CN105481489B - 一种枯草芽胞杆菌生物菌肥及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枯草芽胞杆菌生物菌肥及其制备方法，属于复合微生物菌肥领域。该枯草芽胞杆菌生物菌肥的组分以重量百分比计，包含：枯草芽胞杆菌菌液10％～95％，余量为水。所述枯草芽胞杆菌菌液的发酵配方如下：以重量配比计，决明子粉5～30重量份％、玉米粉20～30重量份％、氯化钠1～3重量份％、硫酸镁1～3重量份％、碳酸钙2～4重量份％、磷酸二氢钾0.5～3重量份％，消泡剂适量，余量为水。本发明通过发酵的方法，将决明子中的有效成份全部释放出来，并连同原料全部在菌肥中得到利用，这样既简单也无废渣、污染物产生，并且其有效成分在菌肥中可以有效地抑制菌肥体系杂菌的产生，提高了菌肥的稳定性，同时与菌剂有协同增效的作用，提高菌肥的防病效果。

Description

一种枯草芽胞杆菌生物菌肥及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物菌肥及其制备方法，特别涉及一种枯草芽胞杆菌生物菌肥及其制备方法，属于复合微生物菌肥领域。

背景技术

由于长期以来化学农药和化肥的不合理应用，导致我国的农业生态环境受到污染和破坏，水土流失，农用土地质量下降，病、虫产生抗性等问题越发严重，农产品的农药高残留问题也成为影响食品安全的重要因素。在绿色农业已成为世界农业发展方向的今天，对环境友好的生物源制剂越来越受到人们的关注和青睐，农业的可持续发展和有机农业兴起，让微生物肥料和微生物农药的市场需求空前加大。

微生物肥料是以有益微生物为主，配以有机、无机成分而制成的一种新型绿色肥料。其利用有益微生物自身生命活动释放的生理活性物质，改善植物根系的微生物环境，调节植物的生长发育，促进植物对营养元素的吸收，拮抗某些致病微生物，减轻作物病害，从而有益于作物生长和产量增加。

枯草芽胞杆菌是芽胞杆菌属的一种革兰氏阳性菌。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故得名。其对多种植物病原菌具有较好的防治作用，如：稻瘟病、稻曲病、白粉病、灰霉病、枯萎病等。枯草芽胞杆菌能够在寄主植物上定殖，可以通过非核糖体途径产生抗菌物，吸附在病原菌的菌丝上并随着菌丝的生长而生长，产生溶菌物质；还可以促进作物生长从而使作物抗病能力提高。

2012年2月1日授权公告的中国发明专利200910214430.2公开了一株广谱抗真菌植物内生枯草芽胞杆菌及其应用，提到了枯草芽胞杆菌R31(Bacillus subtilis R31)菌株(CCTCC NO:M 209261)的制备和应用，其应用如下：枯草芽胞杆菌能够对多种植物病原菌具有较好的平板拮抗活性，尤其对各种尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、交链孢霉等土传维管束病害具有很好的拮抗能力，并在温室和田间表现出良好的防治效果；在珠海斗门小赤坎进行灌根防治巴西蕉枯萎病、皇帝蕉枯萎病和农科1号抗性香蕉枯萎病的大田试验，结果显示，其对巴西蕉枯萎病2年综合防效达到91.71％，对农科1号抗性蕉的防效达到82.71％，对皇帝蕉的防效达到85.07％。

上述应用在生物防治方面没有问题，但如果将其用于抗病菌株制备液态菌肥时，有两个关键技术难题：一方面，菌株发酵液实际上是一个悬浮体系，孢子悬浮在水中，在长期贮藏时孢子的聚集沉淀，会形成分层、成团或结块现象，影响使用，因此需要找到一个合适的分散剂或增稠剂来解决这个问题。目前采用的方法主要是加入黄原胶来增稠，但黄原胶本身在长期贮藏过程中会被微生物生长利用而变质、发臭，既不利于制剂的稳定性，也不利于菌肥中的有效菌株的稳定性。另一方面，保证菌肥在一定的存储时间内药效的稳定性也是一难题。菌肥里的微生物是一个活体，随着贮藏时间的延长，菌肥中芽胞的存活率会逐渐下降，大量试验也证明了这一点，这是由于杂菌、温度条件变化等因素的影响而造成的。

