CN1250329C - 内毒素吸附剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种内毒素吸附剂及其制备方法。本发明是以天然高分子或合成高分子为载体，以二甲基胺作配体，并在二甲基胺的β位连有羟基，吸附剂的胺基含量为10-130μmol/g吸附剂。由于这种结构与内毒素之间可同时形成离子键、氢键、和八元环，且内毒素和吸附剂的疏水链处在八元环的同侧，因此对内毒素有较强的识别能力和吸附能力。吸附剂可用于生化制品中内毒素的去除，也可用于血液灌流去除患者血液中的内毒素，属于新一代产品，使用本发明毒副作用小，成本低，价格便宜，适合在国内推广。
Description
技术领域
本发明涉及生化分离和生物医用材料领域，特别是一种内毒素吸附剂及其制备方法。
背景技术
内毒素血症是由于革兰氏阴性菌外细胞壁上的内毒素释放到血液中引起的，可出现于多种疾病过程中[王今达，中国危重病急救医学，1998，10(10)：578]，如：大面积烧伤、重症肝炎、肝硬化等疾病，使机体免疫功能严重受损，并能引起休克、弥漫性血管内凝血、多器官功能衰竭等一系列严重的病理变化，最终导致器官坏死、不可逆休克和死亡。在美国每年都有超过十万人死于此病(Skelter et al，Arch.Microbiol.1995，164，383-389.)，临床上尚无有效的治疗方法。如何做到及时、有效地清除或破坏患者体内的内毒素，是治疗内毒素血症的关键问题。近年来国外研制了多种拮抗内毒素的分子生物制剂(Lopukhin M A，Am JGastroenterol，1997，68：345)，但由于抗体的生产工艺复杂、药源少、成本高，价格十分昂贵，且迄今为止尚无一种能够通过III期临床实验(姚咏明等.中国危重病急救医学，1999，11：456)。
对一些重大疑难性病症，血液净化疗法有着独特疗效，是临床治疗不可缺少的重要手段，其中血液灌流疗法是依靠吸附剂直接吸附除去血液中的有毒成份或致病物质，达到净化血液、缓解和治疗疾病的目的。国内外研究者已开始研究利用血液净化的方法治疗内毒素血症，张国华等人[中国危重病急救医学，1997，9(4)：193]曾使用活性炭对内毒素造模的动物进行全血灌流，发现有一定的效果。但由于活性炭是一种广谱吸附剂，在吸附内毒素的同时，不可避免的会吸附大量对人体有用的成分，且清除率较低。日本的研究人员将多粘菌素B涂附在血滤器中空纤维的内壁上，可以较好地清除血浆中的内毒素[Tani T，et al.，AtificialOrgans 22(12)：1038-1044(1998)]。但是多粘菌素B价格昂贵且具有肾毒性，如果从载体上脱落有毒副作用，并且上述方法需要将血浆与血球分离后，进行血浆灌流，费用十分昂贵，不适合在国内推广。
生物制品在生产过程中极易受到内毒素的污染，因而去除生物制品中的内毒素是生物医药领域一大难题。近年来，国内外学者在生物制品中去除内毒素方面取得了一些成就。常用的方法有超滤、两相萃取法、吸附法等，其中吸附法中的亲合吸附是选择性吸附内毒素的一种很有前景的方法，选用特定的吸附配体，选择性吸附内毒素。已报道的亲和配体有多粘菌素B、组胺酸、聚阳离子配体、脱氧胆酸等，配体主要通过离子键和疏水作用与内毒素结合，达到去除内毒素的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的内毒素吸附剂及其制备方法，该内毒素吸附剂使用了新型配体结构，对内毒素有较高识别能力和吸附能力，将其固定于天然高分子或合成高分子载体上，可用于生化制品和血液中内毒素的清除。
本发明是以球形天然高分子或合成高分子为载体，通过手臂连接配体构成的吸附剂，吸附剂的胺基含量为10-130μmol/g吸附剂。
所述的配体是二甲基胺；所述的手臂为饱和脂肪链；所述的球形载体为壳聚糖、琼脂、纤维素或聚甲基丙烯酸酯。
所述的二甲基胺的β位连有羟基。
所述的球形载体是聚甲基丙烯酸甲酯。
所述的饱和脂肪链是二胺。所述的二胺，为乙二胺，丙二胺、丁二胺、戊二胺或己二胺。
以球形聚甲基丙烯酸甲酯为载体的内毒素吸附剂的制备方法是经过下述步骤：
(1)载体球形聚甲基丙烯酸甲酯的合成
在含有0.1～0.5g过氧化苯甲酰(引发剂)的甲基丙烯酸甲酯和二乙烯苯混合液中加入到含有10～25％氯化纳和0.1～0.6％明胶的水相中，加入数滴0.05～0.2％次甲基兰，搅拌，升温至50～70℃，聚合1～3小时；再升温至72～78℃，聚合1～3小时；再升温至82～89℃，聚合1～3小时；再升温至92～98℃，恒温4～6小时。
(2)引入手臂
以DMF作溶剂，聚甲基丙烯酸甲酯树脂与过量的二胺反应，在100～150℃下反应7～10小时。
(3)环氧氯丙烷活化
上述产物中加入过量环氧氯丙烷和氢氧化钠溶液，溶胀过夜，在25～60℃下反应4～6小时，制得环氧氯丙烷活化产物。
(4)引入伯胺基
环氧氯丙烷活化产物与过量氨水或二胺反应，在100～150℃下反应7～10小时，得到的产物在环氧氯丙烷末端连上伯胺基。
(5)将伯氨基转化成叔胺基
