CN117088962B - 一种重组人血清白蛋白纯化过程中内毒素的去除工艺 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种重组人血清白蛋白纯化过程中内毒素的去除工艺，属于生物工程技术领域。本申请提供的重组人血清白蛋白纯化过程中内毒素的去除工艺，在纯化前期通过加热、离心、过滤去除宿主菌体和其他微生物，再通过阴离子层析、疏水层析和阳离子层析初步去除内毒素，最后通过内毒素去除层析去除残留内毒素，从而将内毒素含量控制在要求范围内，内毒素去除层析中采用聚ε‑赖氨酸作为配基，采用流穿层析法，聚ε‑赖氨酸能够有效吸附内毒素，从而实现内毒素的有效去除，并保证重组人血清白蛋白较高的收率。本申请方案提供的内毒素去除工艺，对重组人血清白蛋白的纯化具有重要的参考意义，且具有重要的产业应用价值，能够显著提高生产收益。

Description

一种重组人血清白蛋白纯化过程中内毒素的去除工艺
技术领域
本申请涉及一种重组人血清白蛋白纯化过程中内毒素的去除工艺，属于生物工程技术领域。
背景技术
内毒素是革兰氏阴性菌细胞外壁的组成成分，污染的器具、冲洗系统、生物制品如重组人血清白蛋白表达生产过程中，会有大量的内毒素产生和残留，因此内毒素几乎无处不在。内毒素由多糖和脂质部分共价连接组成，其主要的化学成分是脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）。细菌LPS结构分三个部分：脂质A（lipid A），核心寡糖（Core），由相同的寡糖单位重复组成的O-特异性糖链（O-specific chain）。脂质A是内毒素的毒性中心，决定着细菌的致病性，其成分是由氨基葡萄糖双糖构成的亲水性骨架和疏水性脂肪酸链组成的磷脂。即使在相同的细菌中也几乎不能发现脂质A的单一化学结构，尽管它们的结构形式相互不同，但脂质A区域全部被部分磷酸化，Lipid A分子可与阳离子发生相互作用，是基于其分子上带有大量负电荷的磷酸基团，从而发挥其物理特性及生物学功能，又由于脂多糖结构中类脂A的疏水性，使得内毒素倾向于以高分子聚合物的状态存在而难溶于水，并由于环境中Ca2+、Mg2+等被吸引到带负电荷的脂多糖上而得以稳定，通常其分子量几十万至上百万道尔顿（Da）。
人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA）是由585个氨基酸组成的单链非糖基化的可溶性多肽，分子量为66.6kDa，占血浆总蛋白的60%左右，而HSA除存在于血浆中外，还存在于组织、身体的分泌液、皮肤和淋巴腔中。在人的正常生理条件下，HSA具有维持血浆胶体渗透压、营养和促进伤口愈合的作用，而且其作为载体物质，参与诸多生物分子如激素、生物学活性物质及药物在血液中的运输。因此，HSA是一种重要的医用蛋白质，在临床上主要用于治疗因失血、烧伤、烫伤、整形外科手术及脑损伤引起的低蛋白血症以及肝硬化、肾水肿等，在临床上需求量很大。随着基因重组技术的发展，通过基因工程获得重组人血清白蛋白（recombinant Human Serum Albumin，rHSA）并通过进一步纯化以获得HSA成为如今的热门领域。
而基因工程获得的重组人血清白蛋白的过程为非最终灭菌产品，其发酵和纯化工艺复杂，有许多环节会将革兰氏阴性菌带入，从而在重组人血清白蛋白原液中快速地大量繁殖，在菌体死亡裂解时则会释放出大量的内毒素，上述的内毒素污染情况会伴随整个生产过程而存在。而研究发现，LPS可作用到身体的每一个器官、组织系统，其产生的病理生理学影响如发热、心跳过速、白血球减少症、骨髓坏死、低血压及弥漫性血管内凝血（DIC）等，甚至引起脓毒症，最终可能导致器官衰竭而发生死亡。
而重组人血清白蛋白产品在临床使用过程中，其注射液规格一般为10g/50ml，单支注射剂量大，导致其相较于其他小剂量的生物制品，内毒素限度的控制更为严格，作为注射剂量大的重组人血清白蛋白产品，其内毒素必须控制更低水平，才能保证使用的安全性，因此重组人血清白蛋白纯化过程中内毒素的去除工艺非常必要，而整个内毒素去除工艺中，残留内毒素的去除使重组人血清白蛋白产品合格更是重中之重。
杨代常、施波等人在专利CN201210559390中提到了一种从转基因水稻种子的蛋白粗提液中分离纯化重组人血清白蛋白的层析方法，将重组人血清白蛋白粗提取物经阳离子交换层析，在缓冲液中加入乙醇以去除内毒素，但是在基因工程毕赤酵母发酵液分离纯化重组人血清白蛋白过程中，缓冲液加入乙醇后，乙醇的存在会造成鲎试剂不凝，无法检出，而更换缓冲体系，将乙醇利用超滤置换掉之后检测，内毒素的含量反而会有所很高，猜测乙醇的加入，可造成料液中的部分革兰氏阴性菌的死亡，释放出菌体内的内毒素。罗天学、罗培文等人在专利CN2018104710527B中公开了一种生物制品通过阴离子交换层析与羟基磷灰石层析的内毒素去除方法，其中阴离子交换层析只能去除带有负电荷的内毒素，去除效果有限，重组人血清白蛋白羟基磷灰石层析在磷酸盐体系下，通过实验验证，可以起到宿主蛋白（HCPs）以及降解片段的去除效果，无法起到良好的内毒素去除效果。发明人进一步通过实验验证发现，羟基磷灰石可以起到对白蛋白多聚体的去除效果，但也对白蛋白吸附明显，不仅不易淋洗，而且导致目的蛋白收率较低。
