CN1308067C

CN1308067C - 以磺胺二甲嘧啶为配基的亲和色谱填料

Info

Publication number: CN1308067C
Application number: CNB031378331A
Authority: CN
Inventors: 刘国诠; 刘阳; 赵睿
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2003-05-21
Filing date: 2003-05-21
Publication date: 2007-04-04
Anticipated expiration: 2023-05-21
Also published as: CN1548224A

Abstract

本发明是一种利用磺胺二甲嘧啶(SMZ)为配基的亲和色谱填料，可用于专一性地分离抗体球蛋白(IgG)。SMZ为一种广泛应用的抗菌消炎药物，利用其分子上的氨基，可将其键合至各种载体上，制备出亲和色谱填料。该填料用于从血浆、发酵液、组织匀浆液或其它含有丙种抗体球蛋白的物质体系中专一性地将其中的丙种抗体球蛋白分离出来。其纯度可达91%以上。固定化的SMZ与人IgG的相互作用解离常数可达3×10^-6mol/L。这种新的亲和色谱填料具有亲和作用力强、安全性高、原料易得、价格低廉的特点。

Description

以磺胺二甲嘧啶为配基的亲和色谱填料

技术领域

本发明属于一种色谱填料以及其在在生物大分子分离、纯化中的应用。具体涉及到一种亲和色谱填料，即利用磺胺二甲嘧啶(SMZ)为配基的亲和色谱填料，以及其在分离、纯化丙种抗体球蛋白(IgG)方面的应用。

背景技术

IgG(Immunoglobulin G)在体液免疫中起着“主力免疫”的作用，具有重要的生理功能，主要包括：1.中和毒素和病毒；2.凝集作用和沉淀作用；3.激活补体；4.亲细胞功能；5.免疫损伤等。以杂交瘤技术制备的单克隆抗体，属于均质的IgG，广泛应用于疾病的生物化学分析、诊断和导向药物的制备。但是，IgG的分离、纯化一直是其制备过程中的瓶颈技术，应用亲和色谱方法纯化IgG一直是研究的热点[刘国诠，李振甫，赵睿：《抗体工程》，董志伟，王琰主编，北京医科大学出版社，北京，2002年，185-208]。

亲和色谱是用于生物大分子的分离与纯化的一种液相色谱模式，它是根据生物大分子与其配基间所具有的高亲和力而设计的一种高选择性的色谱分离方法。1967年Axen等人[R.Axen，J.Porath and S.Emback：Nature，1967，214：1302-1304]首次将具有伯氨基的分子键合到以CNBr活化的多糖基质上。此后，大量的亲和色谱填料被开发并生产出来，使亲和色谱成为了实验室中广泛应用的一种分离纯化的手段。1978年，Ohlso等人[S.Ohlson，L.Hansson，P.-O.Larssom and K.Mosbach：FEBS Lett.，1978，93：5-9]提出了高效亲和色谱的概念，以小粒径高效基质取代习用的软胶，大大提高了亲和色谱的分离效率与速度。

在亲和色谱中，首先须将配基以共价键连接于不溶性载体相上，得到具有固定化配基的亲和色谱填料。将这种亲和色谱填料填充成亲和色谱柱。若将含有目标蛋白质的混合物加到柱上，则只有能与固定化配基表现出明显亲和作用的蛋白质被保留；其他不能识别固定化配基的组分则不受阻碍地流过色谱柱床。然后，改变溶剂的组成便可将目标蛋白质从固定化配基上解离和洗脱下来。

与其它经典的蛋白质分离方法比较，亲和色谱有许多突出的优点：

1，亲和色谱几乎可应用于任何两种有特异性相互作用的生物分子的分离。

2，亲和色谱是选择性最高的色谱模式。在许多场合下，亲和色谱是纯化倍数最高的操作，可大大减少操作所需时间、步骤和成本。

3，操作条件温和，有利于稳定蛋白质的结构和活性，提高蛋白质的活性回收率。

4，适于分离复杂生物体系中低浓度的蛋白质组份。

对于亲和色谱而言，选择合适的亲和配基是最重要的一环。高效亲和色谱的配基可分为两大类：非专一性亲和配基和生物专一性相互作用配基。非专一性配基如染料、类染料、固定化和氨基酸类似物等。它们的特点在于便宜易得，容易键合且键合量大，易于大规模生产，缺点是专一性差，选择性较低。专一性配基主要是利用抗原-抗体、酶-底物、酶-抑制剂等的生物专一性作用。它们往往有高的选择性，但其成本高，来源困难。在亲和色谱中配基必须具备以下条件：

