CN112125960A - 一种适用于大规模工厂化生产操作的去除内毒素的通用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种适用于大规模工厂化生产操作的去除内毒素的通用方法。本发明将液相分离去除内毒素法和疏水层析去除内毒素法进行了结合和改进，保留了液相分离法高效去除内毒素的优点和疏水层析法适合大规模工厂化操作的优点，去掉了液相分离法中繁琐的离心和萃取以及疏水层析法中的高盐步骤。本发明可用于重组蛋白中内毒素的去除，也可用于制药业的药液中内毒素的去除，经过本发明的方法处理后，最终蛋白溶液中内毒素的含量为不超过10EU/mL或10EU/mg(目的蛋白)，通过本方法，能够以较低的成本将兽用疫苗中内毒素的含量控制到和人用疫苗相近的标准。本发明的一种去除内毒素的方法，具有高效、高回收率、低成本、易于大规模工厂化生产操作的特点。

Description

一种适用于大规模工厂化生产操作的去除内毒素的通用方法
技术领域
本发明涉及一种去除内毒素的方法，特别涉及一种高效、低成本、适用于大规模工厂化生产操作的去除内毒素的通用方法。本发明属于生物工程制药技术领域。
背景技术
内毒素是革兰氏阴性细菌(大肠杆菌，伤寒杆菌，结核杆菌，痢疾杆菌等)细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。脂多糖对宿主是有毒性的。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏细菌的细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。内毒素的生物活性包括：致热性、致死性毒性、白细胞减少、Shwartzman反应、降低血压及休克、激活凝血系统、诱导对内毒素的耐受性、鲎细胞溶解物(鲎试剂)的凝集、刺激淋巴细胞有丝分裂、诱导抗感染的特异性抵抗力、肿瘤细胞坏死作用。
大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉，可以快速大规模地生产目的蛋白等优点，而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的30％，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统；然而，在以大肠杆菌表达系统为基础的大规模工厂化制备重组蛋白的过程中，如何高效、低成本、易于大规模工厂化生产操作的去除内毒素，是全世界的一个难题。
目前已知的去除重组蛋白中内毒素的方法有如下几种：一、液相分离法，其原理是采用Triton X-114能够和内毒素的脂质部分结合，通过液相分离的方法多次萃取(2-3次萃取)内毒素从而使后者有效地去除；其优点是对内毒素的去除率高，且不影响有效成份的活性，该法简单高效、价格低廉，在我们日常的小量蛋白纯化中较为常用；其缺点一是在萃取大量重组蛋白时需要大量的离心机，需要众多操作人员和消耗大量电能，不适合大规模工厂化操作，其缺点二是在萃取过程中不可避免会损失较多的目的蛋白(损失20-30％)。二、离子交换法，其原理是当溶液pH合适时，内毒素带有负电荷，因此内毒素与阴离子交换介质Q或DEAE有较强结合，而目的蛋白流穿，柱上的内毒素用高盐缓冲液或NaOH去除；其优点是成本较低，吸附容量大；其缺点是如果目的蛋白在合适溶液中pH也带负电，则此方法效果不佳。三、亲和纯化法，其原理是将适当的配基(多粘菌素B)固载于色谱基质上合成出亲和介质，使它特异性结合内毒素；其优点是对内毒素的去除率较高；其缺点一是成本很高，其缺点二是载量不高，不适合大规模工厂化操作。四、疏水层析法，其原理是内毒素的脂肪A部份有很强的疏水性，但在高盐条件下会凝集，无法挂上疏水层析柱。因此可选择能结合目标蛋白的疏水介质去除内毒素；其特点是目标蛋白适用于高盐浓度且具有高疏水性；其优点一是适合大规模工厂化操作，其优点二是可反复使用上百次，综合成本较低，其优点三是结合载量高，结合载量是亲和纯化介质的数十倍；其缺点一是高盐操作去除内毒素效率不高，其缺点二是高盐操作会损失较多目的蛋白，导致回收率大大降低，提高了成本，其缺点三是不适用于低疏水性蛋白。五、凝胶过滤法，其原理是是利用凝胶的网状结构，根据分子大小进行分离的一种方法，如果蛋白质和内毒素的分子量有较大差别，则可以有效利用分子筛可以有效去除内毒素；其缺点一是处理样品的量小且时间较长，导致效率低、成本高，其缺点二是如果蛋白质和内毒素的分子量差别较小则无法有效分离。
我们在猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫苗(专利申请号为：202010780803.9)的实验室研究中，对上述5种去除内毒素的方法进行了研究和比较，结果显示，在实验室研究阶段，在不考虑成本、效率和操作便捷性时，以上5种方法可以取得较好的去除内毒素的效果。但是，在随后的大规模工厂化的中试生产中我们发现，以上5种去除内毒素的方法都达不到我们所需要的高效、高回收率、低成本、易于大规模工厂化生产操作的目标。具体而言，液相分离法的缺点是在大规模工厂化生产操作时需要众多操作人员和数量庞大的大容量离心机，萃取的过程中会损失大量的目的蛋白；离子交换法的缺点是，我们研究的猪圆环病毒2型病毒样颗粒在合适溶液中pH也带负电，在兼顾目的蛋白的回收率时无法与内毒素有效分离；亲和纯化法的缺点是成本很高，同时我们发现其去除内毒素的载量较低；疏水层析法的缺点一是去除内毒素效率较低，缺点二是目的蛋白损失较多(损失30-50％)；凝胶过滤法的缺点一是处理样品的量小且时间较长，缺点二是去除内毒素效率较低。
为了解决上述现有技术存在的问题，本发明提出了一种高效、高回收率、低成本、易于大规模工厂化生产操作的去除内毒素的通用方法，该方法可用于重组蛋白或天然蛋白的纯化过程中内毒素的去除，也可用于制药业中药液内毒素的去除，本发明将为疫苗及制药行业相关产品在大规模工厂化生产中去除内毒素提供了一种新方法，将会产生巨大的经济价值和社会效益。
发明内容
本发明的目的是获得一种高效、高回收率、低成本、易于大规模工厂化生产操作的新型去除内毒素的通用方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明发明人在前期研究中，提出了一种经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型或2d型衣壳蛋白基因，其中，经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示，经突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示；优选的，经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，经突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。