现有技术中，去除内毒素的常见方法有碱液裂解法、活性炭吸附法、应用多粘菌素B吸附法等，然而这些方法存在对内毒素去除能力有限的问题，或者存在非特异性吸附强的问题，过多的非特异性吸附会导致重组人血清白蛋白收率降低，导致使其无法用于重组人血清白蛋白制品中内毒素的去除，而对于应用于实际工业生产过程中的纯化工艺，除杂效果所影响的产品品质问题，以及目的蛋白收率所影响的收益问题一直都是倍受关注且又非常关键的问题。因此，目前亟需一种重组人血清白蛋白纯化过程中去除内毒素的工艺方法，既要能保证重组人血清白蛋白的收率，又要能有效去除革兰氏阴性菌菌体死亡释放的内毒素。
发明内容
为了解决上述问题，提供了一种重组人血清白蛋白纯化过程中内毒素的去除工艺，该内毒素的去除工艺首先在纯化前期控制菌体含量以及内毒素含量，然后通过阴离子层析、疏水层析和阳离子层析初步去除内毒素，然后仍旧残留部分内毒素难以去除，因此采用内毒素去除层析对内毒素的含量进行控制，实现重组人血清白蛋白产品中内毒素含量满足要求，提高了重组人血清白蛋白的安全性。
本申请提供了一种重组人血清白蛋白纯化过程中内毒素的去除工艺，包括以下步骤：
1）将含有重组人血清白蛋白的发酵液加热灭活，加入硫酸铵沉淀后再次进行碟片离心，离心清液除菌过滤后超滤换液浓缩；
2）将步骤1）所得样品依次上样进行阴离子层析、疏水层析和阳离子层析；
3）将步骤2）所得样品进行内毒素去除层析；
所述内毒素去除层析为流穿层析法，所述内毒素去除层析介质的配基为聚ε-赖氨酸，所述内毒素去除层析介质的基质为聚丙烯酸酯、聚苯乙烯或纤维素。
ε-聚赖氨酸是一种由25~35个L-赖氨酸残基组成的，分子量大约为2500-4500 Da的单体聚合物。经过进一步研究发现 L-赖氨酸残基是通过ɛ-NH2与α-COOH脱水缩合而成，因此其肽键为ɛ型，小鼠毒性试验表明，作为一种食品防腐剂及添加剂，ɛ-聚赖氨酸无毒副作用，即使人体内有多余的ɛ-聚赖氨酸的积累也会分解为人体必需的赖氨酸，后者可完全被消化吸收。
现有技术中ε-聚赖氨酸对内毒素的吸附作用有所报道，但是尚没有公开报道用于层析过程中用于去除内毒素，并且由于层析过程中还需要考虑ε-聚赖氨酸与基质的作用、ε-聚赖氨酸对人血清白蛋白的影响等因素。本申请方案中，ε-聚赖氨酸被共价固定在基质颗粒上，用于选择性吸附重组人血清白蛋白溶液中的内毒素，使得纯化后的重组人血清白蛋白内毒素含量安全，从而可以作为静脉注射用药物大剂量使用。具体的，在本申请方案中，内毒素去除层析中，固定在基质上的ε-聚赖氨酸能在中性pH时，将内毒素的浓度降低至0.25EU/mL以下，并且不影响酸性蛋白质rHSA的回收，保证目的蛋白的高收率。
可选的，所述加热采用65~68℃保温1h，灭活去除不嗜热的微生物菌体芽孢，同时把发酵过程伴随产生的蛋白酶灭活，防止目的蛋白的降解。
可选的，所述碟片离心，离心机中喷嘴直径为1.0~2.0mm，转速10000~12000rpm，进液压力0.008~0.02MPa，进液流量600~700L/h，清液压力0.3~0.5MPa，清液流量350~450L/h，调整发酵液的固含为25~30%；
可选的，所述除菌过滤选用0.22μm科百特或零界PES过滤滤芯。
可选的，所述阳离子层析为SP层析，阳离子层析中洗杂用缓冲溶液中含有非离子表面活性剂，优选的，所述洗杂用缓冲溶液中非离子表面活性剂的含量不低于0.1wt%，更优选的，所述洗杂用缓冲溶液中非离子表面活性剂的含量不低于0.5wt%，更优选的，所述洗杂用缓冲溶液中非离子表面活性剂的含量不低于0.8wt%，更优选的，所述洗杂用缓冲溶液中非离子表面活性剂的含量不低于1wt%，更优选的，所述洗杂用缓冲溶液中非离子表面活性剂的含量不低于0.1wt%。
可选的，所述非离子表面活性剂的含量为1~5wt%，优选的，所述非离子表面活性剂的含量为1~3wt%，优选的，考虑到成本问题和内毒素去除效果，所述非离子表面活性剂的含量为1wt%。
可选的，所述非离子表面活性剂为TritonX-114、TritonX-110、Tween-20、Tween-80中的一种或多种。
可选的，所述非离子表面活性剂为TritonX-114。
SP层析中洗杂用缓冲溶液中含有TritonX-114（聚乙二醇叔辛基苯基醚），TritonX-114同时具备亲水端与疏水端，是一种非离子表面活性剂，具有很强的漂洗功能，发明人在开发和实验过程中发现，在SP吸附模式下，在洗杂液中添加适量的TritonX-114，可将层析填料吸附的内毒素优先解吸掉，并且对目的蛋白的影响很小，使得内毒素的去除效果显著改善，而基本不会对目的蛋白重组人血清白蛋白的收率产生影响，能够明显提高内毒素的去除效果。
可选的，阳离子层析中洗杂用缓冲溶液中还含有氯化钠和醋酸，优选的，所述氯化钠浓度为0.1~0.3M，所述醋酸浓度为15~25mM，优选的，所述氯化钠浓度为0.2±0.05M，醋酸浓度为20±2mM。