加入过量甲酸和甲醛，加热至沸腾，至无气泡冒出，经水洗、乙醇洗涤，干燥得到端基为二甲基胺的吸附剂。
上述的制备方法各步骤的物料配比为：甲基丙烯酸甲酯：二乙烯苯(W∶W)为3～5∶7(g：g)；聚甲基丙烯酸甲酯树脂：二胺(W∶V)为1∶5～15(g：ml)；引入手臂的载体：环氧氯丙烷(W∶V)为：1∶5～20(g：ml)；环氧活化载体：氨或二胺(W∶V)为1∶5～15(g∶ml)；氢氧化钠溶液浓度为0.55mol/L，2～5ml；伯胺基的载体∶甲酸∶甲醛(W∶V∶V)为：1∶5～15∶5～15(g∶ml∶ml)。
球形壳聚糖为载体的内毒素吸附剂的制备方法是经过下述步骤：
(1)球形壳聚糖载体的合成
把壳聚糖醋酸水溶液，加入溶有0.5～2.5g Span 80的甲苯溶液中，搅拌0.5～2.5小时。缓慢滴加20～60ml戊二醛水溶液，升温至35～55℃，恒温0.5～1.5小时。加入氢氧化钠水溶液，调节反应体系的pH为弱碱性。升温至70～85℃，恒温3～5小时。用无水乙醇抽提产物，水洗，称重，筛分收集不同大小的载体。室温碱性条件下用NaBH4还原12～36h，洗净备用。
(2)环氧氯丙烷活化载体
上述产物中加入过量环氧氯丙烷、二甲亚砜和氢氧化钠溶液，溶胀过夜，在251～5％壳聚糖醋酸水溶液60℃下反应4～6小时，制得环氧氯丙烷活化产物。
以后各步合成方法同聚甲基丙烯酸甲酯载体(3)、(4)步。
上述的制备方法各步骤的物料配比为：壳聚糖：醋酸：水(W∶V∶V)为1～5∶3∶100(g∶ml∶ml)；壳聚糖载体：环氧氯丙烷：二甲亚砜(W∶V∶V)为1∶1～5∶5～10(g∶ml∶ml)，氢氧化钠2M，1～5ml；环氧活化载体：氨或二胺(W∶V)为1∶5～15(g∶ml)；伯胺基的载体∶甲酸∶甲醛(W∶V∶V)为：1∶5～15∶5～15(g∶ml∶ml)。
球形琼脂载体的内毒素吸附剂的制备方法是经过下述步骤
(1)制备球形琼脂载体：
将2～10％的琼脂水溶液加热熔化，倒入甲苯-四氯化碳体系中，加入吐温80，搅拌，使琼脂溶液在有机相中分散成液滴，60～90℃反应2～4小时，冷却后，倾倒出上层有机溶剂，筛选0.45～1.0mm的琼脂球，用水充分洗涤后，作为吸附剂载体。
(2)环氧氯丙烷活化载体：
载体在2M NaOH溶液中，30～50℃下与环氧氯丙烷反应1～4小时，用水洗至中性，除去未反应的环氧氯丙烷，得到环氧氯丙烷修饰的载体。
以后各步合成方法同聚甲基丙烯酸甲酯载体(3)、(4)步。
上述内毒素吸附剂的制备方法各步骤的物料配比为：甲苯：四氯化碳(V∶V)为1～4∶1(ml∶ml)；琼脂球：2M的NaOH：环氧氯丙烷(W：V∶V)为1∶1～4∶0.5～2(g∶ml∶ml)；环氧活化载体∶氨或二胺(W∶V)为1∶5～15(g∶ml)；伯胺基的载体∶甲酸∶甲醛(W∶V∶V)为：1∶5～15∶5～15(g∶ml∶ml)。
球形纤维素载体的内毒素吸附剂的制备方法是经过下述步骤
(1)纤维素载体的合成
棉短绒首先用1％次氯酸钠水溶液漂泊，再放入19％的氢氧化钠溶液中，室温浸泡2小时，挤干，密封，室温下老化三天，取小样测定干重，然后与计量的二硫化碳，25℃下反应5小时，得到橙红色粘稠液体；以氯代苯为分散介质，用四氯化碳调节分散介质比重，油酸钾为分散剂，粘胶液中加入碳酸钙粉末做为致孔剂，采用悬浮聚合方法，80～95℃反应1～3小时，水洗，用0.5N盐酸饱和氯化钙溶液(内含20％氯化钠)水解除去致孔剂，水洗至中性，筛分不同目数备用。
以后各步合成方法同琼脂载体(2)、(3)和(4)步。
上述内毒素吸附剂的制备方法各步骤的物料配比为：75～100％(W∶W)氯代苯、0～25％(W∶W)四氯化碳、0.2％(W∶W)油酸钾，组成有机分散相；称取有机相1/3重量的粘胶液，向其中加入0～10％(W∶W)的碳酸钙(60μm)粉末做为致孔剂；纤维素球：2M的NaOH：环氧氯丙烷(W∶V∶V)为1∶1～4∶0.5～2(g∶ml∶ml)；环氧活化载体：氨或二胺(W∶V)为1∶5～15(g∶ml)；伯胺基的载体∶甲酸∶甲醛(W∶V∶V)为：1∶5～15∶5～15(g∶ml∶ml)。
所述的内毒素吸附剂从生物制品中去除内毒素的方法是：室温下，将吸附剂直接加入含有内毒素的生物制品溶液中，振荡吸附15分钟，吸附剂：溶液(W∶V)为1∶20(g∶ml)，或吸附剂：血清(W∶V)为1∶4(g∶ml)。用动态法检测吸附前后内毒素浓度。
所述的内毒素吸附剂进行血液灌流的方法是：室温下，取吸附剂装入灌流柱内，内毒素血症患者的全血以15ml/min的流速灌流2小时，采用偶氮显色法检测吸附前后内毒素浓度；或室温下，将吸附剂直接加入含内毒素的血浆中，静态吸附20分钟。
本发明所制备的内毒素吸附剂，其间隔臂上具有极性和非极性基团间隔排列的结构。微多相表面假说(Microheterogeneous surface concept)认为，具有亲水/疏水微区结构的嵌段共聚物能显著抑制血小板的黏附和激活，在体内实验中呈现较好的抗凝血性能。许多人工合成的三嵌段共聚物已证实，这类材料具有良好的抗凝血性能。我们所合成的内毒素吸附剂的间隔臂上，也具有类似的亲水/疏水微区结构。这有利于改善吸附剂的血液相容性，使之可以临床应用。
