CN1493368A

CN1493368A - 血液灌流用内毒素吸附剂及制备方法

Info

Publication number: CN1493368A
Application number: CNA031442315A
Authority: CN
Inventors: 直袁; 袁直; 刘涛; 侯光辉; 王孝杰; 张文升
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2003-09-02
Filing date: 2003-09-02
Publication date: 2004-05-05
Anticipated expiration: 2023-09-02
Also published as: CN1239210C

Abstract

本发明涉及一种血液灌流用内毒素吸附剂及其制备方法。本发明是以球形琼脂凝胶为载体，固定有效量的亲和配基，粒度为0.45－1.0mm，吸附剂的胺基含量为40－100μmol/g吸附剂。以琼脂为原料，采取向甲苯－四氯化碳混合液中加琼脂水溶液的方法，得到球状琼脂，经碱性条件下环氧氯丙烷活化后与二胺反应，产物经与戊二醛反应，产生部分交联，得到强度较好的珠状琼脂作为吸附剂载体。载体与多粘菌素B等含胺基的配基反应后，经NaBH₄还原，即得到内毒素吸附剂。本发明得到的吸附剂具有良好的血液相容性，可通过血液灌流的方法，高效吸附患者血液中的内毒素，属于新一代产品。

Description

血液灌流用内毒素吸附剂及制备方法

技术领域

本发明涉及生物医用材料领域，特别是一种血液灌流用内毒素吸附剂及制备方法。

背景技术

内毒素血症是临床最常见的致死疾病之一，死亡率可达40％-90％，在美国每年都有超过十万人死于此病【Skelter et al，Arch.Microbiol.1995，164，383-389.】，临床上尚无有效的治疗方法。内毒素血症是由于革兰氏阴性菌外细胞壁上的内毒素释放到血液中引起的。内毒素进入血液后引起一系列反应最终导致器官坏死、不可逆休克和死亡。如何做到及时、有效地清除或破坏患者体内的内毒素，是治疗内毒素血症的关键问题。近年来国外研制了多种拮抗内毒素的分子生物学制剂，但由于抗体的生产工艺复杂、药源少、成本高，价格十分昂贵，且迄今为止尚无一种能够通过III期临床实验【姚咏明等.中国危重病急救医学，1999，11：456】。

对一些重大疑难性病症，血液净化疗法有着独特疗效，甚至能出现“起死回生”般的奇迹，是临床治疗不可缺少的重要手段，其中血液灌流疗法是依靠吸附剂直接吸附除去血液中的有毒成份或致病物质，达到净化血液、缓解和治疗疾病的目的。近年来，全血灌流疗法由于其费用低而受到国际上空前的关注，认为它是血液净化发展的主要趋势【James F.et al.，Blood Purif.2002，20：81-86】。该疗法已用于红斑狼疮、重症安眠药中毒、类风湿等疾病的治疗，收到较好的疗效。国外研究者已开始研究利用血液净化的方法治疗内毒素血症，日本的研究人员将多粘菌素B涂附在血滤器中空纤维的内壁上，可以较好地清除血浆中的内毒素【Tani T，et al.，Atificial Organs 22(12)：1038-1044(1998)】。维也纳大学的研究人员利用自己设计的MDS系统，将聚乙烯亚胺接在纤维素上进行动物实验，去除内毒素效果也较好【K.von Appen，et al.，Atif.Organs，20(5)：420-425(1996)】。但上述两种方法需要将血浆与血球分离后，进行血浆灌流，费用十分昂贵，不适合在国内推广。国内仅有利用活性碳全血灌流法吸附内毒素的动物实验报道，表明用活性碳灌流可直接吸附血中内毒素，但效果不明显【王今达.中国危重病急救医学，1998，10：578】。以球形琼脂为载体的血液灌流用内毒素吸附剂未见报道。

