CN103405479A

CN103405479A - 一种用于防控养殖后期虾池弧菌的乳杆菌制剂

Info

Publication number: CN103405479A
Application number: CN2013102782028A
Authority: CN
Inventors: 汤江武; 王新; 姚晓红; 吴逸飞; 柳永; 孙宏
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-06-26
Filing date: 2013-07-02
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2033-07-02
Also published as: CN103405479B

Abstract

本发明提供了一种用于防控养殖后期虾池弧菌的乳杆菌制剂及其制备的方法。本发明涉及的乳杆菌制剂由干酪乳杆菌BFT-1，CCTCC保藏号：M2011424，经液体发酵而成，该制剂发酵液具有较强的抑制弧菌效果。使用时每亩?每米水深添加300-400ml，使用前加入20倍的干净水进行活化，进行全池均匀泼洒，可使养殖后期虾池中弧菌数维持在2.4×10³CFU/ml的安全范围内。该乳杆菌制剂是具有防控养殖水体病原菌，尤其是弧菌的专用微生态制剂，制备简单，环境适应性强，在对虾养殖后期施用，具有显著的应用效果。

Description

一种用于防控养殖后期虾池弧菌的乳杆菌制剂

技术领域

本发明属于应用微生物技术领域，具体地说涉及一种可以防控养殖后期虾池中弧菌的乳杆菌制剂及其制备方法。

背景技术

随着水产养殖业的迅猛发展，规模化、集约化程度的不断提高，水产养殖面临水质恶化、生态环境失调、各种病害频发等问题，而长期以来对抗生素和化学药物的滥用导致生态环境破坏、病原微生物产生耐药性、水产品不安全等问题，这种养殖模式已不适合水产养殖业绿色、可持续发展的要求。近年来，施用微生态制剂作为健康养殖的重要技术手段，已为世界水产养殖业广泛接受，创造了巨大的经济、环境效益。

水产养殖环境中存在的病原微生物在水产养殖的各个阶段均可能导致水产动物的病害，尤其是水产养殖的后期，随着水质的恶化，养殖环境的生态失衡，病原微生物，如弧菌，引发的病害会造成巨大的损失。目前，已有多种多样的微生态制剂应用于水产养殖，取得了一定的效果。作为一种重要的有益微生物，乳酸菌具有调节养殖水体、抑制病原微生物、提高动物免疫力、促进动物生长等作用，是诸多微生态制剂的主要成分或重要组成部分。乳酸菌制剂在水产养殖中的应用受到越来越多的重视，尤其是其低成本、高密度发酵方面，已有诸多的研究，如中国发明专利ZL 200810198474.6公开了“一种用于养殖水质调控的乳酸菌微生态制剂的生产方法”，该发明建立了一种低成本的可用于养殖水质调控的液态乳酸菌微生态制剂的生产方法。对于乳酸菌在水产养殖病害防控中的作用，已得到广泛的认可，但尚未有专门利用乳酸菌来防控水产养殖病害的微生态制剂，如申请公开的中国发明专利“一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法”，申请公布号：CN103146611A，创制的乳酸菌微生态制剂，由多种乳酸菌组成，其制备方法简单，保存期限延长，在水质净化中具有强效作用，但对其在水产养殖病原防控中的作用仅笼统提及。作为一种重要的养殖品种，对虾在养殖后期由于养殖环境恶化，弧菌病多发，造成巨大的经济损失，具有防控养殖后期虾池弧菌的微生态制剂，必然具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于，针对对虾养殖后期虾池弧菌丰度升高，容易引发对虾疾病的实际情况，提供一种能有效防控养殖后期虾池弧菌的乳酸菌微生态制剂。

本发明的另一个目的是提供上述适用于防控养殖后期虾池弧菌的乳酸菌微生态制剂的制备方法。

本发明目的通过以下技术方案来实现。

一种用于防控养殖后期虾池弧菌的乳杆菌制剂，所述的制剂包括保藏号为CCTCC No：M2011424的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）BFT-1菌株。