本发明是以天然高分子或合成高分子为载体，以二甲基胺作配体，在二甲基胺的β位连有羟基。由于这种结构与内毒素之间可同时形成离子键、氢键、和八元环，且内毒素和吸附剂的疏水链处在八元环的同侧，因此对内毒素有较强的识别能力和吸附能力。这种配体结构，与同是二甲基胺作配体，β位上无羟基的结构相比较，前者比后者的吸附量高近10倍，说明离子键、氢键、疏水力和八元环的协同作用，比只靠离子键和疏水力对内毒素的识别和吸附作用更有效。计算机模拟结果显示，吸附剂上的羟基，只有在配体二甲基胺的β位时，才有如上所述的协同作用，见附图附表说明。吸附剂可用于生化制品中内毒素的去除，也可用于血液灌流法去除患者血液中的内毒素。
为了与传统内毒素吸附剂比较，我们以聚甲基丙烯酸甲酯为载体，合成了相同手臂，配体分别为组胺酸、赖氨酸和丙氨酸的吸附剂。经水相吸附实验测试，当配体含量固定时，β位联有羟基的二甲基胺配体吸附剂的吸附效果是以组胺酸为配体吸附剂吸附量的4.7倍、是以赖氨酸为配体吸附剂吸附量的4.2倍、是以丙胺酸为配体吸附剂吸附量的7.1倍。
本发明以二甲基胺为配体，并在其β位联有羟基的结构，使用了新型配体结构，对内毒素有较高识别能力和吸附能力，可通过手臂将这种结构引入到球形琼脂、纤维素、壳聚糖或聚甲基丙烯酸酯载体上，形成内毒素吸附剂，可用于生化试剂或血液中内毒素的清除。使用本发明毒副作用小，成本低，价格便宜，适合在国内推广。
附图说明
图1：吸附剂配体结构示意图。
图2二甲基胺的β位存在羟基时，计算机模拟离子键、氢键、疏水力和八元环的协同作用示意图。
图3：羟基处于不同位置时的氢键形成情况示意图。
具体实施方式：
本发明制备的内毒素吸附剂，在水相和血浆中，均对内毒素具有良好的吸附效果，可通过下述实施例予以说明，但不是对本发明作任何限制。
实施例1
1-1聚甲基丙烯酸酯载体的制备
在装有搅拌器、回流冷凝管、温度计的三口瓶中，将含有0.414g过氧化苯甲酰的甲基丙烯酸甲酯8.1g，和二乙烯苯18.8g混合液，加入到含有20％氯化纳和0.5％明胶的水相(体积为有机相的2～4倍)中，加入5～8滴0.1％次甲基兰。调节搅拌速度，待液珠大小合适，粒度均匀，升温至67℃，聚合两小时；再升温至75℃，聚合两小时；再升温至85℃，聚合两小时；再升温至95℃，恒温四小时，制得载体PMMA。经热水反复搓洗，无水乙醇抽提8小时后干燥，筛分收集粒径大小为280～900μm的载体备用。
1-2引入手臂
1-2-1称取1g PMMA，15ml DMF作溶剂，加入10ml 1，2-乙二胺，溶胀过夜。在130℃下反应9小时，制得1，2-乙二胺修饰的聚甲基丙烯酸甲酯。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。用酸碱滴定法测定伯胺基含量为95.4μmol/g。
1-2-2称取1g PMMA，15ml DMF作溶剂，加入10ml 1，3-丙二胺，溶胀过夜。在130℃下反应9小时，制得1，3-丙二胺修饰的聚甲基丙烯酸甲酯树脂。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。用酸碱滴定法测定伯胺基含量为94.7μmol/g。
1-2-3称取1g PMMA，15ml DMF作溶剂，加入10ml 1，4-丁二胺，溶胀过夜。在130℃下反应9小时，制得1，4-丁二胺修饰的聚甲基丙烯酸甲酯树脂。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。用酸碱滴定法测定伯胺基含量为89.6μmol/g。
1-2-4称取1g PMMA，15ml DMF作溶剂，加入10ml 1，5-戊二胺，溶胀过夜。在130℃下反应9小时，制得1，5-戊二胺修饰的聚甲基丙烯酸甲酯树脂。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。用酸碱滴定法测定伯胺基含量为90.5μmol/g。
1-2-5称取1g PMMA，15ml DMF作溶剂，加入10ml 1，6-己二胺，溶胀过夜。在130℃下反应9小时，制得1，6-己二胺修饰的聚甲基丙烯酸甲酯树脂。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。用酸碱滴定法测定伯胺基含量为93.2μmol/g。
1-3环氧氯丙烷活化
1-3-1称取1gl，2-乙二胺修饰的聚甲基丙烯酸甲酯树脂，加入2.5ml环氧氯丙烷，4ml浓度为0.55N氢氧化钠，40℃反应6小时，制得环氧氯丙烷化1，2-乙二胺修饰的聚甲基丙烯酸甲酯树脂。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。取1.0克洗净抽干的凝胶球，加入3.0毫升1.3M硫代硫酸钠溶液，滴入2滴溴代麝香草酚蓝指示剂(0.1％的20％乙醇溶液)。室温放置30分钟后，在电磁搅拌下用0.01M标准盐酸滴定至中性，溶液颜色由蓝变黄即为终点，并用1.0毫升未活化的凝胶载体为对照，由消耗的盐酸计算环氧基含量，得环氧固载量为88.2μmol/g。