发明内容

本发明提供一种用于血液灌流的内毒素吸附剂，它具有良好的血液相容性，可通过血液灌流的方法，高效吸附患者血液中的内毒素，可用于全血灌流，也可用于血浆灌流。

本发明是以球形琼脂凝胶为载体，固定有效量的亲和配基构成，粒度为0.45-1.0mm，吸附剂的胺基含量为40-100μmol/g吸附剂。

所述的亲和配基是多粘菌素B、精氨酸、赖氨酸、组氨酸或聚赖氨酸。。

所述的聚赖氨酸的分子量为1.0-4.0万。

所述血液灌流用内毒素吸附剂的制备方法，包括下述步骤：

(1)制备球形琼脂载体：

将2～10％的琼脂水溶液加热熔化，倒入甲苯-四氯化碳体系中，加入吐温80，搅拌，使琼脂溶液在有机相中分散成液滴，60～90℃反应2-4小时，冷却后，倾倒出上层有机溶剂，筛选0.45-1.0mm的琼脂球，用水充分洗涤后，作为吸附剂载体。

(2)环氧氯丙烷活化载体：

载体在2M NaOH溶液中，30-50℃下与环氧氯丙烷反应1-4小时，用水洗至中性，除去未反应的环氧氯丙烷，得到环氧氯丙烷修饰的载体。

(3)胺解反应

环氧氯丙烷修饰的载体在pH9～12的水溶液中于50-70℃下，与二胺反应1-4小时。加入乙醇胺溶液在室温下反应1-6h以封闭未反应的环氧基团。

(4)交联反应

pH7.4的磷酸缓冲溶液中加入胺解的凝胶球，加25％的戊二醛，室温振荡1-4小时，胺解载体中30％胺基与戊二醛交联，以增加载体的强度，70％胺基与戊二醛相连，留有悬挂醛基，可与配体中的伯胺基生成西佛碱，将配基引入到载体上。由此方法引入的配基含量较高。最后用水冲洗。

(5)固载配基

将交联后的琼脂球在pH9-12下与配基反应1-2小时，使悬挂醛基与配基中的伯胺基生成西佛碱，然后用1M的NaCl冲洗至中性。

(6)还原：固载配基后的凝胶球于pH7.4的磷酸缓冲溶液中加入硼氢化钠，室温振荡2～6小时，反应后用1M的氯化钠和水冲洗至中性。

所述的血液灌流用内毒素吸附剂的制备方法各步骤的物料配比为：

甲苯∶四氯化碳为1～4∶1，v/v；琼脂球∶2M的NaOH∶环氧氯丙烷为1∶1～4∶0.5～2，w/v/v；琼脂球∶二胺为5∶0.1～0.5，w/w；25％的戊二醛的用量为胺化琼脂球的25％-150％，v/w；NaBH₄∶琼脂球为0.1～0.5∶5，w/w。

所述的二胺为乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺或己二胺。

所述的血液灌流用内毒素吸附剂用于临床全血灌流清除血中内毒素，治疗内毒素血症等疾病。

使用所述的吸附剂进行血液灌流的方法，包括下述步骤：室温下，取吸附剂装入灌流柱内，内毒素血症患者的全血，以15ml/min的流速灌流2小时，采用偶氮显色法检测吸附前后内毒素浓度；或室温下，将吸附剂直接加入含内毒素的血浆中，静态吸附20分钟，吸附剂∶血清为1∶20，w/v。

用本发明静态吸附内毒素血症患者的血浆，对内毒素清除率可达70％，可见吸附剂对内毒素有较高的清除能力。

本发明吸附剂具有良好的血液相容性，可通过血液灌流的方法，高效吸附患者血液中的内毒素，可用于全血灌流，也可用于血浆灌流。本发明是全血灌流用内毒素吸附剂，通过全血灌流疗法治疗内毒素血症等疾病。不需要将血球与血浆分开而区别于国外的血浆灌流方法，从而大大降低了治疗成本。

附图说明

图1.琼脂球载体交联前后热失重曲线。

图2.琼脂球载体交联前后微商热失重曲线。

具体实施方式

下列用具体实施例说明本发明，但它们不对本发明作任何限制。

实施例1

1-1球形琼脂凝胶载体的制备

将500ml三口瓶置于60℃水浴中，向瓶内加入100ml甲苯，50ml四氯化碳，0.5ml吐温80，均匀搅拌。

称取4克琼脂粉加入蒸馏水30ml，加热熔化，将熔化的琼脂倒入甲苯-四氯化碳体系中，搅拌，使琼脂溶液在有机相中分散成大小适宜的液滴。冷却到室温，倾倒出上层有机溶剂，筛选0.45-1.0mm的琼脂球，用水洗涤后，移入锥形瓶，4℃湿态保存。

