CN103074282A - 一株肿瘤靶向细菌及其菌剂制备方法与代谢产物 - Google Patents
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Abstract
一株肿瘤靶向细菌及其菌剂制备方法与代谢产物,该肿瘤靶向细菌是昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01,XenorhabdusstockiaeHN_xs01;该菌种于2012年03月09日在中国典型培养物保藏中心保藏,菌种保藏编号为CCTCCNO:M2012069。本发明还包括该肿瘤靶向细菌的菌剂制备方法与代谢产物。本发明之肿瘤靶向细菌通过静脉注射后能特异积聚于小鼠肿瘤部位,而在小鼠的肝、肾、脾等正常组织和器官不能定殖,具有极强的肿瘤靶向性,通过最终肿瘤的重量比较,得到抑瘤率为60~100%,对小鼠黑色素瘤表现出很好的体内抗肿瘤效果。
Description
技术领域
本发明涉及一株肿瘤靶向细菌及其菌剂制备方法与代谢产物,尤其是涉及一株肿瘤靶向细菌昆虫病原线虫共生致病杆菌及其菌剂制备方法与代谢产物。
背景技术
癌症已成为当今世界人类的主要杀手。传统治疗癌症的方法如放射疗法、化学疗法以及外科手术切除法,对一半的癌症患者没有效果。随着医疗技术的进步,光能疗法、人类α-乳清蛋白疗法(HAMLET)、高温疗法、射频疗法、饮食疗法、胰岛素增强疗法、基因治疗、端粒酶治疗、二氯乙酸(DCA)治疗和细菌治疗等方法被用于癌症的治疗,但这些新的方法都有各自的弊端,无法大规模用于临床治疗。
靶向抗肿瘤是指在特定的导向机制作用下,将具有抗肿瘤活性的物质输送到肿瘤部位,但在机体其他组织或器官中不存在或存在很少,从而起到特异性杀伤肿瘤的效果,其具有用药量少、专一性强、毒副作用低、作用时间长等特点。近年来,细菌靶向治疗肿瘤成为一大研究热点。肿瘤内部存在低氧区,是传统的肿瘤治疗如放疗、化疗等方法效果不佳的主要原因,但部分厌氧或兼性厌氧细菌能在此微环境中繁殖生长,通过竞争有限的营养、分泌细胞毒素来消除肿瘤,而不会扩散到机体其他部位。另外,细菌具有能动性、抗生素敏感性及载运和表达多种抗肿瘤药物的能力,突显了其在临床应用中的潜力。细菌靶向治疗肿瘤在经过长时间且广泛的研究后,先后挖掘出梭状芽孢杆菌(Clostridium sp.)、鼠伤寒沙门氏菌(S. choleraesuis)、双歧杆菌(B. adolescentis)、大肠杆菌(E. coli)、霍乱弧菌(V. cholerae)、单核细胞增多性李斯特细菌(L. monocytogenes)等细菌用于靶向肿瘤治疗,但这些细菌作用方式单一且存有各种不足,如具有较强毒力的菌株在杀死肿瘤细胞的同时也对机体产生较强的毒性,而毒性较弱的菌株虽然有很高的肿瘤靶向性且对机体毒力较弱,但对肿瘤抑制效果较弱;对于坏死区域较小的早期肿瘤及外围含氧量较高的肿瘤,不适合厌氧菌的生长,兼性厌氧菌虽能弥补这一缺点,但肿瘤靶向性不强。
昆虫病原线虫共生菌是一类与线虫互惠共生的革兰氏阴性细菌,属肠杆菌科,存在于线虫肠道内,分为致病杆菌属(Xenorhabdussp.)和发光杆菌属(Photorahbdussp.),分别与斯氏线虫(Steinernema)和异小杆线虫(Heterorhabditis)共生,已有的研究表明该类细菌具有广谱高效杀虫、抑菌及体外抗肿瘤等生物活性,但有关该类细菌的体内抗肿瘤效果和肿瘤靶向性研究国内外尚无报道。
虽然有关细菌靶向治疗肿瘤的研究起始较早,但在已经研究过的细菌中,具有较好抗肿瘤效果和较强肿瘤靶向性且对机体毒性较小的野生型菌株存在极少。厌氧细菌虽能特异积聚于肿瘤的无氧区,但在较大肿瘤的外围区域或早期肿瘤内,受到氧气影响而无法生存,对肿瘤的消除不彻底;兼性厌氧细菌虽能存在于肿瘤的有氧区域,但肿瘤靶向性不强,同时也能分布于机体的其他组织或器官中。高毒力菌株虽能对肿瘤具有较强的杀伤作用,但其同时也对机体有较大的毒副作用;低毒力菌株虽对机体毒副作用较低,但其抗肿瘤效果不强。
昆虫病原线虫共生菌是一类与线虫互惠共生的革兰氏阴性细菌,存在于线虫肠道内,属肠杆菌科(Enterobacteriaceae),人们对该类细菌的研究起步相对较晚,主要集中于杀虫和抑菌两个方面,而在抗肿瘤方面的研究极少,只是初步尝试了个别菌株的体外抗肿瘤细胞活性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是,克服现有技术的不足,提供一株肿瘤靶向细菌及其菌剂制备方法与代谢产物,该菌株具有极强的肿瘤靶向性,并且其菌剂与代谢产物具有较好的体内抗肿瘤效果。
本发明解决所述技术问题采用的技术方案是:
一株肿瘤靶向细菌,是昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01(Xenorhabdus stockiae HN_xs01);该菌种于2012年03月09日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC,地址:中国·武汉·武汉大学),保藏编号为CCTCC NO:M 2012069。