在一个优选的方式中，该菌株通过以下方式获得：于2007年从浙江绍兴虾池采集健康南美白对虾，带回实验室后分离肠道内容物，接入200 ml MRS肉汤培养基中富集培养，一周后取100 μl富集液接入新鲜的200 ml MRS肉汤培养基中继续培养，再过一周后采用稀释涂布平板法用加有1％碳酸钙的MRS琼脂平板分离乳酸菌，共分离获得可产生透明圈的菌株8株。随后以引起对虾常见的细菌性病害的病原菌—鳗弧菌、副溶血弧菌为指示菌，通过体外抑菌法—牛津杯法，对筛选获得到8株细菌进行体外拮抗试验，对鳗弧菌有较好抑菌效果的菌株共4株，其中1株抑菌圈直径大于7.9 cm；对副溶血弧菌有较好抑菌效果的菌株共有2株，最大抑菌圈分别达6.3cm和5.9cm。其中1株亦是对鳗弧菌有最佳抑制效果的菌株，该菌株被命名为BFT-1。该菌株经VITEK-32细菌快速鉴定系统鉴定及16S rRNA 基因序列分析和生理生化鉴定，确定为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）。

该菌株已于2011年11月29日保存于武汉中国典型培养物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC），保藏号： M2011424，地址：中国武汉大学，邮编430072。

已有实验证实该菌具有较强的抑制弧菌生长效果，经液体发酵后发酵液亦具有较强的抑制弧菌生长效果。所述乳杆菌制剂由干酪乳杆菌BFT-1的液体发酵产物制成。

所述乳杆菌制剂的制备方法，按以下步骤进行：

（1）各级培养基的配置，其中：

a）斜面培养基：MRS琼脂培养基，备用；

b）摇瓶菌种培养基和种子罐发酵培养基：MRS肉汤培养基，备用；

c）批量生产培养基：酵母提取物0.8-1％，蛋白胨：0.9－1.2％，葡萄糖1.8-2.5％，氯化钠 0.4-0.5％，碳酸钙 0.9-1.2％，其余为水，初始pH 7.0-7.4；

（2）摇瓶菌种扩增：分别将用斜面培养基活化的干酪乳杆菌BFT-1，接入100 ml的摇瓶培养基中，在30℃，培养24小时后备用；

（3）种子罐发酵：将步骤（1）种子罐发酵培养基放入种子罐中，在种子罐内进行蒸汽高温灭菌并冷却后，按接种量0.5-1％接入步骤（2）的摇瓶菌种；每隔1h开动搅拌机3min混匀，温度30℃，罐压保持正压0.06M Pa，自然pH的条件下培养24小时后备用；

（4）批量产品的制备：

在发酵罐中装入批量生产培养基，在发酵罐内进行蒸汽高温灭菌并冷却；将步骤（3）中种子液打入发酵罐中，接种量为发酵罐体积的8-10％，每隔1h开动搅拌机3min混匀，温度28-33℃，罐压0.05-0.08M Pa，自然pH的条件下培养36-42小时；

所述用于防控养殖后期虾池弧菌的乳杆菌制剂，发酵完成后分装于密闭容器，常温存放；该制剂用于对虾养殖后期水体的用量为：每亩·每米水深添加300-400 ml，在使用前加入20倍的干净水进行活化，进行全池均匀泼洒，施用该制剂后增氧泵开启1h左右，每隔7天使用一次。

本发明的有益效果：

本发明与现有技术相比，是专用于养殖后期虾池，高效防控弧菌的微生态制剂。所用干酪乳杆菌BFT-1具有较强的抑制弧菌活性，在具备乳酸菌固有的益生、调控水质作用外，其制剂能将养殖后期虾池弧菌控制在安全范围内，可有效替代对虾养殖后期控制弧菌的抗生素或其它化学药物；其发酵产物中含有抑制弧菌生长的活性产物，即便本发明所述乳杆菌制剂中菌体死亡，该制剂的抑制弧菌活性依然存在，相较现有大多数以菌体活性为基础实现其功能的乳酸菌类微生态制剂，本发明所述的的乳杆菌制剂具有更长的有效期，更强的环境适应性。

说明书附图

图1 干酪乳杆菌BFT-1副溶血弧菌的抑制效果。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作更详细说明，但以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施例的限制。