进一步的，还提出了一种猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗，其包含猪圆环病毒2b型和2d型病毒样颗粒，所述的猪圆环病毒2b型病毒样颗粒是由经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白自组装而成，所述的猪圆环病毒2d型病毒样颗粒是由经突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白自组装而成，其中编码经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示，编码经突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10或SEQID NO.11所示，优选的，编码经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码经突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明在前期研究的基础上，在猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗的实验室研究中，对上述5种去除内毒素的方法进行了研究和比较，结果显示，在实验室研究阶段，在不考虑成本、效率和操作便捷性时，以上5种方法可以取得较好的去除内毒素的效果。但是，在随后的大规模工厂化的中试生产中我们发现，以上5种去除内毒素的方法都达不到我们所需要的高效、高回收率、低成本、易于大规模工厂化生产操作的目标。具体而言，液相分离法的缺点是在大规模工厂化生产操作时需要众多操作人员和数量庞大的大容量离心机，萃取的过程中会损失大量的目的蛋白；离子交换法的缺点是，我们研究的猪圆环病毒2型病毒样颗粒在合适溶液中pH也带负电，在兼顾目的蛋白的回收率时无法与内毒素有效分离；亲和纯化法的缺点是成本很高，同时我们发现其去除内毒素的载量较低；疏水层析法的缺点一是去除内毒素效率较低，缺点二是目的蛋白损失较多(损失30-50％)；凝胶过滤法的缺点一是处理样品的量小且时间较长，缺点二是去除内毒素效率较低。
在上述研究的基础上，我们对以上5种去除重组蛋白中内毒素的方法有了很深刻的认识。因此，本发明创造性的将液相分离法和疏水层析法进行了结合和改进，保留了液相分离法高效去除内毒素、低成本的优点和疏水层析法适合大规模工厂化操作的优点，去掉了液相分离法中繁琐的离心和萃取的步骤，去掉了疏水层析法中高盐的步骤，经过大量研究，取得了非常好的效果。本发明克服了液相分离法在大规模工厂化操作时需要众多操作人员和数量庞大的大容量离心机，萃取的过程中会损失大量的目的蛋白的缺点，也克服了疏水层析法去除内毒素效率较低和目的蛋白损失较多的缺点。本发明创造性的将液相分离法和疏水层析法进行结合和改进而得到的新的去除内毒素的方法，目前在国内外均未见报道。本发明所显示的新的去除内毒素的方法的有效结果是，经过本发明的方法处理后，最终重组蛋白溶液中内毒素的含量为不超过10EU/mL或10EU/(mg目的蛋白)，也就是说，通过本方法，我们能够以较低的成本将兽用疫苗中内毒素的含量控制到和人用疫苗相同的标准。
因此，在上述研究的基础上，本发明提出了一种适用于大规模工厂化生产操作的去除内毒素的通用方法，包括以下步骤：
1)将初步纯化后的菌液上清中的NaCl的浓度调整为0.5-1mol/L，随后加入0.5-2％体积的Triton X114，2-8℃搅拌1-24小时；
2)将步骤1)制备的上清回温至20-25℃，搅拌均匀后以0.45-1微米孔径的滤膜过滤，过滤后的蛋白溶液待用；
3)准备好疏水层析柱，层析柱中的疏水介质包括含苯基、辛基、丁基、丁硫基为配基的疏水层析介质中的任意一种，以缓冲液平衡疏水层析柱；将准备好的蛋白溶液上样于已经平衡好的疏水层析柱，收集流穿的包含目的蛋白的溶液；
4)向步骤3)制备的包含目的蛋白的溶液中加入0.5-2％体积的Triton X114，2-8℃搅拌1-24小时，随后重复步骤2)和步骤3)的操作直到目的蛋白溶液中内毒素含量小于10EU/mL。
其中，优选的，步骤1)中，所述的初步纯化后的菌液上清是指采用饱和硫酸铵或离子交换进行初步纯化后的菌液上清。
其中，优选的，步骤1)中，初步纯化后的菌液上清中内毒素含量大于10万EU/mL。
其中，优选的，所述的方法适用于重组蛋白或天然蛋白的纯化过程中内毒素的去除，也适用于制药业中药液内毒素的去除。
在本发明的具体实施例中，本发明给出了一种适用于大规模工厂化生产操作的去除猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗内毒素的方法，包括以下步骤：
1)合成SEQ ID NO.8所示的突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白基因和SEQ ID NO.11所示的突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白基因；
2)将合成的基因分别连接至pET30a载体的NdeI和XhoI酶切位点，产物转化到E.coli DH5α感受态细胞，挑菌鉴定后抽提质粒，重组质粒分别命名为pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap；
3)将pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap质粒分别转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，培养后，得到分别含有pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap质粒的大肠杆菌菌液；
4)将含有pET30a-2b-rCap质粒的菌液接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h。然后加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，37℃，220rpm进行诱导表达10h，随后离心收集菌液；将含有pET30a-2d-rCap质粒的菌液接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h，然后加入终浓度为2g/L的α-乳糖，25℃，220rpm进行诱导表达20h，随后离心收集菌液；
5)破碎步骤4)中收集的菌液上清，以饱和硫酸铵初步纯化后获得含有PCV2-病毒样颗粒的菌液上清10000-20000mL，将上清中NaCl的浓度调整为0.5-1mol/L，随后加入0.5-2％体积的Triton X114，2-8℃搅拌1-24小时；
6)将步骤5)制备的上清回温至20-25℃，搅拌均匀后以0.45-1微米孔径的滤膜过滤，过滤后的蛋白溶液待用；准备好疏水层析柱(140mm×200mm)，层析柱中的疏水介质以丁基(Butyl)为配基的疏水层析介质，介质的有效体积为2000mL，以0.5M NaCl-PB6.5缓冲液平衡疏水层析柱；将准备好的蛋白溶液以60cm/h流速过已经平衡好的疏水层析柱，收集流穿的包含目的蛋白的溶液，经过此步处理后，目的蛋白溶液中内毒素含量为不超过10万EU/mL；
7)将步骤6)制备的包含目的蛋白的溶液加入0.5-2％体积的Triton X114，2-8℃搅拌1-24小时，随后重复步骤6)的操作，经过此步处理后，目的蛋白溶液中内毒素含量为不超过1000EU/mL；
