CN111676148B - 一种副干酪乳杆菌csdn-6及其应用 - Google Patents

一种副干酪乳杆菌csdn-6及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株副干酪乳杆菌CSDN‑6及其应用，属于微生物领域，所述副干酪乳杆菌CSDN‑6保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CGMCC No.19756。本发明还提供了所述菌株在刺参微生态制剂中的应用。本发明副干酪乳杆菌CSDN‑6对刺参重要疾病“腐皮综合征”中的2种致病菌灿烂弧菌(V.splendidus)及假交替单胞菌(P.nigrifaciens)具有拮抗作用，能够预防和治疗刺参重要疾病，具有刺参疾病生态防控的作用；本发明菌株还能够提高刺参的ACP、AKP、LZM、SOD等非特异性免疫活力，增强刺参的抵抗力，预防疾病发生；同时，该菌株能够提高刺参的生长速度，提高养殖效益。

Description

一种副干酪乳杆菌CSDN-6及其应用
技术领域
本发明属于功能微生物的筛选与应用技术领域，具体涉及一种副干酪乳杆菌CSDN-6及其在刺参健康养殖中的应用。
背景技术
近年来，我国刺参养殖业的迅猛发展，特别是集约化与规模化养殖技术的 推广，养殖密度和投饵量也逐渐增加，养殖系统中残饵、粪便以及养殖动物尸 体不断积累，破坏养殖环境中的生态平衡，养殖环境中的细菌大量滋生，从而 导致病害问题接踵而至，严重影响了该产业的健康可持续发展。目前刺参的主 要疾病为“腐皮综合征”，因其发病率和死亡率高，成为制约该养殖业的难题。
对刺参“腐皮综合征”的病原学研究表明该疾病主要致病菌包括假交替单 胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)和灿烂弧菌(Vibrio splendidus)等。目前，养 殖过程中大多采用抗生素等化学类药物对疾病进行防控，抗生素的长期使用会 诱导病原菌产生耐药性并造成养殖环境微生物的生态平衡失调。而微生态制剂 能够调节养殖动物肠道菌群平衡，提高养殖动物的免疫力和生长速度，并且能 够降解水体中的氨氮、亚硝酸盐等有害物质，成为近年来养殖动物病害防控的 研究热点。
虽然我国近年来开发了很多微生态制剂产品，对刺参的健康养殖具有积极 的作用，但是进行疾病防控的微生态制剂相对匮乏，不能达到疾病生态防控的 效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种副干酪乳杆菌及其应用，提供适用 于刺参健康养殖的副干酪乳杆菌，并给出了该菌株的发酵条件及在海参养殖中 的使用方法。本发明的副干酪乳杆菌具有抑制刺参重要的病原菌、增强刺参免 疫力、促进刺参生长等多种功能，对刺参健康养殖及疾病的生态防控有重要意 义。
为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种副干酪乳杆菌CSDN-6，保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏日期为2020年4月28日，保藏号为CGMCC No.19756。
本发明提供所述副干酪乳杆菌是从刺参养殖池塘的底泥中分离得到。
本发明还提供所述副干酪乳杆菌CSDN-6在制备治疗或预防刺参腐皮综合 征微生态制剂中的应用。
本发明还提供含有副干酪乳杆菌CSDN-6的微生态制剂。
本发明还提供副干酪乳杆菌CSDN-6促进刺参生长功能的应用，所述副干 酪乳杆菌使用浓度为1×103CFU/mL。
本发明与现有技术相比的有益效果：
1.本发明菌株副干酪乳杆菌CSDN-6对刺参重要疾病“腐皮综合征”中的2 种致病菌灿烂弧菌(V.splendidus)及假交替单胞菌(P.nigrifaciens)具有拮抗作用， 具有刺参疾病生态防控的作用。
2.本发明菌株副干酪乳杆菌CSDN-6能够提高刺参的ACP、AKP、LZM、 SOD等非特异性免疫活力，增强刺参的免疫力，预防疾病发生。同时，该菌株 能够促进刺参生长，提高养殖效益。
附图说明
图1.基于菌株CSDN-6 16SrDNA序列构建的系统发育树；
图2.不同温度条件对菌株CSDN-6生长的影响；
