CN109395190A - 一种用于治疗免疫性疾病的体外血浆吸附/血液灌注的方法及其装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以α肿瘤坏死因子为靶点进行免疫性疾病治疗的装置，与血浆分离机和血浆泵连接起来构成完整的血浆分离、吸附、回输系统；也可直接与血泵相连构成血液灌注系统。该装置的主要特点是由壳体和吸附介质构成，还可以含有除菌过滤膜。血浆或血液通过该装置时，吸附介质特异性地吸附α肿瘤坏死因子，从而将其从人体血液中清除，进而治疗与其相关的免疫性疾病，如风湿/类风湿、多发性硬化症、牛皮鲜、强直性脊柱炎、炎症性肠病(如克罗恩病)等。

Description

一种用于治疗免疫性疾病的体外血浆吸附/血液灌注的方法 及其装置

技术领域

本发明具体涉及一种去除血浆内α肿瘤坏死因子的体外吸附或血浆灌注的方法及其装置，用于治疗与α肿瘤坏死因子相关的疾病。

背景技术

肿瘤坏死因子(TNFα)是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，并参与正常炎症反应和免疫反应。α肿瘤坏死因子在许多病理状态下产生增多，包括败血症、恶性肿瘤、心脏衰竭和慢性炎性疾病。在重症类风湿关节炎患者的血液及关节中都可发现肿瘤坏死因子增多。肿瘤坏死因子与人类的许多疾病密切相关。

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性炎症性疾病，它的发病与多种细胞因子有关，其中肿瘤坏死因子(TNF)是引起该病的最主要的细胞因子之一。研究表明，TNF-α在RA的发病机制中起着重要作用，是导致炎性反应的持续发生和软骨与骨的破坏的重要促炎性细胞因子。抗TNF-α药物在临床上治疗RA有良好的效果，对控制病情和改善预后非常重要。(陈如平，王昌兴，王伟东。类风湿性关节炎中肿瘤坏死因子α的表达及意义。医学综述，2011年05期)。(朱江，王毅，张震宇，杨国夫，杨卫良；类风湿性关节炎及骨性关节炎关节滑液TNF-α水平的相关性，哈尔滨医科大学学报，2004年06期)

研究表明，银屑病皮损TNF-α的免疫反应性和生物学活性明显升高。冻融的银屑病皮损上清液含有大量的TNF-α；角质形成细胞、血管内皮细胞和表皮树突状细胞上的粘附分子表达增高，角质形成细胞和真皮血管内皮细胞上的TNF-α表达增高，提示TNF-α可能通过干预银屑病皮损区粘附分子表达而参与银屑病的发生。TNF-α是重要的促炎症性细胞因子，能促进Th1型的免疫反应，促进炎症细胞浸润与表皮细胞增生，导致更多的T细胞活化而引起放大效应。Kristensen等研究表明，在银屑病患者的皮肤损伤中发现高表达的TNF-α，且具有高于正常人的免疫反应性和生物学活性。以上研究都表明TNF-α与银屑病的发病密切相关。(管海宏，刘玉峰，沈柱.天然免疫紊乱与银屑病.国外医学皮肤性病学分册2005；31：285-287.)(Kristensen M，Chu CQ，Eedy DJ，et al.Localization of tumour necrosisfactor-alpha(TNF-α)and its receptors in nor-mal and psoriatic skin：epidermalcells express the 55-kDbut not the 75-kD TNF receptor.Clin Exp Immunol，1993，94：354-362.)(春玲，谢志宏.银屑病患者血清中细胞因子TNF-α和IL-6测定临床皮肤科杂志2000；29：276-277)。

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种慢性、进行性、致残性疾病，TNF-α是导致AS的主要致炎因子，抗TNF-α的靶向治疗成为AS主要治疗手段之一。(齐海宇等。肿瘤坏死因子-α抑制剂治疗强直性脊柱炎进展。中国医师进修杂志，2013，36：69-71页)。