8)将步骤7)制备的包含目的蛋白的溶液加入0.5％体积的Triton X114，2-8℃搅拌1-24小时，随后重复步骤6)的操作，经过此步处理后，目的蛋白溶液中内毒素含量小于10EU/mL。
在本发明的具体实施例中，本发明还给出了一种适用于大规模工厂化生产操作的去除猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗内毒素的方法，包括以下步骤：
1)合成SEQ ID NO.8所示的突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白基因和SEQ ID NO.11所示的突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白基因；
2)将合成的基因分别连接至pET30a载体的NdeI和XhoI酶切位点，产物转化到E.coli DH5α感受态细胞，挑菌鉴定后抽提质粒，重组质粒分别命名为pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap；
3)将pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap质粒分别转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，培养后，得到分别含有pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap质粒的大肠杆菌菌液；
4)将含有pET30a-2b-rCap质粒的菌液接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h。然后加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，37℃，220rpm进行诱导表达10h，随后离心收集菌液；将含有pET30a-2d-rCap质粒的菌液接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h；然后加入终浓度为2g/L的α-乳糖，25℃，220rpm进行诱导表达20h，随后离心收集菌液；
5)破碎步骤4)中收集的菌液上清，以饱和硫酸铵进行初步纯化后，用pH6.5的20mMPB缓冲液平衡DEAE阴离子交换柱，随后将以饱和硫酸铵进行初步纯化的上清缓慢载入平衡后的柱子，选用pH6.5的含有0.3M NaCl的20mM PB缓冲液对杂蛋白进行洗脱，选用pH6.5的含有1M NaCl的20mM PB缓冲液对目的蛋白进行洗脱，可得一定纯度的重组2b型和2d型Cap蛋白，即为初步纯化的重组2b型和2d型Cap蛋白溶液；利用孔径为300kD的切向流膜过滤系统分别对经离子交换层析的重组2b型和2d型Cap蛋白溶液进行5到10倍超滤浓缩获得中间纯化上清5000-10000mL，将上清中NaCl的浓度调整为0.5-1mol/L，随后加入0.5-2％体积的Triton X114，2-8℃搅拌1-24小时；
6)将步骤5)制备的上清回温至20-25℃，搅拌均匀后以1微米孔径的滤膜过滤，过滤后的蛋白溶液待用；准备好疏水层析柱(140mm×200mm)，层析柱中的疏水介质以丁基(Butyl)为配基的疏水层析介质，介质的有效体积为2000mL，以0.5M NaCl-PB6.5缓冲液平衡疏水层析柱；将准备好的蛋白溶液以60cm/h流速过已经平衡好的疏水层析柱，收集流穿的包含目的蛋白的溶液，经过此步处理后，目的蛋白溶液中内毒素含量为不超过1000EU/mL；
7)将步骤6)制备的上清加入0.5-2％体积的Triton X114，2-8℃搅拌1-24小时，随后重复步骤6)的操作，经过此步处理后，目的蛋白溶液中内毒素含量小于10EU/mL。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
1)本发明将液相分离去除内毒素法和疏水层析去除内毒素法进行了结合和改进，即将非离子型表面活性剂Triton X114与疏水层析进行结合，层析条件由高盐浓度(2-4mol/L的NaCl)改进为低盐浓度(0.5-1mol/L的NaCl)，吸收了液相分离法高效去除内毒素、低成本的优点和疏水层析法适合大规模工厂化操作的优点，克服了液相分离法除内毒素在大规模工厂化操作时需要众多操作人员和数量庞大的大容量离心机，以及在萃取的过程中会损失大量的目的蛋白的缺点，也克服了疏水层析法在高盐操作时去除内毒素效率较低和目的蛋白损失较多的缺点。
2)本发明是一种高效、高回收率、低成本、易于大规模工厂化生产操作的去除内毒素的通用方法，该方法可用于重组蛋白或天然蛋白的纯化过程中内毒素的去除，也可用于制药业中药液内毒素的去除。
3)本发明将为疫苗及制药行业相关产品在大规模工厂化生产中去除内毒素提供了一种创新性的方法，将会产生巨大的经济价值和社会效益。
附图说明
图1为大肠杆菌表达的本发明猪圆环病毒2b型重组衣壳蛋白的SDS-PAGE结果；
其中：M为预染蛋白Marker；1为SEQ ID NO.1所示序列表达结果；2为SEQ ID NO.2所示序列表达结果；3为SEQ ID NO.3所示序列表达结果；4为SEQ ID NO.4所示序列表达结果；5为SEQ ID NO.5所示序列表达结果。
图2为SEQ ID NO.4所示序列表达重组蛋白的可溶性分析SDS-PAGE结果；
其中：M为预染蛋白Marker；1为SEQ ID NO.4所示序列重组菌表达的总蛋白；2为SEQ ID NO.4所示序列重组菌表达的不可溶性蛋白；3为SEQ ID NO.4所示序列重组菌表达的可溶性蛋白。
图3为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示序列表达重组蛋白的可溶性分析SDS-PAGE结果；
其中：M为预染蛋白Marker；1为SEQ ID NO.6所示序列重组菌表达的总蛋白；2为SEQ ID NO.6所示序列重组菌表达的不可溶性蛋白；3为SEQ ID NO.6所示序列重组菌表达的可溶性蛋白；4为SEQ ID NO.7所示序列重组菌表达的总蛋白；5为SEQ ID NO.7所示序列重组菌表达的不可溶性蛋白；6为SEQ ID NO.7所示序列重组菌表达的可溶性蛋白；7为SEQID NO.8所示序列重组菌表达的总蛋白；8为SEQ ID NO.8所示序列重组菌表达的不可溶性蛋白；9为SEQ ID NO.8所示序列重组菌表达的可溶性蛋白。
图4为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示序列表达重组蛋白的可溶性分析SDS-PAGE结果；
其中：M为预染蛋白Marker；1为SEQ ID NO.9所示序列重组菌表达的总蛋白；2为SEQ ID NO.9所示序列重组菌表达的不可溶性蛋白；3为SEQ ID NO.9所示序列重组菌表达的可溶性蛋白；4为SEQ ID NO.10所示序列重组菌表达的总蛋白；5为SEQ ID NO.10所示序列重组菌表达的不可溶性蛋白；6为SEQ ID NO.10所示序列重组菌表达的可溶性蛋白；7为SEQ ID NO.11所示序列重组菌表达的总蛋白；8为SEQ ID NO.11所示序列重组菌表达的不可溶性蛋白；9为SEQ ID NO.11所示序列重组菌表达的可溶性蛋白。