图3.不同pH条件对菌株CSDN-6生长的影响；
图4.菌株CSDN-6胞内外产物对病原菌的抑制作用；
A、B为菌株CSDN-6胞内产物对灿烂弧菌、假交替单胞菌的抑制作用
C、D为菌株CSDN-6胞外产物对灿烂弧菌、假交替单胞菌的抑制作用
图5.添加副干酪乳杆菌CSDN-6对刺参ACP的影响；
图6.添加副干酪乳杆菌CSDN-6对刺参AKP的影响；
图7.添加副干酪乳杆菌CSDN-6对刺参LZM的影响；
图8.添加副干酪乳杆菌CSDN-6对刺参SOD的影响。
副干酪乳杆菌CSDN-6，拉丁文名称Lactobacillus paracaseiCSDN-6，于2020 年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址 为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCCNo.19756
具体实施方式
下面通过实施例结合附图来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明 的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1副干酪乳杆菌的筛选、鉴定和安全性评价
1.1菌株的筛选
采集位于山东地区刺参养殖池塘的底泥样品，利用MRS培养基对底泥样品 进行细菌的培养和分离纯化，以刺参“腐皮综合征”2种致病菌灿烂弧菌(V. splendidus)及假交替单胞菌(P.nigrifaciens)为指示菌，测定从刺参养殖底泥中分 离、纯化的乳杆菌对指示菌的抑制效果，从而筛选出具有拮抗病原菌的菌株。
通过对指示菌的拮抗实验筛选出1株具有显著拮抗作用的乳杆菌CSDN-6。 该菌株表面光滑，有光泽，中央隆起，边缘清晰。革兰氏染色阳性，无鞭毛， 无芽孢。
1.2菌株对刺参的安全性评价
利用MRS液体培养基培养CSDN-6，通过细菌高浓度胁迫实验测试CSDN-6 菌株对刺参的安全性。实验用健康刺参规格为15～20g/头。刺参暂养7d后随机 分组，每组20头，每个水槽定量加水20L。实验分实验组和空白对照组，各设 3个平行，其中实验组采用CSDN-6菌株浸浴的方式，浸浴浓度设置1×107 CFU/mL、1×108CFU/mL和1×109CFU/mL3个浓度梯度。实验共进行30d，每 天观察并记录刺参的活力、体色、摄食、排便、病征及死亡等情况。整个实验 过程中刺参健康，活力良好，摄食正常，无发病和死亡现象，说明菌株CSDN-6 对刺参是安全的。
1.3菌株的生理生化鉴定
参照麦氏比浊法制备0.5麦氏浊度的菌悬液，以细菌微量检定管进行生理生 化指标的测定。参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，2001)和《乳酸细菌 分类鉴定及实验方法》(凌代文等，1999)进行归类判定。
菌株CSDN-6能分解利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇；3％NaCl尿素酶、 3％NaClONPG、苦杏仁苷、丙二酸盐呈阳性，氧化酶反应呈阴性，不液化明胶， 不产生硫化氢气体，主要生理生化特征见表1。参照《常见细菌系统鉴定手册》 和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》中乳杆菌属的特征，对菌株CSDN-6进行 分类地位的鉴定，初步鉴定筛选菌株属于乳杆菌科(Lactobacillaceae)。
表1菌株CSDN-6的生理生化特征
Figure BDA0002486067290000041
Figure BDA0002486067290000051
注：﹢表示阳性，﹣表示阴性
1.4菌株的16S rDNA序列分析
利用细菌16S rDNA基因通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)对细菌总DNA的相应序列进 行扩增、测序。将测序结果通过Blast检索程序与NCBI基因库中相关序列进行 比对，并通过MEGA 6.0软件构建系统发育树。
