CN108048471B

CN108048471B - 一种具有抗肿瘤活性的三元复合毒素及其制备方法

Info

Publication number: CN108048471B
Application number: CN201711373010.XA
Authority: CN
Inventors: 胡胜标; 胡晓凤; 谢亚丽; 张国勇; 杨曦; 夏立秋; 丁学知; 彭智辉
Original assignee: Hunan Normal University
Current assignee: Hunan Normal University
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2017-12-19
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2037-12-19
Also published as: CN108048471A

Abstract

一种具有抗肿瘤活性的三元复合毒素及其制备方法，本发明之具有抗肿瘤活性的三元复合毒素，其编码基因来源于昆虫病原线虫共生致病杆菌Xenorhabdus stockiae HN_xs01，为xsrfABC基因，xsrfABC基因包含三个开放阅读框：xsrfA、xsrfB和xsrfC，xsrfA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，xsrfB的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，xsrfC的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。本发明还包括所述具有抗肿瘤活性的三元复合毒素的制备方法。本发明中，所得复合毒素XSrfABC对肿瘤细胞具有毒性，但对正常细胞没有毒性。

Description

一种具有抗肿瘤活性的三元复合毒素及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的三元复合毒素及其制备方法。

背景技术

根据世界卫生组织统计，全世界有3/5的人死于恶性肿瘤、糖尿病、心血管疾病、慢性呼吸系统疾病这4大类疾病，而恶性肿瘤则是最主要的死因之一。微生物来源的抗肿瘤活性成分结构新颖、作用机制独特，具有很好的发展潜力。夏立秋等分离到一株具有肿瘤靶向性的昆虫病原线虫共生致病杆菌Xenorhabdus stockiae HN_xs01(CCTCC NO:M2012069)，从中分离到了四种具有抗肿瘤活性的次级代谢产物——长沙霉素A、长沙霉素B、长沙霉素C、长沙霉素D；在进一步研究X.stockiae HN_xs01中抗肿瘤活性物质时，筛选到一种具有抗肿瘤活性的三元复合毒素。该三元复合毒素与细菌中普遍存在的SrfABC毒素具有同源性。目前，已有研究报道主要集中在SrfABC类毒素的所在基因岛序列特点、毒素表达调控研究上，有关SrfABC类毒素的认识还存在较大的分歧、矛盾性观点较多；而关于SrfABC毒素的抗肿瘤活性没有相关研究和报道。

发明内容

本发明的目的是，克服现有技术的不足，提供一种具有抗肿瘤活性的三元复合毒素及其制备方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，本发明之具有抗肿瘤活性的三元复合毒素，其编码基因来源于昆虫病原线虫共生致病杆菌Xenorhabdus stockiae HN_xs01(CCTCC NO:M2012069)(参见CN103074282A)，为xsrfABC基因(即SrfABC毒素基因)，xsrfABC基因包含三个开放阅读框(ORF)：xsrfA(1395bp)、xsrfB(3021bp)和xsrfC(2682bp)。xsrfA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，xsrfB的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，xsrfC的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。

SEQ ID NO:1

xsrfA：

SEQ ID NO:2

xsrfB：

SEQ ID NO:3

xsrfC：

本发明之具有抗肿瘤活性的三元复合毒素(XSrfABC)的氨基酸序列，xsrfA基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示，xsrfB基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示，xsrfC基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示。xsrfA编码产物XSrfA由464个氨基酸组成，xsrfB编码产物XSrfB由1006个氨基酸组成，xsrfC编码产物XSrfC由893个氨基酸组成。

SEQ ID NO:4

XSrfA：

SEQ ID NO:5

XSrfB:

SEQ ID NO:6

XSrfC：

本发明还包括序列表SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列以及编码这些氨基酸序列的核苷酸序列。