1-3-2称取1g1，3-丙二胺修饰的聚甲基丙烯酸甲酯树脂，加入2.5ml环氧氯丙烷，4ml浓度为0.55N氢氧化钠，40℃反应6小时，制得环氧氯丙烷化1，3-丙二胺修饰的聚甲基丙烯酸甲酯树脂。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。测试方法同1-3-1，测得环氧固载量为87.3μmol/g。
1-3-3称取1g1，4-丁二胺修饰的聚甲基丙烯酸甲酯树脂，加入2.5ml环氧氯丙烷，4ml浓度为0.55N氢氧化钠，40℃反应6小时，制得环氧氯丙烷化1，4-丁二胺修饰的聚甲基丙烯酸甲酯树脂。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。测试方法同1-3-1，测得环氧固载量为85.2μmol/g。
1-3-4称取1g1，5-戊二胺修饰的聚甲基丙烯酸甲酯树脂，加入2.5ml环氧氯丙烷，4ml浓度为0.55N氢氧化钠，40℃反应6小时，制得环氧氯丙烷化1，5-戊二胺修饰的聚甲基丙烯酸甲酯树脂。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。测试方法同1-3-1，测得环氧固载量为83.2μmol/g。
1-3-5称取1g1，6-己二胺修饰的聚甲基丙烯酸甲酯树脂，加入2.5ml环氧氯丙烷，4ml浓度为0.55N氢氧化钠，40℃反应6小时，制得环氧氯丙烷化1，6-己二胺修饰的聚甲基丙烯酸甲酯树脂。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。测试方法同1-3-1，测得环氧固载量为81.4μmol/g。
1-4在环氧基团末端引入伯胺基
1-4-1称取1g1-3-1，加入10ml氨水，在130℃下反应9小时，在环氧基团末端引入伯胺基，得到β位存在羟基的伯胺载体球。用蒸馏水洗至中性，酸碱滴定法测得伯胺基含量为23.6μmol/g。
1-4-2称取1g1-3-2，加入10ml氨水，在130℃下反应9小时，在环氧基团末端引入伯胺基，得到β位存在羟基的伯胺载体球。用蒸馏水洗至中性，酸碱滴定法测得伯胺基含量为26.1μmol/g。
1-4-3称取1g1-3-3，加入10ml氨水，在130℃下反应9小时，在环氧基团末端引入伯胺基，得到β位存在羟基的伯胺载体球。用蒸馏水洗至中性，酸碱滴定法测得伯胺基含量为29.5μmol/g。
1-4-4称取1g1-3-4，加入10ml氨水，在130℃下反应9小时，在环氧基团末端引入伯胺基，得到β位存在羟基的伯胺载体球。用蒸馏水洗至中性，酸碱滴定法测得伯胺基含量为25.1μmol/g。
1-4-5称取1g1-3-5，加入10ml氨水，在130℃下反应9小时，在环氧基团末端引入伯胺基，得到β位存在羟基的伯胺载体球。用蒸馏水洗至中性，酸碱滴定法测得伯胺基含量为21.4μmol/g。
1-4-6称取1g1-3-1，加入10ml1，2-乙二胺，在130℃下反应9小时，在环氧基团末端引入乙二胺基团。用蒸馏水洗至中性，酸碱滴定法测得伯胺基含量为63.1μmol/g。
1-4-7称取1g1-3-2，加入10ml1，2-乙二胺，在130℃下反应9小时，在环氧基团末端引入乙二胺基团。用蒸馏水洗至中性，酸碱滴定法测得伯胺基含量为67.5μmol/g。
1-4-8称取1g1-3-3，加入10ml1，2-乙二胺，在130℃下反应9小时，在环氧基团末端引入乙二胺基团。用蒸馏水洗至中性，酸碱滴定法测得伯胺基含量为65.2μmol/g。
1-4-9称取1g1-3-4，加入10ml1，2-乙二胺，在130℃下反应9小时，在环氧基团末端引入乙二胺基团。用蒸馏水洗至中性，酸碱滴定法测得伯胺基含量为70.4μmol/g。
1-4-10称取1g1-3-5，加入10ml1，2-乙二胺，在130℃下反应9小时，在环氧基团末端引入乙二胺基团。用蒸馏水洗至中性，酸碱滴定法测得伯胺基含量为62.8μmol/g。
1-5将伯胺转化为叔胺
1-5-1称取1g1-4-1产物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加热至微沸，至无气泡冒出，停止反应。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。制得β位存在羟基的二甲基胺内毒素吸附剂。酸碱滴定法测得叔胺基含量为17.9μmol/g。
1-5-2称取1g1-4-2产物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加热至微沸，至无气泡冒出，停止反应。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。制得β位存在羟基的二甲基胺内毒素吸附剂。酸碱滴定法测得叔胺基含量为18.1μmol/g。