可选的，阳离子层析中洗脱用缓冲溶液中含有氯化钠、PB和乙醇，优选的，所述氯化钠浓度为0.4~0.6M，PB浓度为18~22mM。
可选的，阳离子层析中平衡缓冲液含有醋酸，优选的，所述醋酸浓度为18~22mM。
可选的，所述内毒素去除层析介质的基质为聚丙烯酸酯。聚丙烯酸酯作为亲水性基质，不含有苯环等疏水性强的化学结构，可以减少对rHSA的特异性吸附，内毒素的毒性中心是脂质A，其成分含有由氨基葡萄糖双糖构成的亲水性骨架，聚丙烯酸酯可以对内毒素起到一定的吸附性。
可选的，所述步骤3）中所用的平衡缓冲液和淋洗缓冲液均为氯化钠、PB的混合液，所述氯化钠、PB的混合液的pH为7.0±0.05。
固定在基质上的ε-聚赖氨酸，其支链中有大量氨基，等电点pH 9.0，所处于的缓冲液在pH 9.0以下配体ε-聚赖氨酸表现出带正电，大部分内毒素分子的等电点在pH 2.0左右，所处于的缓冲液在pH 2.0以上，内毒素脂质A区域被部分磷酸化，将会令内毒素分子的磷酸基团带有大量负电荷，从而被配体ε-聚赖氨酸的氨基捕获，PB磷酸盐体系显然最适合内毒素分子的这一磷酸化特征，PB体系的缓冲范围为pH6.0-8.0，缓冲液的pH范围既要远大于2.0，又要远小于9.0。
可选的，所述氯化钠、PB的混合液的pH为7.0。
可选的，所述氯化钠、PB的混合液中，氯化钠浓度为0.1±0.05M，PB浓度为20±3mM。
rHSA等电点pH 4.9，pH为7.0条件下，rHSA表现出带负电荷，所以也会被带正电荷的ε-聚赖氨酸的氨基吸附，然而当增加PB或者氯化钠的浓度时，内毒素去除层析介质对rHSA的吸附明显会增加，虽然会相应地增加内毒素的去除率，但是会降低rHSA的收率。
可选的，所述氯化钠、PB的混合液中，氯化钠浓度为0.1M，PB浓度为20mM。
可选的，所述步骤3）中内毒素去除层析过程循环上样重复2~4次。
可选的，为了保证内毒素含量处于更低水平，所述步骤3）中内毒素去除层析过程循环上样重复3次。
可选的，所述循环上样过程中还包括对内毒素去除层析柱的清洗步骤，所述清洗步骤先后分别采用高盐溶液和碱液清洗内毒素，优选的，所述清洗步骤先后分别采用氯化钠溶液和氢氧化钠溶液清洗内毒素。
由于基质键合的ε-聚赖氨酸配体密度是一定的，当原液中的内毒素与配体结合完全后，填料去除内毒素的能力达到饱和，继续上样含有内毒素的料液，内毒素含量不会降低，此时需要使用高盐对填料进行洗脱，可将内毒素解析，然后使用碱液清洗再生。
可选的，所述清洗步骤中，氯化钠溶液的浓度为1±0.5M；
可选的，所述清洗步骤中，氢氧化钠溶液的浓度为0.3±0.2M。
可选的，所述洗杂用缓冲液还包括氯化钠和醋酸；
优选的，氯化钠浓度为0.2±0.05M，醋酸浓度为20±2mM。
可选的，所述步骤2）中疏水层析和阳离子层析之间还包括超滤换液步骤，使用30KD的超滤膜可以将缓冲液置换为内毒素去除层析柱所用缓冲液，同时可以将分子量小于30KD的内毒素分子去除掉。
可选的，所述超滤换液中滤膜为30KD。
可选的，所述步骤1）中硫酸铵沉淀加入硫酸铵固体，并控制硫酸铵饱和度为35%~45%。
可选的，缓慢加入所述硫酸铵固体。
可选的，所述硫酸铵沉淀步骤完成后，将发酵液冷却至0~5℃，静置6~18h。
由于发酵液中含有较多且比较复杂的杂蛋白，本申请中使用价格低廉的中性盐硫酸铵，采取简单的盐析沉淀方法进行去除，加入硫酸铵时遵循缓慢均匀少量多次，接近计划饱和度时，加盐的速度更缓慢，能尽量避免局部浓度过大而造成不应有的产品蛋白质沉淀。由于硫酸铵的亲水性大于蛋白质亲水性，加入大量中性盐硫酸铵后，硫酸铵夺走水分子，可以破坏水膜，又能中和电荷，从而使得杂蛋白质分子即盐析形成沉淀，盐析后再低温放置一段时间，待沉淀完全后即进行离心以去除沉淀，之后取上清液备用，考虑到人血清白蛋白与杂蛋白共沉淀的影响，发明人通过研究发现，硫酸铵的浓度不应过高，硫酸铵的饱和度超过40%后，目标蛋白回收率开始下降。
本申请的有益效果包括但不限于：
1．根据本申请的重组人血清白蛋白纯化过程中内毒素的去除工艺，采用内毒素去除层析步骤，并对所用填料和层析条件进行优化，能够有效去除内毒素并且保证较高的目的蛋白收率。
2．根据本申请的重组人血清白蛋白纯化过程中内毒素的去除工艺，通过前期控制发酵液中菌体含量并且减少菌体裂解暴露过多内毒素，中期通过各层析步骤去除其他杂质进行纯化的同时，去除大部分内毒素，后期通过专门的内毒素去除层析，去除残留的少量难以去除的内毒素，使得制备的重组人血清白蛋白产品中内毒素含量达到安全标准含量。
3．根据本申请的重组人血清白蛋白纯化过程中内毒素的去除工艺，对中期层析过程中的阳离子SP层析进行优化处理，通过在洗杂缓冲液中添加适量TritonX-114，在保证目的蛋白收率基本不产生较大的影响的同时，显著提高内毒素的去除效果。
4．根据本申请的重组人血清白蛋白纯化过程中内毒素的去除工艺，不仅能够明显提高重组人血清白蛋白产品的使用安全性，并且降低生产成本、提高生产收益，对工业发酵生产重组人血清白蛋白具有重要的应用价值，对重组人血清白蛋白的纯化相关研究也具有重要的参考意义。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为本申请方案涉及的ɛ-聚赖氨酸的化学结构式示意图（n取值为25~35范围内的整数）；