通过实验发现，XSrfABC复合毒素对肿瘤细胞具有很好的抑制效果。

本发明之具有抗肿瘤活性的三元复合毒素的制备方法：首先我们提取了Xenorhabdus stockiae HN_xs01的基因组，构建了基因组fosmid文库，筛选对Hela细胞具有毒性的克隆子，对克隆子进行测序分析，将xsrfABC基因克隆获得表达载体pSC101-BAD-xsrfABC，将表达载体转化入GB05，得到重组菌株GB05(XSrfABC)，诱导表达XSrfABC毒素。可测定对肿瘤细胞的毒性(参见图1)。(从Xenorhabdus stockiae HN_xs01的基因组fosmid文库中筛选到xsrfABC基因，将xsrfABC基因诱导表达得到复合毒素)。

本发明中，GB05(XSrfABC)重组菌株经诱导后，提取全蛋白对肿瘤细胞Hela、B16进行毒性检测。与空白对照相比，诱导后全蛋白对细胞的影响更为明显，特别是诱导4h全蛋白造成细胞形态变圆，伪足消失，细胞结团，细胞贴壁性降低，细胞数目减少，说明诱导后全蛋白有明显的细胞毒性。说明XSrfABC毒素对肿瘤细胞具有很好的毒性。此外，本发明通过原核表达、纯化制备XSrfABC毒素，提供了一种新型的、细菌来源的抗肿瘤活性物质。XSrfABC毒素对正常细胞——人脐静脉内皮细胞(HUVEC)没有毒性。

本发明之具有抗肿瘤活性的三元复合毒素，还可以采用以下方法制备：(将三个基因片断分别表达三种蛋白，再收集，即得到复合毒素)

为了制备XSrfABC毒素，我们分别构建了XSrfA、XSrfB和XSrfC的原核表达载体，诱导表达复合毒素的各组分，并利用亲和层析纯化毒素蛋白，将三种组分混合后以Hela细胞为靶标进行细胞毒性测定。具体过程：PCR分别扩增xsrfA、xsrfB和xsrfC基因片段，并克隆到表达质粒pGEX-4T-2，获得三个重组质粒：pGEX-4T-srfA，pGEX-4T-srfB，pGEX-4T-srfC(参见图2)。

将三个重组质粒分别电转至E.coli BL21中，获得重组菌株BL21-SrfA、BL21-SrfB、BL21-SrfC。三种重组菌株经IPTG诱导后，均表达可溶性的目的蛋白。将三种可溶性表达蛋白的菌体上清用0.22μm滤膜过滤，用清洗缓冲液清洗GST琼脂糖树脂，加入蛋白裂解液，加入5倍柱体积的洗涤缓冲液洗脱蛋白，重复洗脱一次，加入2倍柱体积Elution buffer洗脱，收集蛋白，SDS-PAGE检测所纯化蛋白的纯度(参见图3)。分别表达再收集的复合毒素。

诱导后复合毒素对肿瘤细胞有明显的细胞毒性。但对正常细胞——人脐静脉内皮细胞(HUVEC)没有毒性。

微生物来源说明

昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01(Xenorhabdus stockiae HN_xs01)；于2012年03月09日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国·武汉·武汉大学)保藏，菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2012069。(参见CN103074282A)

附图说明

图1为表达质粒pSC101-BAD-xsrfABC示意图；

图2为表达质粒pGEX-4T-xsrfA、pGEX-4T-xsrfB、pGEX-4T-xsrfC示意图；

图3为毒素蛋白XSrfA、XSrfB、XSrfC可溶性表达及纯化检测图；

图4为毒素蛋白XSrfABC对Hela细胞的毒性；图中，A，对照(PBS处理肿瘤细胞)；B～F，实验组(毒素蛋白XSrfABC的浓度分别为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl)；

图5为毒素蛋白XSrfABC对B16细胞的毒性；图中，A，对照(PBS处理肿瘤细胞)；B～F，实验组(毒素蛋白XSrfABC的浓度分别为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl)；

图6为毒素蛋白XSrfABC对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的毒性；图中，A，对照(PBS处理人脐静脉内皮细胞细胞)；B～F，实验组(毒素蛋白XSrfABC的浓度分别为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl)。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

本实施例之具有抗肿瘤活性的三元复合毒素，其编码基因来源于昆虫病原线虫共生致病杆菌Xenorhabdus stockiae HN_xs01(CCTCC NO:M2012069)(参见CN103074282A)，为xsrfABC基因(即SrfABC毒素基因)，xsrfABC基因包含三个开放阅读框(ORF)：xsrfA(1395bp)、xsrfB(3021bp)和xsrfC(2682bp)。xsrfA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，xsrfB的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，xsrfC的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:3所示。