因此，提供一种同时达到增稠、杀菌、提高菌肥稳定性的枯草芽胞杆菌生物菌肥及其制备方法就成为该技术领域急需解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种同时达到增稠、杀菌、提高菌肥稳定性的枯草芽胞杆菌生物菌肥。

本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：

一种枯草芽胞杆菌生物菌肥，其特征在于，组分以重量百分比计，包含：枯草芽胞杆菌菌液10％～95％，余量为水；

所述枯草芽胞杆菌菌液通过发酵得到，其发酵配方如下：组分以重量百分比计，决明子粉5％～45％、玉米粉20％～30％、氯化钠1％～3％、硫酸镁1％～3％、碳酸钙2％～4％、磷酸二氢钾0.5％～3％，聚硅氧烷消泡剂SXP-101适量，余量为水。

优选地，决明子粉的含量为5％～30％，更优选为15％～30％。

优选地，所述枯草芽胞杆菌生物菌肥还包括营养复合体5％～30％，增效剂1％～5％，助剂0.5％～1％，所述营养复合体为海藻酸、腐植酸、氨基酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、尿素中一种或几种任意比例的混合；所述增效剂为硫酸锰；所述助剂为缩聚萘磺酸盐分散剂D-425或其它常用分散剂。

优选地，所述枯草芽胞杆菌菌液的发酵配方中还含有豆粕5％～30重量％，更优选10～15重量％。

优选地，所述枯草芽胞杆菌生物菌肥的配方为：枯草芽胞杆菌菌液为60重量％、营养复合体22重量％、硫酸锰为2.5重量％、D-425为0.5重量％，余量为水。

优选地，所述22重量％的营养复合体包括：占枯草芽胞杆菌菌液5重量％的海藻酸、占枯草芽胞杆菌菌液10重量％的氨基酸、占枯草芽胞杆菌菌液7重量％的磷酸氢二钾。

优选地，所述枯草芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌R31、枯草芽胞杆菌B-001、枯草芽胞杆菌S9、枯草芽胞杆菌B2、枯草芽胞杆菌Bs-916、枯草芽胞杆菌B-332、枯草芽胞杆菌BS-2等。

本发明的另一发明目的是提供一种上述枯草芽胞杆菌生物菌肥的制备方法。

本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：

一种枯草芽胞杆菌生物菌肥的制备方法，其步骤如下：

(1)枯草芽胞杆菌菌液的制备

1)发酵液制备：发酵罐培养基采用的发酵配方为：决明子粉5～45重量份％、玉米粉20～30重量份％、氯化钠1～3重量份％、硫酸镁1～3重量份％、碳酸钙2～4重量份％、磷酸二氢钾0.5～3重量份％，聚硅氧烷消泡剂SXP-101适量，余量为水；

2)接种用菌株种子液制备：将斜面保存的枯草芽胞杆菌菌株活化培养，并将其划线接种于牛肉膏蛋白胨培养基上培养；待菌株充分生长后，挑取单菌落，接种到LB培养基中培养，得到枯草芽胞杆菌的种子液，备用；

3)菌液的制备：将步骤2)培养好的枯草芽胞杆菌的种子液以0.5％～2％(V/V)的接种量接种到步骤1)所得发酵罐中的发酵液进行发酵；发酵后开始检测，当芽胞形成率达95％以上时，停止发酵，得菌液；

(2)枯草芽胞杆菌生物菌肥的制备：将步骤(1)所得菌液加入水，得枯草芽胞杆菌生物菌肥。

优选地，所述步骤(1)中之步骤1)中所述发酵罐培养基采用的发酵配方中还含有豆粕5～30重量份％，更优选10～15重量份％；决明子粉的含量为5％～30％，更优选为15％～30％。