克罗恩病患者存在严重的细胞免疫功能紊乱。TNF-a的含量明显升高，测定炎症因子的变化可以为克罗恩病的诊断提供依据。(李忆岚。血清TNF-a在克罗恩病中早期诊断的意义。中国伤残医学，2014(1))克罗恩病(CD)目前尚无有效治愈方法，抗TNF-α制剂的出现给CD的治疗带来了新的选择。(练晶晶，丁藜葭，陈世耀。抗TNF-α制剂治疗克罗恩病的系统评价，胃肠病学，2009)。

抗TNF-a治疗已经成为临床普遍接受的概念。至今已有5种TNF-α抑制剂，包括依那西普(etanercept)、英夫利西单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、戈利木单抗(golimumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)。这些单抗的靶点均为人体内的TNF-α。这些治疗药物的上市为TNF相关免疫治病的治疗提供了很好的手段。但同时，这些治疗方法也伴随着许多不良反应，包括过敏、抗药抗体的产生、发热、皮疹、腹泻等等，严重困扰着药物的使用，患者依从性不好。

发明内容

本发明的目的是提供一种全新的治疗方法，并提供了该疗法下的主要治疗装置。既然临床上抗TNF-α的治疗能够显著改善临床症状，那么同理，从人体内特异性地清除该物质在理论上也能发挥治疗效果，且可以避免药物进入体内产生的毒副作用。免疫吸附、亲和等特异性免疫学及化学手段为上述设想提供了有力的方法学和技术支撑。通过体外血浆/血液吸附的方式，将人体内的TNF-α捕获在吸附介质上，其余成份回输到人体，实现特异性清除体内治病因素的作用。

为实现这种效果，首先应该制备一个过滤吸附装置。

该装置首先包括一个壳体，用于装填吸附介质。壳体主要发挥盛装与支撑吸附介质的作用，因此在材质上可以是医学上可以接受的任何材质，可以是但不限于玻璃、金属、纤维、塑料等等。从功能角度出发，壳体的形状可以是但不限于柱状、盘状或其它可以实现相同功能的空心壳体形状。同时，为了实现吸附功能，该壳体还应有进液口和出液口，还应设置排气口。进液口和出液口的设置目的是为满足血浆或血液的进出，其在客体上的位置可以分别设置在但不限于壳体的两端或两侧。

该装置的另一个重要组成部分是吸附介质。

该介质的主要功能是在体外结合捕获TNF-α。为实现该功能，该介质上交联有能特异性结合TNF-α的物质，可以称其为捕获分子。TNF-α捕获分子可以是但不限于肿瘤坏死因子受体(TNFR)及其突变体、TNFR或其突变体的融合蛋白、TNF-α的抗体或者抗体片段、人工合成的合成的TNF-α配体等。进一步地，捕获分子可以是与已经上市的抗TNF-α的抗体药物结构一致或相似的物质。这些用于捕获分子交联或者连接到介质的基质上。因此，基质发挥的作用是作为捕获分子的载体，故此，其可以是但不限于树脂、纤维素、凝胶等材料中的一种或几种。

本发明所述吸附基质可以是多孔载体，捕获分子在吸附基质上的偶合密度可以在0.02-25mg/g湿基质之间。基质与捕获分子的结合或交联可以是但不限于共价结合或非共价结合，色谱技术领域中的蛋白固定化实践为本发明的设想提供了方法学的支撑，可以实现的方法有很多(曹黎明和陈欢林。酶的定向固定化方法及其对酶生物活性的影响。中国生物工程杂志。2003，1：22-28)。在本发明的一个实施方案中，以交联琼脂糖为载体基质，羰基二咪唑(CDI)用作活化试剂，反应快速，条件也不苛刻。未完全反应的CDI活化位点以水解方式释放活性，避免非特异性的吸附。

鉴于介质的作用是捕获血浆/血液中的TNF-α，其形状可以是但不限于球形、薄膜或束状。本发明采用的可分别识别TNF-α的捕获分子，可以是但不限于TNF-α抗体，可以是TNF-α受体或其它配体，还可以是上述这些分子突变体或融合蛋白。简单地说，能够与TNF-α发生结合的物质均可以用以实现本发明的目的，均属于本发明的范围。在吸附介质的制备中回避了静电作用，对白蛋白几乎没有吸附作用。吸附介质性能相对稳定，耐碱，可以重复使用。