本实施例之具有抗肿瘤活性的三元复合毒素(XSrfABC)的氨基酸序列，xsrfA基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示，xsrfB基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示，xsrfC基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示。xsrfA编码产物XSrfA由464个氨基酸组成，xsrfB编码产物XSrfB由1006个氨基酸组成，xsrfC编码产物XSrfC由893个氨基酸组成。

致病杆菌基因组Fosmid文库构建

制备昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01(Xenorhabdus stockiae HN_xs01)过夜菌，提取基因组；用200μL的枪头进行机械剪切50次～100次，回收取目的DNA片段。将基因组DNA末端补齐及磷酸化修复，与载体pCC1FO进行连接，进行噬菌体包装，并感染EPI300-T1R，稀释涂板，涂布在含Cm 12.5μg/mL的LB固体平板上，37℃倒置培养，待克隆子长出。待克隆子都长出，进行计数并做好记录，加2mL LB培养基于第一个平板上，将菌落洗脱下来后吸入另外一个平板上，每两个平板的洗脱液吸入同一个2mL的EP管中，加上终浓度为10wt％的甘油保菌，-80℃保存。

实施例2对肿瘤细胞具有毒性的克隆子筛选

从液氮罐里面取出肿瘤细胞(Hela细胞和B16细胞)冻存管，于37℃水浴锅中快速来回划动使其融化，加入7mL 1640培养基后，放入37℃培养。肿瘤细胞生长24h后倒掉废液，用3mL PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤两次后加入1mL0.25wt％的胰酶于37℃消化30s，加入4mL新鲜培养基终止酶的反应，将细胞按“Z”字打散，1000rpm离心5min，将上清倒掉后加入8mL培养基将细胞悬浮后全部转移到培养皿中，37℃培养。

取出实施例1中所得致病杆菌基因组Fosmid文库克隆管，分别取10μL接种于20mL含Cm(氯霉素)12.5μg/mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养24h；离心收集上述菌体，用去离子水洗涤两次，加入2mL去离子水混匀，进行超声破碎；离心收集上清，将上清溶液通过0.22μm滤膜在超净台中进行过滤，取50μL上清液作用于各肿瘤细胞，筛选出对肿瘤细胞有毒性的Fosmid克隆；对克隆子进行测序分析。

实施例3表达载体pSC101-BAD-xsrfABC的构建

设计引物(hyg-pBAD-F：ACGCGGATCCACCTGCAGTGTTACATTGC；hyg-pBAD-R：ACGCGTCGACATAGTGAATTCCTCCTGCTAGC)，采用高保真Taq酶扩增xsrfABC基因的ORF，扩增反应的条件为94℃5min，(94℃30s，56℃30s，72℃4min)共30个循环，72℃10min。BamH I和SalI双酶切后将其克隆到实验室保存的pSC101-BAD-hyg质粒上，转化大肠杆菌宿主GB05菌株，得到重组菌株GB05(XSrfABC)，诱导表达XSrfABC毒素。并通过PCR鉴定挑选出转化阳性的克隆子，进一步通过测序鉴定。图1为表达质粒pSC101-BAD-xsrfABC示意图。

将XSrfABC毒素配制成不同浓度的溶液，将不同浓度的XSrfABC毒素蛋白加入肿瘤细胞和正常细胞中，培养48h后观察毒素对细胞的作用情况。

图4为毒素蛋白XSrfABC对Hela细胞的毒性；图中，A，对照(PBS处理细胞)；B～F，实验组(毒素蛋白XSrfABC的浓度分别为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl)；

图5为毒素蛋白XSrfABC对B16细胞的毒性；图中，A，对照(PBS处理细胞)；B～F，实验组(毒素蛋白XSrfABC的浓度分别为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl)。