1-2环氧氯丙烷活化

取琼脂球20.0克，加入29.6毫升2M的氢氧化钠，再加入13.3毫升的环氧氯丙烷，在40℃下反应2小时，用水洗涤至中性，并彻底洗去剩余的环氧氯丙烷，得到环氧活化的凝胶球，环氧基固载量为110.2μmol/g凝胶球。

1-3胺解

1-3-1于80ml蒸馏水中加入1克1，2-乙二胺，调节pH值为10，加入20克环氧活化的凝胶球，于50℃下反应2小时。反应后用水冲洗至中性，得到乙二胺化的凝胶球。乙二胺固载量为90.6μmol/g凝胶球。将得到的产品与0.1g乙醇胺溶液在室温下反应2h以封闭未反应的环氧基团。

1-3-2于80ml蒸馏水中加入2克1，3-丙二胺，调节pH值为11，加入20克环氧活化的凝胶球，于60℃下反应3小时。反应后用水冲洗至中性，得到丙二胺化的凝胶球。丙二胺固载量为92.8μmol/g凝胶球。将得到的产品与0.1g乙醇胺溶液在室温下反应3h以封闭未反应的环氧基团。

1-3-3于80ml蒸馏水中加入2克1，4-丁二胺，调节pH值为12，加入20克环氧活化的凝胶球，于70℃下反应1小时。反应后用水冲洗至中性，得到丁二胺化的凝胶球。丁二胺固载量为91.3μmol/g凝胶球。将得到的产品与0.1g乙醇胺溶液在室温下反应5h以封闭未反应的环氧基团。

1-3-4于80ml蒸馏水中加入2克1，5-戊二胺，调节pH值为9，加入20克环氧活化的凝胶球，于50℃下反应4小时。反应后用水冲洗至中性，得到戊二胺化的凝胶球。戊二胺固载量为90.9μmol/g凝胶球。将得到的产品与0.1g乙醇胺溶液在室温下反应1h以封闭未反应的环氧基团。

1-3-5于80ml蒸馏水中加入2克1，6-己二胺，调节pH值为10，加入20克环氧活化的凝胶球，于50℃下反应3小时。反应后用水冲洗至中性，得到己二胺化的凝胶球。己二胺固载量为92.9μmol/g凝胶球。将得到的产品与0.1g乙醇胺溶液在室温下反应3h以封闭未反应的环氧基团。

1-4引入戊二醛手臂及部分交联反应

1-4-1于50毫升0.05M pH＝7.4的磷酸缓冲溶液中加入20克己二胺化的载体，在搅拌条件下滴加15毫升25％的戊二醛，室温振荡2小时。琼脂球上剩余醛基为74.3μmol/克。反应后用0.1M磷酸缓冲溶液和水冲洗。

1-4-2在1-4-1条件下，将己二胺换成戊二胺，振荡1小时，琼脂球上剩余醛基为70.3μmol/克。

1-4-3在1-4-1条件下，将己二胺换成丁二胺，振荡1小时，琼脂球上剩余醛基为68.3μmol/克。

1-4-4在1-4-1条件下，将己二胺换成丙二胺，振荡4小时，琼脂球上剩余醛基为74.3μmol/克。

1-4-5在1-4-1条件下，将己二胺换成乙二胺，振荡1小时，琼脂球上剩余醛基为78.3μmol/克。

1-5固载配基

1-5-1在20毫升pH11的水溶液中加入0.2克多粘菌素B，加入交联后的1-4-2琼脂球5克，室温振荡2小时，然后用1M的氯化钠冲洗。吸附剂胺基固载量为44.8μmol胺基/g。

1-5-2在20毫升pH9的水溶液中加入0.2克精氨酸，加入交联后的1-4-3琼脂球5克，室温振荡1小时，然后用1M的氯化钠冲洗。吸附剂胺基固载量为69.5μmol胺基/g。

1-5-3在20毫升pH10的水溶液中加入0.2克赖氨酸，加入交联后的1-4-4琼脂球5克，室温振荡1小时，然后用1M的氯化钠冲洗。吸附剂胺基固载量为87.6μmol胺基/g。

1-5-4在20毫升pH12的水溶液中加入0.2克聚赖氨酸，加入交联后的1-4-1琼脂球5克，室温振荡2小时，然后用1M的氯化钠冲洗。吸附剂胺基固载量为74.5μmol胺基/g。