作为吸附装置，可以在被吸附的血浆流出装置之前加装过滤除菌结构，比如一层或多层孔径为0.2-0.6微米的纤维滤膜，商业上可选对象很多。该除菌滤膜是接触人体血液治疗的仪器设备可选的常规性的部件，并不是本发明的重点，不影响本发明的创造性和实用性。在现实操作中，在装置的制造过程中可以在无菌的条件下进行，或者在制成后进行灭菌处理，因此，除菌过滤膜是可选而非必选组件。

上述装置可以与血浆分离机、血浆泵、血浆回输装置联合使用作为血浆吸附，也可以和血液泵联合使用实现血液灌注。作为血浆吸附时，实现血浆的特异性吸附和血浆回输；和血液泵连接使用时，实现血液的特异性过滤吸附和血液回输。

附图说明

图1是本发明过滤吸附装置的俯视图

图2是本发明过滤吸附装置的正视图

图3是本发明过滤吸附装置的切面图

图4是本发明过滤吸附装置的底视图

图5是使用本发明进行血浆过滤吸附的示意图

图6人血浆中TNF-α的清除效果.图中的1、2、3、4泳道分别对应原液、流出、洗脱1和洗脱2样品。

图7血浆吸附效果图。各个泳道1、2、3、4、5、6从左到右分别代表原液1/2浓度原液、流出液、洗1、洗2和分子量标准。

图8人血浆中白蛋白的吸附程度。各个泳道1、2、3、4、5从左到右分别代表原液1/2浓度原液、流出液、洗1、洗2和分子量标准。

具体实施例

本发明的部分实施例提供了实施本发明方案的实例及其效果，是为了更好地诠释本发明的实施，但并不是对本发明的限制。

实施例1：

根据发明的设计思路，本发明的血浆/血液吸附装置包括壳体和吸附介质组成。结合实施例的附图1到附图4，对本发明的一个实例阐述如下：壳体的进液端为圆形的顶盖，近中央位置为进液口，另外设有排气口。顶盖与壳体的主体部分通过螺旋扣连接。壳体的出液端是圆形的底盖，近中央位置设有出液口。底盖与壳体的主体部分通过螺旋扣连接。本实施例采用的吸附介质的基质是琼脂糖凝胶，市售品有多家商业化供应，可以方便地选择。当然，在其它实施本发明的实践中，基质也可以是纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶或是聚丙烯酸酯等。本实施例采用的捕获分子是人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白【分子的氨基酸序列与上市产品依那西普(商品名)结构相同，经基因工程方法制得该蛋白也已经是本专业领域的人员可以方便实现的】，采用了市售依那西普作为蛋白的来源。参考实施例2的方法将依那西普中的活性成分人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白偶联到活化的基质材料。参照图5，将吸附装置与血浆分离机(市售有多种型号)、血浆泵连接好，形成一个完整的治疗装置。血浆分离后，经过血浆泵进入到过滤吸附装置中，流经后者再回到人体。

在本实施例中所用的人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白作用是捕获TNF-α，在其他的实施例中人们可以采用已经上市的其它抗TNF-α的抗体药物分子作为捕获分子，如英夫利西单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、戈利木单抗(golimumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、CIMZIA等等，这些分子在市场上均可以方便获得。当然，其它所有能够与人TNF-α相结合的天然或人工蛋白分子均可以发挥该功能，均在本专利的保护范围内。

实施例2：

本实施例中，本发明的吸附介质为100μm左右的琼脂糖，将琼脂糖凝胶均匀分散在等体积的丙酮中，保证整个体系无水。以0.8g CDI作为活化剂，与凝胶悬液混合搅拌1小时，得到活化交联琼脂糖凝胶。在pH5-8条件下将10mL活化凝胶均匀分散到含有TNF-α受体-抗体融合蛋白(分子结构与商品名为依那西普的药物相同。当然，在实施本发明时，该捕获分子可以是说明书描述的其它形式)的溶液中，搅拌3h，获得携带捕获分子的TNF-α的吸附介质，其耦合密度为0.06mg/ml基质。将5ml制备的人II型肿瘤坏死因子吸附介质装于吸附装置内，将吸附装置与泵装置相连接。以50cm/min速率进入含800ng/mlTNF-α的300ml人血浆，血浆全部通过吸附柱后，并利用pH9碱洗和pH2酸洗将吸附在介质上的蛋白洗脱下来。利用Western-blot对原血浆液、吸附后流出的血浆和吸附介质洗脱后的洗脱液进行分析。Western-blot结果见图6。从分析结果可见，该吸附装置有效的去除了人血浆中的TNF-α，去除率约95％以上。