采用通用引物对菌株CSDN-6的16S rDNA PCR扩增产物进行序列测定，具 体序列见SEQ ID NO.1。使用Blast软件对所获得测序结果在NCBI数据库进行 序列相似性比对分析，系统发育树如图1所示。结果表明，本研究分离获得的 菌株CSDN-6与副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracaseiJCM1171)的相似性为 99.83％。菌株的系统发育树如图1所示。
1.5菌株的最适生长温度和pH
利用TSB培养基将筛选菌株分别在温度为9℃、16℃、23℃、30℃、37℃、 44℃、51℃、58℃和pH为2、3、4、5、6、7、8、9的条件下进行液体培养， 180r/min恒温培养24h，对培养液进行培养计数，确定菌株最适温度和pH。
菌株CSDN-6在不同温度下的生长情况如图2所示。菌株在9℃～51℃范围 内均可以生长，58℃时不生长；在30℃～44℃范围内表现出明显的生长优势，37℃ 时生长速度最快，菌落数明显高于其他温度组。菌株CSDN-6在不同pH条件下 的生长情况如图3所示。pH在3～9范围内均可以生长，但菌株在pH为2和10 时不生长，pH为7时生长速度最快。通过以上实验确定菌株CSDN-6菌株的最 适培养条件为37℃、pH为7，180r/min恒温培养24h。
实施例2：副干酪乳杆菌CSDN-6对刺参腐皮综合征重要致病菌的抑菌作 用
1方法
1.1胞内及胞外产物的制备
采用MRS液体培养基对所分离且对病原菌有良好抑制作用的副干酪乳杆菌 CSDN-6进行培养，培养条件为温度为37℃、pH为7，180r/min恒温培养24h。 培养液5000r/min离心10min，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤得到无细胞上清 液，即供试菌胞外产物，随即用于实验或于4℃冰箱保存备用。副干酪乳杆菌 CSDN-6菌泥使用PBS冲洗3次后，用超声波细胞破碎仪进行细胞破碎，得到 供试菌胞内产物，随即用于进一步实验。
1.2胞内及胞外产物抑菌效果比较
以灿烂弧菌(V.splendidus)及假交替单胞菌(P.nigrifaciens)为指示菌，采用牛津杯法分别测定所制备的副干酪乳杆菌CSDN-6胞内产物及胞外产物对2株致 病菌的抑制效果。
2.结果
如图4、表2所示，副干酪乳杆菌CSDN-6的胞内产物与胞外产物对指示菌 灿烂弧菌和假交替单胞菌均具有较强的抑菌作用，胞内产物对灿烂弧菌的抑菌 圈是17mm，对假交替单胞菌的抑菌圈是22mm；胞外产物对灿烂弧菌的抑菌圈 是25mm，对假交替单胞菌的抑菌圈是31mm。由结果可见胞外产物对刺参重要 病原菌的抑菌效果优于胞内产物。
表2.菌株CSDN-6对病原菌的抑制作用
Figure BDA0002486067290000071
实 施例3：副干酪乳杆菌CSDN-6提高刺参增重率和非特异性免疫力
1.方法
1.1实验材料
刺参规格平均10g/头，刺参暂养3d后随机分组，每组50头，水槽有效容 积为35L水槽，每个水槽定量加水30L。
1.2实验设计
利用MRS液体培养基培养副干酪乳杆菌CSDN-6，培养条件为温度为37℃、 pH为7，180r/min恒温培养24h。实验分为实验组和空白对照组，实验组设置 副干酪乳杆菌CSDN-6的不同浸浴浓度，分别为1×102CFU/mL、1×103CFU/mL、 1×104CFU/mL、1×105CFU/mL、1×106CFU/mL、1×107CFU/mL，每个浓度梯度 设置3个平行组，同时设置3个空白对照组。实验进行40d，实验期间水温14～18℃， 每天换水一次，每次换水量为总水体的20％，换水后添加副干酪乳杆菌CSDN-6 至各实验组浓度，盐度30，每天饵料按照刺参重量的1％投喂。
1.3刺参相对增重率的测定
分别在实验开始和结束时，测量刺参体重、记录刺参数量。计算各实验组 开始和结束时刺参的平均体重W0和Wt，计算增重率。增重率(％)＝(Wt-W0)
/W0×100。
1.4刺参非特异性免疫酶活力测定
实验结束后，每组随机采集3头刺参进行体腔液的采集，测定刺参碱性磷 酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)和溶菌酶(LZM) 等非特异性免疫酶活。
