CN102671638A - 一种仿生物特异性免疫吸附材料及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种仿生物特异性免疫吸附材料及其制备方法与应用。制备时，先通过环氧化琼脂糖与叠氮化钠反应得叠氮化琼脂糖凝胶；将丁二酸酐溶于二氯甲烷后和炔丙醇，加入催化剂，制得炔酸；将炔酸和N-羟基丁二酰亚胺溶于1，4-二氧六环后，加入缩合剂，制得炔酸的活性酯，将炔酸的活性酯溶于1，4-二氧六环后与配基的水溶液混合，制得炔化氨基酸，将炔化氨基酸的溶液加入叠氮化琼脂糖中，加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠作催化剂，制得产物。本发明以含有丰富羟基，血液相容性和机械性能良好的琼脂糖凝胶为载体，合成步骤简单、制备安全；产品具有特异性强、对IgG的吸附效率高、再生性能好的特性，可用于IgG分离和临床上免疫吸附治疗。

Description

一种仿生物特异性免疫吸附材料及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种仿生物特异性免疫吸附材料，特别是涉及一种可用于血液净化的仿生物特异性免疫吸附材料及其制备方法。本发明涉及采用点击化学（click chemistry）的方法实现载体与配基的偶联，制备仿生物特异性免疫吸附材料，。

技术背景

免疫吸附（immunoadsorption）疗法是一种基于亲和层析原理以实现血液净化的一种新技术，用于治疗一些传统方法难以奏效的疾病。它是将对某些具有专一而可逆亲和力的生物活性分子作为配基与载体结合，制成吸附柱，利用其特异吸附性能，特异性地清除患者血液中的致病因子，从而达到净化血液，预防及治疗疾病的目的。自1979年Terman首次报道用DNA免疫吸附剂血液灌流治疗一例重度系统性红斑狼疮患者获得成功后，免疫吸附疗法日益受到临床医学的重视。

对免疫吸附疗法的疗效起决定性作用的是免疫吸附材料（也称为免疫吸附剂）。目前，国外临床应用的免疫吸附材料主要是以蛋白A为配基的吸附材料，它可以清除患者体内的IgG等致病因子。蛋白A吸附材料自从上世纪80年代应用于自身免疫性疾病治疗以来，它对多种疾病的治疗有效性已经得到证实，并获得美国FDA批准，成为多种自身免疫性疾病的推荐疗法。但是，蛋白A吸附材料也存在一些缺陷，限制了它的广泛使用。首先，蛋白A价格高昂，占蛋白A免疫吸附材料成本的80%左右，给普通患者带来了极其沉重的经济负担；其次，蛋白A作为一种蛋白质配基，稳定性不高，容易变性，为吸附材料的生产、运输、保存和使用带来不便；其三，蛋白A是一种蛋白质大分子，如果治疗过程中出现脱落则会给患者安全带来风险。因此，如何克服蛋白A吸附材料的这些缺陷，设计和制备既具有与蛋白A吸附材料相当的免疫吸附效率，又具有稳定的物理化学性质和相对低廉的成本的新型免疫吸附材料，具有重要的研究价值和现实意义。

与蛋白A类生物大分子相比，化学合成的小分子化合物在成本和物理化学稳定性上都具有显著优势，故很多研究着眼于筛选和设计具有仿生物亲和作用的小分子配基，即模拟生物特异性配基或仿生配基（pseudobiospecific ligand），进而研究以这类小分子物质为配基的IgG吸附材料。在这些仿生配基中，氨基酸由于其无毒，价廉和对IgG的高选择性已代替蛋白质用于亲和色谱方面。有报道证明氨基酸能高效地从人血浆或血清中分离出IgG。然而，目前所研究的这类非蛋白A类的免疫吸附材料在实际应用中还不能达到与蛋白A吸附材料相当的分离或治疗效果。其主要原因在于吸附材料与抗体的结合力和选择性上还不够理想。因此，如何在降低成本的同时，提高吸附材料与抗体的结合能力和选择性对于设计和制备吸附性能与蛋白A吸附剂相当的新型免疫吸附材料是一个非常重要的问题。