优选地，所述步骤(1)中之步骤2)中所述斜面保存的温度为4℃，所述活化培养的温度为32～37℃，活化培养的时间为1～2小时；在牛肉膏蛋白胨培养上培养的温度为32～37℃，活化培养的时间为20～28小时；在LB培养基上培养的温度为32～37℃，转速为180rpm，时间为10～18小时。

优选地，所述步骤(2)如下：将步骤(1)所得菌液中按比例将营养复合体、增效剂、助剂及水，充分搅拌，得枯草芽胞杆菌生物菌肥；

所述营养复合体为海藻酸、腐植酸、氨基酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、尿素中一种或几种任意比例的混合，所述增效剂为硫酸锰，所述助剂为缩聚萘磺酸盐分散剂D-425或其它常用分散剂。

优选地，所述步骤(1)之步骤3)的发酵条件为：在32℃～37℃、转速180rmp、溶氧量≧30％条件下发酵。

优选地，所述枯草芽胞杆菌生物菌肥的配方为：枯草芽胞杆菌菌液为60重量％、营养复合体22重量％、硫酸锰为2.5重量％、D-425为0.5重量％，余量为水，所述22重量％的营养复合体包括：占枯草芽胞杆菌菌液5重量％的海藻酸、占枯草芽胞杆菌菌液10重量％的氨基酸、占枯草芽胞杆菌菌液7重量％的磷酸氢二钾。

优选地，所述枯草芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌R31、枯草芽胞杆菌B-001、枯草芽胞杆菌S9、枯草芽胞杆菌B2、枯草芽胞杆菌Bs-916、枯草芽胞杆菌B-332、枯草芽胞杆菌BS-2等。

本发明的另一目的是提供一种枯草芽胞杆菌菌液。

本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：

一种枯草芽胞杆菌菌液，其发酵配方如下：以重量配比计，决明子粉5～45重量份％、玉米粉20～30重量份％、氯化钠1～3重量份％、硫酸镁1～3重量份％、碳酸钙2～4重量份％、磷酸二氢钾0.5～3重量份％，聚硅氧烷消泡剂SXP-101适量，余量为水。

优选地，所述枯草芽胞杆菌菌液的发酵配方中还含有豆粕5～30重量份％，更优选10～15重量份％。

优选地，决明子粉的含量为5％～30％，更优选为15％～30％。

本发明的再一目的是提供一种上述枯草芽胞杆菌菌液的制备方法。

本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：

一种枯草芽胞杆菌菌液的制备方法，其步骤如下：

(1)发酵液制备：发酵罐培养基采用的发酵配方为：决明子粉5～45重量份％、玉米粉20～30重量份％、氯化钠1～3重量份％、硫酸镁1～3重量份％、碳酸钙2～4重量份％、磷酸二氢钾0.5～3重量份％，聚硅氧烷消泡剂SXP-101适量，余量为水；

(2)接种用菌株种子液制备：将斜面保存的枯草芽胞杆菌菌株活化培养，并将其划线接种于牛肉膏蛋白胨培养基上培养；待菌株充分生长后，挑取单菌落，接种到LB培养基中培养，得到枯草芽胞杆菌的种子液，备用；

(3)菌液的制备：将步骤(2)培养好的枯草芽胞杆菌的种子液以0.5％～2％(V/V)的接种量接种到步骤(1)所得发酵罐中的发酵液进行发酵；发酵后开始检测，当芽胞形成率达95％以上时，停止发酵，得菌液。

优选地，决明子粉的含量为5％～30％，更优选为15％～30％。

优选地，步骤(1)中所述的发酵罐培养基采用的发酵配方中还含有豆粕5～30重量份，更优选10～15重量份％。

优选地，步骤(2)中所述斜面保存的温度为4℃，所述活化培养的温度为32～37℃，活化培养的时间为1～2小时；在牛肉膏蛋白胨培养上培养的温度为32～37℃，活化培养的时间为20～28小时；在LB培养基上培养的温度为32～37℃，转速为180rpm，时间为10～18小时。