实施例3：

具体步骤同实施例2，区别在于本实施例中的琼脂糖粒径为500μm左右，将琼脂糖凝胶均匀分散在等体积的丙酮中，保证整个体系无水。以0.8g CDI作为活化剂，与凝胶悬液混合搅拌1小时，得到活化交联琼脂糖凝胶。在pH5-8条件下将10mL活化凝胶均匀分散到含有TNF-α受体-抗体融合蛋白的溶液中，搅拌3h，获得携带捕获分子的TNF-α的吸附介质，其耦合密度为0.4mg/ml基质。将5ml制备的人II型肿瘤坏死因子吸附介质装于吸附装置内，参考实施例1将吸附装置与泵装置相连接。以300cm/min速率进入含800ng/mlTNF-α的500ml人血液，血液全部通过吸附柱后，并利用pH9碱洗和pH2酸洗将吸附在介质上的蛋白洗脱下来。利用Western-blot对原血液、吸附后流出的血液和吸附介质洗脱后的洗脱液进行分析。Western-blot结果显示该吸附装置有效的去除了人血液中的TNF-α，去除率约93％左右。

实施例4：

以孔径为10nm的聚丙烯酸酯为吸附介质，首先用pH 5缓冲液冲洗聚丙烯酸酯微球，然后用NHS/EDC为活化剂在室温下搅拌30min活化微球。冲洗后与微球与TNF-α受体-抗体融合蛋白(分子结构与商品名为依那西普的药物相同。当然，在其它实施本发明的个例中，该捕获分子可以是说明书描述的其它形式)在室温下搅拌3h，获得耦合密度为0.8mg/ml的吸附介质，冲洗后待用。将5ml制备的人II型肿瘤坏死因子吸附介质装于吸附装置内，将吸附装置与泵装置相连接。以100cm/min速率进含1000ng/ml TNF-α的人血浆，血浆全部通过吸附柱后，并利用碱洗和酸洗将吸附在介质上的蛋白洗脱下来。利用Western-blot对原液、流出和洗脱液进行分析。Western-blot结果见图7。从分析结果可见，该吸附装置有效的去除了人血浆中的TNF-α，去除率约95％左右。

实施例5：

以80μm聚丙烯酸酯为吸附介质，首先用pH 5.3缓冲液冲洗聚丙烯酸酯微球，然后用NHS/EDC为活化剂在室温下搅拌30min活化微球。冲洗后与微球与TNF-α受体-抗体融合蛋白(分子结构与商品名为依那西普的药物相同。当然，在其它实施本发明的个例中，该捕获分子可以是说明书描述的其它形式)在室温下搅拌3h，获得耦合密度为1.2mg/ml的吸附介质，冲洗后待用。将5ml制备的人II型肿瘤坏死因子吸附介质装于吸附装置内，将吸附装置与泵装置相连接。以500cm/min速率进含1000ng/mlTNF-α的500ml人血浆，血浆全部通过吸附柱后，并利用碱洗和酸洗将吸附在介质上的蛋白洗脱下来。利用Western-blot对原液、流出和洗脱液进行分析。Western-blot分析结果显示该吸附装置有效的去除了人血浆中的TNF-α，去除率约95％左右，且白蛋白的吸附量低于5％。