作为免疫吸附材料的载体-配基复合物，其制备过程一般包括两个基本过程：载体活化以及活性载体与配基的偶联。在免疫吸附材料的制备过程中，多糖基载体活化最通常的方法是先将其羟基氧化后，接上二胺类间隔臂，再经醛化（一般用戊二醛）生成希夫碱；然后，还原成烷胺键化合物。经活化的活性载体直接与未经修饰的配基通过烷胺键偶联。该制备方法中，活化步骤繁琐，且经过多步活化反应后，载体的总活化率大大降低。而且烷胺键对蛋白A的反应选择性并不高。因此，活性载体与配基之间的反应不具有高选择性和高效性，从而极大地影响了免疫吸附材料的吸附性能。

发明内容

本发明的第一目的旨在提供一种安全、有效、成本低廉，性能稳定可靠的仿生物特异性免疫吸附材料。

本发明第二目的是提供上述仿生物特异性免疫吸附材料的制备方法。

本发明第三个目的在于提供上述仿生物特异性免疫吸附材料在IgG分离中的应用。

本发明以含有丰富羟基，血液相容性和机械性能良好的琼脂糖凝胶为载体，以廉价、稳定、易于保存和消毒的氨基酸为仿生配基，采用一种高效、高选择性的方法-点击化学设计和制备一种对IgG具有高选择性，且成本低廉，性能稳定可靠，效果与蛋白A吸附材料相当的仿生物特异性免疫吸附材料。

点击化学（Click Chemistry）于2001年由诺贝尔化学奖获得者美国化学家Sharpless提出，指那些最佳的化学反应。这些反应的活性组件衍生于烯烃和炔烃，绝大部分反应涉及碳-杂原子键的形成；反应易于操作，对空气和水不敏感，并能高产率生成目标产物，很少甚至没有副产物，而且不会受相连在一起的其他官能团影响，即反应具有选择性。最广泛使用的点击反应是Cu(Ⅰ)催化的Huisgen 1,3-偶极环加成反应，即叠氮化合物和炔基化合物反应都能生成含有三唑的化合物。由于点击化学可以在不同的分子和材料间有效地实现共价连接，叠氮基和端基炔彼此间有非常高的选择性，因而能高产率地生成目标产物。所生成的反应物在生理条件下的惰性及温和的反应条件为体内、体外生物的应用提供了极大的便利，如其在生物耦联方面的应用越来越广泛。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种仿生物特异性免疫吸附材料，具有如下的化学结构：

其中，Sep代表琼脂糖凝胶。

上述R也是L-组氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的侧链环。

所述的仿生物特异性免疫吸附材料的制备方法，包括如下步骤和工艺条件：

（a）叠氮化琼脂糖凝胶的制备

向环氧化琼脂糖中加入叠氮化钠的水溶液，每克环氧化琼脂糖中加入叠氮化钠3～15mmol，20～60℃反应6～60h后，洗涤抽干得产物；

（b）炔酸的合成

将丁二酸酐溶于二氯甲烷后和炔丙醇于－10～10℃下混合，丁二酸酐与炔丙醇的摩尔比为1～3∶1；然后加入催化剂4-二甲氨基吡啶及缚酸剂三乙胺或吡啶，催化剂、缚酸剂与炔丙醇的摩尔比为0.01～0.1∶0.1～1.0∶1，保温反应0.5～3h后回流12～72h，洗涤干燥得炔酸；

（c）制备炔酸的活性酯

将所述炔酸和N-羟基丁二酰亚胺溶于1,4-二氧六环后，加入缩合剂N,N′-二环己基碳二亚胺（DCC）并于－10～10℃下保温反应0.5～3h后，升温至20～60℃反应12～72h，过滤、旋蒸，并进行柱层析纯化得炔酸的活性酯；其中N-羟基丁二酰亚胺、N,N′-二环己基碳二亚胺与炔酸的摩尔比为1～3∶1～3∶1；

（d）炔化氨基酸的合成

将炔酸的活性酯溶于1,4-二氧六环后与配基的水溶液混合；用碳酸钠溶液或三乙胺调pH至9.0～12.0，然后于20～80℃反应12～72h；反应完毕以盐酸或饱和柠檬酸水溶液调混合液的pH至2.0～5.0，再用乙酸乙酯及水萃取后进行柱层析纯化得产物；其中氨基酸与炔酸的活性酯的摩尔比为1～3∶1；所述配基为L-组氨酸、苯丙氨酸或色氨酸；