优选地，枯草芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌R31、枯草芽胞杆菌B-001、枯草芽胞杆菌S9、枯草芽胞杆菌B2、枯草芽胞杆菌Bs-916、枯草芽胞杆菌B-332、枯草芽胞杆菌BS-2等。

本发明的枯草芽胞杆菌生物菌肥的应用：

本发明的枯草芽胞杆菌生物菌肥可以直接灌根，具体的施用方法：将本发明所述枯草芽胞杆菌生物菌肥稀释500～1000倍后用于灌根，施用量为：1000～2000g/亩。

本发明的枯草芽胞杆菌生物菌肥可以广泛应用于黄瓜、番茄、辣椒、草莓、香蕉等作物，使用后农产品的产量显著增加，品质明显提高。

本发明的优点：

(1)本发明采用决明子为发酵原料之一，决明子为常用中药，含有多种维生素和丰富的氨基酸、脂肪、碳水化合物等，能提供发酵所需的氮源；同时决明子中含有大黄素、大黄酚和大黄素甲醚，这些成分具有杀病原菌等功效，这些物质会在发酵过程中释放出来，起到抑制菌肥中有害杂菌的作用，从而提高产品的稳定性，并通过与枯草芽胞杆菌的协同增效作用提高抗病效果。

(2)本发明采用决明子为发酵原料之一，决明子在发酵后变粘稠，能增加菌肥的粘稠度，提高发酵产物体系的稳定性。

(3)本发明生物菌肥所采用的增效剂为硫酸锰，可以提高菌肥防病效果。

(4)本发明采用廉价的原料作为菌体液态发酵的培养基，采用高效的发酵方法，降低了生产成本并且无任何污染排放，提供了一种高效、廉价、无污染的制备生物菌肥方法；本发明优化的培养基具有快速生孢子的特点，使菌体在培养24～28小时就可达到92％～95％的芽胞生成率。

(5)本发明所提供的生物菌肥，在黄瓜、番茄、菜心、豆角、草莓种植试验中发现，本发明的菌肥在促长和对土传性病害的防治效果上均明显优于空白对照组，也明显优于传统方法获得的菌肥。

(6)本发明所述的复合生物菌肥可在阴凉的环境保存至少12个月。

下面通过具体实施方式对本发明进行详细说明。应该理解的是，所述的实施例仅涉及本发明的优选实施方案，在不脱离本发明的精神和范围情况下，各种成分及含量的变化和改进都是可能的。

具体实施方式

实施例1枯草芽胞杆菌R31菌液的制备

(1)发酵培养基的配制

发酵培养基，按重量比计算：决明子与豆粕的用量见下表1，其它成分：市售玉米粉25g、市售氯化钠2g、市售硫酸镁2g、市售碳酸钙3g、市售磷酸二氢钾2g、市售聚硅氧烷消泡剂SXP-101 0.3克，余量为水，总体积为1L，pH为7.2；

(2)枯草芽胞杆菌R31菌种液制备

将4℃条件下斜面保存的枯草芽胞杆菌R31菌株置于35℃条件下活化培养2小时，将其划线接种于琼脂牛肉膏培养基上，35℃条件下培养24小时，待菌株充分生长后，挑取菌落，接种到LB号培养基中，于30℃、180rpm条件下培养12小时，得枯草芽胞杆菌R31菌种液，备用；

(3)枯草芽胞杆菌R31菌液的制备

30L发酵罐空消后，在发酵罐内装入20L步骤(1)所得发酵培养基，灭菌30分钟，降温后接种1％(V/V)步骤(2)所得枯草芽胞杆菌R31菌种液，于35℃、180rpm下培养，发酵22小时，开始检测，芽胞形成率达95％以上，停止发酵，得枯草芽胞杆菌R31菌液。

