杆菌导入胚珠，从而使拟南芥结出含有基因超量表达的种子。

具体步骤：植株构建：1.农杆菌悬浮液制备：(1)转化前三天，将含有超量表达载体pCAMBIA1302的农杆菌接种至5mL LB液体培养基(含有千分之一体积的抗生素庆大霉素、卡那霉素)中，28℃下振荡培养2天；(2)将1mL菌液转接至100mL LB液体培养基(含有千分之一体积的抗生素庆大霉素、卡那霉素)中，28℃继续振荡培养24h；(3)将菌液转入离心管中，6000rpm，室温下离心10min后，将上清倒出；(4)用侵染液重悬菌块，并调至OD₆₀₀＝0.8，并将农杆菌悬浮液转移至500mL烧杯中；2.侵染：(1)选取健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬浮液的烧杯上方，将整个花序浸泡约20-30s；(2)用保鲜膜将侵染过的植株罩起来以保持湿度，暗培养24h，然后置于正常培养条件，2-3天后去除保鲜膜，转化一周后可浇水，并定期继续侵染2次；(3)大约3周后收取成熟种子，并种植T0代转基因植株。

表达量测定：(1)取样：剪取指甲盖大小的拟南芥叶片，快速放进装有钢珠的离心管中并放入液氮；(2)RNA提取、反转录及鉴定：利用反转录试剂盒Supermix(购自北京全式金公司)将所提取的RNA反转录合成cDNA，反应条件：42℃30min，80℃5s，将产物稀释10倍；(4)qRT-PCR测定表达量：利用SYBR qPCR定量PCR检测试剂盒(购自Vazyme公司)进行qPCR检测(使用方法根据上述试剂盒说明书)，使用实时荧光定量PCR软件QuantstudioTM，以拟南芥Actin基因At5g60390为内参，检测引物序列为qRT-F：5’-AATGGTGACGCTGGTATG-3’，qRT-R：5’-CTTCTTGTCCACGCTCTT-3’，采用ΔΔCt法计算各基因的相对表达量，结果如图5所示。结果显示对于CgUGT1和CgUGT2，分别成功获得了3个独立的超量表达家系(CgUGT1：OX-1、OX-3、OX-6；CgUGT2：OX-1、OX-3、OX-4)。

代谢物含量测定：(1)冻干及研磨：将液氮中或者-80℃冰箱中取出的样品放入冻干机中进行干燥(约1周左右)，然后使用研磨机研磨成粉末；(2)提取：每个样品称量0.1g左右，加入万倍体积的70％甲醇(如0.1g加入1mL)，涡旋振荡混匀，放置于冰上，每隔10min涡旋一次，共三次，而后保存于4℃5h以上，再涡旋后进行离心，吸取上清液进行过滤灭菌后即可使用液相色谱-质谱联用仪LC-MS进行代谢样的检测，结果如图6所示。结果显示，与CgUGT1和CgUGT2在烟草中瞬时超表达的结果类似，超表达CgUGT1和CgUGT2不仅能够催化柚皮素和与UDP-葡萄糖的7-O-糖基化修饰反应生成柚皮素-7-O葡萄糖，也能够催化黄酮的5-O-糖基化(如chrysin和apigenin)、黄酮醇的3-O-糖基化(如kaempferol和quercetin)的糖基化修饰，另外，一系列类黄酮糖基化衍生物的积累量也随之升高，说明这两个基因在体内功能的多效性。

所用试剂配制

侵染液配方:200mL 5％蔗糖和10μL 50-500uL/L Silwet L-77的水溶液。

实施例7在烟草中实现异源合成Melitidin。

发明人将已报道的Cg1,2RhaT基因及拟南芥AtHMGS(At4g11820)基因片段使用Gateway载体构建体系构建入烟草瞬时表达载体pEAQ-HT-DEST2，得到的阳性克隆质粒测序正确后，转入农杆菌获得这两个基因片段的农杆菌菌液。连同实施例5中得到的Melitidin代谢合成基因(CgAT1、CgAT2、CgUGT1、CgUGT2)的农杆菌菌液，在烟草中实现Melitidin生物合成示意图如图8所示，发明人将这些基因按照Melitidin生物合成的主要步骤进行等比混合，混合后的菌液通过注射入烟草叶片进行瞬时表达，对表达3天后的烟草叶片提取代谢物进行LC-MS检测，检测结果见图9。结果显示，CgUGT1、Cg1,2RhT、CgAT1和AtHMGS共表达，能够在烟草中形成了一个完整的melitidin产生途径。