2结果
2.1副干酪乳杆菌CSDN-6提高刺参增重率效果分析
实验结果如表3，实验期间不同组刺参增重率变化可以看出，添加不同浓度 的副干酪乳杆菌CSDN-6实验组，除了1×102CFU/mL组，其余各组刺参的增重 率均显著高于对照组(P＜0.05)，1×103CFU/mL、1×104CFU/mL组显著高于 其他各组(P＜0.05)，1×103CFU/mL组增重率最高，达到25.6％。由此可以看 出副干酪乳杆菌CSDN-6对刺参生长具有显著的促进作用，可以制备成微生态 制剂用于刺参养殖。
表3.不同浓度的副干酪乳杆菌CSDN-6对刺参增重率的影响
Figure BDA0002486067290000081
2.2副干酪乳杆菌CSDN-6提高刺参非特异性免疫力效果分析
刺参养殖环境中添加不同浓度的副干酪乳杆菌CSDN-6后，通过图5可以 看出刺参体腔液的ACP酶活力变化情况：1×103CFU/mL、1×104CFU/mL、1×105 CFU/mL组的刺参体腔液的ACP酶活力均显著高于对照组；通过图6可以看出 刺参AKP酶活力变化情况：添加CSDN-6的不同实验组均显著高于对照组(P ＜0.05)，；通过图7可以看出刺参体腔液的LZM酶活力情况：1×103CFU/mL、 1×104CFU/mL、1×105CFU/mL、1×106CFU/mL组均显著高于对照组(P＜0.05)，1×103CFU/mL组LZM酶活力最高；通过图8可以看出刺参SOD活力情况： 1×103CFU/ml、1×104CFU/ml组SOD一直处于较高水平，其中1×103CFU/mL组 SOD酶活力最高。
通过以上实验结果图5-8可以看出，添加副干酪乳杆菌CSDN-6能够提高刺 参体腔液中ACP、AKP、LZM、SOD等非特异性免疫酶活力，其中浓度为1×103 CFU/mL、1×104CFU/mL时刺参非特异性免疫酶活力处于较高的水平。
综上所述：副干酪乳杆菌CSDN-6添加浓度为1×103CFU/mL组增重率最高， 副干酪乳杆菌CSDN-6添加浓度为1×103CFU/mL和1×104CFU/m组能够显著提 高刺参免疫力。结合副干酪乳杆菌CSDN-6对刺参增重率和提高刺参免疫力的 实验，可以确定副干酪乳杆菌CSDN-6最佳使用浓度为1×103CFU/mL。
序列表
<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所
<120> 一种副干酪乳杆菌CSDN-6及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1414
<212> DNA
<213> 副干酪乳杆菌CSDN-6(Lactobacillus paracasei CSDN-6)
<400> 1
gggttacgcc accggcttcg ggtgttacaa actctcatgg tgtgacgggc ggtgtgtaca 60
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Claims (5)

1.一种副干酪乳杆菌CSDN-6，其特征在于所述副干酪乳杆菌CSDN-6保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年4月28日，保藏号为CGMCC No.19756。
2.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌CSDN-6，所述副干酪乳杆菌是从刺参养殖环境底泥中分离得到。
3.权利要求1所述副干酪乳杆菌CSDN-6在制备治疗或预防刺参腐皮综合征微生态制剂中的应用。
4.含有权利要求1所述副干酪乳杆菌CSDN-6的刺参微生态制剂。
5.权利要求1所述副干酪乳杆菌CSDN-6促进刺参生长功能的应用，所述副干酪乳杆菌使用浓度为1×103 CFU/mL。
CN202010391775.1A 2020-05-07 2020-05-11 一种副干酪乳杆菌csdn-6及其应用 Active CN111676148B (zh)

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