本发明菌株在发酵配方的筛选中，不同决明子含量的产孢量，见下表1。

表1发酵配方中决明子含量对产孢量的影响

从表1中的数据可以看出：CK培养基与4号培养基对比结果显示，决明子能够取代豆粕粉作为该菌株的氮源供给；CK与3号培养基对比结果显示，决明子与豆粕混用能获得比较理想的发酵结果，甚至可以超越单独使用豆粕；CK与其它几个培养基对比结果显示，采用决明子发酵所得的菌液粘度明显提高(CK培养基为目前发酵工艺中的常用培养基，代表了现在的发酵技术)。

实施例2：不同发酵培养基所得液态生物菌肥的稳定性

本实施例中枯草芽胞杆菌R31生物菌肥所采用配方为，以重量百分比计，枯草芽胞杆菌R31菌液为60％、市售海藻酸5％、市售氨基酸10％、市售磷酸氢二钾7％、市售硫酸锰为2.5％、市售D-425为0.5％，余量为水。

枯草芽胞杆菌生物菌肥的制备：将海藻酸、氨基酸、磷酸氢二钾、硫酸锰、D-425依次加入实施例1所得菌液中，充分搅拌，得枯草芽胞杆菌生物菌肥。其中采用CK培养基的菌肥编号为“菌肥CK”，采用3号发酵培养基的菌肥编号为“菌肥3#”，将两个样品于室温下静置，定期测定产品总活芽胞数，所得数据见下表2。

表2不同贮藏时间枯草R31菌肥的芽胞存活率

试验结果显示：产品中总活芽胞数在3个月之内未有明显下降，6个月内未大幅下降，保存至12个月时，依旧符合国家标准(见表2)。但在加入了决明子的发酵培养基制备的菌肥(菌肥3#)中，其芽胞的稳定性明显更高。从表2中可以看出，培养基中加入决明子，菌肥中芽胞的存活率明显提高。

实施例3：添加硫酸锰与否对菌肥的增效试验对比

选择重茬严重，病害发生重的地块进行药效试验。供试作物为辣椒，防治对象为青枯病，试验地点在湛江市徐闻县，供试地块种植面积约2亩左右，由于连续种植，病害严重，死苗现象很难控制。

参试药剂A为对比试验2中“菌肥3#”配方，参试药剂B为在“菌肥3#”配方中将硫酸锰用水代替而得。菌肥采用稀释500倍，灌根处理。试验结果如下表3：

表3枯草R31菌剂中硫酸锰对辣椒青枯病的防病效果

从表3的结果可以看出，含有硫酸锰的菌肥A防病效果明显好于不含硫酸锰的菌肥B。说明硫酸锰与枯草R31菌肥混合使用，具有增效作用。在本发明的菌肥中加入硫酸锰，对菌肥药效的提高有明显作用。

实施例4：本发明最优菌肥对作物的防病促长试验

本发明优选菌肥配方工艺如下：

(1)发酵培养基的配制

发酵培养基，按重量配比计算：决明子30g、豆粕10g、玉米粉20g、氯化钠2g、硫酸镁2g、碳酸钙3g、磷酸二氢钾2g，聚硅氧烷消泡剂SXP-101 0.3g，余量为水，总体积为1L，pH为7.2。

(2)枯草芽胞杆菌R31菌种液制备

将4℃条件下保存的R31菌株置于35℃条件下活化培养2小时，将其划线接种于琼脂牛肉膏培养基上，35℃条件下培养24小时。待菌株充分生长后，挑取菌落，接种到LB培养基中，于35℃、180rpm条件下培养12小时，备用。

(3)枯草芽胞杆菌R31菌液的制备

30L发酵罐空消后，在发酵罐内装入20L发酵培养基，灭菌30分钟，降温后接种1％(V/V)上述菌种液，于35℃、180rpm下培养，发酵22小时后开始检测，发酵液中芽胞形成率达95％以上，发酵完成，得枯草芽胞杆菌R31菌液。