实施例8Melitidin降低胆固醇和抑制癌细胞活性的生物活性验证

发明人通过不同浓度的Melitidin对HMG-CoA还原酶活性的抑制效率来验证Melitidin具有降低胆固醇的生物活性，通过对肝癌细胞Hep3B和PLC活力的抑制效果，以及对正常细胞系LO2的活力的影响来鉴定Melitidin抑制癌细胞的生物活性。

具体步骤：

1、Melitidin抑制HMG-CoA还原酶活性的鉴定

发明人使用HMG-CoA还原酶(HMGR)测定试剂盒(购自Sigma-Aldrich公司)测量每种化合物抑制胆固醇生物合成的限速酶的潜力，使用Pravastatin作为HMG-CoA还原酶抑制剂的内参。HMG-CoA还原酶活性抑制百分比的计算公式为：抑制率(％)＝[(A₀-A_s)/A₀]×100，其中A₀是对照的吸光度，As是含有该化合物的反应混合物的吸光度。

2、细胞活力测定和IC50测量

发明人将细胞以每孔1000-2000个细胞的密度接种在96孔平板中，在DMEM培养基(购自ThermoFisher公司)中培养24小时。制备不接种细胞的空白培养基，将等份稀释的化合物和空白对照DMSO试剂添加到对应的孔中，使每个孔的最终体积为100μL，并在37℃、5％CO₂条件下培养细胞72小时。使用CCK8试剂盒(购自Proteintech公司)在450nm处评估细胞活力。每种化合物终浓度分别设置为7.8125μM、15.625μM、31.2μM、62.5μM、125μM、250μM、500μM至1mM时，用于IC50(细胞活力抑制一半时对应的化合物浓度)测量。使用4次技术重复计算IC50值，然后对3次生物重复进行统计分析，结果如图10所示，A为不同浓度的Melitidin对HMGR酶活的抑制评估，以Naringin为参照。图B为Melitidin对肝癌细胞Hep3B和PLC的活力有不同的影响，以DMSO和Naringin为对照。图C为Melitidin对正常细胞系LO2活力的影响，以DMSO和pravastatin为参照。结果显示，Melitidin具有抑制胆固醇合成和癌细胞增殖的双重活性。

综上，本发明筛选出柚子体内合成他汀类次生代谢物Melitidin的关键基因，并推断出Melitidin的代谢合成途径，为研究和利用Melitidin这种独特的重要天然活性成分提供了新的思路和基因资源。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种柚子中他汀类次生代谢物Melitidin合成途径的关键基因，其特征在于，包括CgAT1、CgAT2、CgUGT1、CgUGT2和Cg1,2RhT基因，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.14-18所示。

2.一种根据权利要求1所述的关键基因在促进植物体内合成他汀类次生代谢物Melitidin中的应用，其特征在于，所述植物为柚子、烟草和拟南芥。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过上调CgAT1、CgAT2、CgUGT1、CgUGT2和Cg1,2RhT蛋白表达水平，促进Melitidin的合成。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，促进所述Melitidin合成的途径为：CgUGT1和/或CgUGT2蛋白催化柚皮素和葡萄糖反应合成柚皮素-7-O葡萄糖，柚皮素-7-O葡萄糖与Cg1,2RhT蛋白反应生成柚皮苷，之后CgAT1和/或CgAT2蛋白以HMG-CoA和所述柚皮苷为底物，合成Melitidin。

5.一种植物中合成Melitidin的方法，其特征在于，包括将CgAT1、CgAT2、CgUGT1、CgUGT2、Cg1,2RhT和AtHMGS基因导入受体植物的步骤；所述CgAT1、CgAT2、CgUGT1、CgUGT2和Cg1,2RhT基因的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.14-18所示；所述植物为柚子、烟草和拟南芥。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将基因导入受体植物的过程为：分别将所述CgAT1、CgAT2、CgUGT1、CgUGT2、Cg1,2RhT和AtHMGS基因连入植物表达载体，获得表达目的基因的重组载体，再将重组载体转入受体植物中，得到转基因植物，所述转基因植物中合成Melitidin。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述转基因植物中合成Melitidin是根据权利要求4中所述Melitidin合成的途径进行合成。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过农杆菌介导法将重组载体转入受体植物中。