图5为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示序列表达重组蛋白初步纯化产物形成病毒样颗粒的电镜结果；
其中：A为SEQ ID NO.6所示序列表达重组蛋白初步纯化产物；B为SEQ ID NO.7所示序列表达重组蛋白初步纯化产物；C为SEQ ID NO.8所示序列表达重组蛋白初步纯化产物。
图6为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示序列表达重组蛋白初步纯化产物形成病毒样颗粒的电镜结果；
其中：A为SEQ ID NO.9所示序列表达重组蛋白初步纯化产物；B为SEQ ID NO.10所示序列表达重组蛋白初步纯化产物；C为SEQ ID NO.11所示序列表达重组蛋白初步纯化产物。
图7为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11所示序列表达重组蛋白在第一步离子交换层析纯化结果；
其中：M为预染蛋白Marker；1为SEQ ID NO.8所示序列表达的重组衣壳蛋白；2为SEQ ID NO.11所示序列表达的重组衣壳蛋白。
图8为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11所示序列表达重组蛋白在第二步凝胶过滤层析纯化结果；
其中：M为预染蛋白Marker；1为SEQ ID NO.8所示序列表达的重组衣壳蛋白；2为SEQ ID NO.11所示序列表达的重组衣壳蛋白。
图9为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11所示序列表达重组蛋白精细纯化产物形成病毒样颗粒的电镜结果；
其中：A为SEQ ID NO.8所示序列表达重组蛋白精细纯化产物；B为SEQ ID NO.11所示序列表达重组蛋白精细纯化产物。
具体实施方式
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所设定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
实施例1、经过密码子优化和基因突变改造优化的PCV2b和PCV2d衣壳蛋白基因的合成
本发明开始设计了5套PCV2b衣壳蛋白的密码子优化和基因突变改造优化方案，包括1套PCV2b衣壳蛋白原始全长基因的密码子优化和4套PCV2b衣壳蛋白基因的突变改造优化。具体而言，方案1：在考虑到密码子偏爱性和GC含量等因素的基础上对PCV2b衣壳蛋白基因进行部分密码子优化，优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；方案2：在方案1的基础上，对N端进行三个氨基酸突变，优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；方案3：在方案2的基础上，对N端进行其它四个氨基酸突变，优化后的基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；方案4：在方案3的基础上，对N端进行其它两个氨基酸突变，优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；方案5：在方案4的基础上，对N端进行其它两个氨基酸突变，优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
根据方案4的结果，本发明随后设计了3套PCV2b衣壳重组蛋白的基因突变改造优化方案。具体而言，方案6：对PCV2b衣壳蛋白N端重新设计了9个氨基酸突变，优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；方案7：对PCV2b衣壳蛋白N端重新设计了9个氨基酸突变，优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；方案8：对PCV2b衣壳蛋白N端重新设计了15个氨基酸突变，优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
根据方案4的结果，本发明随后设计了3套PCV2d衣壳重组蛋白的基因突变改造优化方案。具体而言，方案9：对PCV2d衣壳蛋白N端重新设计了9个氨基酸突变，优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；方案10：对PCV2d衣壳蛋白N端重新设计了9个氨基酸突变，优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；方案11：对PCV2d衣壳蛋白N端重新设计了15个氨基酸突变，优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
实施例2、对比各种优化及突变改造的PCV2b和PCV2d衣壳蛋白(Cap)基因的重组蛋白表达水平及是否形成病毒样颗粒
1)Cap蛋白表达载体的构建
分别将人工合成的优化后的Cap蛋白基因(SEQ ID NO.1-11所示)与pET30a载体的NdeI和XhoI酶切位点连接并在16℃过夜。之后将连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞，涂至含卡那霉素的LB平板上，37℃培养12h。挑取平板上的单菌落，进行菌液PCR鉴定并测序。鉴定正确后抽提重组质粒。
2)重组Cap蛋白的诱导表达
将重组质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，以1：100的比例接入含卡那霉素的TB培养基中37℃，220rpm过夜培养。将活化的菌液以1:50比例接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h。然后加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，25℃，220rpm进行诱导表达10h。随后离心收集菌液，按照100ml菌体加入10ml缓冲液(50mM Tris-HCl,pH8.0)重悬菌体。对重悬的菌体进行超声破碎，冰上操作。工作3s，停顿6s，Amp设置为39％，重复300个循环。随后将破碎完成的菌液离心，12000rpm，30min，4℃，收集上清。
样品处理过后进行SDS-PAGE分析，结果如图1，图2，图3以及图4所示，目的蛋白大小约28Kd。对比多套方案的表达水平，在突变改造和优化的PCV2b衣壳蛋白基因中，SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8基因的可溶性重组蛋白的表达水平远高于SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。PCV2d衣壳蛋白基因突变改造和优化的SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11基因直接借鉴于PCV2b衣壳蛋白基因优化的方案6、方案7和方案8，表达结果表明，SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11基因均获得了高效可溶性重组蛋白的表达。因此选取SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11进行后续电镜观察，判断是否形成猪圆环病毒2b和2d型病毒样颗粒。