图2为本申请方案测试例1中鲎试剂凝胶法检测不合格样品结果示意图；
图3为本申请方案测试例1中鲎试剂凝胶法检测合格样品结果示意图；
图4为本申请方案实施例2中样品（f）液相检测纯度图谱；
图5为本申请方案实施例2中样品（h）液相检测纯度图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例、对比例、测试例和实验例详述本申请方案，但本申请方案并不局限于这些实施例，如无特别说明，本申请中的实施例中采用的原料、催化剂和其他材料均通过商业途径购买。
本申请方案所涉及的技术术语如下：
重组人血白蛋白（rHSA）：是指通过重组技术将编码人血清白蛋白（HSA）的DNA导入到合适的宿主细胞中，在适于表达的条件下培养该细胞，从而产生的重组人血清白蛋白。
热原（pyrogen）：是指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质，包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。注射液中的热原主要是指细菌性热原，为某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。
内毒素（LPS，也称脂多糖）：其来自革兰阴性菌的外膜，结构包含3个区域，类脂A区、核心多糖区和特异性多糖区，为热原的一种。
离子交换层析介质：是以聚合物为基质，且该基质经过表面亲水改性后再键合离子交换基团形成，其具备对生物活性大分子良好的生物相容性和物化稳定性。
多粘菌素B（Polymyxin B Sulfate）：多粘菌素系由多粘芽胞杆菌（bacilluspolymyxa）产生的一组多肽类抗生素。
ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine，简称ε-PL）：如图1所示，为一种含有25~30个赖氨酸残基的同型单体聚合物，是一种具有抑菌功效的多肽。
磷酸缓冲液（PB，Phosphate Buffer），是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，通常使用的有磷酸钠缓冲液（NaH2PO4&Na2HPO4）和磷酸钾缓冲液（K2HPO4&KH2PO4)，由于它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广。在本申请中，所述的氯化钠、PB的混合液为氯化钠和PB的混合溶液，由氯化钠和PB（磷酸缓冲液）两组成分混合而成。
本申请中所述的重组人血清白蛋白（rHSA）是指通过基因重组技术产生的人血清白蛋白（HSA），即将编码HSA的基因序列导入到合适的宿主细胞中，在适宜的条件下培养宿主细胞，HSA的基因在宿主细胞中表达，从而产生rHSA。所述的宿主细胞选自细菌如大肠杆菌和枯草杆菌、酵母如啤酒酵母、巴斯德毕赤酵母，优选的微生物为巴斯德毕赤酵母。
本申请中所述的单位mM为mmol/L，单位M为mol/L。
本申请中所述的含有重组人血清白蛋白发酵液的生产方式可以采用本领域常用的技术手段，本申请方案中采用的生产方式具体参见专利CN 116082490A一种利用毕赤酵母高效生产重组人血清白蛋白的发酵方法中公开内容。
由于重组人血白蛋白生产过程中的发酵和纯化工艺比较复杂，其中有许多环节会将革兰氏阴性菌持续带入，比如纯化过程中投料操作过程、管道连接、设备管道清洗死角、使用分析纯级别的物料、原液检测的取样过程等，而革兰氏阴性菌可在重组人血清白蛋白的原液中大量繁殖，随着层析缓冲液条件的改变，会使其大量死亡，从而导致内毒素进而释放进入原液。
因此对于在临床中使用剂量较高的重组人血清白蛋白而言，内毒素的控制水平是至关重要的问题，因此这也对重组人血清白蛋白的纯化过程提出了较高的要求，尤其是其中内毒素的去除，现有技术中通过普通的提纯手段虽然也能够去除部分内毒素，然而现有技术中有些方式会使得菌体大规模裂解而暴露出大量的内毒素导致去除效果差，有些方式则无法达到较高的内毒素去除率，有些方式则针对内毒素的去除过于繁复，导致目的蛋白的收率非常低，因此亟需一种工艺简单成本低、内毒素去除效果好且保证较高目的蛋白收率的适用于大规模工业生产应用的内毒素去除工艺。
为此，本申请中，发明人通过前期控制发酵液中菌体的含量，避免菌体大规模死亡裂解暴露过多内毒素，并且通过阴离子层析、疏水层析和阳离子层析在纯化过程中先去除大部分内毒素，最后针对纯化后期中小含量存在的内毒素去除难度大的问题，提出了一套结合ε-聚赖氨酸与层析技术的去除方法，通过这一整套从发酵液处理到重组人血清白蛋白产品的纯化工艺，使得最终产品中内毒素含量低，满足安全使用标准，并且纯化工艺简单，操作难度小，并且获得了较高的目的蛋白收率。