1.在一定条件下，能和欲分离的生物大分子进行专一性结合，所形成复合物的解离常数一般在10^-4～10^-8mol/L之间。

2.配基和生物大分子结合后，在一定条件下又能解离，而且解离后不能破坏生物大分子的生物活性。

3.配基上必须含有可被利用的官能团，以便用适宜的化学方法将其偶联到固相载体上，且偶联后不应影响配基和欲分离生物大分子的专一性结合。

发明内容

本发明中提出了一种新的亲和色谱用配基一磺胺二甲嘧啶(SMZ)。磺胺二甲嘧啶为一种大量生产且广泛应用的抗菌消炎药物。其分子结构中含有氨基，这一氨基可以与表面或整体含有环氧基、氨基、羟基、羧基、醛基或其它能与氨基进行偶联反应的基团的固体载体进行反应，从而可通过很多方法将其键合至载体上，便可制备出亲和色谱填料并据以制备出相应的亲和色谱柱。所指的载体为多孔或无孔的球形、无定型、薄膜或纤维状的硅胶、可控孔径玻璃、氧化物陶瓷、合成高分子材料或天然高分子材料。其中，所述的氧化物陶瓷为氧化铝、氧化锆或氧化钛为基质的陶瓷；所述的合成高分子材料为聚甲基丙烯酸环氧丙酯、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸乙二醇酯、聚丙烯腈、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或聚酰胺材料或它们的复合物；所述的天然高分子材料为琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、壳聚糖、纤维素材料或它们的复合物。所发明的亲和色谱填料具有下图所示的结构：

当使用多孔或无孔聚甲基丙烯酸环氧丙酯、聚甲基丙烯酸乙二醇酯或以琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、壳聚糖或纤维素材料为基质的固体材料为载体时。其制备方法，按下列合成步骤进行：

(1)接活化的空间臂：取一份多孔或无孔聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，其直径2～200微米，若为多孔微球，其孔径应大于20纳米。加入0.1～10份0.01～1.0mol/L的NaOH，0.1～10份双官能团化合物，如乙二醇二缩水甘油醚或丁二醇二缩水甘油醚，再加入0.001～0.1份硼氢化钠，在振荡器或在搅拌下，于10℃～90℃反应2～72小时，产物抽吸过滤并以蒸馏水洗净备用。

(2)偶联配基：取一份上述产物，置于含0.1～10份磺胺二甲嘧啶的NaCO₃缓冲液(pH 10)中，于10℃～90℃下振荡或搅拌反应2～72h。反应物过滤，以大量水冲洗，抽吸过滤，于30～70℃下真空干燥。

(3)封闭残余活性基团：取一份上述产物，加入5～30份1M的pH 8.5的Tris-HCl缓冲液，10℃～90℃下振荡或搅拌反应1.0～10h，过滤，用大量水冲洗，最后用甲醇洗涤2次，，于30～70℃下真空干燥至干，得到以SMZ为配基的亲和色谱填料

将所制备的亲和色谱填料填装进不锈钢、塑料或玻璃制的柱管中制成亲和色谱柱，将此种亲和色谱柱连接至色谱系统中，便可用以进行目的产物的分离与分析。进行色谱分离时，流动相A液为pH 5.0～6.0的0.005～0.05mol/L的缓冲液，B液为A液中加入0.020～0.5mol/L氯化钠或氯化钾。可采用阶段梯度，也可采用其它梯度模式。在280nm或在220nm下进行监测。所发明的亲和色谱填料，在pH5.0～pH6.0时，可以与丙种抗体球蛋白产生专一性的分子识别相互作用，但不与人血清白蛋白(HAS)、牛血清白蛋白(BSA)、A蛋白(Protein A)、伴刀豆球蛋白A(Con A)、胰蛋白酶(Trypsin)、抗凝血酶III(AT III)等常见蛋白质产生专一性的分子识别相互作用。固定化的磺胺二甲嘧啶与人丙种抗体球蛋白具有强的相互作用力，若以解离常数表示，其解离常数可达3×10^-6mol/L。从而，该填料可以从复杂的体系中，例如，从血浆、发酵液、组织匀浆液或其它含有丙种抗体球蛋白的物质中专一性地将其中的丙种抗体球蛋白分离出来。使用血浆为样品时，血浆不需特别预处理，使用血浆原液或以A液稀释，以0.45μm的滤膜过滤后直接进样，所得到的抗体球蛋白的纯度大于91％(以SDS-PAGE测定)。