可见复合毒素对两种肿瘤细胞具有毒性，对正常细胞正常。

实施例4表达质粒pGEX-4T-srfA，pGEX-4T-srfB，pGEX-4T-srfC的构建

分别设计引物(srfA-F:ACGCGGATCCATGTGTATTTTTAATAACAAGG，srfA-R:ACGCGTCGACTTAATCTGCCTCTCGCTTTATCG；srfB-F:ACGCGGATCCATGCTGGCAACTATTACTG，srfB-R:ACGCGTCGAC TTAGATTTTAATACTTCCAC；srfC-F:ACGCGGATCC ATGAATCATTTTACTCCTGAAC，srfC-R:ACGCGTCGAC TTACTCCGACGACAATTGAATACG)，采用高保真Taq酶分别扩增xsrfA、xsrfB和xsrfC基因片段，扩增反应的条件为94℃5min，(94℃30s，56℃30s，72℃1～3min)共30个循环，72℃10min。BamH I和SalI双酶切后将其克隆到表达质粒pGEX-4T-2上，转化大肠杆菌宿主GB05菌株，并通过PCR鉴定挑选出转化阳性的克隆，进一步通过测序鉴定。得到重组菌株BL21(SrfA)，BL21(SrfB)，BL21(SrfC)。

实施例5XSrfABC毒素的可溶性表达及表达产物的纯化

将实施例4所得重组菌株BL21(SrfA)，BL21(SrfB)，BL21(SrfC)分别转接至LB液体培养基，37℃，160rpm培养过夜；按2wt％的接种量将过夜菌转接至50mLLB液体培养基中，37℃培养2h，使OD₆₀₀为0.6，进行IPTG诱导。

结果表明，SrfA蛋白在IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)浓度为0.5mM，16℃诱导14h，可以使蛋白可溶性表达的量达到最大；SrfB蛋白在IPTG浓度为0.5mM，16℃诱导过夜，可以使蛋白可溶性表达的量达到最大；SrfC蛋白在IPTG浓度为0.2mM，16℃诱导过夜，可以使蛋白可溶性表达的量达到最大。收集各菌体并超声破碎，收集上清液进行SDS-PAGE检测。分别以空载体pGEX-4T-2的菌体过夜诱导表达的上清为对照，在BL21(SrfA)上清中表达分子量81kDa的目的蛋白条带，在BL21(SrfB)上清中表达分子量为136kDa的目的蛋白条带，在BL21(SrfC)上清中表达分子量为124kDa的目的蛋白条带，表明SrfA，SrfB，SrfC在重组菌株中均得到了可溶性表达。将诱导表达后的三种蛋白的菌体上清用0.22μm滤膜过滤，用10倍柱体积的清洗缓冲液清洗GST琼脂糖树脂，加入蛋白裂解液5mL，封闭底部，4℃结合6h，加入5倍柱体积的洗涤缓冲液洗脱蛋白，重复洗脱一次，加入2倍柱体Elution buffer洗脱，收集蛋白，重复洗脱三次，收集洗脱液，进行SDS-PAGE检测。纯化结果SrfA，SrfB，SrfC蛋白纯度较高，三种蛋白的纯度均在96～98％之间。图2为表达质粒pGEX-4T-xsrfA、pGEX-4T-xsrfB、pGEX-4T-xsrfC示意图；图3为毒素蛋白XSrfA、XSrfB、XSrfC可溶性表达及纯化检测图。

从液氮罐里面取出肿瘤细胞(Hela细胞和B16细胞)冻存管，于37℃水浴锅中快速来回划动使其融化，加入7mL 1640培养基后，放入37℃培养24h，倒掉废液，用3mL PBS洗涤两次后加入1mL 0.25％的胰酶进行37℃消化30s，加入4mL新鲜培养基终止酶的反应，将细胞按“Z”字打散，1000rpm离心5min，将上清倒掉后加入8mL培养基将细胞悬浮后全部转移到培养皿中，37℃培养。待细胞状态极佳时，将细胞进行悬浮，通过血球计数板进行计数，加入培养基调整细胞悬液浓度(2×10⁴细胞/mL)，将调整好的细胞悬液按100μL/孔加入到96孔板中。