实施例1：

配制MRS琼脂和MRS肉汤培养基，备用，MRS琼脂培养基的成分如下：蛋白胨 10 g，牛肉膏 10 g，酵母膏 5 g，葡萄糖 20 g，吐温80 ml，K₂HPO₄ 2 g，乙酸钠 5 g，柠檬酸二铵 2 g，MgSO₄7H₂O 0.2 g，MnSO₄4H₂O 0.05 g，琼脂粉 15 g，加蒸馏水至1000 ml，用高压灭菌锅在121℃ 灭菌15 min，调节pH =6.2-6.4。MRS肉汤培养基成分为MRS琼脂培养基去掉琼脂粉。用MRS斜面活化干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）BFT-1，保藏号：CCTCC No：M2011424，随后接种于100 ml的MRS肉汤培养基中，在30℃，培养24小时后备用。配制2216E固体培养基：蛋白胨 5 g，酵母膏 1 g，磷酸高铁 0.1 g，琼脂15 g，加陈海水至 1000 ml，调pH=7.6，用高压灭菌锅在121℃ 灭菌20 min，倒固体平板。将活化后的鳗弧菌（Vibrio anguillarum）用无菌水混匀后涂布于2216E固体平板，用镊子将3只无菌的牛津杯均匀放入培养皿中，分别吸取0.2 ml MRS肉汤培养基、干酪乳杆菌BFT-1培养液和过滤去除菌体的干酪乳杆菌BFT-1培养液，置于牛津杯中，在30℃条件下培养12 h，观察抑菌圈，结果发现MRS肉汤对鳗弧菌没有抑菌效果，干酪乳杆菌BFT-1培养液形成直径4.4 cm的抑菌圈，过滤去除菌体的干酪乳杆菌BFT-1培养液形成直径2.1 cm的抑菌圈。如图1所示。结果表明干酪乳杆菌BFT-1及其培养液对鳗弧菌有较好的抑制效果。

随后对过滤去除菌体的干酪乳杆菌BFT-1培养液分别于60℃、80℃、100℃加热处理15min，用牛津杯法检测干酪乳杆菌BFT-1无菌培养液对鳗弧菌的抑菌效果。结果表明，在30℃条件下培养12 h后，三种处理条件下抑菌圈直径分别为2.2 cm、2.1 cm和1.7 cm，说明干酪乳杆菌BFT-1无菌培养液中的抑菌活性物质具有较好的热稳定性。

实施例2：

1）菌种的斜面活化和摇瓶培养。将保藏号为CCTCC No：M2011424的干酪乳杆菌接种于MRS琼脂斜面固体培养基上，在30℃条件下培养24小时活化，随后接入装有100 ml MRS肉汤培养基的摇瓶中，在30℃，培养24小时，备用；

2）种子罐发酵：将MRS肉汤培养基放入种子罐中，在种子罐内进行蒸汽高温灭菌并冷却后，按接种量0.5％接入步骤（1）的摇瓶菌种；每隔1h开动搅拌机3min混匀，温度30℃，罐压0.06M Pa，自然pH的条件下培养24小时，备用；

（3）批量产品的制备：在发酵罐中装入批量生产培养基：酵母提取物0.8％，蛋白胨：0.9％，葡萄糖1.8％，氯化钠 0.4％，碳酸钙 0.9％，其余为水，初始pH 7.0-7.4；在发酵罐内进行蒸汽高温灭菌并冷却；将步骤（2）中种子液打入发酵罐中，接种量为发酵罐体积的8％，每隔1h开动搅拌机3min混匀，温度33℃，罐压0.08 MPa，自然pH的条件下培养42小时，所得样品经平板计数法计数，菌含量约为4.91×10⁹ CFU/ml。

（4）采用牛津杯法测定发酵产物的对鳗弧菌的抑制效果，发酵液和除菌的发酵液的抑菌圈直径分别为5.2 cm和2.5 cm。

实施例3：

1）菌种的斜面活化和摇瓶培养。具体实施同实施例2的步骤1）；

2）种子罐发酵：将MRS肉汤培养基放入种子罐中，在种子罐内进行蒸汽高温灭菌并冷却后，按接种量1％接入步骤（1）的摇瓶菌种；每隔1h开动搅拌机3min混匀，温度30℃，罐压0.06M Pa，自然pH的条件下培养24小时，备用；

（3）批量产品的制备：在发酵罐中装入批量生产培养基，酵母提取物1％，蛋白胨： 1.2％，葡萄糖2.5％，氯化钠 0.5％，碳酸钙 1.2％，其余为水，初始pH 7.0-7.4；在发酵罐内进行蒸汽高温灭菌并冷却；将步骤（2）中种子液打入发酵罐中，接种量为发酵罐体积的10％，每隔1h开动搅拌机3min混匀，温度28℃，罐压0.05M Pa，自然pH的条件下培养36小时，所得样品经平板计数法计数，菌含量约为4.55×10⁹ CFU/ml。