1-5-5在20毫升pH9的水溶液中加入0.2克组氨酸，加入交联后的1-4-5琼脂球5克，室温振荡2小时，然后用1M的氯化钠冲洗。吸附剂胺基固载量为94.5μmol胺基/g。

1-6还原

1-6-1于10毫升0.1M pH7.4的磷酸缓冲溶液中加入0.3g的硼氢化钠，加入5g固载配基后的1-5-4凝胶球，室温振荡4小时，反应后用1M的氯化钠和水冲洗至中性。得到内毒素吸附剂。

在上述条件下，将1-5-4分别换成1-5-1，1-5-2，1-5-3，1-5-5进行硼氢化钠还原，得到系列内毒素吸附剂。

实施例2

戊二醛交联对琼脂球载体性质的影响

2-1分别取50mg戊二醛交联前1-1及戊二醛交联后1-4琼脂球，洗净，真空干燥后研碎。采用TG209热重分析仪测定载体球的热失重曲线，升温速度14.0℃/min，升温范围20～620℃。交联以后，热失重的峰值从277.4℃增高到295.8℃，这说明交联后琼脂球的热稳定性得到了提高(见图1，2)。图1.琼脂球载体交联前后热失重曲线。图2.琼脂球载体交联前后微商热失重曲线。

热重法是评价高分子材料热稳定性的一种最重要的方法。。从图1的热失重曲线可以看出，交联后热失重的比例由67.06％减少到48.05％，这说明经过交联凝胶球受热脱水量减少了；另一方面，从图2的微商热失重曲线可以看出，交联以后热失重的峰值从277.4℃增高到295.8℃，这也说明交联后凝胶球的热稳定性提高了。

2-2准确量取30ml交联前后的琼脂球，装入一个直径1cm底部带有磨砂板的玻璃柱内，从柱的上部加入蒸馏水，保持蒸馏水在柱内稳定流动，用秒表测定蒸馏水的流出速度。交联前的流动速度为38.4毫升/分，交联后为66.8毫升/分。交联以后，水在柱内的流动速度明显加快，说明交联后琼脂球的硬度得到明显提高。

实施例3

血液相容性实验

取实施例1制备的吸附剂2毫升，在生理盐水中浸泡12小时后装入灌流柱内，用注射器注入5毫升混有抗凝剂的兔子全血，以15ml/min的流速灌流2小时。同时以一空灌流柱作为对照柱。通过MEK-6318K血细胞分析仪测定灌流前后血液各成分的变化。结果表明，灌流前后，各种血液成分变化不大，下降的百分数均在5％以内，这表明该系列吸附剂具有较好的血液相容性，可用于全血灌流。

实施例4

动物血浆中内毒素的吸附实验

4-1取0.05克还原后1-5-3吸附剂，加入1毫升内毒素血症模型大白鼠的血浆，室温振荡20分钟，采用偶氮显色法检测吸附前后内毒素浓度。吸附前血浆中内毒素浓度0.635EU/ml(EU为内毒素单位)，吸附后0.220EU/ml，而正常大白鼠血浆中内毒素浓度为0.18～0.22EU/ml。

4-2取0.05克还原后1-5-5吸附剂，加入1毫升内毒素血症模型大白鼠的血浆，室温振荡20分钟，采用偶氮显色法检测吸附前后内毒素浓度。吸附前血浆中内毒素浓度0.635EU/ml，吸附后0.380EU/ml。

4-3取1ml还原后1-5-4吸附剂装入1×5ml灌流器内，用医用酒精反复流动洗涤，再用蒸馏水、二次蒸馏水、生理盐水反复流动洗涤，最后用无热源水100ml流动洗涤。用横流泵控制流速15ml/min，用20ml内毒素模型兔子全血(内加抗凝剂)灌流2小时。采用偶氮显色法检测灌流前后内毒素浓度。灌流前血浆内毒素含量0.685EU/ml，灌流后血浆内毒素含量0.122EU/ml。正常兔子血浆内毒素含量0.067-0.135Eu/ml。

人体血浆中内毒素的吸附实验

4-4取0.05克还原后1-5-4吸附剂，加入1毫升内毒素血症患者的血浆，室温振荡20分钟，采用偶氮显色法检测吸附前后内毒素浓度。吸附前血浆中内毒素浓度0.683EU/ml，吸附后0.200EU/ml，而正常人血浆中内毒素浓度为0.18～0.22EU/ml，这说明该吸附剂对内毒素有较强吸附能力。