将毒素蛋白XSrfA、XSrfB、XSrfC混合后，配制浓度为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl的溶液，37℃孵育48h后观察毒素对正常细胞、Hela细胞和B16细胞的作用情况。结果表明，混合毒素对两种肿瘤细胞具有毒性，对正常细胞无素性。

将毒素蛋白XSrfA、XSrfB、XSrfC分别配制浓度为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl的溶液，分别于37℃孵育48h后观察毒素对正常细胞、Hela细胞和B16细胞的作用情况。结果表明，所有浓度的单独的毒素蛋白XSrfA或XSrfB或XSrfC对正常细胞、Hela细胞和B16细胞均没有毒性。

将毒素蛋白XSrfA、XSrfB混合，配制浓度为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl的溶液，分别于37℃孵育48h后观察毒素对正常细胞、Hela细胞和B16细胞的作用情况。结果表明，XSrfA、XSrfB混合蛋白对正常细胞、Hela细胞和B16细胞均没有毒性。

将毒素蛋白XSrfA、XSrfC混合，配制浓度为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl的溶液，分别于37℃孵育48h后观察毒素对正常细胞、Hela细胞和B16细胞的作用情况。结果表明，XSrfA、XSrfC混合蛋白对正常细胞、Hela细胞和B16细胞均没有毒性。

将毒素蛋白XSrfB、XSrfC混合，配制浓度为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl的溶液，分别于37℃孵育48h后观察毒素对正常细胞、Hela细胞和B16细胞的作用情况。结果表明，XSrfB、XSrfC混合蛋白对正常细胞、Hela细胞和B16细胞均没有毒性。