本发明之肿瘤靶向细菌-昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01(Xenorhabdus stockiae HN_xs01)的分离鉴定:采用土壤线虫分离法,结合NBTA鉴别培养基(NBTA培养基),从云南德宏傣族景颇族自治洲盈江县太平乡采集的土样中直接分离得到一株具有昆虫病原线虫共生菌性状的蓝色细菌,经菌落形态观察、革兰氏染色、镜检和16S rRNA基因同源性分析等方法鉴定该菌株为Xenorhabdus属,stockiae种,命名为昆虫病原线虫致病杆菌HN_xs01(Xenorhabdus stockiae HN_xs01),其16S rRNA基因在Genbank中的登录号为HQ840745.1。
本发明之肿瘤靶向细菌-昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01菌剂制备方法:
利用昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01易于培养,发酵周期短的特性,制备该菌体制剂。主要工艺流程包括菌种活化、一级发酵培养、二级种子罐发酵培养和生产用发酵罐培养,发酵完成后,收集菌液,离心收集菌体,生理盐水洗涤,快速冷冻,真空干燥并包装,-20℃保藏,使用时,根据个体差异用生理盐水溶解通过瘤内或静脉给药。
活菌菌剂制备的具体过程如下:
(1)菌种活化,将保藏于-80℃冰箱中的昆虫病原线虫共生致病杆菌 HN_xs01划线接种于NBTA培养基上,30℃条件倒置培养36~48 h;然后挑取单菌落划线,以作进一步的纯化;
(2) 一级发酵培养和二级种子罐发酵培养:挑取经再次纯化后的Xenorhabdus stockiae HN_xs01接种LB液体培养基中,30℃下180~200 rpm振荡培养12h至对数生长中期,然后将10 mL培养液接种于1000 mL LB液体培养基中,30℃下180~200 rpm振荡培养12~24h,得一级种子罐发酵菌液;将二级种子罐在121℃下灭菌30min,装入发酵罐培养基后再灭菌,冷却至25~30℃,将一级种子罐发酵液按体积比4%~5%接种量接入二级种子罐,通入无菌空气1.8立方米/小时,并以180 rpm的速度搅拌进行培养,培养12~24h,得二级种子罐发酵菌液;
(3) 生产用发酵罐培养,先将发酵罐灭菌,121℃,压力1.2-1.3 kg/cm2条件下灭菌30min,装入发酵罐培养基后再以121℃条件灭菌25min,保压降温至25℃~30℃,按体积比4%~5%的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养,通入无菌空气,通气量3升/分钟,温度30℃,搅拌转速为200rpm,培养36h;
(4)制备制剂:当菌体的发酵液密度≥20g.L-1,菌体量不足1020g.L-1时放罐,收集菌液,11000 rpm,2 min离心收集菌体,生理盐水洗涤6-8遍,先使微生物在极低温度-70℃下快速冷冻,然后在减压下利用升华现象除去水分(真空干燥,真空度-0.1Mpa,真空包装在玻璃瓶中,-20℃保藏,即成。
使用时,根据个体差异用生理盐水溶解,通过瘤内或静脉给药。
所述培养基的配方及制备:
LB液体培养基配方:蛋白胨10 g.L-1,NaCl 10 g.L-1,酵母提取物5 g.L-1,水溶,灭菌前pH值7.0~7.4,121℃,20 min条件湿热灭菌;
NBTA培养基配方:营养琼脂45 g,红四氮唑0.04 g,溴麝香草酚蓝0.025 g,容于1 L单蒸水中,121℃,20 min条件湿热灭菌;
发酵罐培养基配方:蛋白胨20g.L-1,酵母浸粉12g.L-1,NaCl 10 g.L-1,葡萄糖13.7 g.L-1,K2HPO4 2.3 g.L-1,KH2PO4 1.5 g.L-1,MgSO4 . 7H2O 0.25 g.L-1,水溶,pH值7.0~7.4。
昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01产生的抗肿瘤天然产物分离纯化、鉴定及粉剂制备。将昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01在生产用发酵罐中以30℃,200 rpm发酵培养72 h,发酵培养液11000 rpm离心10 min,收集上清,使用Rohm and Hass公司生产的XAD-11吸附树脂进行吸附,依次用甲醇、丙酮、乙酸乙酯萃取XAD-11吸附树脂,再经高效液相色谱纯化,质谱分析,核磁共振进行结构解析,结合肿瘤细胞毒性实验,筛选出具有较高抗肿瘤活性的次级代谢产物,并制备成方便储运的粉剂。
昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01所产生的具有较高抗肿瘤活性的次级代谢产物为苯乙酰胺类衍生物和大环内酯类化合物,分别命名为长沙霉素A(Changshamycin A, m/z 843)、长沙霉素B(Changshamycin B, m/z 785)、长沙霉素C(Changshamycin C, m/z 672)和长沙霉素D(Changshamycin D, m/z 560),分子结构如下所示,具有很好的抗肿瘤活性。
抗肿瘤生物活性和肿瘤靶向性:昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01经过夜培养后,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次,通过静脉注射5×105~5×107个细菌到荷瘤小鼠体内,每隔6天注射一次,对照组注射磷酸盐缓冲液,用电子天平和游标卡尺每天记录荷瘤小鼠体重和肿瘤大小,连续观测9 天后,采用颈椎脱臼法处死小鼠并解剖,取出其肝、肾、脾和肿瘤分别置于洁净的EP管中称重,计算抑瘤率(),之后肝、肾、脾和肿瘤等各组织和器官分别通过200目细胞筛研磨,每克组织加入5 ml无菌PBS(pH 7.4),分别取悬液500 μL,50 μL及5 μL 3梯度均匀涂抹于NBTA培养基上,30℃倒置培养24 h,观察各器官和肿瘤中的细菌分布情况。
研究结果表明,昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01通过静脉注射后能特异积聚于小鼠肿瘤部位,而在小鼠的肝、肾、脾等正常组织和器官不能定殖,具有极强的肿瘤靶向性,通过最终肿瘤的重量比较,得到抑瘤率为60~100%,对小鼠黑色素瘤表现出很好的体内抗肿瘤效果。
体内抗肿瘤机制。荷瘤小鼠注射有昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01后3~5天,解剖小鼠,取出肿瘤组织切片并进行HE染色(苏木精-伊红染色),通过观察肿瘤组织形态,初步确定昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01体内抗肿瘤作用方式,主要集中在三个方面:产生抗肿瘤活性次级代谢产物长沙霉素A、长沙霉素B、长沙霉素C和长沙霉素D(Changshamycin A, ChangshamycinB, Changshamycin C and Changshamycin D)、抑制肿瘤微血管的生成和诱发肿瘤部位炎症反应。
附图说明
图1是本发明之昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01(Xenorhabdus stockiae HN_xs01)在NBTA培养基上的菌落形态图;
图2是本发明之昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01(Xenorhabdus stockiae HN_xs01)在LB固体培养基上的菌落形态图;
图3是本发明之昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01(Xenorhabdus stockiae HN_xs01)的革兰氏染色图(放大2000倍);
图4是本发明之昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01(Xenorhabdus stockiae HN_xs01)的透射电子显微镜镜检图;
图5 是本发明之昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01(Xenorhabdus stockiae HN_xs01)细菌菌剂和抗肿瘤天然产物粉剂的制备流程图;
图6和图7是本发明之昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01(Xenorhabdus stockiae HN_xs01)实施例静脉注射对C57BL/6荷瘤小鼠肿瘤大小和体重的影响图;
图8是本发明之昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01(Xenorhabdus stockiae HN_xs01)实施例静脉注射对C57BL/6荷瘤小鼠器官和肿瘤重量的影响图;
图9是本发明实施例静脉注射昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01(Xenorhabdus stockiae HN_xs01)后,Xenorhabdus stockiae HN_xs01在C57BL/6荷瘤小鼠组织器官中分布情况图;
图10是本发明实施例之PBS对照处理的C57BL/6小鼠肿瘤组织的HE染色图(放大100倍);
图11是本发明实施例之Xenorhabdus stockiae HN_xs01处理的C57BL/6小鼠肿瘤组织的HE染色图(放大100倍);
图12是本发明实施例之PBS对照处理的C57BL/6小鼠肿瘤组织的HE染色图(放大400倍);