1-5-3称取1g1-4-3产物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加热至微沸，至无气泡冒出，停止反应。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。制得β位存在羟基的二甲基胺内毒素吸附剂。酸碱滴定法测得叔胺基含量为15.8μmol/g。
1-5-4称取1g1-4-4产物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加热至微沸，至无气泡冒出，停止反应。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。制得β位存在羟基的二甲基胺内毒素吸附剂。酸碱滴定法测得叔胺基含量为21.4μmol/g。
1-5-5称取1g1-4-5产物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加热至微沸，至无气泡冒出，停止反应。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。制得β位存在羟基的二甲基胺内毒素吸附剂。酸碱滴定法测得叔胺基含量为13.6μmol/g。
1-5-6称取1g1-4-6产物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加热至微沸，至无气泡冒出，停止反应。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。酸碱滴定法测得叔胺基含量为63.0μmol/g。
1-5-7称取1g1-4-7产物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加热至微沸，至无气泡冒出，停止反应。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。酸碱滴定法测得叔胺基含量为57.1μmol/g。
1-5-8称取1g1-4-8产物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加热至微沸，至无气泡冒出，停止反应。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。酸碱滴定法测得叔胺基含量为60.3μmol/g
1-5-9称取1g1-4-9产物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加热至微沸，至无气泡冒出，停止反应。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。酸碱滴定法测得叔胺基含量为56.2μmol/g
1-5-10称取1g1-4-10产物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加热至微沸，至无气泡冒出，停止反应。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。酸碱滴定法测得叔胺基含量为59.1μmol/g
实施例2
2-1壳聚糖树脂的制备
向5％壳聚糖醋酸水溶液(5g壳聚糖+3ml冰醋酸+100ml水)，加入溶有1g Span 80的300ml甲苯溶液中，搅拌1.5小时。缓慢滴加50ml 50％戊二醛水溶液，升温至50℃，恒温1.0小时。加入氢氧化钠水溶液，调节反应体系的pH为弱碱性。升温至80℃，恒温4小时。用无水乙醇抽提产物，水洗，称重，筛分收集粒径大小为280～900μm的载体。室温碱性条件下用NaBH4还原24h，洗净备用。用酸碱滴定法测得剩余氨基的含量为101.3～120.7μmol/g。
2-1环氧活化
1g壳聚糖树脂，加入5ml二甲亚砜，2ml2M的氢氧化钠，3ml环氧氯丙烷，40℃反应4小时。得到环氧活化载体，用水洗涤至中性，并彻底洗去剩余的环氧氯丙烷。用1-3-1方法测定环氧的固载量为112.6μmol/g。
2-3在环氧基团末端引入伯胺基
2-3-1称取1g环氧氯丙烷化产品，加入10ml氨水，在130℃下反应9小时，在环氧基团末端引入伯胺基，得到β位存在羟基的伯胺载体球。用酸碱滴定法测定伯胺基含量为35.6μmol/g。
2-3-2称取1g环氧氯丙烷化产品，加入10ml1，2-乙二胺，在130℃下反应9小时，在环氧基团末端引入乙二胺基团。用酸碱滴定法测定伯氨基含量为94.2μmol/g。
2-4将伯胺转化为叔胺
2-4-1称取1g2-3-1产物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加热至微沸，至无气泡冒出，停止反应。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。制得β位存在羟基的二甲基胺内毒素吸附剂。用酸碱滴定法测定叔胺基含量为30.2μmol/g。