3)电镜观察
分别将2)中获得的高效表达的重组蛋白送至透射电镜观察。SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8所示序列方案都可以观察到明显的圆形空心颗粒，结果如图5所示，直径大约为17-20nm，说明此三套方案均成功形成了猪圆环病毒2b型病毒样颗粒。SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示序列方案也都可以观察到明显的圆形空心颗粒，结果如图6所示，直径大约为17-20nm，说明此三套方案均成功形成了猪圆环病毒2d型病毒样颗粒。在SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示序列方案中，SEQ ID NO.8的病毒样颗粒量最高。在SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示序列方案中，SEQ ID NO.11的病毒样颗粒量最高。所以最终确定SEQ ID NO.8所示的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白基因和SEQ IDNO.11所示的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白基因为制备病毒样颗粒的最佳目的基因。
实施例3、猪圆环病毒2b和2d型衣壳蛋白的表达、纯化以及猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗的制备
1)合成SEQ ID NO.8所示的突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白基因和SEQ ID NO.11所示的突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白基因；
2)将合成的基因分别连接至pET30a载体的NdeI和XhoI酶切位点，产物转化到E.coli DH5α感受态细胞，挑菌鉴定后抽提质粒，重组质粒分别命名为pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap；
3)将pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap质粒分别转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，培养后，得到分别含有pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap质粒的大肠杆菌菌液；
4)将含有pET30a-2b-rCap质粒的菌液接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h。然后加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，37℃，220rpm进行诱导表达10h，随后离心收集菌液；将含有pET30a-2d-rCap质粒的菌液接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h。然后加入终浓度为2g/L的α-乳糖，25℃，220rpm进行诱导表达20h，随后离心收集菌液；；
5)破碎步骤4)中收集的菌液上清，以饱和硫酸铵进行初步纯化后，用缓冲液(20mMPB缓冲液,PH6.5)平衡DEAE阴离子交换柱，随后将以饱和硫酸铵进行初步纯化的上清缓慢载入平衡后的柱子。选用含有一定盐浓度的缓冲液(含有0.3M NaCl的20mM PB缓冲液，pH6.5)对杂蛋白进行洗脱，选用含有一定盐浓度的缓冲液(含有1M NaCl的20mM PB缓冲液，pH6.5)对目的蛋白进行洗脱，可得一定纯度的重组2b型和2d型Cap蛋白，即为初步纯化的重组2b型和2d型Cap蛋白，结果如图7所示。
重组2b型和2d型Cap蛋白的精细纯化：利用孔径为300kD的切向流膜过滤系统分别对经离子交换层析的重组2b型和2d型Cap蛋白溶液进行5到10倍超滤浓缩；选用含有一定盐浓度的缓冲液(含有0.2M NaCl的20mM PB缓冲液，pH6.5)平衡琼脂糖6FF凝胶过滤层析柱，5％柱体积分别载入初步纯化后经过超滤浓缩的重组2b型和2d型Cap蛋白溶液。收集在OD280nm监测下第一个可吸收峰洗脱的样品，即精细纯化的目的蛋白，结果如图8所示。可以看到经过第二步纯化后，目的蛋白的纯度可以达到极高的水平，在电镜下可以看到典型的猪圆环病毒2b和2d型病毒样颗粒，分别命名为PCV2b-VLP和PCV2d-VLP，结果如图9所示。
猪圆环病毒2b和2d型二价病毒样颗粒疫苗的制备：将纯化并经终浓度为0.05％的β-丙内酯灭活的PCV2b-VLP蛋白液和PCV2d-VLP蛋白液等比例混合均匀，经过无菌过滤后，与纳米603佐剂(购自北京生泰尔科技股份有限公司)按照质量比为2:1乳化制备成二价病毒样颗粒疫苗，使得每毫升疫苗中PCV2b-VLP和PCV2d-VLP的蛋白浓度均为50微克，放置4℃存储。
猪圆环病毒2b或2d型单价病毒样颗粒疫苗的制备：将纯化并经终浓度为0.05％的β-丙内酯灭活的PCV2b-VLP蛋白液或PCV2d-VLP蛋白液，经过无菌过滤后，与纳米603佐剂(购自北京生泰尔科技股份有限公司)按照质量比为2:1乳化制备成单价病毒样颗粒疫苗，使得每毫升疫苗中PCV2b-VLP或PCV2d-VLP的蛋白浓度为50微克，放置4℃存储。
实施例4、猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗接种仔猪的安全性评价
1材料
1.1疫苗
猪圆环病毒2b、2d二价病毒样颗粒疫苗，共三批号为2017001、2017002及2017003，均按照实施例3的方法制备。
1.2试验动物
21-28日龄健康仔猪(PCV2、PRRSV抗原抗体阴性)，购自哈尔滨市道里区立新养殖场。
2方法
取21-28日龄仔猪20头，分为4组，每组5头，3组为试验组，1组为对照组。每个批次疫苗免疫一组猪，每头猪耳后肌肉注射2mL，对照组以相同方式和剂量注射生理盐水。观察14日，观察各组猪体温、采食、饮水、精神是否正常，有无不良临床反应，有无发病及死亡。
3结果
结果显示见表1，整个试验观察期14天内，免疫三批疫苗的15头仔猪的体温、精神状态和食欲均正常，没有出现任何临床异常现象，试验结束后，20头仔猪均健活。空白对照组的5头仔猪也无任何不良反应。这说明，猪圆环病毒2b、2d二价病毒样颗粒疫苗对仔猪是安全的。
表1猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗接种仔猪的安全性评价
Figure BDA0002653430530000141
实施例5、猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗接种仔猪的效力评价