图13是本发明实施例之Xenorhabdus stockiae HN_xs01处理的C57BL/6小鼠肿瘤组织的HE染色图(放大400倍);
图14是本发明实施例之PBS对照处理的C57BL/6小鼠肿瘤组织的HE染色图(放大1000倍);
图15是本发明实施例之Xenorhabdus stockiae HN_xs01处理的C57BL/6小鼠肿瘤组织的HE染色图(放大1000倍);
图16是本发明实施例之Xenorhabdus stockiae HN_xs01处理的C57BL/6小鼠肿瘤组织的中性粒细胞聚集区域HE染色图(放大400倍);
图17是图16中性粒细胞聚集区域HE染色放大图(放大1000倍)。
微生物保藏情况说明
昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01(Xenorhabdus stockiae HN_xs01);于2012年03月09日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC,地址:中国·武汉·武汉大学)保藏,菌种保藏编号为CCTCC NO:M 2012069。
具体实施方式
实施例
本实施例之肿瘤靶向细菌,是昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01(Xenorhabdus stockiae HN_xs01);该菌种于2012年03月09日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏,菌种保藏编号为CCTCC NO:M 2012069。
本实施例之昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01(Xenorhabdus stockiae HN_xs01)的具体分离过程:从云南德宏傣族景颇族自治洲盈江县太平乡采集土样,采用贝尔曼漏斗法收集线虫,无菌磷酸缓冲液洗涤2~3次,在无菌研钵中加无菌水研磨,取适量匀浆涂布于鉴别培养基NBTA培养基平板上,30℃条件下培养48 h,从平板上挑取单菌落再次稀释划线于NBTA培养基上,30℃条件下培养48 h,将重复分离纯化到的单菌落接种到LB液体培养基摇瓶中,30℃,180 rpm,培养36 h,在最终所得菌液中加入与菌液等体积的50%(v/v)的甘油水溶液,-80℃冰箱中长期保藏。
将从NBTA培养基上分离纯化到的蓝色菌落接种到LB、NBTA固体培养基平板上,30℃条件下培养48 h,观察菌落形态、色素产生及生物染色剂的吸收情况。同时,将该单菌落转接到装有10 ml LB液体培养基的50 ml摇瓶中,30℃,180 rpm,培养24 h,进行革兰氏染色与电子显微镜观察。
革兰氏染色过程:取菌液5 μl,涂片并固定;结晶紫染色1min,水洗并用吸水纸吸干;碘液媒染1min,水洗并吸干;用体积浓度为95%的酒精脱色,直到酒精不出现紫色时即停止(大约0.5 min),立即水洗,并吸干;番红复染3 min,水洗并吸干;在光学显微镜油镜头下观察菌体形状与颜色。
电子显微镜观察:
取菌液1.5 ml,6000 rpm,3 min,离心,去上清,PBS缓冲液洗涤两次,最后用300 ??L PBS缓冲液重悬菌体,在透射电子显微镜下观察单个菌体。
图1~图4是昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01经分离纯化后的形态特征图。其中图1和图2分别是Xenorhabdus stockiae HN_xs01在NBTA培养基、LB固体培养基培养48 h后的菌落形态图。图2中,在LB固体培养基培养上,菌珠表现为圆形黄色菌落,直径1~3 mm不等,不透明,边缘整齐,颜色较浅,稍微隆起,中心颜色较深,较湿润,有粘性,有光泽。图1中,在NBTA培养基上,呈现出两种不同的菌落形态,其中蓝色菌落为初生型菌株(Ⅰ型),红色菌落为次生型菌株(Ⅱ型),I型菌落生长成圆形,隆起,边缘整齐,为浅蓝色并稍为透明,中心为深蓝色,有粘性,Ⅱ型菌落生长成圆形,稍微隆起,边缘整齐,为浅灰色,不透明,中心为红色,粘性低。图3是对Xenorhabdus stockiae HN_xs01进行的革兰氏染色图,革兰氏染色为阴性杆状细菌,不产生芽孢。图4是该菌株的扫描电镜图,透射电子显微镜下观察,其宽度为1 μm,细胞宽度一致,长短变化较大,颜色深浅不均,有荚膜。
根据分离菌株16S rRNA基因构建的系统发育树的具体实施过程:从NBTA培养基上挑取单菌落,转接到含有1.4 ml LB液体培养基的1.5 ml Ep管中,在管盖上用注射器针头扎小孔,30℃,1000 rpm,振荡培养24 h后,使用细菌基因组DNA提取试剂盒,按操作步骤进行全基因组提取。根据昆虫病原线虫共生菌16S rRNA基因序列设计通用引物(Bf-F,AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;Bf-R,ACGGCTACCTTGTTACGACTT)并由生工(上海)生物技术有限公司合成。按以下反应体系和反应条件进行16S rRNA基因扩增:
反应体系(30 μL):无菌双蒸水,21.5 μL;Buffer,3 μL;dNTP,2 μL;Bf-R(10 μM),1 μL;Bf-F(10 μM),1 μL;基因组模板,1 μL ;Pyrobest DNA Polymerase,0.5 μL
反应程序:预变性 94℃ 4 min,变性 94℃ 30 s,退火 58.5℃ 30 s,延伸 72℃ 90 s,30次循环,延伸 72℃ 10 min。
PCR产物经多功能DNA纯化回收试剂盒纯化,与适量引物一起送交上海英骏生物技术有限公司测序。将测得的HN_xs01的16S rRNA基因序列,与在美国国家生物技术信息中心(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中Blast得到的19个致病杆菌属(Xenorhabdussp.)不同菌种的16S rRNA基因序列及其他5个外来群种(Photorhabdus luminescens、Escherichia coli、Pseudomonas sp.、Rhizobium giardinii、Bacillus subtitis)的16S rRNA基因序列进行同源性比对分析,并构建系统发育树(Replications=1000,Bootstrap值取百分比)。同时,将16S rRNA基因序列提交到NCBI的GenBank数据库中。
本实施例之昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01活菌菌剂制备:
(1)菌种活化,将保藏于-80℃冰箱中的昆虫病原线虫共生致病杆菌 HN_xs01划线接种于NBTA培养基上,30℃条件倒置培养48 h;然后挑取单菌落划线,30℃条件倒置培养48 h,以作进一步的纯化;
(2)一级和二级种子发酵菌液的制备:挑取经再次纯化后的Xenorhabdus stockiae HN_xs01接种LB液体培养基中,30℃下180 rpm振荡培养12h至对数生长中期,然后将10 mL培养液接种于1000 mL LB液体培养基中,30℃下180 rpm振荡培养24h,得一级种子罐发酵菌液;将二级种子罐在121℃下灭菌30 min,装入发酵罐培养基后再灭菌,冷却至30℃,将一级种子罐发酵液按体积比5%接种量接入二级种子罐,通入无菌空气1.8立方米/小时,培养24h并搅拌(180 rpm)进行培养,得二级种子罐发酵菌液;
(3) 生产用发酵罐培养,先将发酵罐灭菌,121℃,压力1.2 kg/cm2条件下灭菌30min,装入发酵罐培养基后再以121℃条件灭菌25 min,保压降温至30℃,按体积比5%的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养,通入无菌空气,通气量3升/分钟,温度30℃,搅拌转速为200 rpm,培养36 h;
(4)制备制剂:当菌体的发酵液密度≥20 g.L-1,菌体量不足1020 g.L-1时放罐,收集菌液,11000 rpm,2 min离心收集菌体,生理盐水洗涤8遍,先使微生物在极低温度(-70℃)下快速冷冻,然后在减压下利用升华现象除去水分(真空干燥,真空度-0.1Mpa),真空包装在玻璃瓶中,-20℃保藏,即成。
使用时,根据个体差异用生理盐水溶解,通过瘤内或静脉给药。
本实施例中所使用的培养基配方:
LB液体培养基配方:蛋白胨10 g.L-1,NaCl 10 g.L-1,酵母提取物5 g.L-1,水溶,灭菌前pH值7.0~7.4,121℃,20 min条件湿热灭菌;
NBTA培养基配方:营养琼脂45 g,红四氮唑0.04 g,溴麝香草酚蓝0.025 g,容于1 L单蒸水中,121℃,20 min条件湿热灭菌;
发酵罐培养基配方:蛋白胨20g.L-1,酵母浸粉12g.L-1,NaCl 10 g.L-1,葡萄糖13.7 g.L-1,K2HPO4 2.3 g.L-1,KH2PO4 1.5 g.L-1,MgSO4 . 7H2O 0.25 g.L-1,水溶,pH值7.0~7.4。
昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01产生的抗肿瘤天然产物粉剂制备:
将昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01在生产用发酵罐中以30℃,200 rpm发酵培养72 h,发酵培养液11000 rpm离心10 min,收集上清,使用Rohm and Hass公司生产的XAD-11吸附树脂进行吸附,依次用甲醇、丙酮、乙酸乙酯萃取XAD-11吸附树脂,再经高效液相色谱纯化,质谱分析,核磁共振进行结构解析,结合肿瘤细胞毒性实验,筛选出具有较高抗肿瘤活性的次级代谢产物,并制备成方便储运的粉剂。
粉剂的具体制备过程如下:
(1)菌种活化,将保藏于-80℃冰箱中的昆虫病原线虫共生致病杆菌 HN_xs01划线接种于NBTA培养基上,30℃条件倒置培养48 h;然后挑取单菌落划线,30℃条件倒置培养48 h,以作进一步的纯化;