这种新的亲和色谱填料与既有的分离抗体球蛋白的亲和色谱填料，具有亲和作用力强、安全性高、原料易得、价格低廉的特点。可用于从血浆、发酵液、组织匀浆液或其它含有丙种抗体球蛋白的物质中将其中所含的丙种抗体球蛋白的加以分离、纯化，也可将其用于丙种抗体球蛋白或丙种抗体球蛋白复合物的分析与测定。

具体实施方式：

1.选择粒径单分散的聚甲基丙烯酸环氧丙酯高分子微球(PGMA)为载体，微球粒径约11μm，具有良好的机械强度和化学稳定性，可在pH 2～13范围内使用，其表面富含环氧基，含量为1.1mmol/g树脂。取PGMA微球1.5g，置于圆底烧瓶中，加入5ml 0.5mol/LNaOH，5ml乙二醇二缩水甘油醚及10mg硼氢化钠，在摇床上室温振荡反应8小时，抽吸过滤并以蒸馏水洗净、称取上述干树脂1.2g，加至溶有2g SMZ的NaCO₃缓冲液(pH 10)30ml中，50℃下振荡反应36h。反应物过滤，以大量水冲洗，抽干。加入10ml 1M的pH 8.5的Tris-HCl缓冲液，室温下振荡反应3h，过滤，用大量水冲洗，最后用甲醇洗涤2次，真空下烘干备用。此即为以PGMA为载体、以SMZ为配基的亲和色谱填料。

2.选择粒径单分散的聚甲基丙烯酸环氧丙酯高分子微球(PGMA)为载体，微球粒径约11μm，具有良好的机械强度和化学稳定性，可在pH 2～13范围内使用，其表面富含环氧基，含量为1.1mmol/g树脂。取PGMA微球1.5g，置于于圆底烧瓶中，加入5ml 0.5mol/LNaOH，5ml乙二醇二缩水甘油醚及10mg硼氢化钠，在摇床上室温振荡反应8小时，抽吸过滤并以蒸馏水洗净、称取上述干树脂1.2g，加至30ml NaCO₃缓冲液(pH 10)中，50℃下振荡反应36h。反应物过滤，以大量水冲洗，抽干。加入10ml 1M的pH 8.5的Tris-HCl缓冲液，室温下振荡反应3h，过滤，用大量水冲洗，最后用甲醇洗涤2次，真空下烘干备用。此即为以PGMA为载体、不接SMZ的空白亲和色谱填料。

3.取直径为4mm，长度为70mm d1不锈钢柱管洗净备用。1g以PGMA为载体、以SMZ为配基的亲和色谱填料，悬浮于pH为7.4的50mM磷酸缓冲液(PBS)中，在15Mpa压力下以匀浆法装柱，制备出亲和色谱柱。以同样方法可以制备出空白亲和色谱柱。

4.以PGMA为载体、以SMZ为配基的亲和色谱柱及未键合配基的空白柱与IgG亲和作用的比较：将亲和色谱柱或空白柱连接于高效液相色谱仪上，样品为人IgG。流动相A液为50mM PBS(pH 5.5)，B液为50mM PBS+250mM盐(pH 5.5)，梯度条件：0-10minA液，10-20min B液，20-30min A液；在280nm下监测，从色谱分离结果可知，人IgG在空白柱上没有保留，在亲和柱上可保留且在换为B液时重新被洗脱下来，说明键合SMZ配基的亲和柱与IgG有专一性作用。

5.不同蛋白质在亲和柱上保留行为：将亲和色谱柱连接于高效液相色谱仪上，样品为人血清白蛋白(HAS)、牛血清白蛋白(BSA)、A蛋白(ProteinA)、伴刀豆球蛋白A(ConA)、胰蛋白酶(Trypsin)、抗凝血酶III(AT III)等常见蛋白质。流动相A液为50mMPBS(pH 5.5)，B液为50mM PBS+250mM盐(pH 5.5)，梯度条件：0-10minA液，10-20min B液，20-30minA液：在280nm下监测。从色谱分离结果可知，上述不同类型的蛋白质中，只有人IgG显示了特异性的吸附。

6.不同种属的IgG在亲和柱上保留行为：将亲和色谱柱连接于高效液相色谱仪上，样品为羊IgG、鼠IgG以及人IgG。流动相A液为50mMPBS(pH 5.5)，B液为50mM PBS+250mM盐(pH 5.5)，梯度条件：0-10min A液，10-20min B液，20-30min A液；在280nm下监测，从其色谱分离结果可知，它们与配基SMZ作用强度的顺序是：鼠IgG＜羊IgG＜人IgG。