2-4-2称取1g2-3-2产物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加热至微沸，至无气泡冒出，停止反应。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。用酸碱滴定法测定叔胺基含量为89.6μmol/g。
实施例3
3-1球形琼脂载体的制备
将500ml三口瓶置于60℃水浴中，向瓶内加入100ml甲苯，50ml四氯化碳，0.5ml吐温80，均匀搅拌。称取4克琼脂粉加入蒸馏水30ml，加热熔化，将熔化的琼脂倒入甲苯-四氯化碳体系中，搅拌，使琼脂溶液在有机相中分散成大小适宜的液滴。冷却到室温，倾倒出上层有机溶剂，筛选粒径大小为280～900μm的琼脂球，用水洗涤后，移入锥形瓶，4℃湿态保存。
3-2环氧氯丙烷活化
取琼脂球20.0克，加入29.6毫升2M的氢氧化钠，再加入13.3毫升的环氧氯丙烷，在40℃下反应2小时，用水洗涤至中性，并彻底洗去剩余的环氧氯丙烷，得到环氧活化的凝胶球，用1-3-1测试方法测得环氧基固载量为110.2μmol/g凝胶球。
3-3在环氧基团末端引入伯胺基
3-3-1称取1g环氧氯丙烷化产品，加入10ml氨水，在130℃下反应9小时，在环氧基团末端引入伯胺基，得到β位存在羟基的伯胺载体球。伯胺基含量为33.5μmol/g。
3-3-2称取1g环氧氯丙烷化产品，加入10ml1，2-己二胺，在130℃下反应9小时，在环氧基团末端引入己二胺基团。伯胺基含量为78.4μmol/g。
3-4将伯胺转化为叔胺
3-4-1称取1g3-3-1产物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加热至微沸，至无气泡冒出，停止反应。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。制得β位存在羟基的二甲基胺内毒素吸附剂。叔胺基含量为27.9μmol/g。
3-4-2称取1g3-3-2产物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加热至微沸，至无气泡冒出，停止反应。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。叔胺基含量为71.2μmol/g。
实施例4
4-1球形纤维素载体的制备
将棉短绒加入到8倍(重量比)1％的次氯酸钠水溶液中，用盐酸溶液调节PH＝7～8，滴加5％尿素，棉短绒被漂白，水洗，挤干。经漂白的棉短绒在19％的氢氧化钠溶液中室温浸泡2小时，挤干，放入广口瓶中，加盖，室温下放置老化三天。取小样，酸中和，水洗后烘干，计算实际干重。向老化后的碱棉花中加入计算量的二硫化碳(二硫化碳V＝碱棉花干重g/2)，密封，25℃振荡5小时，得到橙红色粘稠液体。根据碱棉干重，用6％氢氧化钠溶液稀释得到浓度为6～12％的粘胶液。
在500ml三口瓶中，加入氯苯160ml，四氯化碳40ml，油酸钾0.4克，搅拌约30分钟至均匀。称取60克脱脂棉的粘胶液，加入一定量300目CaCO3粉末，并搅拌均匀。调节搅拌速度，用玻璃漏斗将粘胶液缓慢加入三口瓶，使粘胶液分散成大小适宜的液滴。室温下恒速搅拌30分钟以上，观察液滴分散情况。以约2℃/min的速度缓慢升高水浴温度，升至90℃保温2.5小时。撤去恒温水浴，搅拌下自然冷却至室温，倾倒出上层有机溶剂，用大量自来水冲洗合成的载体至无氯苯味，用蒸馏水洗涤数遍，筛选出粒径大小为280～900μm的载体备用。
4-2环氧氯丙烷活化
取1g抽干的10％凝胶载体，加入2.0ml3.0M的NaOH和1.0ml环氧氯丙烷，40℃摇床振荡下反应2.5小时。用水洗涤至中性，并彻底洗去剩余的环氧氯丙烷，得到环氧活化的凝胶球，测试方法同1-3-1，环氧基固载量为82μmol/g凝胶球。
4-3在环氧基团末端引入伯胺基
4-3-1称取1g环氧氯丙烷化产品，加入10ml氨水，在130℃下反应9小时，在环氧基团末端引入伯胺基，得到β位存在羟基的伯胺载体球。用酸碱滴定法测定伯胺基含量为30.5μmol/g。
4-3-2称取1g环氧氯丙烷化产品，加入10ml1，2-己二胺，在130℃下反应9小时，在环氧基团末端引入己二胺基团。用酸碱滴定法测定伯胺基含量为62.4μmol/g。
4-4将伯胺转化为叔胺
4-4-1称取1g4-3-1产物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加热至微沸，至无气泡冒出，停止反应。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。制得β位存在羟基的二甲基胺内毒素吸附剂。用酸碱滴定法测定叔胺基含量为22.6μmol/g。
4-4-2称取1g4-3-2产物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加热至微沸，至无气泡冒出，停止反应。经水洗、乙醇洗涤，干燥备用。用酸碱滴定法测定叔胺基含量为53.2μmol/g。