发明人在研究过程中发现，现有技术中使用的原液碱液裂解法，在去除内毒素过程中，会存在pH突然升高的现象导致局部蛋白变性，从而导致目的蛋白重组人血清白蛋白的收率明显降低，并且该方法还存在操作风险大的问题，并且该方法对小含量残留内毒素的去除效果也不明显。为了解决上述问题，发明人经过广泛的实验研究，开发出一种重组人血清白蛋白纯化过程中内毒素的去除效果显著的工艺方法。
本申请方案中，内毒素去除率计算公式为：（上样前的内毒素总含量-上样后的内毒素总含量）/上样前的内毒素总含量*100%，目的蛋白的收率计算公式为：收样后的总蛋白量/上样前的总蛋白量*100%。
下面通过具体实施例、对比例、测试例和实验例对本申请技术方案进行说明。
实施例1发酵液预处理和内毒素初步去除
发酵放罐得到表达量7.8g/L的发酵液1500L，设置发酵液收集罐搅拌转速为100rpm，加入10~15mM的辛酸钠、1~3mM半胱氨酸，65~68℃加热保温1h后降温至15℃，开启搅拌100rpm，缓慢加入硫酸铵至饱和度为40%，4℃静置12h后离心，离心机选用喷嘴直径为1.0mm，转速12000rpm，进液压力0.02MPa，进液流量600~700L/h，清液压力0.4MPa，清液流量350~450L/h，调整发酵液的固含为25~30%，保证菌体去除干净后收集离心清液，使用5支20英寸1微米PES滤芯，10支20英寸0.45微米PES滤芯以及20支20英寸0.22微米PES滤芯过滤，使用30KD超滤系统，PB浓度为50mM，pH6.5的缓冲液换液5~7CV后浓缩，获得预处理后的194L样品（a），浓度为14.26 g/L，HPLC液相检测样品纯度为84.24%，凝胶限度检测法检测内毒含量为1024~2048 EU/ml。
使用600×700mm层析柱装填80Q阴离子交换层析介质，装柱高度300±10mm，对称因子：0.8~1.5，塔板数＞6000N/M。样品（a）上样到已用50mM的PB溶液（pH6.5）平衡好的80Q填料层析柱中，上样后先用氯化钠、PB缓冲溶液洗杂，后用氯化钠、PB缓冲溶液洗脱后，收集获得洗脱液；其中平衡与再平衡用PB溶液的浓度为50mM，pH6.5；洗杂用缓冲溶液中氯化钠浓度为0.15M，PB浓度为50mM，pH6.5；洗脱用缓冲溶液中氯化钠浓度为0.5M，PB浓度为50mM，pH6.5，同时收集洗脱液获得206L样品（b）；rHSA浓度为12.13g/L，液相检测纯度为83.74%；检测内毒素含量为256~512 EU/ml。
使用600×700mm层析柱装填UniHR Butyl 80L 疏水层析介质，装柱高度210±10mm，对称因子：0.8~1.5，塔板数＞6000N/M。样品（b）上样到已用0.3M氯化钠、50mM PB缓冲溶液（pH6.0）平衡好的butyl填料层析柱中，使用0.3M氯化钠、50mM PB缓冲溶液（pH6.0）洗涤后收集获得样品（c），其体积为325L，rHSA浓度为6.50g/L，液相检测纯度为94.81%；检测内毒素含量为64~128 EU/ml。
样品（c）使用30KD超滤系统用20mM醋酸，pH4.5换液5次后浓缩，透过排废，收集回流液获得样品（d），其体积为161L，rHSA浓度为12.89g/L，检测内毒素含量为128~256 EU/ml。
使用600×700mm层析柱装填NanoGel 50SP 离子交换层析，装柱高度250±10mm，对称因子：0.8~1.5，塔板数＞6000N/M。样品（d）上样到已用20mM醋酸，pH4.5缓冲液平衡好的阳离子50SP层析柱，再平衡用醋酸溶液的浓度为20mM，pH4.5±0.05；洗杂用缓冲溶液中氯化钠浓度为0.2M，醋酸浓度为20mM，TritonX-114为1%，pH4.5；再次使用0.2M氯化钠，20mM醋酸，pH4.5的缓冲液清洗层析柱；洗脱用缓冲溶液中氯化钠浓度为0.5M，PB浓度为20mM，pH7.6。同时收集洗脱液获得样品（e），其体积为87L，rHSA浓度为19.69 g/L，液相检测纯度为98.69%；检测内毒素含量为8~16 EU/ml。
表1 发酵液前期处理和层析去除效果
实施例1中各步骤内毒素去除效果的统计结果如上表1所示，根据表1结果可知，通过发酵液的前期处理和控制，能够将发酵液中菌体含量控制在较低的水平，并且减少了因菌体死亡裂解暴露过多内毒素导致去除难度增加的情况，根据样品（e）结果分析可知，经过实施例1中处理后内毒素已被大部分去除，残留剩余20~40 EU/ml的内毒素，此部分残留的内毒素难以去除，发明人对此继续进行研究，以去除剩余的这小部分内毒素，从而使得重组人血清白蛋白产品达到安全使用的标准。
实验例1SP阳离子层析中添加不同浓度的TritonX-114
发明人在针对内毒素的去除研究过程中发现，在上述层析步骤中的阳离子SP层析的吸附模式下，在洗杂缓冲液中添加适量的TritonX-114，可将层析填料吸附的内毒素优先解吸掉，而对目的蛋白的影响很小，能够使得内毒素的去除效果显著改善，并且保证较高的目的蛋白重组人血清白蛋白收率。
此对比例条件与实施例1基本相同，不同之处在于，SP阳离子层析中，洗杂缓冲液中添加不同浓度的Triton X-114，具体的实验条件如下：