（e）点击反应制备免疫吸附材料

将炔化氨基酸的溶液加入叠氮化琼脂糖中，每克叠氮化琼脂糖加入3～10mmol炔化氨基酸，然后依次加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠作催化剂，五水硫酸铜、抗坏血酸钠与炔化氨基酸的摩尔比为0.01～0.05∶0.02～0.1∶1；混合物于20～80°C反应12～72h后，洗涤抽干得产物。

本发明制备方法中，先以琼脂糖凝胶为载体，将其叠氮化以制备“可点击”的载体，再合成端基炔化的氨基酸，并将该功能化的配基通过点击反应偶联到叠氮化的琼脂糖载体表面制备免疫吸附材料。各步骤的反应方程式如下：

（a）叠氮化琼脂糖凝胶的制备

（b）炔酸的合成

（c）制备炔酸的活性酯

（d）炔化氨基酸的合成

（e）点击反应制备免疫吸附材料

其中，Sep代表琼脂糖凝胶；R也为L-组氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的侧链环。

为进一步实现本发明目的，所述环氧化琼脂糖优选通过如下方法制备：按每克琼脂糖凝胶加入2mL环氧氯丙烷和1～2mL氢氧化钠溶液的比例，将琼脂糖凝胶、环氧氯丙烷和氢氧化钠溶液混合后室温下搅拌反应3～4h，以水洗涤，抽干直到在洗涤液中加入1.3M硫代硫酸钠后酚酞不变红为止，即得环氧化琼脂糖；所述氢氧化钠溶液的浓度为1.5～3M。

所述丁二酸酐溶于二氯甲烷中，每1mmol丁二酸酐中二氯甲烷加入量优选为0.5~2.5mL。

所述炔酸和N-羟基丁二酰亚胺溶于1,4-二氧六环中，每1mmol炔酸中1,4-二氧六环的加入量优选为0.2~1.0mL。

所述炔酸的活性酯溶于1,4-二氧六环中，每1mmol炔酸的活性酯中1,4-二氧六环的加入量优选为0.5~2.5mL。

所述炔化氨基酸溶于DMF或1,4-二氧六环中，每1mmol炔化氨基酸中DMF或1,4-二氧六环的加入量优选为1.0~3.0mL。

本发明还提供所述的仿生物特异性免疫吸附材料在IgG分离中的应用。

相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：

（1）以廉价，安全，稳定且具有可修饰性的氨基酸小分子为仿生配基代替常用的蛋白A制备免疫吸附材料，可避免蛋白A类免疫吸附材料昂贵，易脱落，安全性不高等缺陷。并可对配基的结构进行适宜的设计和修饰，使经修饰的配基保持其分子上用于与IgG等物质发生专一性结合的活性位点的完整并维持一定的空间结构。

（2）提出将反应条件温和、高效、高选择性的点击化学反应——Huisgen 1,3-偶极环加成反应用于载体-配基的偶联，设计和制备非蛋白A类的免疫吸附材料的研究思路，可望大大提高载体与配基之间的偶联效果，避免副反应的发生，最大限度地保护配基上对IgG等物质发生专一性结合的活性位点，为非蛋白A类的免疫吸附材料的制备探索一条具有工业化前景的新途径。

（3）根据点击化学的原理，通过叠氮化或端基炔化的方法活化载体和修饰配基，从而能够利用叠氮化物和端基炔化合物的多样性和可控性，实现对载体与配基之间的间隔臂的长度与刚/柔性的设计与控制，为免疫吸附材料的结构设计与控制提供了极大的空间，进而为研究和揭示免疫吸附材料的构效关系奠定了基础。

（4）体外血浆吸附试验数据表明，本发明的仿生物特异性免疫吸附材料对人血浆中免疫球蛋白IgG具有特异性吸附。

附图说明

图1为实施例一中叠氮化琼脂糖凝胶的红外光谱图。

图2为实施例一中炔化组氨酸的核磁氢谱图。

图3为实施例二中炔化苯丙氨酸的核磁氢谱图。

图4为实施例三中炔化色氨酸的核磁氢谱图。

图5为实施例一、二、三中免疫吸附材料的红外光谱图。

图6为实施例一中Sep-PA和Sep-triazole-His洗脱液的凝胶电泳图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，需要说明的是，实施例用于说明本发明而不是对本发明的限制。