(2)一级和二级种子发酵菌液的制备:挑取经再次纯化后的Xenorhabdus stockiae HN_xs01接种LB液体培养基中,30℃下180 rpm振荡培养12h至对数生长中期,然后将10 mL培养液接种于1000 mL LB液体培养基中,30℃下180 rpm振荡培养24h,得一级种子罐发酵菌液;将二级种子罐在121℃下灭菌30 min,装入发酵罐培养基后再灭菌,冷却至30℃,将一级种子罐发酵液按体积比5%接种量接入二级种子罐,通入无菌空气1.8立方米/小时,并搅拌(180 rpm)进行培养,培养24h,得二级种子罐发酵菌液;
(3) 生产用发酵罐培养,先将发酵罐灭菌,121℃,压力1.2 kg/cm2条件下灭菌30min,装入发酵罐培养基后再以121℃条件灭菌25 min,保压降温至30℃,按体积比5%的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养,通入无菌空气,通气量3升/分钟,温度30℃,200 rpm发酵培养72 h;
(4) 粉剂制备,生产用发酵罐发酵培养液11000 rpm离心10 min,收集上清,向上清中加入体积分数为2%的XAD-11吸附树脂进行吸附,2天后过滤收集XAD-11吸附树脂,单蒸水洗2次,依次用甲醇、丙酮和乙酸乙酯萃取,萃取溶剂用量与原发酵培养液体积比为3︰10,提取物经真空1.3kPa,-50℃冷冻干燥后重溶于水,用于各溶剂萃取物对肿瘤细胞毒性检测,发现甲醇萃取剂萃取得到的物质具有较强的肿瘤细胞毒性。采用高效液相色谱对甲醇萃取剂作进一步纯化,使用的高效液相色谱仪为AKTA punfier 10,色谱柱为YMC-Pack ODS(C18)反相柱(4.6×150 mm),流动相A2和B1分别为水和乙腈,使用梯度为乙腈0~100%,历时50 min,流速为0.5 mL/min,检测波长为215 nm和254 nm。收集各峰用于肿瘤细胞毒性实验,最终确定4个主要的抗肿瘤活性组份,进一步通过质谱与核磁共振分析,确定了4种主要的抗肿瘤天然产物,为苯乙酰胺类衍生物和大环内酯类化合物,分别命名为长沙霉素A(Changshamycin A, m/z 843)、长沙霉素B(Changshamycin B, m/z 785)、长沙霉素C(Changshamycin C, m/z 672)和长沙霉素D(Changshamycin D, m/z 560)。抗肿瘤活性物质确定后,在半制备型高效液相色谱仪上扩大化分离纯化并收集各抗肿瘤天然产物,真空1.3kPa,-50℃冷冻干燥,得抗肿瘤天然产物粉剂,密封于玻璃瓶内,-20℃保藏,用时根据个体差异用水溶解通过瘤内或静脉给药。
图5是本实施例之昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01(Xenorhabdus stockiae HN_xs01)细菌菌剂和抗肿瘤天然产物粉剂的制备流程图。主要工艺流程包括菌种活化、一级发酵培养、二级种子罐发酵培养和生产用发酵罐培养,离心使菌液分离,36 h发酵培养菌体用于活菌菌剂制备,72 h发酵上清液用于抗肿瘤天然产物粉剂制备。
肿瘤细胞毒性实验:
将分离纯化到的抗肿瘤天然产物粉剂稀释成8个不同浓度,分别为0.25μg/mL,0.5μg/mL,1μg/mL,2μg/mL,4μg/mL,8μg/mL,16μg/mL,32μg/mL。将人类上皮癌细胞A431和人类慢性骨髓瘤细胞K562分别铺于96孔板中,静置培养12h,分别加入10 ??L以上不同浓度的次级代谢产物,以等量无菌水作对照,每样品3孔平行,置于5% CO2培养箱中37℃培养24 h。用细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(MTT)检测各样品对A431细胞和K562细胞的抑制率,操作严格按试剂盒使用说明进行,并计算出半抑制率浓度(IC50)。结果表明长沙霉素B(Changshamycin B)抗肿瘤活性最强,对A431和K562的半抑制剂量分别为 2.5 μg/mL和1.5 μg/mL。
计算公式:
ODck: 对照组在492 nm处所测吸光值
OD调零: 调零孔在492 nm处所测吸光值
OD样品: 各样品组在492 nm处所测吸光值
Xm:lg最大剂量
I:lg(最大剂量/相临剂量)
P:抑制率之和
Pm:最大抑制率
Pn:最小抑制率
昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01生产发酵制剂的抗肿瘤效果实验:取Xenorhabdus stockiae HN_xs01通过生产发酵所得菌剂,通过检测菌悬液的OD600值,按每OD600含菌体数为1×109个/ml计,测得菌体浓度。通过尾静脉注射Xenorhabdus stockiae HN_xs01活菌菌液至C57BL/6荷瘤小鼠体内,菌体注入量为5×105~5×107个,以等体积无菌PBS(pH 7.4)为阴性对照,每组8只。用电子天平和游标卡尺记录每天上午10点的荷瘤小鼠体重和肿瘤大小,并按公式(a,肿瘤长;b,肿瘤宽)