(4)枯草芽胞杆菌R31生物菌肥的制备

菌肥3#：按重量百分比，含上述枯草芽胞杆菌R31菌液为60％、市售海藻酸5％、市售氨基酸10％、市售磷酸氢二钾7％、市售硫酸锰为2.5％、市售D-425为0.5％，余量为水，搅拌均匀，检测合格，包装，得到本发明产品枯草芽胞杆菌R31生物菌肥，编号“菌肥3#”。

同时将采用实施例1中CK培养基所得菌液、其它成分与“菌肥3#”完全一样的样品，编号为“菌肥CK”。

将该“菌肥3#”及“菌肥CK”分别在叶菜、辣椒、茄果等作物上进行了大田试验，均取得了很好抗病、促长的效果。具体试验结果见下表，其中表4至表5为其对不同植物的促长效果，表6至表7为不同作物的防病效果。

表4枯草菌肥对菜心的促长作用田间效果

从表4中结果可以看出，使用本发明所述生物菌肥14天后，菜心的长势优于对照处理的长势，施用一个月后增产效果明显。

表5枯草菌肥对辣椒的促长作用田间效果

从表5中结果可以看出，使用本发明所述生物菌肥20d后，辣椒的长势比对照处理组好；施用一个月后亩产量增加达20.3％。

表6枯草菌肥对叶菜软腐病田间防治效果

从表6的结果可以看出，应用本发明所述生物菌肥14天后，菜心和芥菜的软腐病的发病率，与空白对照相比均明显降低，而“菌肥3#”的效果又明显优于“菌肥CK”。

表7枯草R31菌肥对番茄青枯病田间防治效果

从表7的结果可以看出，应用本发明所述生物菌肥14天后，番茄青枯病的发病率与空白对照相比，均显著降低；而“菌肥3#”的效果又明显优于“菌肥CK”。

综合表4至表7中的结果可知，本发明所述实施列4菌肥3#对不同作物均具有促长作用，还可以降低植株的发病率，提高农产品的产量，在防止病害和提高产量上均具有很好的应用空间。菌肥3#的效果不仅明显优于空白对照，也优于菌肥CK。说明本发明所采用的发酵工艺比传统发酵培养基，在提高菌肥抗病性方面有明显提高。

实施例5：对不同枯草芽胞杆菌菌株进行发酵，试验结果见表8。

(1)发酵培养基的配制

发酵培养基，按重量配比计算：决明子30g、豆粕10g、玉米粉20g、氯化钠2g、硫酸镁2g、碳酸钙3g、磷酸二氢钾2g，聚硅氧烷消泡剂SXP-101 0.3克，余量为水，总体积为1L，pH为7.2。

(2)枯草芽胞杆菌菌种液制备

将4℃条件下保存的菌株置于32～37℃条件下活化培养2小时，将其划线接种于琼脂牛肉膏培养基上，32～37℃条件下培养20～28小时。待菌株充分生长后，挑取菌落，接种到LB培养基中，于32～37℃、180rpm条件下培养10～18小时，备用。

(3)枯草芽胞杆菌菌液的制备

30L发酵罐空消后，在发酵罐内装入20L发酵培养基，灭菌30分钟，降温后接种0.5％～2％(V/V)上述菌种液，于32～37℃、180rpm下培养，发酵22小时后开始检测，发酵液中芽胞形成率达95％以上，发酵完成，得枯草芽胞杆菌菌液。

表8采用决明子发酵不同菌株产孢量比较

从表8可以看出多种枯草芽胞杆菌菌株，采用决明子作为营养物质均能正常发酵。此外，发酵液的粘度也普遍比采用传统发酵配方提高了3倍以上。

实施例6：将菌株B2按照实施例4的工艺制备菌肥H，将菌株BS-916按照实施例4的工艺制备菌肥M，同时采用实施例2的方法制备的相应的菌肥H-CK和菌肥M-CK。用于大田试验，结果见表9和表10。