序列表

<110> 湖南师范大学

<120> 一种具有抗肿瘤活性的三元复合毒素及其制备方法

<160> 6

<210> 1

<211> 1395

<212> DNA

<213>昆虫病原线虫共生致病杆菌Xenorhabdus stockiae HN_xs01（CCTCC NO:M2012069）

<220>

<400>1

atgtgtattt ttaataacaa ggaacggttt accgtggaag aaacattttt acgtggtgat 60

aagctcgaaa gttatttgcc aatgggggag aatggtcagg ccgtccacct ttcggcacta 120

caactacgtg aaactttacg tttgcggcag ctttctgaag tagctaactc tctggctatt 180

ccgcaagtta atgaacaagg tgatcgtatt gattggtacg cgagcttttc cggtaatgtt 240

gttccttggg cggctgcaac ggatgatgaa cgtcaagctg cattgaaaca actggaagct 300

aataaagtgg caatcgagca actcagtgct caaatgttaa gtcaaaagac gcatgaaatg 360

cgtctttttg gggccttgtt gagtaagacg atacaatttc ctgataagga tcatgtatat 420

ttggtcgatg gtaaacccgt attgactttt tggggatttg tcaatgctca gcaacaggct 480

cgccctaatc cttttgattg cctaaaatta aaccgtcctg ctccctctaa tactggaaaa 540

tctactgata tcccgccagt tcctacaaca ctcgctaagc catctgtaaa aatagaagaa 600

gtaatttcaa tatcccgttc agcgggaaaa cagactcggc gttgggtaat accacgttgg 660

ttgtggtggg tgttacccat tttattgctt tttatcttac ttatgttagt gcgcggctgt 720

gtacccaatt ggtatttttg gggagtatca ccttccactc atcttgtttc tgaacttcca 780

atgcgggaag agaaaaattt gcaagatgga aaaagaatat tattaccacc agaaatagct 840

gtttctccgc cagagacaaa tactattgac tcaatgaatc caactttgtc tacacagtca 900

aatgtaccta ctacaccgac tgtaggcatg aattctacat ctggtaaggt atcaatacct 960

tcacctttat caacagccgc taatattccc cctgtattgt taacagttcc atctgttgat 1020

gcactagtga tccctgataa tgctgtacaa aaaggaaccg ttgattttct caatggacgt 1080

tggtacgcgg gagcaggaat tcaggatatc cgaacgggta aacccctaag attgatgtat 1140

caaattactg atggcaaagg atttgttgaa atggttcgtg gagatggtat tcgttgccaa 1200

gcacctgtca cagcggctat ggaatccggt agcttaaaat tggataacca tgatgaagca 1260

aagtgcagcg atggttcaac ttatactatg cctgaagtta tctgtcagtc agatagtcaa 1320

ggtgtaacgg cgtgcacagg acgctataac gaaaaaactt tatttcctat gtcgataaag 1380

cgagaggcag attaa 1395

<210>2

<211> 3021

<212> DNA

<220>

<400>2

atgctggcaa ctattactga ttttaaagaa aaagttaccc tgattcgtga cagcggtatc 60

cagtttctgg attttgcttt tgcacttcct aaccgcaaaa tctacggcga attcttgctg 120

ggaggagaaa ataatccgct tattcgtctg gtgtacaatg aacgggaaga tacttttcag 180

gttcctgcct catcaggttc tgctgcattt tcagcagaac ctgattaccc attggcattg 240

gaaaagtcac ttgagattta taatgatatc tggttaccac tgccattctt ccgttttaac 300

tccccaaaat gttttgctca ggggccaact aactggtcac gaataaaatt tcatgcactt 360

gatacaccgg atgaacaagg aaatacgtgg cgcgtcactt tggcttttga taccaaagtt 420

cttccagaca gaaggaatac gcaatatctg gctccctgtg atgatgatgt ccgttctggg 480

gtgggttttg cactggcaga aaatcaccat gaaatgggag attttctgtt attgaggtgg 540

gtagatgatt ggttacggga aagctattcc gagcgtgcgg cttcattgtg gcgtttatat 600

catgaagata ttgagcacaa tctgaatcag agggaacacc aggggcatta tcttaattta 660

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cgtgaaggct ttaaagttgc cggtgacgat attttattag atatcatcca attctattta 1860

cagcccgcat ttaaggccgc attgttgaat atcggctatc aggatttaga tgcagaagcg 1920

gtgatgtcgc gtctgtttgg cagcgaagca ttggatgctg gtaaacaggt attgcgtcag 1980

caactgacat tgcagatatt ttcacctata gcactggcta ttctgcatcg ctatgagaaa 2040

tttaccccag gctccagtga gcaggttatt agtacaacat ttggtgagtt actcccccat 2100

ctgcctacag ataaggtatg tagctatgtg gatgatgaag ttaaacgttg tttaccgata 2160

gggaacaata actcgttttc aatacttgat gtgccgttga atatcaattt gacgcagctt 2220

cataatgagt ttattgatgc ctacaatatt cgtttcaata tttgtcatag cctgcgagcg 2280

ttgtgtgaag tgctttggta ttacaattgc gatatgttgt tattaaccgg gcgtccctct 2340

cgtttacccg gaattcaggc actaatccgt cagctacagc cagttcctcc tgcccgtatc 2400

ctccctttac atggttatga aactgggggg tggtatccgt tcaataagaa aggtctgatt 2460

gaagatccta aatccactgc ggcggtgggc gcaatgttgt gtcttctggc ggaaaaatca 2520

cgtctgagta atttttactt ccgtactgcc aattttaagc cttattcaac aatccgttat 2580

ctgggaatgc ttgacagtaa caacttgttg aaagacagca acgtgtttta tagaaacatt 2640

gatttagaca catcaggatt ccaattggat aatcaccaat actttgaagt acgtggtgaa 2700

atgcgaatcg gttttcgcca gcttgataac gaacgttggc ctgcgacgcc actgtatact 2760

ttaaaaattc cgggggcacg tttagcgacg gctttatctg gtgatgcagt attgaggctg 2820

aagctggaag tagaagaggg acgtgggcca gatgcagaag ctaatggcag ccctgaaaaa 2880

ttccgtatca gtgaaataga tattgttggt tctgaacaaa atcctcgtaa gcaggatatt 2940

agttttaaat tgaatacatt agccggcaat ggactgggtg aaattcatta ttggctcgac 3000

agtggaagta ttaaaatcta a 3021

<210>3

<211> 2682

<212> DNA

<220>

<400>3

atgaatcatt ttactcctga acagttaaaa agagagtggc ttagtgttgc ggaaggtgca 60

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ctatttaatg aagtggaaat cgctaagatc ttcgcgaata cgttcattca tgatttcaat 480

caggaaaaga ttgactggag ttatgatgaa aaacgtatag gtgatttact tacctcacta 540

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gggcgtctgg gagtggagtc taccgcttat tttcagcaaa tgactgaaaa cgatgacagc 1140