计算出肿瘤体积。第1次注射后第6天采用同样的方法进行第2次等量注射,第2次注射后3天,采用颈椎脱臼法处死小鼠并解剖,取出其肝、肾、脾和肿瘤分别置于洁净的EP管中称重,按公式
计算抑瘤率,并将取出的肝、肾、脾和肿瘤分别通过200目细胞筛研磨,每克组织加入5 ml无菌PBS(pH 7.4),分别取悬液500 μL,50 μL及5 μL 3梯度均匀涂抹于NBTA培养基上,30℃倒置培养24 h,观察各器官和肿瘤中的细菌分布情况。
图6和图7是本实施例之昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01(Xenorhabdus stockiae HN_xs01)静脉注射对C57BL/6荷瘤小鼠肿瘤大小和体重的影响图。结果表明Xenorhabdus stockiae HN_xs01通过静脉注射后,C57BL/6荷瘤小鼠肿瘤的生长受到明显抑制,在第一次注射后9天,阴性对照组(PBS)中荷瘤小鼠的肿瘤体积是试验组(Xenorhabdus stockiae HN_xs01)中的1.88倍;静脉注射细菌后,C57BL/6荷瘤小鼠的体重变化较大,试验组(Xenorhabdus stockiae HN_xs01)中,Xenorhabdus stockiae HN_xs01注入后,体重有一个缓慢下降过程,但第2天开始得到恢复,第6天进行第二次注射,体重又出现有缓慢下降并恢复的过程,结果表明Xenorhabdus stockiae HN_xs01对C57BL/6小鼠生长没有太大的影响,毒副作用较小。
图8是Xenorhabdus stockiae HN_xs01经两次静脉注射后对C57BL/6荷瘤小鼠器官和肿瘤重量的影响。Xenorhabdus stockiae HN_xs01经两次静脉注射后,C57BL/6荷瘤小鼠的肝、肾和脾重分别是阴性对照组(注射磷酸缓冲液)的1.49、1.25和2.67倍,阴性对照组的肿瘤重量是实验组的2.12倍,抑瘤率为62.7%。Xenorhabdus stockiae HN_xs01对C57BL/6小鼠的肝和肾虽存有一定影响,但影响不大,脾重显著增加,表明Xenorhabdus stockiae HN_xs01通过静脉注射小鼠后诱发了机体的免疫反应,而抑瘤率大于30%,说明Xenorhabdus stockiae HN_xs01能明显抑制C57BL/6小鼠肿瘤的生长。
图9是Xenorhabdus stockiae HN_xs01经两次静脉注射后在荷瘤小鼠体内的分布情况。阴性对照组C57BL/6荷瘤小鼠的肝、肾、脾和瘤内均没有检测到任何细菌,试验组中的肝、肾和脾内没有检测到任何细菌,但瘤内积聚有大量的Xenorhabdus stockiae HN_xs01,每克瘤内含有菌体数目为2.5×106。结果表明,采用静脉注射的方法,Xenorhabdus stockiae HN_xs01在C57BL/6荷瘤小鼠具有极强的肿瘤靶向性。
为观察注射Xenorhabdus stockiae HN_xs01后对C57BL/6荷瘤小鼠肿瘤组织产生的影响,对C57BL/6荷瘤小鼠肿瘤组织采取如下处理:
1) 固定:在瘤内注射Xenorhabdus stockiae HN_xs01后6天,采用颈椎脱臼法处死C57BL/6荷瘤小鼠并解剖,取出其肝、肾、脾和肿瘤,分别投入到质量浓度为4%的多聚甲醛溶液中,常温固定过夜;
2) 脱水:分别用体积浓度为70%,80%和95%的乙醇依次脱水,每次2 h,95%乙醇再次脱水2 h,最后各用无水乙醇脱水两次,每次2 h,乙醇用量为完全浸没组织块;
3) 透明:组织脱水后,置于无水乙醇和二甲苯体积分数各50%的混合液中,透明30 min,之后用二甲苯透明两次,每次1 h,溶液用量为完全浸没组织块;
4) 浸蜡:将已透明的组织块置于已熔化的软蜡(熔点54-56℃)中,放入熔蜡箱保温40 min,再置于已熔化的硬蜡(熔点56-58℃)中,保温30 min;
5) 包埋:石蜡(熔点60-62℃)熔化后,倒入方型小纸盒中,将已浸透石蜡(软蜡和硬蜡)的组织块迅速放入其中,待其冷却凝固;
6) 切片:用切片机将包埋好的蜡块切成4~5 ??m薄片;
7) 贴片:切下的薄片在热水中烫平后,贴到载玻片上,60℃烘烤24 h;
8) 脱蜡:将烘烤好的切片立即投入到二甲苯中,脱蜡30 min;
9) 染色:切片脱蜡后,依次用无水乙醇、95%(v/v)乙醇、80%(v/v)乙醇和单蒸水泡洗2 min,苏木精染色15 min,水洗1.5 min,含体积分数为1% HCl的酒精分化15 s,单蒸水泡洗15 min,伊红染色15 min,单蒸水泡洗2 min,95%(v/v)乙醇脱水3 min,再用无水乙醇脱水2次,每次5 min,二甲苯透明;
10)封片:切片透明后,擦去组织外围的二甲苯,将树胶滴于组织切片上方,盖上盖玻片后晾干;