7.将亲和色谱柱连接于高效液相色谱仪上，样品为人IgG。流动相为50mM PBS(pH 5.5)，以前沿色谱法测定固定化SMZ与人IgG的亲和常数。若以解离常数Kd表示其亲和常数，则Kd＝3.49×10^-6mol/L，此亲和常数值恰恰处于一般亲和色谱的最适亲和常数范围内。

8.从人血浆中直接分离纯化IgG：将亲和色谱柱连接于高效液相色谱仪上，流动相为50mMPBS(pH 5.5)，样品为人IgG。血浆样品不需特别预处理，于实验前将冷冻保存的血浆样品于37℃水浴中解冻，用上样液稀释一倍，以0.45μm的滤膜过滤后，取50μl此50％血浆溶液进样，可直接得到人球蛋白。以SDS-PAGE测定，其纯度大于91％。

Claims

1.一种亲和色谱填料，其特征在于所述的亲和色谱填料以抗菌消炎药物磺胺二甲嘧啶SMZ为亲和配基，且具有如下结构：

2.根据权利要求1所述的亲和色谱填料，其特征在于所述的亲和色谱填料，在pH5.0-pH6.0时与丙种抗体球蛋白产生专一性的分子识别相互作用。

3.根据权利要求1所述的亲和色谱填料，其特征在于所述的亲和色谱填料，在pH5.0-pH6.0时与丙种抗体球蛋白产生专一性的分子识别相互作用，但不与人血清白蛋白HAS、牛血清白蛋白BSA、A蛋自、伴刀豆球蛋白A、胰蛋白酶、抗凝血酶III产生专一性的分子识别相互作用。

4.根据权利要求1所述的亲和色谱填料，其特征在于所述的亲和色谱填料上固定化的磺胺二甲嘧啶与人丙种抗体球蛋白具有强的相互作用力，若以解离常数表示，其解离常数达3×10^-6mol/L。

5.根据权利要求1所述的亲和色谱填料，其特征在于所述的亲和色谱填料的固相载体为多孔或无孔的球形、无定型、薄膜或纤维状的硅胶、可控孔径玻璃、氧化物陶瓷、合成高分子材料或天然高分子材料。

6.根据权利要求5所述的亲和色谱填料，其特征在于所述的氧化物陶瓷为氧化铝、氧化钴或氧化钛为基质的陶瓷。

7.根据权利要求5所述的亲和色谱填料，其特征在于所述的合成高分子材料为聚甲基丙烯酸环氧丙酯、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸乙二醇酯、聚丙烯腈、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或聚酰胺材料或它们的复合物。

8.根据权利要求5所述的亲和色谱填料，其特征在于所述的天然高分子材料为琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、壳聚糖、纤维素材料或它们的复合物。

9.根据权利要求1所述的亲和色谱填料的制备方法，其特征在于使用多孔或无孔聚甲基丙烯酸环氧丙酯、聚甲基丙烯酸乙二醇酯或以琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、壳聚糖或纤维素材料为基质的固体材料为固相载体的亲和色谱填料的制备方法，按下列合成步骤进行：

(1)接活化的空间臂：取一重量份多孔或无孔聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，其直径2～200微米，若为多孔微球，其孔径应大于20纳米；加入0.1～10重量份0.01～1.0mol/L的NaOH，0.1～10重量份双官能团化合物，再加入0.001～0.1重量份硼氢化钠，在振荡器或在搅拌下，于10℃～90℃反应2～72小时，产物抽吸过滤并以蒸馏水洗净备用；

(2)偶联配基：取一重量份上述产物，置于含0.1～10重量份磺胺二甲嘧啶的pH10的Na₂CO₃缓冲液中，于10℃～90℃下振荡或搅拌反应2～72h；反应物过滤，以大量水冲洗，抽吸过滤，于30℃～70℃下真空干燥；

(3)封闭残余活性基团：取一重量份上述产物，加入5～30重量份1M的pH 8.5的Tris-HCl缓冲液，10℃-90℃下振荡或搅拌反应1～10h，过滤，用大量水冲洗，最后用甲醇洗涤2次，于30～70℃下真空干燥至干，得到以SMZ为配基的亲和色谱填料。

10.根据权利要求1所述的亲和色谱填料的用途，其特征在于所述的亲和色谱填料用于从血浆、发酵液、组织匀浆液或其它含有丙种抗体球蛋白的物质体系中专一性地将其中的丙种抗体球蛋白分离出来。