CN1176940C - 一种高效亲和色谱填料及其制备方法 - Google Patents
一种高效亲和色谱填料及其制备方法Info
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Abstract
本发明公开了一种以聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球作为基质高效亲和色谱填料，该填料中含有下式的聚合单元：其中Hep为肝素，P的结构为：其制备方法是通过将肝素键合到聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球上，得到本发明的亲和色谱填料。本发明的亲和色谱填料对抗凝血酶III具有高的亲和容量和低的非特异性吸附，质量回收率达94%。
Description
本发明涉及一种高效亲和色谱填料及其制备方法，具体涉及以肝素为配基的高效亲和色谱填料及其制备方法。
按亲和填料的基质又可分为软胶和硬胶两种类型。软胶包括天然多糖和聚丙烯酰胺等，它们具有良好的亲水性，对蛋白质的非特异性吸附低，在低压操作下，具有优良的色谱分离性能，但它们的机械强度差，凝胶颗粒极易变形而破坏，使操作压力和流速均受到很大限制，且使用寿命也短。大孔硅胶是被广泛使用的硬胶，它们具有很好的机械性能，可在高压、高流速条件下使用，但它们的化学稳定性差，仅在pH 2～8条件下使用。另外，硅胶表面的带负电荷的硅羟基，对蛋白质有较强的非特异性吸附，使得回收率大大降低，因而也很难用于实用的高效亲和色谱。理想的高效亲和色谱填料应具有较高的机械强度，较好的化学稳定性，良好的亲水性和生物相容性以及较长的使用寿命。
以肝素为配基的亲和填料是一种用途广泛的特种生化分离材料。以肝素为配基的亲和填料有肝素-Sepharose，肝素-聚丙烯酰胺和肝素-硅胶等。
在与本发明相关的工作中，F.L.Zhuo等曾报道了一种以肝素为配基的高效亲和色谱填料[Journal of Chromatography，476(1989)，195-203]，他们是将DEAE-agrose包覆在大孔硅胶的表面，再将肝素键合在包覆层上，制备了以肝素为配基的高效亲和色谱填料。经色谱表征，该材料对抗凝血酶III有较强的亲和作用，但在硅胶表面包覆天然多糖后，并不能完全屏蔽硅胶表面的硅羟基，对蛋白质仍存在较强的非特异性吸附，质量回收率仅为78％。
本发明的目的在于提供了一种以肝素为配基的高效亲和色谱填料，克服了已有技术中以肝素为配基的高效亲和色谱填料蛋白质回收率低的缺点。
本发明的另一个目的在于提供该填料的制备方法。
本发明的高效亲和色谱填料，以聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球作为基质，在该填料中含有下式的聚合单元：
其中P的结构为：
Hep为肝素，其结构为：
上述的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球是甲基丙烯酸环氧丙酯和甲基丙烯酸乙二醇双酯的共聚物。
本发明的高效亲和色谱填料的制备，采用如下三种方法：
1)先用盐酸对肝素进行处理，然后再利用肝素分子中的氨基与聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球上的环氧基偶联，得到本发明的填料，其中肝素处理步骤包括将肝素溶于0.1M盐酸中，加热，然后加入到乙醇中。
2)先将聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球进行氨基化，得到氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，然后再将所述氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球与肝素在1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)碳二亚胺存在下，利用肝素分子中的羧基与聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球上的氨基反应，得到本发明的填料。
3)先将聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球进行氨基化，得到氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，然后再将所述氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球与肝素在氰基硼氢化钠存在下进行还原氨化反应，利用肝素分子还原端的醛基与聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球上的氨基反应得到本发明的填料。
方法一：
聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球 聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球-肝素
方法二：
聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球 氨基化聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球
聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球-肝素
方法三：
聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球 氨基化聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球
聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球-肝素
本发明的高效亲和色谱填料的3种制备方法具体步骤如下：