11)观察,组织切片染色完成后,置于显微镜下放大不同倍数观察其形态。
图10~图17是注射Xenorhabdus stockiae HN_xs01后对C57BL/6荷瘤小鼠肿瘤组织产生的影响图。
在低倍镜(100×)下,可以观察到对照组小鼠肿瘤组织中含有丰富的新生微血管(图10),坏死区域较小,有少量血液外渗;Xenorhabdus stockiae HN_xs01处理小鼠肿瘤组织中微血管较少,存在有大片坏死区,大量血液外渗,炎症细胞浸润明显(图11),结果表明肿瘤组织中注射Xenorhabdus stockiae HN_xs01后,其新生血管受到抑制或破坏。
高倍镜(400×)下观察结果显示,对照组中,肿瘤细胞排列紧密,间隙均匀,形态规则,周边免疫细胞呈球状(图12),为淋巴细胞,说明对照组中存在的较少的坏死现象是由机体自身免疫引发;Xenorhabdus stockiae HN_xs01处理小鼠肿瘤细胞排列稀疏,形态不规则,免疫细胞呈分叶状(图13),为中性粒细胞,并在部分区域可以观察到中性粒细胞积聚(图16,图17),说明肿瘤组织中出现的炎症细胞浸润现象是由外来感染所致,Xenorhabdus stockiae HN_xs01能诱发机体肿瘤部位的炎症反应,协同抗肿瘤,加强宿主对肿瘤的免疫反应。油镜(1000×)下观察肿瘤组织炎症边缘区域,在对照组中,受炎症反应影响的细胞呈蓬松状,胀大,胞浆外泄,核质染色均匀且深,核没有受到明显影响,紧邻着的正常肿瘤细胞排列规则,浆质均匀丰富,可以看到有核分裂现象(图14);Xenorhabdus stockiae HN_xs01处理后,细胞破碎,胞浆外泄,细胞核染色质固缩(图15),并有空泡,周围布满丝状细胞骨架,无核分裂,该现象是细胞凋亡过程中伴随有炎症反应的结果,表明Xenorhabdus stockiae HN_xs01能产生促肿瘤细胞凋亡的活性物质,并同时引起机体自己炎症反应,在抗肿瘤过程中协同作用。
Claims (3)
1.一株肿瘤靶向细菌,其特征在于,是昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01,Xenorhabdus stockiae HN_xs01;该菌种于2012年03月09日在中国典型培养物保藏中心保藏,菌种保藏编号为CCTCC NO:M 2012069。
2.一株制备如权利要求1所述肿瘤靶向细菌菌剂的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)菌种活化,将保藏于-80℃冰箱中的昆虫病原线虫共生致病杆菌 HN_xs01划线接种于NBTA培养基上,30℃条件倒置培养36~48 h;然后挑取单菌落划线,以作进一步的纯化;
(2) 一级发酵培养和二级种子罐发酵培养:挑取经再次纯化后的Xenorhabdus stockiae HN_xs01接种LB液体培养基中,30℃下180~200 rpm振荡培养12h至对数生长中期,然后将10 mL培养液接种于1000 mL LB液体培养基中,30℃下180~200 rpm振荡培养12~24h,得一级种子罐发酵菌液;将二级种子罐在121℃下灭菌30min,装入发酵罐培养基后再灭菌,冷却至25~30℃,将一级种子罐发酵液按体积比4%~5%接种量接入二级种子罐,通入无菌空气1.8立方米/小时,并以180 rpm的速度搅拌进行培养,培养12~24 h,得二级种子罐发酵菌液;
(3) 生产用发酵罐培养,先将发酵罐灭菌,121℃,压力1.2-1.3 kg/cm2条件下灭菌30min,装入发酵罐培养基后再以121℃条件灭菌25 min,保压降温至25℃~30℃,按体积比4%~5%的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养,通入无菌空气,通气量3升/分钟,温度30℃,搅拌转速为200 rpm,培养36 h;
(4)制备制剂:当菌体的发酵液密度≥20g.L-1,菌体量不足1020g.L-1时放罐,收集菌液,11000 rpm,2 min离心收集菌体,生理盐水洗涤6-8遍,先使微生物在极低温度-70℃下快速冷冻,然后在真空度-0.1Mpa下真空干燥,除去水分,真空包装在玻璃瓶中,-20℃保藏,即成;
所述培养基的配方及制备:
LB液体培养基配方:蛋白胨10 g.L-1,NaCl 10 g.L-1,酵母提取物5 g.L-1,水溶,灭菌前pH值7.0~7.4,121℃,20 min条件湿热灭菌;
NBTA培养基配方:营养琼脂45 g,红四氮唑0.04 g,溴麝香草酚蓝0.025 g,容于1 L单蒸水中,121℃,20 min条件湿热灭菌;
发酵罐培养基配方:蛋白胨20g.L-1,酵母浸粉12g.L-1,NaCl 10 g.L-1,葡萄糖13.7 g.L-1,K2HPO4 2.3 g.L-1,KH2PO4 1.5 g.L-1,MgSO4 . 7H2O 0.25 g.L-1,水溶,pH值7.0~7.4。
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