表9 H菌肥对黄瓜枯萎病田间防治效果

从表9的结果可以看出，使用本发明所述生物菌肥40天后，黄瓜枯萎病的发病率与空白对照相比，有显著差异(P<0.01)。且明显好于菌肥H-CK。

表10枯草M菌肥对草莓根腐病田间防治效果

从表10的结果可以看出，应用本发明所述液态生物菌肥14天后，草莓根腐病的发病率与空白对照相比，有显著差异(P<0.01)，且明显好于菌肥M-CK。

本发明的枯草芽胞杆菌生物菌肥及其制备方法，通过上述发酵液与营养复合体、增效剂、助剂的复配，提供了一种新型、稳定、无公害的生物菌肥，在该生物菌肥的生产过程中不会产生任何三废污染，对环境友好，而且制得的生物菌肥既可以有效防治土传病害，还可以促进作物生长，提高农产品的品质。

本发明通过发酵的方法，将决明子中的有效成份全部释放出来，并连同原料全部在菌肥中得到利用，这样既简单也无废渣、污染物产生，并且其有效成分在菌肥中可以有效地抑制菌肥体系杂菌的产生，提高了菌肥的效果稳定性，同时与菌剂起到协同增效的杀菌作用，提高菌肥的药效。为该类成分的应用开创了一条新的道路。

本发明选用决明子为发酵原料之一，既提供了枯草芽胞杆菌在发酵过程中所需要的营养物质氮源，同时决明子含多种蛋白质和粘液，发酵后有一定的粘性，有增稠作用，可以较好地替代黄原胶，解决了菌肥的分层问题。其次，通过发酵过程使得决明子中的大黄素和大黄素甲醚得以很好的释放，能起到杀菌作用，抑制杂菌生长，保证了菌肥的防病效果的稳定性。同时，这些抑菌成分能与芽胞杆菌起到协同增效的作用，可以提高枯草芽胞杆菌的稳定性，提高菌肥药效。再者，本发明制备的菌肥常温条件下贮藏稳定性很好，存放12个月有效孢子含量在85％以上(国家标准，液肥贮藏时间为最低3个月有效孢子含量在85％以上)。

Claims (10)

1.一种枯草芽胞杆菌生物菌肥，其特征在于，组分以重量百分比计，包含：枯草芽胞杆菌菌液10％～95％，余量为水；

所述枯草芽胞杆菌菌液通过发酵得到，其发酵配方如下：组分以重量百分比计，决明子粉5～45％、玉米粉20～30％、氯化钠1～3％、硫酸镁1～3％、碳酸钙2～4％、磷酸二氢钾0.5～3％，聚硅氧烷消泡剂SXP-101适量，余量为水。

2.根据权利要求1所述的枯草芽胞杆菌生物菌肥，其特征在于：所述枯草芽胞杆菌生物菌肥还包括营养复合体5～30重量％，增效剂1～5重量％，助剂0.5～1重量％，所述营养复合体为海藻酸、腐植酸、氨基酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或尿素中一种或几种任意比例的混合；所述增效剂为硫酸锰；所述助剂为缩聚萘磺酸盐分散剂D-425；所述枯草芽胞杆菌菌液的发酵配方中还含有豆粕5～30重量份％。

3.根据权利要求1所述的枯草芽胞杆菌生物菌肥，其特征在于：所述枯草芽胞杆菌生物菌肥的配方为：枯草芽胞杆菌菌液的重量比为60重量％，海藻酸的重量比为5重量％，氨基酸的重量比为10重量％，磷酸氢二钾的重量比为7重量％，硫酸锰的重量比为2.5重量％，缩聚萘磺酸盐分散剂D-425的重量比为0.5重量％，余量为水。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的枯草芽胞杆菌生物菌肥，其特征在于：所述枯草芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌R31、枯草芽胞杆菌B-001、枯草芽胞杆菌S9、枯草芽胞杆菌B2、枯草芽胞杆菌Bs-916、枯草芽胞杆菌B-332或枯草芽胞杆菌BS-2。