实施例5
血液相容性实验
分别取实施例1、2、3制备的吸附剂各2毫升，在生理盐水中浸泡12小时后装入灌流柱内，用注射器注入5毫升混有抗凝剂的兔子全血，以15ml/min的流速灌流2小时。同时以一空灌流柱作为对照柱。通过MEK-6318K血细胞分析仪测定灌流前后血液各成分的变化。结果表明，灌流前后，各种血液成分变化不大，下降的百分数均在5％以内，这表明该系列吸附剂具有较好的血液相容性，可用于全血灌流。
实施例6
内毒素的初始浓度和吸附量的关系
6-1称取0.050gl-5-5加入1ml含有10EU内毒素的水溶液中，震荡15min，用动态浊度法检测吸附前后内毒素含量。计算得附剂吸附量为110EU/g。
6-2称取0.050g1-5-10加入1ml含有117EU内毒素的水溶液中，震荡15min，用动态浊度法检测吸附前后内毒素含量。计算得附剂吸附量为1142EU/g。
从上述例子可以看到，在吸附剂用量固定的基础上(均为0.050g)，随着内毒素初始浓度的增加，单位吸附剂的吸附量也成倍增长甚至指数增长。这是由于当内毒素浓度较大时，吸附剂所吸附的内毒素分子上的带负电的磷酸根基团可以通过溶液中的阳离子为“桥梁”，与溶液中的内毒素分子缔合，形成一个大的分子囊团，这无形中增大了吸附剂的表观吸附能力[Seydel，U.et al，Immunobiology 1993.187，191-211]。因此在高浓度下具有较强吸附能力的吸附剂，在低浓度下的吸附能力不一定强。内毒素血症患者血液中内毒素浓度比较低，一般低于1EU/ml。为了考察吸附剂的吸附能力，我们的吸附试验，在低内毒素浓度下进行。水相中内毒素初始浓度定为10EU/ml，血相中内毒素初始浓度低于3EU/ml。(浓度再低，误差较大)。
实施例7
水相中内毒素的吸附实验
7-1称取0.050g1-5-5加入1ml含有10EU内毒素的水溶液中，震荡15min，用动态浊度法检测吸附前后内毒素含量。计算得附剂吸附量为110EU/g，而吸附剂叔胺基含量14.0μmo/g，所以每μmol配体吸附量为7.84EU。
7-2称取0.05g1-5-10加入1ml含有10EU内毒素的水溶液中，震荡15min，用动态浊度法检测吸附前后内毒素含量。计算得吸附剂吸附量为73EU/g，而吸附剂叔胺基含量59.1μmo/g，所以每μmol配体吸附量为1.24EU。
动物血浆中内毒素的吸附实验
7-3称取0.050克壳聚糖载体吸附剂，加入1毫升内毒素血症模型大白鼠的血浆，室温振荡20分钟，采用偶氮显色法检测吸附前后内毒素浓度。吸附前血浆中内毒素浓度0.479EU/ml，吸附后0.117EU/ml，清除率75.6％。(正常大白鼠血浆中内毒素浓度为0.18～0.22EU/ml。)
7-4称取0.100克壳聚糖载体1-5-3吸附剂，加入0.400毫升内毒素血症模型大白兔的血浆，室温振荡20分钟，采用偶氮显色法检测吸附前后内毒素浓度。吸附前血浆中内毒素浓度2.58EU/ml，吸附后0.57EU/ml。清除率77.9％。
实施例8
我们采用sybyl 6.3软件(Tripos公司)构建了β位亲核基团模型，对其进行分子力学计算，力场采用Tripos力场。全部计算在南开大学伯龄楼507室SGI Indigo II工作站上完成。计算中所选用的各项参数，除非特别指明，都采用缺省值。计算机模拟结果见表1。我们选择叔胺基团作为端基官能团，讨论了位于端基官能团的不同位置的羟基对内毒素吸附的影响。因为氢键是有方向性和饱和性的，只有位于端基的β位的羟基氧原子才可与磷酸根上的羟基氢原子形成氢键。
表1：计算机模拟羟基在不同位置时氢键的形成情况
| 羟基位置 | 氢原子位置 | 氧原子位置 | 氢键 | 氢键长度 |
| α位β位γ位 | 在内毒素分子上在吸附剂上在内毒素分子上在吸附剂上在内毒素分子上在吸附剂上 | 在吸附剂上在内毒素分子上在吸附剂上在内毒素分子上在吸附剂上在内毒素分子上 | 不能形成不能形成能形成不能形成不能形成不能形成 | 0.978 |
Claims (10)
1、一种内毒素吸附剂，其特征在于它是以球形天然高分子或合成高分子为载体，通过手臂连接配体构成的吸附剂，吸附剂的胺基含量为10-130μmol/g吸附剂；
所述的配体是二甲基胺；所述的手臂为饱和脂肪链；所述的球形载体为壳聚糖、琼脂、纤维素或聚甲基丙烯酸酯。
2、按照权利要求1所述的内毒素吸附剂，其特征在于所述的二甲基胺的β位连有羟基。
3、按照权利要求1所述的内毒素吸附剂，其特征在于所述的球形载体是聚甲基丙烯酸甲酯。
4、按照权利要求1所述的内毒素吸附剂，其特征在于所述的饱和脂肪链是二胺。
5、按照权利要求4所述的内毒素吸附剂，其特征在于所述的二胺为乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺或己二胺。
6、权利要求3所述的球形聚甲基丙烯酸甲酯为载体的内毒素吸附剂的制备方法，其特征在于经过下述步骤：
(1)载体球形聚甲基丙烯酸甲酯的合成