方法一：
1.将肝素溶于0.1M HCl中，浓度为1％-20％(w/V)，置于沸水浴中加热10-60min。
2.将上述溶液加入到乙醇中，有大量白色沉淀生成，乙醇的体积是上述溶液的1-10倍。
3.过滤，将滤渣于30-80℃温度下干燥至于。
4.将上述干燥后产物溶于0.3-1.0mol/L的Na2CO3溶液中，溶液浓度为0.5％-10％(w/V)，再加入聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，肝素与聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球的重量比为30∶1-3∶1，较佳的为20∶1-5∶1，搅拌，在40-80℃反应24-96h。
5.过滤，将滤渣于30-80℃温度下干燥至干。
方法二：
1.制备氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球
将聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球加入氨水中，二者的重量体积比为1∶6-1∶2，搅拌，在30-60℃保温5-10h后，得到氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球。
2.0.05-0.20mol/L HCl溶液中加入肝素，浓度为1％-40％(w/V)，再加入氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)碳二亚胺，氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球与1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)碳二亚胺的重量比为10∶1-1∶1，较佳的为8∶1-3∶1，搅拌，调节pH＝2-8，在室温下反应24-96h。
3.过滤，将滤渣用大量水洗涤至中性后抽干。
4.加入0.1-0.5mol/Na2CO3溶液，搅拌成均匀的悬浊液后，加入乙酸酐，乙酸酐的体积是悬浊液的0.5-5倍，在室温下反应10-60min。
5.过滤，滤渣用水充分洗涤至pH值为中性后抽干。
方法三：
1、同方法二(1)
2.将肝素溶于0.05-0.50mol/L K2HPO4中，肝素的浓度为1％-10％(w/V)，再加入氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球和氰基硼氢化钠，二者的重量比为100∶1-10∶1，搅拌成均匀的悬浊液后，于30-100℃加热5-15h，反应温度优选为50-95℃。
3.过滤，滤渣用水充分洗涤至中性后真空抽至干。
4.加入0.1-0.5mol/Na2CO3溶液，搅拌成均匀的悬浊液后，加入乙酸酐，乙酸酐的体积是悬浊液的0.5-5倍，在室温下反应10-60min。
5.过滤，用水充分洗涤至中性后真空吸滤至干。
本发明的以肝素为配基的高效亲和色谱填料，首先通过分散聚合的方法，制备微米级粒度均匀的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，再将其活化，将活性官能团引入聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球后，通过多种方法将肝素键合在聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面，制备出高效亲和色谱填料。
聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球的制备，是通过将甲基丙烯酸环氧丙酯、偶氮二异丁腈、聚乙烯吡咯烷酮、乙醇和甲苯混合，甲基丙烯酸环氧丙酯、偶氮二异丁腈、聚乙烯吡咯烷酮分别为上述总体原料量的1wt％-10wt％、0.1wt％-1.0wt％、0.5wt％-5.0wt％，乙醇与甲苯的比例为2/8-9/1(V/V)，搅拌，在氮气保护下于20-70℃下反应5-48h，反应结束后，用沉降法除去溶剂，并用乙醇充分洗涤，得到粒径单分散的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球。
由扫描电镜可知，本发明的高效亲和色谱填料颗粒尺寸为7μm，且颗粒粒径分布极其均匀，呈单分散状。当将该填料以20Mpa压强装填于φ4.0×7.0cm的不锈钢柱中，并连接于高效液相色谱系统时，其柱后压力为1.5-4.0MPa(流速为1mL/min)，以抗凝血酶III为样品时，其亲和容量为1.2-4.0mg/g亲和填料。当以人血清白蛋白为样品测定其对蛋白质的非特异性吸附时，蛋白质回收率大于90％。
实验例1：
将下面实施例1-4制备的肝素-聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球树脂为填料，在20MPa压力下以匀浆法装柱，柱管为：φ4.0×7.0cm不锈钢柱或任选。在下列条件下进行高效液相色谱表征及高效亲和分离：
平衡液：0.004M Tris-HCl，0.10M NaCl，pH＝4.0
洗脱液：0.02M Tris-HCl，2.0M NaCl，pH＝7.35
流速：0.1mL/min～10.0mL/min
检测波长：280nm
本发明的以肝素为配基的高效亲和色谱填料具有很好的机械强度，能于30MPa以下稳定工作，从而可用于高流速淋洗；化学性质稳定，能耐受pH 1.0-12.0的环境；对抗凝血酶III具有高的亲和容量和低的非特异性吸附，质量回收率达94％，如表1所示。
表1
实施例1：
将1g甲基丙烯酸环氧丙酯、0.01g偶氮二异丁腈、0.1g聚乙烯吡咯烷酮与9.4mL乙醇和9.4mL甲苯混合，搅拌，在氮气保护下于40℃下反应12h，反应结束后，用沉降法除去溶剂，并用乙醇充分洗涤，得到粒径单分散的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球。