本实验过程中，选用16mm柱子，装填高度25cm，装至50mL，用20mM醋酸，pH4.5缓冲液平衡层析柱5CV后上样，用醋酸溶液的浓度为20mM，pH4.5再平衡层析柱5CV；洗杂用缓冲溶液中氯化钠浓度为0.2M，醋酸浓度为20mM，TritonX-114分别采用0%、0.1%、1%、2%、3%冲洗层析柱3CV；使用0.2M氯化钠，20mM醋酸，pH4.5的缓冲液清洗层析柱2CV；洗脱用缓冲溶液中氯化钠浓度为0.5M，PB浓度为20mM，pH7.6。
表2TritonX-114不同浓度条件设置
发明人在本实验案例中发现，如果在阳离子层析SP结合模式中，在洗杂缓冲液中添加适量TritonX-114，可以有效提高内毒素的去除效果，并且对目的蛋白的收率不会产生明显影响，发明人发现在SP模式下添加TritonX-114，存在目标蛋白不易洗脱的问题，导致蛋白收率稍微偏低，但是对目的蛋白的收率影响不大，但是却能明显提高内毒素的去除效果。
实验例2 内毒素去除层析介质的筛选
发明人继续针对实施例1中残留的少量难去除的内毒素，通过层析方法进行内毒素的去除，同时还要兼顾目的蛋白的收率以及内毒素去除后的含量合格，由此发明人开展了一系列采用层析步骤中内毒素吸附填料的筛选实验以及对应的层析条件优化实验。
1）与聚ε-赖氨酸配体搭配的基质的筛选
本实验过程中，选用16mm柱子，装填高度50mm，装至10mL，选用对于重组人血清白蛋白最为温和的中性pH下的PB缓冲体系进行实验。其中，实验过程中的三款填料均为聚ε-赖氨酸为配体，不同之处在于GZQ070261的基质为聚苯乙烯，GZQ070262的基质为聚丙烯酸酯，Cellufine ET clean L的基质为纤维素，其中编号为GZQ070262的填料为于苏州纳微科技股份有限公司量产定制的UniGel ® ET Removal层析介质。
表3 填料筛选实验结果
填料名称 线性流速(cm/min) 保留时间(min) 缓冲体系 上样前体积（ml） 上样前内毒素（EU/ml） 上样后体积（ml） 上样后内毒素（EU/ml） 内毒素去除率（%） 收率（%）
GZQ070261 1 5 0.1M Nacl＋20mMPB pH 7.0 100 50-100 144 32-64 7.84 86.59
GZQ070262 1 5 0.1M Nacl＋20mM PB pH 7.0 100 100-200 112 32-64 64.13 99.17
CellufineET clean L 1 5 0.1M Nacl＋20mM PB pH 7.0 100 125-250 157 32-64 6.07 96.24
GZQ070261 0.5 10 0.1M Nacl＋20mM PB pH 7.0 100 125-250 158 16-32 14.78 88.01
GZQ070262 0.5 10 0.1M Nacl＋20mM PB pH 7.0 100 125-250 151 16-32 80.67 98.93
CellufineET clean L 0.5 10 0.1M Nacl＋20mM PB pH 7.0 100 125-250 152 16-32 12.22 97.35
内毒素去除层析步骤中，发明人选择聚ε-赖氨酸作为配体，并对与之配合三种基质进行了对比和筛选，所采用的三种基质分别为聚苯乙烯、聚丙烯酸酯和纤维素，具体对比了不同填料之间、不同保留时间以及相同填料、不同保留时间的实验结果，去除效果如上表3所示。
通过表3中实验结果可知，以聚ε-赖氨酸作为配体、聚丙烯酸酯作为基质制备的填料，在内毒素的去除率上最高，并且目的蛋白的收率也最高，目的蛋白损失最少且内毒素去除明显。
2）放大实验条件优化
2.1）层析步骤中流速优化
发明人基于选择的聚ε-赖氨酸与聚丙烯酸酯搭配的GZQ070262填料，即UniGel ®ET Removal层析介质，进行方法实验结果验证，并基于实验结果对内毒素去除工艺继续进行优化，优化实验中条件如表4所示。
表4 方法效果验证实验结果
通过50mm装柱，进一步放大填料体积之后，内毒素的去除率随保留时间的延长而增加，然而当保留时间继续增长后，内毒素的去除率并不会进一步提高，发明人通过试验筛选出了最佳的上样线性流速为0.5cm/min（30cm/h），此时能够在保证层析时间短的同时还能取得较好的内毒素去除效果。
2.2）增加清洗步骤并采用循环上样
在研究中发明人发现，聚ε-赖氨酸与聚丙烯酸酯搭配的填料，在内毒素层析过程中会对上样载量有一定的要求，当配基聚ε-赖氨酸结合内毒素分子达到了饱和后，继续上样或者增加保留时间已然无法继续对内毒素起到更好的去除效果。
发明人发现，继续增加保留时间，内毒素的去除效果并没有明显改善，直接原因是聚丙烯酸酯上键合的聚ε-赖氨酸对内毒素的吸附已经基本达到饱和，为了提高对内毒素的吸附去除效果，发明人进一步优化，具体采用循环上样并在循环上样过程中增加对聚ε-赖氨酸与聚丙烯酸酯层析介质的清洗操作，其中清洗步骤包括：配制1M氯化钠清洗液，氢氧化钠配制罐配制0.5M氢氧化钠溶液，氯化钠清洗液和氢氧化钠溶液先后分别冲洗5CV，最后采用注射用水冲洗5CV。