（4）采用牛津杯法测定发酵产物的对鳗弧菌的抑制效果，发酵液和除菌的发酵液的抑菌圈直径分别为5.7 cm和2.6 cm。

实施例4：

2）种子罐发酵：将MRS肉汤培养基放入种子罐中，在种子罐内进行蒸汽高温灭菌并冷却后，按接种量0.8％接入步骤（1）的摇瓶菌种；每隔1h开动搅拌机3min混匀，温度30℃，罐压0.06M Pa，自然pH的条件下培养24小时，备用；

（3）批量产品的制备：在发酵罐中装入批量生产培养基：酵母提取物0.9％，蛋白胨：1％，葡萄糖2％，氯化钠 0.45％，碳酸钙 1％，其余为水，初始pH 7.0-7.4；在发酵罐内进行蒸汽高温灭菌并冷却；将步骤（2）中种子液打入发酵罐中，接种量为发酵罐体积的9％，每隔1h开动搅拌机3min混匀，温度31℃，罐压0.06M Pa，自然pH的条件下培养40小时，所得样品经平板计数法计数，菌含量约为5.18×10⁹ CFU/ml。

（4）采用牛津杯法测定发酵产物的对鳗弧菌的抑制效果，发酵液和除菌的发酵液的抑菌圈直径分别为5.8 cm和2.8 cm。

实施例5：

为了检验乳杆菌制剂对养殖后期虾池弧菌防控的实际应用效果，在浙江科盛生物科技有限公司位于绍兴市的水产养殖基地，选择2个面积为15亩、平均水深1.6 m的方形标准对虾养殖池塘进行了应用实验。2个试验池分别标记为A池和B池，其中A池为实验池，B池为对照池。南美白对虾养殖由该基地其养殖方法自行管理，其中A池从投入虾苗开始，每隔7天投洒乳杆菌制剂1次（采用实施例4中获得的培养物制剂）。每次投洒前，取9 L乳杆菌制剂，倒入约400 L的桶中，随后加入约200 L自来水，混匀后均匀泼洒于A池中。

分别在养殖的前期、中期和后期从A池和B池中采样，采样点为虾池中央水下0.5 m，样品装入冰盒中，6 h之内带回实验室用TCBS琼脂培养基，采用平板菌落计数法检测水样中的总弧菌数。结果表明，与对照组相比，在养殖的前期和中期，投洒乳杆菌制剂的A池总弧菌数明显低于对照池，而在养殖后期，A池水体中的弧菌数维持在2.4×10³ CFU/ml安全范围内，而对照池几乎超过1.0×10⁴ CFU /ml的对虾发病的弧菌数量临界值。如表1所示。

表1 对虾养殖各阶段虾池水体中总弧菌数

本发明的乳杆菌制剂具有更长的有效期，更强的环境适应性。

Claims

1.一种用于防控养殖后期虾池弧菌的乳杆菌制剂，其中，所述的制剂由酪乳杆菌经液体发酵后制成，其特征在于：所述干酪乳杆菌为保藏号为CCTCC No：M2011424的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）BFT-1菌株。

2.如权利要求1所述的用于防控养殖后期虾池弧菌的乳杆菌制剂，其特征在于：该乳杆菌制剂的制备方法，按以下步骤进行：（1）各级培养基的配置，其中：

a）斜面培养基：MRS琼脂培养基，备用；

（4）批量产品的制备：

在发酵罐中装入批量生产培养基，在发酵罐内进行蒸汽高温灭菌并冷却；将步骤（3）中种子液打入发酵罐中，接种量为发酵罐体积的8-10％，每隔1h开动搅拌机3min混匀，温度28-33℃，罐压0.05-0.08M Pa，自然pH的条件下培养36-42小时。

3.如权利要求1-2之一所述的用于防控养殖后期虾池弧菌的乳杆菌制剂，其特征在于：该制剂用于对虾养殖后期水体的用量为：每亩·每米水深添加300-400 ml，在使用前加入20倍的干净水进行活化，进行全池均匀泼洒，施用该制剂后增氧泵开启1h左右，每隔7天使用一次。