1材料
1.1疫苗
猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗，按照实施例3的方法制备。
猪圆环病毒2b或2d型单价病毒样颗粒疫苗，按照实施例3的方法制备。
1.2试验动物
21～28日龄健康仔猪(PCV2抗原抗体阴性猪)，购自哈尔滨市道里区立新养殖场。
1.3效检用毒
猪圆环病毒2b(YW株)和2d(DF株)冻干毒，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所制备、鉴定、保存及供应。
2方法
2.1动物试验设计
取21～28日龄健康仔猪45头，分为9组，每组5头，其中2组为攻毒对照组，1组为空白对照组，2组为猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗免疫组，2组为猪圆环病毒2b型病毒样颗粒疫苗免疫组，2组为猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗免疫组，试验设计见表2。按照1ml/头接种，14天后加强免疫一次，空白对照组不免疫不攻毒。二次免疫后14日，使用PCV2b(YW株)或PCV2d(DF株)按照表2方案接种攻毒。PCV2的攻毒接种途径为YW株F7代，DF株F8代，每头猪均滴鼻2ml，肌肉注射2ml(含105TCID50/ml)。免疫前3天和免疫后1-7天，攻毒后1-21天，每天测定各组试验猪体温，观察各组猪采食、饮水、精神是否正常，有无不良临床反应，有无发病及死亡。攻毒当日对每头试验仔猪的体重进行称量并记录，攻毒后28日再对每头试验仔猪的体重进行称量并记录。攻毒后28天，前腔静脉采血，采用PCR的方法检测PCV2的核酸；攻毒后28天，安乐死所有试验猪，采集腹股沟淋巴结采用免疫组织化学(IHC)的方法检测PCV2。
3 PCV2发病判定标准
3.1血清中PCV2病毒核酸检测
攻毒后21日，前腔静脉采血，分离血清，按PCV2病毒检测法检测PCV2病毒核酸，在PCR 30个循环时出现特异性条带，判为PCV2病毒血症阳性。
3.2体重标准
相对增重率应不低于5％，非攻毒仔猪的平均日增重应大于攻毒仔猪的平均日增重；攻毒当日对每头试验仔猪的体重进行称量并记录，攻毒后28日再对每头试验仔猪的体重进行称量并记录；相对增重率的计算按照下列公式进行：相对增重率＝{非攻毒对照组仔猪平均日增重-攻毒组仔猪平均日增重}/
3.3淋巴结中PCV2免疫组化检测(IHC)
攻毒后28日，对所有仔猪实施安乐死，取腹股沟淋巴结，按淋巴结中PCV2抗原免疫组化检测法进行IHC检测，出现阳性信号。
以上3项出现任意2项，即判为发病。
4、结果
猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗的效力评价及和猪圆环病毒2b型病毒样颗粒疫苗、猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗的效力对比评价见表2。效力评价结果表明，二价病毒样颗粒疫苗和2b型病毒样颗粒疫苗、2d型病毒样颗粒疫苗均具有免疫保护效果。进一步分析发现，PCV2b的单价病毒样颗粒疫苗对于PCV2d攻击的保护效果不如PCV2d的单价病毒样颗粒疫苗，PCV2d的单价病毒样颗粒疫苗对于PCV2b攻击的保护效果不如PCV2b的单价病毒样颗粒疫苗，而PCV2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗的免疫保护效果均优于PCV2b的单价病毒样颗粒疫苗和PCV2d的单价病毒样颗粒疫苗。
表2猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗接种仔猪的效力评价
Figure BDA0002653430530000161
实施例6、本发明的去除内毒素的方法在去除经饱和硫酸铵初步纯化后PCV2-病毒样颗粒菌液上清中内毒素的工厂规模化中试生产应用1
1)合成SEQ ID NO.8所示的突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白基因和SEQ ID NO.11所示的突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白基因；
2)将合成的基因分别连接至pET30a载体的NdeI和XhoI酶切位点，产物转化到E.coli DH5α感受态细胞，挑菌鉴定后抽提质粒，重组质粒分别命名为pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap；
3)将pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap质粒分别转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，培养后，得到分别含有pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap质粒的大肠杆菌菌液；
4)将含有pET30a-2b-rCap质粒的菌液接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h。然后加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，37℃，220rpm进行诱导表达10h，随后离心收集菌液；将含有pET30a-2d-rCap质粒的菌液接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h。然后加入终浓度为2g/L的α-乳糖，25℃，220rpm进行诱导表达20h，随后离心收集菌液；
5)破碎步骤4)中收集的菌液上清，以饱和硫酸铵进行初步纯化后获得含有PCV2-病毒样颗粒的菌液上清(此上清中内毒素含量大于200万EU/mL)16000mL，将上清中NaCl的浓度调整为0.5mol/L，随后加入1％体积的Triton X114，4℃搅拌1小时；
6)将步骤5)制备的上清回温至20-25℃，搅拌均匀后以1微米孔径的滤膜过滤，过滤后的蛋白溶液待用；准备好疏水层析柱(140mm×200mm)，层析柱中的疏水介质以丁基(Butyl)为配基的疏水层析介质，介质的有效体积为2000mL，以0.5M NaCl-PB6.5缓冲液平衡疏水层析柱；将准备好的蛋白溶液以60cm/h流速过已经平衡好的疏水层析柱，收集流穿的包含目的蛋白的溶液，经过此步处理后，目的蛋白溶液中内毒素含量为不超过10万EU/mL；
7)将步骤6)制备的包含目的蛋白的溶液加入1％体积的Triton X114，2-8℃搅拌1小时，随后重复步骤6)的操作，经过此步处理后，目的蛋白溶液中内毒素含量为不超过1000EU/mL；
8)将步骤7)制备的包含目的蛋白的溶液加入0.5％体积的Triton X114，2-8℃搅拌1小时，随后重复步骤6)的操作，经过此步处理后，目的蛋白溶液中内毒素含量小于10EU/mL。
实施例7、本发明的去除内毒素的方法在去除经饱和硫酸铵初步纯化后PCV2-病毒样颗粒菌液上清中内毒素的工厂规模化中试生产应用2