进一步，考虑到层析柱与填料的规格与投入成本，还采用重复上样的方式提高内毒素的去除效果，表5中记载了2次上样后的实验结果数据。
表5填料循环上样实验条件结果
通过表5数据可知，通过增加一步中间清洗步骤后，再次重复上样，而两次上样的保留时间均为50min，可以明显提高内毒素的去除率，使得内毒素的含量降低至0.25EU/ml以下，且还能保证目的蛋白的收率仍保持较高水平。由此推断如果再次增加一次上样即采用三次循环上样，重组人血清白蛋白产品中的内毒素含量会处于更加安全的范围内，对于循环上样的次数以及清洗操作可根据实际操作过程中的情况和需要，操作人员对此可以根据需要具体设计循环重复上样的次数等条件。
实验例2 内毒素去除层析条件的优化
在确定了层析介质以及整体层析步骤后，发明人继续对层析条件进行优化，具体针对层析过程中所使用的缓冲液（平衡缓冲液和淋洗缓冲液）浓度进行筛选和优化。
发明人通过前期实验验证发现，层析缓冲液采用氯化钠、PB混合液能够保证内毒素的有效去除，且能够获得较高的目的蛋白收率，然而当增加PB或者氯化钠的浓度时，内毒素去除层析介质的去除率会有上升的趋势，但是填料对rHSA的吸附却明显会增加，这虽然会相应地增加内毒素的去除率，但是却会降低rHSA的收率，因此有必要对层析过程所使用的缓冲液进行优化。
表6 缓冲液浓度筛选
填料名称 线性流速(cm/min) 保留时间(min) 缓冲体系 上样前体积（ml） 上样前内毒素（EU/ml） 上样后体积（ml） 上样后内毒素（EU/ml） 内毒素去除率（%） 收率（%）
UniGel ®ET Removal 0.5 50 0.1M Nacl＋50mM PB pH7.0 500 32-64 485 4-8 87.88 93.20
UniGel ®ET Removal 0.5 50 0.15M Nacl＋20mM PB pH 7.0 500 32-64 430 4-8 89.25 85.09
UniGel ®ET Removal 0.5 50 0.1M Nacl＋20mM PB pH 7.0 500 32-64 528 4-8 86.80 98.61
根据表6结果可知，当内毒素层析步骤中所述缓冲液，氯化钠浓度0.1M、PB浓度20mM时能够保证较高的收率，且能够达到不错的内毒素去除率，再结合多次循环上样并配合清洗内毒素层析柱层析介质以提高去除效果的方式，能够保证控制内毒素含量在安全、符合标准的范围内。表6数据显示，缓冲体系的不同条件设置，对内毒素的去除效率影响不大，但是却会对目的蛋白的收率产生较大的影响，在此处选择氯化钠浓度0.1M、PB浓度20mM的条件，虽然内毒素的去除效果不是最佳，但是却能够保证较高的目的蛋白收率，结合实验例2中对内毒素层析步骤的优化，通过循环上样结合清洗也能够保证内毒素的去除效果，从而能够实现既能保证内毒素的去除效果，又能保证目的蛋白较高收率，发明者还发现多次循环上样后，内毒素层析介质还可以有效去除产品中的多聚体与降解片段，可以起到提高产品液相纯度的效果。
实施例2 内毒素去除层析具体步骤
使用APPS PROCESS DN10层析系统，与SAC-bio-100手动层析柱（100*750mm）相连，将UniGel ET Removal 填料进行装柱，装柱柱高380±10mm。氯化钠配制罐配制0.1M氯化钠、20mM PB、pH7.0的缓冲液100L。采用0.1M氯化钠、20mM PB、pH7.0的缓冲液平衡5CV至基线平衡。
取上样液（e）6L使用30KD膜包超滤换液浓缩后获得3L样品（f），rHSA浓度为39.06g/L，液相检测纯度为99.09%，内毒素检测含量为40-80 EU/ml；再将样品（f）以30cm/min的线性流速上样，上样完成后，使用0.1M氯化钠、20mM PB、pH7.0的缓冲液顶洗至UV曲线与基线平行，收集流穿液，获得流穿样品（g）。
氯化钠配制罐配制1M氯化钠清洗液，氢氧化钠配制罐配制0.5M氢氧化钠溶液，分别冲洗5CV，最后注射用水冲洗5CV。重复上述内毒素去除层析操作，进行两次循环上样后，获得4L流穿样品（h），rHSA浓度为27.57 g/L，液相检测纯度为99.92%，收率为94.11%，内毒素检测含量小于0.25 EU/ml。
测试例1 凝胶限度实验验证目的蛋白内毒素含量合格
将上述实施例中样品（f）和（h）作为供试品溶液。
取鲎试剂18支，折断安瓿颈，其中2支为阴性对照管，2支为阳性对照管，2支为供试品管，2支为供试品阳性对照管，2支为供试品稀释20倍阳性对照管，2支为供试品稀释20倍管，2支为供试品稀释40倍管，2支为供试品稀释80倍管，2支为供试品稀释160倍管。
阴性对照，2支分别加入0.2ml细菌内毒素检查用水，封闭管口，做好标记，在旋涡混合器上混合30秒。
供试品管，向已加入0.1ml细菌内毒素检查用水的10支安瓿中分别加入0.1ml的供试品溶液和稀释倍数为20倍、40倍、80倍、160倍的供试品溶液，封闭管口，做好标记，在旋涡混合器上混合30秒。