4-5取0.05克还原后1-5-1吸附剂，加入1毫升内毒素血症患者的血浆，室温振荡20分钟，采用偶氮显色法检测吸附前后内毒素浓度。吸附前血浆中内毒素浓度0.523EU/ml，吸附后0.300EU/ml。

4-6取0.05克还原后1-5-2吸附剂，加入1毫升内毒素血症患者的血浆，室温振荡20分钟，采用偶氮显色法检测吸附前后内毒素浓度。吸附前血浆中内毒素浓度0.523EU/ml，吸附后0.324EU/ml。

Claims

1、一种血液灌流用内毒素吸附剂，其特征在于它是以球形琼脂凝胶为载体，固定有效量亲和配基的树脂构成，粒度为0.45-1.0mm，吸附剂的胺基含量为40-100μmol/g吸附剂。

2、按照权利要求1所述的血液灌流用内毒素吸附剂，其特征在于所述的亲和配基是多粘菌素B、精氨酸、赖氨酸、组氨酸或聚赖氨酸。

3、按照权利要求2所述的血液灌流用内毒素吸附剂，其特征在于所述的聚赖氨酸的分子量为1.0-4.0万。

4、权利要求1所述血液灌流用内毒素吸附剂的制备方法，包括下述步骤：

(1)制备球形琼脂载体：

将2～10％的琼脂水溶液加热熔化，倒入甲苯-四氯化碳体系中，以吐温80作分散剂，搅拌，使琼脂溶液在有机相中分散成液滴，60～90℃反应2-4小时，冷却后，倾倒出上层有机溶剂，筛选0.45-1.0mm的琼脂球，用水充分洗涤后，作为吸附剂载体；

(2)环氧氯丙烷活化载体：

上述载体在2M NaOH溶液中，30-50℃下与环氧氯丙烷反应1-4小时，用水洗至中性，除去未反应的环氧氯丙烷，得到环氧氯丙烷修饰的载体；

其特征在于它还包括：

(3)胺解反应

上述环氧氯丙烷修饰的载体在pH9～12于50-70℃下与二胺反应1-4小时；水洗后，加入乙醇胺溶液在室温下反应1-6h以封闭未反应的环氧基团；

(4)交联反应

将经胺解的琼脂载体在搅拌下加入25％的戊二醛，室温振荡1-4小时，胺解载体中约30％的胺基与戊二醛交联，以增加载体的强度和配基引入量，70％胺基与戊二醛相连，留有悬挂醛基；

(5)固载配基

将交联后的琼脂球pH＝9-12下与亲和配基反应，通过上述的醛基与所述的配基中的伯胺基反应生成西佛碱，将亲和配基引入到吸附剂上，然后用1M的NaCl冲洗至中性；

(6)还原

固载配基后的凝胶球在pH7.4的磷酸缓冲液中加入NaBH₄，室温振荡2～6小时，反应后用1M的氯化钠和水冲洗至中性。

5.按权利要求4所述的血液灌流用内毒素吸附剂的制备方法，其特征在于各步骤的物料配比为：

甲苯∶四氯化碳为1～4∶1，v/v；琼脂球∶2M的NaOH∶环氧氯丙烷为1∶1～4∶0.5～2，w/v/v；25％的戊二醛的用量为胺化琼脂球的25％-150％，v/w；NaBH₄∶琼脂球为0.1～0.5∶5，w/w。

6、按权利要求4所述的血液灌流用内毒素吸附剂的制备方法，其特征在于所述的二胺为乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺或己二胺。

7、按权利要求4所述的血液灌流用内毒素吸附剂的制备方法，其特征在于所述的用硼氢化钠还原的条件是pH7.4的磷酸缓冲液。

8、权利要求1所述的血液灌流用内毒素吸附剂用于临床全血灌流，清除患者血液中的内毒素，治疗内毒素血症疾病。

9、一种使用权利要求1所述的吸附剂进行血液灌流的方法，其特征在于它包括下述步骤：室温下，取吸附剂装入灌流柱内，内毒素血症患者的全血以15ml/min的流速灌流2小时，采用偶氮显色法检测吸附前后内毒素浓度；或室温下，将吸附剂直接加入含内毒素的血浆中，静态吸附20分钟，吸附剂∶血清为1∶20，w/v。