本实施例与实施例6的区别仅在于将上清中NaCl的浓度调整为1mol/L，随后加入0.5％体积的Triton X114，2℃搅拌24小时。其余步骤与实施例6相同，本实施例最终获得的目的蛋白溶液中内毒素含量小于10EU/mL。
实施例8、本发明的去除内毒素的方法在去除经饱和硫酸铵初步纯化后PCV2-病毒样颗粒菌液上清中内毒素的工厂规模化中试生产应用3
本实施例与实施例6的区别仅在于将上清中NaCl的浓度调整为0.5mol/L，随后加入2％体积的Triton X114，8℃搅拌10小时。其余步骤与实施例6相同，本实施例最终获得的目的蛋白溶液中内毒素含量小于10EU/mL。
实施例9、本发明的去除内毒素的方法在去除以离子交换纯化后含有PCV2-病毒样颗粒的中间纯化上清中内毒素的工厂规模化中试生产应用1
1)合成SEQ ID NO.8所示的突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白基因和SEQ ID NO.11所示的突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白基因；
2)将合成的基因分别连接至pET30a载体的NdeI和XhoI酶切位点，产物转化到E.coli DH5α感受态细胞，挑菌鉴定后抽提质粒，重组质粒分别命名为pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap；
3)将pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap质粒分别转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，培养后，得到分别含有pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap质粒的大肠杆菌菌液；
4)将含有pET30a-2b-rCap质粒的菌液接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h。然后加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，37℃，220rpm进行诱导表达10h，随后离心收集菌液；将含有pET30a-2d-rCap质粒的菌液接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h。然后加入终浓度为2g/L的α-乳糖，25℃，220rpm进行诱导表达20h，随后离心收集菌液；；
5)破碎步骤4)中收集的菌液上清，以饱和硫酸铵进行初步纯化后，用缓冲液(20mMPB缓冲液，pH6.5)平衡DEAE阴离子交换柱，随后将以饱和硫酸铵进行初步纯化的上清缓慢载入平衡后的柱子。选用含有一定盐浓度的缓冲液(含有0.3M NaCl的20mM PB缓冲液，pH6.5)对杂蛋白进行洗脱，选用含有一定盐浓度的缓冲液(含有1M NaCl的20mM PB缓冲液，pH6.5)对目的蛋白进行洗脱，可得一定纯度的重组2b型和2d型Cap蛋白，即为初步纯化的重组2b型和2d型Cap蛋白溶液；利用孔径为300kD的切向流膜过滤系统分别对经离子交换层析的重组2b型和2d型Cap蛋白溶液进行5到10倍超滤浓缩获得中间纯化上清(此上清中内毒素含量为10万EU/mL)8000mL，目的蛋白浓度为1mg/mL，将上清中NaCl的浓度调整为0.5mol/L，随后加入1％体积的Triton X114，4℃搅拌1小时；
6)将步骤5)制备的上清回温至20-25℃，搅拌均匀后以1微米孔径的滤膜过滤，过滤后的蛋白溶液待用；准备好疏水层析柱(140mm×200mm)，层析柱中的疏水介质以丁基(Butyl)为配基的疏水层析介质，介质的有效体积为2000mL，以0.5M NaCl-PB6.5缓冲液平衡疏水层析柱；将准备好的蛋白溶液以60cm/h流速过已经平衡好的疏水层析柱，收集流穿的包含目的蛋白的溶液，经过此步处理后，目的蛋白溶液中内毒素含量为不超过1000EU/mL；
7)将步骤6)制备的上清加入0.5％体积的Triton X114，2-8℃搅拌1小时，随后重复步骤6)的操作，经过此步处理后，目的蛋白溶液中内毒素含量小于10EU/mL。经过此步处理后所得蛋白溶液的体积为12000mL，目的蛋白的浓度为650mg/L，目的蛋白回收率为97.5％。按照50μg/头份来进行疫苗配制，此批所得蛋白溶液可以配制15.6万头份疫苗。
实施例10、本发明的去除内毒素的方法在去除以离子交换纯化后含有PCV2-病毒样颗粒的中间纯化上清中内毒素的工厂规模化中试生产应用2
本实施例与实施例9的区别仅在于将上清中NaCl的浓度调整为1mol/L，随后加入0.5％体积的Triton X114，2℃搅拌24小时。其余步骤与实施例9相同，本实施例最终获得的目的蛋白溶液中内毒素含量小于10EU/mL。
实施例11、本发明的去除内毒素的方法在去除以离子交换纯化后含有PCV2-病毒样颗粒的中间纯化上清中内毒素的工厂规模化中试生产应用3
本实施例与实施例9的区别仅在于将上清中NaCl的浓度调整为0.5mol/L，随后加入2％体积的Triton X114，8℃搅拌10小时。其余步骤与实施例9相同，本实施例最终获得的目的蛋白溶液中内毒素含量小于10EU/mL。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）
<120> 一种适用于大规模工厂化生产操作的去除内毒素的通用方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 702
<212> DNA
<213> Porcine circovirus
<400> 1
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Claims (6)

1.一种适用于大规模工厂化生产操作的去除内毒素的通用方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将初步纯化后的菌液上清中的NaCl的浓度调整为0.5-1mol/L，随后加入0.5-2％体积的Triton X114，2-8℃搅拌1-24小时；
2)将步骤1)制备的上清回温至20-25℃，搅拌均匀后以0.45-1微米孔径的滤膜过滤，过滤后的蛋白溶液待用；
3)准备好疏水层析柱，层析柱中的疏水介质包括含苯基、辛基、丁基、丁硫基为配基的疏水层析介质中的任意一种，以缓冲液平衡疏水层析柱；将准备好的蛋白溶液上样于已经平衡好的疏水层析柱，收集流穿的包含目的蛋白的溶液；
4)向步骤3)制备的包含目的蛋白的溶液中加入0.5-2％体积的Triton X114，2-8℃搅拌1-24小时，随后重复步骤2)和步骤3)的操作直到目的蛋白溶液中内毒素含量小于10EU/mL。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的初步纯化后的菌液上清是指采用饱和硫酸铵或离子交换进行初步纯化后的菌液上清。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，初步纯化后的菌液上清中内毒素含量大于10万EU/mL。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述的方法适用于重组蛋白或天然蛋白的纯化过程中内毒素的去除，也适用于制药业中药液内毒素的去除。