实施例6：

以孔径为50nm的聚丙烯酰胺为吸附介质，以表面带羧基的聚丙烯酰胺固相微球为载体，通过碳二亚胺(EDC)活化。首先用pH7缓冲液冲洗微球，然后以EDC的用量为5mg/10mg微球的浓度对微球活化30min，然后冲洗活化微球。TNF-α受体-抗体融合蛋白(分子结构与商品名为依那西普的药物相同。当然，在其它实施本发明的个例中，该捕获分子可以是说明书描述的其它形式)在pH值为6.0的MES缓冲溶液中，将活化微球置于该溶液中进行偶联。在室温下搅拌反应时间为15h。耦合密度分别为3mg/ml，冲洗后待用。将5ml制备的人II型肿瘤坏死因子吸附介质装于吸附装置内，将吸附装置与血泵相连接。以200cm/min速率进人含400ng/mlTNF-α300ml血浆，血浆全部通过吸附柱后，用酸洗将吸附在介质上的蛋白洗脱下来。Western-blot结果表明该吸附装置有效的去除了人血浆中的TNF-α，去除率约94％左右。

实施例7：

以孔径为500μm的聚丙烯酰胺为吸附介质，以表面带羧基的聚丙烯酰胺固相微球为载体，通过碳二亚胺(EDC)活化。首先用pH6.5缓冲液冲洗微球，然后以EDC的用量为2mg/10mg微球的浓度对微球活化1h，然后冲洗活化微球。TNF-α受体-抗体融合蛋白(分子结构与商品名为依那西普的药物相同。当然，在其它实施本发明的个例中，该捕获分子可以是说明书描述的其它形式)在pH值为6.5的MES缓冲溶液中，将活化微球置于该溶液中进行偶联。在室温下搅拌反应时间为18h。耦合密度分别为1.8mg/ml，冲洗后待用。将5ml制备的人II型肿瘤坏死因子吸附介质装于吸附装置内，将吸附装置与泵相连接。以400cm/min速率进人含400ng/mlTNF-α400ml血液，血液全部通过吸附柱后，用酸洗将吸附在介质上的蛋白洗脱下来。Western-blot结果表明该吸附装置有效的去除了人血液中的TNF-α，去除率约93％左右。

实施例8：

以孔径为20nm的聚丙烯酰胺为吸附介质，通过碳二亚胺(EDC)活化。首先用pH7.5缓冲液冲洗微球，然后以EDC的用量为3mg/10mg微球的浓度对微球活化30min，然后冲洗活化微球。TNF-α受体-抗体融合蛋白(分子结构与商品名为依那西普的药物相同。当然，在其它实施本发明的个例中，该捕获分子可以是说明书描述的其它形式)在pH值为7的MES缓冲溶液中，将活化微球置于该溶液中进行偶联。在室温下搅拌反应时间为15h。耦合密度分别为2mg/ml，冲洗后待用。将5ml制备的人II型肿瘤坏死因子吸附介质装于吸附装置内，将吸附装置与泵相连接。以600cm/min速率进人含1000ng/mlTNF-α300ml血浆，血浆全部通过吸附柱后，用pH9洗液冲洗吸附介质上。Western-blot结果(图8)表明该吸附装置对白蛋白的吸附率低于5％。

Claims (5)

1.一种用于治疗与人α肿瘤坏死因子有关的免疫性疾病的体外血液灌注或血浆吸附的装置，至少包括壳体和吸附介质，其主要特征在于：

1)壳体的形状可以是盘状、柱状或其它可以接受的用于装填吸附介质的空心状壳体；

2)壳体的进液端设有血浆/血液入口和排气孔，壳体的出液端设有血浆/血液出口；

3)吸附介质是交联有可以与人α肿瘤坏死因子蛋白相结合的配体、受体或特异性抗体的基质。

2.权利要求1所述的血浆吸附、血液灌注装置，其又一个特征在于所述吸附介质的基质可以是树脂、纤维素、凝胶等材料中的一种或几种。

3.如权利要求1、2所述的装置，其吸附介质可以是球形颗粒、束状或者薄膜状。

4.如权利要求1、2、3所述的吸附装置，其吸附介质的基质上所结合的用于结合人α肿瘤坏死因子的配体可以是下列分子中的一种或几种：

1)人α肿瘤坏死因子受体及其各种突变体；

2)人α肿瘤坏死因子受体或其突变体的融合蛋白；

3)人α肿瘤坏死因子的抗体或抗体片段；

4)其它来源的人α肿瘤坏死因子的配体。

5.如权利要求1、2、3、4所述的装置在制备用于去除人血浆、血液中α肿瘤坏死因子的设备中的用途。