供试品阳性对照，取0.3ml供试品溶液，再加入0.3ml 1EU/ml的内毒素溶液，在旋涡混合器上混合30秒，作为供试品阳性对照液。再取0.3ml 稀释倍数为20倍的供试品溶液，再加入0.3ml 1EU/ml的内毒素溶液，在旋涡混合器上混合30秒，作为供试品稀释20倍阳性对照液。向已加入0.1ml细菌内毒素检查用水的4支安瓿中分别加入0.1ml供试品阳性对照液和供试品稀释20倍阳性对照液，封闭管口，做好标记，在旋涡混合器上混合30秒。
阳性对照，向已加入0.1ml细菌内毒素检查用水的2支安瓿中分别加入0.1ml0.5EU/ml细菌内毒素溶液，封闭管口，做好标记，在旋涡混合器上混合30秒。
将上述18支安瓿瓶垂直放入37℃±1℃的恒温水浴箱中60min±2min，水浴过程中不可振动，以免造成假阴性。
阴性结果，缓慢倒转试管180度，形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（-）。
阳性结果，缓慢倒转试管180度，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）。
本申请中的凝胶限度试验分析，供试品两管有一管呈阳性（+），一管为（-），按上述方法进行复试。复试供试品做4管，4管中有1为（+），即判为不符合规定。4管均为阴性则合格。
阳性对照和供试品阳性对照任何一管为（-）或阴性对照为（+），试验无效。
表7 凝胶限度试验结果
分析表7结果可知，采用本申请方案经过UniGel ET Removal填料吸附，可将内毒素去除至合格范围内，且通过凝胶限度试验验证。
对比例1 碱液裂解法
现有技术中专门针对内毒素的去除多采用碱液裂解法，本对比例中所采用的碱液裂解法具体包括以下步骤：
本实验需要在超净工作台下进行，烧杯、量筒、玻璃棒等工器具需要提前进行干热灭菌柜去除热源，将原液放置烧杯中先使用0.2mM氢氧化钠溶液将原液调节至10.5，放置37℃恒温箱中孵育12小时以上，再使用0.1mM盐酸溶液将原液回调至7.0，分别检测内毒素含量与产品蛋白浓度。
表8 碱液裂解实验条件设置
原液加碱后pH 回调后pH 孵育时间(h) 原液体积（ml） 原液内毒素（EU/ml） 孵育后体积（ml） 孵育后内毒素（EU/ml） 内毒素去除率（%） 收率（%）
10.50 7.00 50 200 32-64 258 32-64 0 94.75
10.55 7.02 50 1000 32-64 1080 32-64 0 95.93
本对比例中，发明人通过检测发现，碱液裂解法虽然在现有技术中可用于内毒素的去除，然而碱液裂解法却并不适用于重组人血清白蛋白发酵液中内毒素去除，根据表8实验结果可知，碱液裂解法并没有起到任何的去除作用，而且碱液还对重组人血白蛋白存在损伤，会影响蛋白收率，再考虑到配制盐酸过程存在安全风险，因此该方法并不适合应用于大规模工业发酵成产重组人血清白蛋白工艺中。
本申请方案提供的重组人血清白蛋白纯化过程中内毒素的去除工艺，能够保证较高目的蛋白收率的情况下，有效去除内毒素，保证重组人血清白蛋白产品中内毒素含量控制在要求的安全范围内，并且内毒素的控制工艺操作简单，能够明显提高重组人血清白蛋白产品的使用安全性，并且降低生产成本、提高生产收益，对工业发酵生产重组人血清白蛋白具有重要的应用价值。
以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种重组人血清白蛋白纯化过程中内毒素的去除工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1）将含有重组人血清白蛋白的发酵液加热灭活，加入硫酸铵沉淀后进行碟片离心，所得离心清液过滤除菌后，进行超滤换液浓缩；
2）将步骤1）所得样品依次上样进行阴离子层析、疏水层析和阳离子层析；
3）将步骤2）所得样品进行内毒素去除层析；
所述内毒素去除层析为流穿层析法，所述内毒素去除层析介质的配基为聚ε-赖氨酸，所述内毒素去除层析介质的基质为聚丙烯酸酯，所述步骤3）中所用的平衡缓冲液和淋洗缓冲液均为氯化钠、PB的混合液，所述氯化钠、PB的混合液的pH为7.0±0.05，所述氯化钠、PB的混合液中，氯化钠浓度为0.1±0.05M，PB浓度为20±3mM；
所述步骤3）中内毒素去除层析过程循环上样重复2~4次，所述循环上样过程中还包括对内毒素去除层析柱的清洗步骤，所述清洗步骤先后分别采用高盐溶液和碱液清洗内毒素，所述清洗步骤中，所述清洗步骤先后分别采用氯化钠溶液和氢氧化钠溶液清洗内毒素，所述氯化钠溶液的浓度为1±0.5M，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.3±0.2M；
所述步骤2）中阳离子层析中所用洗杂用缓冲液包含非离子表面活性剂TritonX-114，所述非离子表面活性剂TritonX-114的含量不低于1wt%。
2.根据权利要求1所述的重组人血清白蛋白纯化过程中内毒素的去除工艺，其特征在于，所述洗杂用缓冲液还包括氯化钠和醋酸。
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