5.一种适用于大规模工厂化生产操作的去除猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗内毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)合成SEQ ID NO.8所示的突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白基因和SEQ IDNO.11所示的突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白基因；
2)将合成的基因分别连接至pET30a载体的NdeI和XhoI酶切位点，产物转化到E.coliDH5α感受态细胞，挑菌鉴定后抽提质粒，重组质粒分别命名为pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap；
3)将pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap质粒分别转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，培养后，得到分别含有pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap质粒的大肠杆菌菌液；
4)将含有pET30a-2b-rCap质粒的菌液接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h。然后加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，37℃，220rpm进行诱导表达10h，随后离心收集菌液；将含有pET30a-2d-rCap质粒的菌液接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h，然后加入终浓度为2g/L的α-乳糖，25℃，220rpm进行诱导表达20h，随后离心收集菌液；
5)破碎步骤4)中收集的菌液上清，以饱和硫酸铵初步纯化后获得含有PCV2-病毒样颗粒的菌液上清10000-20000mL，将上清中NaCl的浓度调整为0.5-1mol/L，随后加入0.5-2％体积的Triton X114，2-8℃搅拌1-24小时；
6)将步骤5)制备的上清回温至20-25℃，搅拌均匀后以0.45-1微米孔径的滤膜过滤，过滤后的蛋白溶液待用；准备好疏水层析柱(140mm×200mm)，层析柱中的疏水介质以丁基(Butyl)为配基的疏水层析介质，介质的有效体积为2000mL，以0.5M NaCl-PB6.5缓冲液平衡疏水层析柱；将准备好的蛋白溶液以60cm/h流速过已经平衡好的疏水层析柱，收集流穿的包含目的蛋白的溶液，经过此步处理后，目的蛋白溶液中内毒素含量为不超过10万EU/mL；
7)将步骤6)制备的包含目的蛋白的溶液加入0.5-2％体积的Triton X114，2-8℃搅拌1-24小时，随后重复步骤6)的操作，经过此步处理后，目的蛋白溶液中内毒素含量为不超过1000EU/mL；
8)将步骤7)制备的包含目的蛋白的溶液加入0.5％体积的Triton X114，2-8℃搅拌1-24小时，随后重复步骤6)的操作，经过此步处理后，目的蛋白溶液中内毒素含量小于10EU/mL。
6.一种适用于大规模工厂化生产操作的去除猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗内毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)合成SEQ ID NO.8所示的突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白基因和SEQ IDNO.11所示的突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白基因；
2)将合成的基因分别连接至pET30a载体的NdeI和XhoI酶切位点，产物转化到E.coliDH5α感受态细胞，挑菌鉴定后抽提质粒，重组质粒分别命名为pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap；
3)将pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap质粒分别转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，培养后，得到分别含有pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap质粒的大肠杆菌菌液；
4)将含有pET30a-2b-rCap质粒的菌液接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h。然后加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，37℃，220rpm进行诱导表达10h，随后离心收集菌液；将含有pET30a-2d-rCap质粒的菌液接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h；然后加入终浓度为2g/L的α-乳糖，25℃，220rpm进行诱导表达20h，随后离心收集菌液；
5)破碎步骤4)中收集的菌液上清，以饱和硫酸铵进行初步纯化后，用pH6.5的20mM PB缓冲液平衡DEAE阴离子交换柱，随后将以饱和硫酸铵进行初步纯化的上清缓慢载入平衡后的柱子，选用pH6.5的含有0.3M NaCl的20mM PB缓冲液对杂蛋白进行洗脱，选用pH6.5的含有1M NaCl的20mM PB缓冲液对目的蛋白进行洗脱，可得一定纯度的重组2b型和2d型Cap蛋白，即为初步纯化的重组2b型和2d型Cap蛋白溶液；利用孔径为300kD的切向流膜过滤系统分别对经离子交换层析的重组2b型和2d型Cap蛋白溶液进行5到10倍超滤浓缩获得中间纯化上清5000-10000mL，将上清中NaCl的浓度调整为0.5-1mol/L，随后加入0.5-2％体积的Triton X114，2-8℃搅拌1-24小时；
6)将步骤5)制备的上清回温至20-25℃，搅拌均匀后以1微米孔径的滤膜过滤，过滤后的蛋白溶液待用；准备好疏水层析柱(140mm×200mm)，层析柱中的疏水介质以丁基(Butyl)为配基的疏水层析介质，介质的有效体积为2000mL，以0.5M NaCl-PB6.5缓冲液平衡疏水层析柱；将准备好的蛋白溶液以60cm/h流速过已经平衡好的疏水层析柱，收集流穿的包含目的蛋白的溶液，经过此步处理后，目的蛋白溶液中内毒素含量为不超过1000EU/mL；
7)将步骤6)制备的上清加入0.5-2％体积的Triton X114，2-8℃搅拌1-24小时，随后重复步骤6)的操作，经过此步处理后，目的蛋白溶液中内毒素含量小于10EU/mL。
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