5.权利要求1-3中任一项所述枯草芽胞杆菌生物菌肥的制备方法，其步骤如下：

(1)枯草芽胞杆菌菌液的制备

1)发酵液制备：发酵罐培养基采用的发酵配方为：决明子粉5～45重量份％、玉米粉20～30重量份％、氯化钠1～3重量份％、硫酸镁1～3重量份％、碳酸钙2～4重量份％、磷酸二氢钾0.5～3重量份％，聚硅氧烷消泡剂SXP-101适量，余量为水；

2)接种用菌株种子液制备：将斜面保存的枯草芽胞杆菌菌株活化培养，将其划线接种于牛肉膏蛋白胨培养基上培养；待菌株充分生长后，挑取单菌落，接种到LB培养基中培养，得到枯草芽胞杆菌的种子液，备用；

3)菌液的制备：将步骤2)培养好的枯草芽胞杆菌的种子液以0.5％～2％的接种量接种到步骤1)所得发酵罐中的发酵液进行发酵；发酵后开始检测，当芽胞形成率达95％以上时，停止发酵，得菌液；

(2)枯草芽胞杆菌生物菌肥的制备：将步骤(1)所得菌液加入水，得枯草芽胞杆菌生物菌肥。

6.根据权利要求5所述的枯草芽胞杆菌生物菌肥的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中之步骤1)中所述发酵罐培养基采用的发酵配方中还含有豆粕5～30重量份％；所述步骤(1)中之步骤2)中所述斜面保存的温度为4℃，所述活化培养的温度为32～37℃，活化培养的时间为1～2小时；在牛肉膏蛋白胨培养上培养的温度为32～37℃，活化培养的时间为20～28小时；在LB培养基上培养的温度为32～37℃，转速为180rpm，时间为10～18小时。

7.根据权利要求5所述的枯草芽胞杆菌生物菌肥的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)如下：将步骤(1)所得菌液中按比例将营养复合体、增效剂、助剂及水，充分搅拌，得枯草芽胞杆菌生物菌肥；所述营养复合体为海藻酸、腐植酸、氨基酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或尿素中一种或几种任意比例的混合，所述增效剂为硫酸锰，所述助剂为缩聚萘磺酸盐分散剂D-425。

8.一种枯草芽胞杆菌菌液，其发酵配方如下：以重量配比计，决明子粉5～45重量份％、玉米粉20～30重量份％、氯化钠1～3重量份％、硫酸镁1～3重量份％、碳酸钙2～4重量份％、磷酸二氢钾0.5～3重量份％，聚硅氧烷消泡剂SXP-101适量，余量为水。

9.根据权利要求8所述的枯草芽胞杆菌菌液，其特征在于：所述发酵配方中还含有豆粕5～30重量份％。

10.一种枯草芽胞杆菌菌液的制备方法，其步骤如下：

(1)发酵液制备：发酵罐培养基采用的发酵配方为：决明子粉5～45重量份％、豆粕5～30重量份％、玉米粉20～30重量份％、氯化钠1～3重量份％、硫酸镁1～3重量份％、碳酸钙2～4重量份％、磷酸二氢钾0.5～3重量份％，聚硅氧烷消泡剂SXP-101适量，余量为水；

(2)接种用菌株种子液制备：将4℃条件下斜面保存的枯草芽胞杆菌菌株置于32～37℃条件下活化培养1～2小时，将其划线接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，32～37℃条件下培养20～28小时；待菌株充分生长后，挑取单菌落，接种到LB培养基中，于32～37℃、180rpm下培养10～18小时，得到枯草芽胞杆菌的种子液，备用；

(3)菌液的制备：将步骤(2)培养好的枯草芽胞杆菌的种子液以体积比为0.5％～2％的接种量接种到步骤(1)所得发酵罐中的发酵液进行发酵；发酵22小时后开始检测，当芽胞形成率达95％以上时，停止发酵，得菌液。