在含有0.1～0.5g过氧化苯甲酰引发剂的甲基丙烯酸甲酯和二乙烯苯混合液中加入到含有10～25％氯化钠和0.1～0.6％明胶的水相中，加入5～8滴0.05～0.2％次甲基兰，搅拌，升温至50～70℃，聚合1～3小时；再升温至72～78℃，聚合1～3小时；再升温至82～89℃，聚合1～3小时；再升温至92～98℃，恒温4～6小时；
(2)引入手臂
以二甲亚砜作溶剂，聚甲基丙烯酸甲酯树脂与过量的二胺反应，在100～150℃下反应7～10小时；
(3)环氧氯丙烷活化
上述产物中加入过量环氧氯丙烷和氢氧化钠溶液，溶胀过夜，在25～60℃下反应4～6小时，制得环氧氯丙烷活化产物；
(4)引入伯胺基
环氧氯丙烷活化产物与过量氨水或二胺反应，在100～150℃下反应7～10小时，得到的产物在环氧氯丙烷末端连上伯胺基；
(5)将伯胺基转化成叔胺基
加入过量甲酸和甲醛，加热至沸腾，至无气泡冒出，经水洗、乙醇洗涤，干燥得到端基为二甲基胺的吸附剂；
各步的物料配比：甲基丙烯酸甲酯∶二乙烯苯为3～5∶7，克/克；聚甲基丙烯酸甲酯树脂∶二胺为1∶5～15，克/毫升；引入手臂的载体∶环氧氯丙烷为：1∶5～20，克/毫升；氢氧化钠溶液浓度为0.55mol/L；环氧活化载体∶氨或二胺为1∶5～15，克/毫升；伯胺基的载体∶甲酸∶甲醛为：1∶5～15∶5～15，克/毫升/毫升。
7、权利要求1所述的球形壳聚糖为载体的内毒素吸附剂的制备方法，其特征在于是经过下述步骤：
(1)球形壳聚糖载体的合成
把壳聚糖醋酸水溶液，加入溶有0.5～2.5g司盘-80的甲苯溶液中，搅拌0.5～2.5小时，缓慢滴加20～60ml戊二醛水溶液，升温至35～55℃，恒温0.5～1.5小时，加入氢氧化钠水溶液，调节反应体系的pH为弱碱性，升温至70～85℃，恒温3～5小时，用无水乙醇抽提产物，水洗，称重，筛分收集不同大小的载体，室温碱性条件下用NaBH4还原12～36h，洗净备用；
(2)环氧氯丙烷活化载体
上述产物中加入过量环氧氯丙烷、二甲亚砜和氢氧化钠溶液，溶胀过夜，在1～5％壳聚糖醋酸水溶液60℃下反应4～6小时，制得环氧氯丙烷活化产物；
以后各步合成方法同权利要求6所述的聚甲基丙烯酸甲酯载体(4)、(5)步；
各步的物料配比：壳聚糖∶醋酸∶水为1～5∶3∶100，克/毫升/毫升；壳聚糖载体∶环氧氯丙烷∶二甲亚砜为1∶1～5∶5～10，克/毫升/毫升，氢氧化钠2M；环氧活化载体∶氨或二胺为1∶5～15，克/毫升；伯胺基的载体∶甲酸∶甲醛为：1∶5～15∶5～15，克/毫升/毫升。
8、权利要求1所述的球形琼脂载体的内毒素吸附剂的制备方法，其特征在于是经过下述步骤：
(1)制备球形琼脂载体：
将2～10％的琼脂水溶液加热熔化，倒入甲苯-四氯化碳体系中，加入吐温80，搅拌，使琼脂溶液在有机相中分散成液滴，60～90℃反应2～4小时，冷却后，倾倒出上层有机溶剂，筛选0.45～1.0mm的琼脂球，用水充分洗涤后，作为吸附剂载体；
(2)环氧氯丙烷活化载体：
载体在2M NaOH溶液中，30～50℃下与环氧氯丙烷反应1～4小时，用水洗至中性，除去未反应的环氧氯丙烷，得到环氧氯丙烷修饰的载体；
以后各步合成方法同权利要求6所述的聚甲基丙烯酸甲酯载体(4)、(5)步；
各步的物料配比：甲苯∶四氯化碳为1～4∶1，毫升/毫升；琼脂球∶2M的NaOH∶环氧氯丙烷为1∶1～4∶0.5～2，克/毫升/毫升；环氧活化载体∶氨或二胺为1∶5～15，克/毫升；伯胺基的载体∶甲酸∶甲醛为：1∶5～15∶5～15，克/毫升/毫升。
9、权利要求1所述的球形纤维素载体的内毒素吸附剂的制备方法，其特征在于是经过下述步骤：
(1)纤维素载体的合成
棉短绒首先用1％次氯酸钠水溶液漂白，再放入19％的氢氧化钠溶液中，室温浸泡2小时，挤干，密封，室温下老化三天，取小样测定干重，然后与计量的二硫化碳，25℃下反应5小时，得到橙红色粘稠液体；以氯代苯为分散介质，用四氯化碳调节分散介质比重，油酸钾为分散剂，粘胶液中加入碳酸钙粉末做为致孔剂，采用悬浮聚合方法，80～95℃反应1～3小时，水洗，用0.5N盐酸饱和氯化钙溶液，内含20％氯化钠，水解除去致孔剂，水洗至中性，筛分不同目数备用；
以后各步合成方法同权利要求8所述的琼脂载体(2)、(3)和(4)步；
各步的物料配比：75～100％氯代苯、0～25％四氯化碳、0.2％油酸钾，重量比，组成有机分散相；称取有机相1/3重量的粘胶液，向其中加入0～10％重量比的碳酸钙粉末做为致孔剂；纤维素球∶2M的NaOH∶环氧氯丙烷为1∶1～4∶0.5～2，克/毫升/毫升；环氧活化载体∶氨或二胺为1∶5～15，克/毫升；伯胺基的载体∶甲酸∶甲醛为：1∶5～15∶5～15，克/毫升/毫升。
10、一种使用权利要求1所述的内毒素吸附剂从生物制品中去除内毒素的方法，其特征在于：室温下，将吸附剂直接加入含有内毒素的生物制品溶液中，振荡吸附15分钟，吸附剂∶溶液为1∶20，克/毫升，用动态法检测吸附前后内毒素浓度。
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