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aaagatgttg gtggagtact tgacgagtgg atccgttata cccaaggagt ggatgctgta 1320

agccgttccc gtcgtccatc gggattagtt tgggcaatca ctaaactcga tttacggatc 1380

acccaagagc tgaataaatc agaagatatg ttacgtgagg tgtggggaca gggtggaatg 1440

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gaaacactgg tggatgaatt gatcactgcg atccagagaa tggatattga aggtgaattg 2280

gtaaatgtat tagcaaatac agaacaagca ggtgtgcgtc gggagaaaat ggtggaacgt 2340

caggtatccc gtgtgttgaa cgtcataaac gatttcatca cttggctggg ataccaaaaa 2400

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<210>4

<211> 464

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<400>4

Met Cys Ile Phe Asn Asn Lys Glu Arg Phe Thr Val Glu Glu Thr Phe

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Leu Arg Gly Asp Lys Leu Glu Ser Tyr Leu Pro Met Gly Glu Asn Gly

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<211> 1006

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<400>5

Met Leu Ala Thr Ile Thr Asp Phe Lys Glu Lys Val Thr Leu Ile Arg

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Asp Ser Gly Ile Gln Phe Leu Asp Phe Ala Phe Ala Leu Pro Asn Arg

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Lys Ile Tyr Gly Glu Phe Leu Leu Gly Gly Glu Asn Asn Pro Leu Ile

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Arg Leu Val Tyr Asn Glu Arg Glu Asp Thr Phe Gln Val Pro Ala Ser

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<220>

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Leu Gly Thr Ile Ile Glu Arg Ile Gln Leu Ser Ser Glu

885 890

Claims

1.三元复合毒素在制备抑制Hela细胞的药物中的用途，其特征在于，所述三元复合毒素的编码基因来源于昆虫病原线虫共生致病杆菌Xenorhabdus stockiae HN_xs01，为xsrfABC基因，xsrfABC基因包含三个开放阅读框：xsrfA、xsrfB和xsrfC，xsrfA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示，xsrfB的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 2所示，xsrfC的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 3所示；xsrfA基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表SEQID NO: 4所示，xsrfB基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID NO: 5所示，xsrfC基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID NO: 6所示。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述三元复合毒素的制备方法包括以下步骤：首先提取了Xenorhabdus stockiae HN_xs01的基因组，构建了基因组fosmid文库，筛选对Hela细胞具有毒性的克隆子，对克隆子进行测序分析，将xsrfABC基因克隆获得表达载体pSC101-BAD-xsrfABC，将表达载体转化入GB05，得到重组菌株GB05，诱导表达XSrfABC毒素。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述三元复合毒素的制备方法还包括以下步骤：分别构建了XSrfA、XSrfB和XSrfC的原核表达载体，诱导表达复合毒素的各组分，并利用亲和层析纯化毒素蛋白，将三种组分混合。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述三元复合毒素的制备方法还包括以下步骤：PCR分别扩增xsrfA、xsrfB和xsrfC基因片段，并克隆到表达质粒pGEX-4T-2，获得三个重组质粒：pGEX-4T-srfA，pGEX-4T-srfB，pGEX-4T-srfC；

将三个重组质粒分别电转至E. coli BL21中，获得重组菌株BL21-SrfA、BL21-SrfB、BL21-SrfC；三种重组菌株经IPTG诱导后，均表达可溶性的目的蛋白；将三种可溶性表达蛋白的菌体上清用0.22 μm滤膜过滤，用清洗缓冲液清洗GST琼脂糖树脂，加入蛋白裂解液，加入5倍柱体积的洗涤缓冲液洗脱蛋白，重复洗脱一次，加入2倍柱体积Elution buffer洗脱，收集蛋白，将分别表达再收集的三种蛋白混合。