将150mg肝素溶于1.0mL 0.1M HCl中，置于沸水浴中加热60min后，将反应液加入到乙醇中，有大量白色沉淀生成，乙醇的体积是上述溶液的2倍。过滤，将滤渣于40℃温度下干燥至干。将上述干燥后产物50mg溶于2mL的0.5mol/L的Na2CO3溶液中，再加入1.0g聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，搅拌，在40℃反应48h后，过滤，将滤渣用水洗涤后，于30-80℃温度下干燥至干。所得到的以肝素为配基的高效亲和色谱填料中肝素的浓度为1.6mg/g微球，对抗凝血酶III的亲和容量为3.6mg/g填料，蛋白质回收率为94％。
实施例2：
在2mL的氨水中加入1.0g实施例1制备的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，搅拌，在30℃保温5h后，得到氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球。将100mg的肝素溶于1mL 0.1M HCl中，加入1.0g上述氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球和250mg的1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)碳二亚胺，搅拌，调pH＝7，在室温下反应24h。过滤，将滤渣用大量水洗涤至中性后抽干。加入1mL的0.5mol/Na2CO3溶液，搅拌成均匀的悬浊液后，加入1mL乙酸酐，在室温下反应60min后，过滤，滤渣用水充分洗涤至pH值为中性后抽干。所得到的以肝素为配基的高效亲和色谱填料中肝素的浓度为10.2mg/g微球，对抗凝血酶III的亲和容量为1.8mg/g填料，蛋白质回收率为93.6％。
实施例3：
在2mL的氨水中加入1.0g实施例1制备的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，搅拌，在30℃保温5h后，得到氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球。将130mg的肝素溶于2mL 0.1M HCl中，加入1.0g上述氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球和150mg的1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)碳二亚胺，搅拌，调节pH＝4-5，在室温下反应48h。过滤，将滤渣用大量水洗涤至中性后抽干。加入1mL的0.5mol/LNa2CO3溶液，搅拌成均匀的悬浊液后，加入2mL乙酸酐，在室温下反应60min后，过滤，滤渣用水充分洗涤至pH值为中性后抽干。所得到的以肝素为配基的高效亲和色谱填料中肝素的浓度为1.4mg/g微球，对抗凝血酶III的亲和容量为2.4mg/g填料，蛋白质回收率为94.8％。
实施例4：
在2mL的氨水中加入1.0g实施例1制备的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，搅拌，在30℃保温5h后，得到氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球。将30mg肝素溶于1.0mL 0.1mol/L K2HPO4中，再加入1.0g氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球和30mg氰基硼氢化钠，搅拌成均匀的悬浊液后，于50℃加热8h。过滤，滤渣用水充分洗涤至中性后真空抽至干。加入1mL的0.5mol/L Na2CO3溶液，搅拌成均匀的悬浊液后，加入2mL乙酸酐，在室温下反应60min后，过滤，滤渣用水充分洗涤至pH值为中性后抽干。所得到的以肝素为配基的高效亲和色谱填料中肝素的浓度为1.0mg/g微球，对抗凝血酶III的亲和容量为1.1mg/g填料，蛋白质回收率为94％。
Claims (4)
1.一种高效亲和色谱填料，以聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球作为基质，其特征在于在所述的填料中含有下式的聚合单元：
其中Hep为肝素，P的结构为：
2.权利要求1的填料的制备方法，其特征在于先用盐酸对肝素进行处理，然后再将肝素直接键合到聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球上，得到权利要求1的填料，其中肝素处理步骤包括将肝素溶于0.1M盐酸中，加热，然后加入到乙醇中。
3.权利要求1的填料的制备方法，其特征在于先将聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球进行氨基化，得到氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，然后再将所述氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球与肝素在1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)碳二亚胺存在下进行反应，得到权利要求1的填料。
4.权利要求1的填料的制备方法，其特征在于先将聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球进行氨基化，得到氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，然后再将所述氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球与肝素在氰基硼氢化钠存在下进行还原氨化反应，得到权利要求1的填料。
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