实施例一：

叠氮化琼脂糖凝胶的制备

在100mL锥形瓶中加入4.0g抽干的琼脂糖凝胶，8mL环氧氯丙烷和4mL 3M氢氧化钠溶液。混合物在室温下搅拌反应3h后，以水洗涤抽干直到在洗涤液中加入1.3M硫代硫酸钠后酚酞不变红为止，即得环氧化琼脂糖。将1.82g叠氮化钠溶于15mL水，再加入4.0g环氧化琼脂糖，20°C反应60h。反应完毕，洗涤抽干得叠氮化琼脂糖凝胶。附图1所示的红外光谱图在2100cm^-1处出现叠氮基的特征吸收峰，证明了叠氮化琼脂糖中叠氮基的存在。

炔酸的合成

将10.0g丁二酸酐，1.01g三乙胺，0.12g 4-二甲氨基吡啶和50mL二氯甲烷加入到200mL圆底烧瓶中。－10°C条件下逐滴加入10mL含5.6g炔丙醇的二氯甲烷溶液。滴加完毕，锥形瓶中的混合物在－10°C下保温反应0.5h后再于40°C回流72h。所得产物依次用盐酸溶液和水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液旋蒸后得黄色固体。

制备炔酸的活性酯

将上一步反应所制备的12.49g炔酸和9.21g N-羟基丁二酰亚胺溶于16mL 1,4-二氧六环，再加入16.50g DCC，所得反应液在－10°C下保温反应3h，然后升温至20°C反应72h。过滤除去混合物中的不溶物，所得滤液旋蒸并真空干燥。粗产品用硅胶柱色谱进行柱层析纯化，所选淋洗剂为石油醚∶乙酸乙酯=1∶2的混合溶剂。过柱后得白色的结晶体。

炔化组氨酸的合成

将上一步反应所制备的12.66g炔酸的活性酯溶于50mL 1,4-二氧六环后与溶有15.52g L-组氨酸的100mL水溶液混合。用2M碳酸钠溶液调pH至12.0，然后于20°C下反应72h。反应完毕以2M盐酸溶液调混合液的pH至5.0，再用乙酸乙酯和水分别萃取三次，所得水相经旋蒸除水后溶于甲醇，将析出的白色粉末状沉淀过滤掉后取滤液浓缩得黄色的粘稠体。附图2所示的¹H NMR图表明所制备的样品中含有炔基、亚甲基和咪唑基等特征峰，且各峰的位置和积分面积与理论相符，证明成功合成了炔化组氨酸。

点击反应制备免疫吸附材料

将20mmol炔化组氨酸溶于60mL DMF，加入3g叠氮化的琼脂糖。二者混合均匀后，依次加入溶有150mg五水硫酸铜的水溶液5mL和溶有237mg抗坏血酸钠的水溶液5mL。混合物在50°C反应48h后依次用水，0.1M EDTA和水洗涤抽干得产物Sep-triazole-His，其中His表示L-组氨酸。附图5所示的红外光谱图表明以组氨酸为配基的免疫吸附材料在2100cm^-1处的叠氮峰完全消失，说明叠氮化琼脂糖上的叠氮基反应完全，结合图1和图2证明通过点击反应成功合成了目标产物。

免疫吸附材料吸附容量研究

所用血浆在37°C下解冻，然后加入用0.02M，pH为7.0的磷酸缓冲液平衡过的免疫吸附材料样品，25°C搅拌吸附2h。然后将琼脂糖凝胶洗涤抽干，再用0.02M，pH为2.5的柠檬酸缓冲液洗脱。2h后取上层清液用紫外分光光度计测其在200~500nm波长范围内的吸收，其中280nm处的吸光度对应洗脱液中IgG的浓度，由公式Q=（M洗×A₂₈₀）/（1.35×M琼）计算每克免疫吸附材料所吸附的IgG的量，其中Q为琼脂糖的吸附容量，M洗为洗脱液的质量，M琼为所用琼脂糖的质量，1.35表示IgG的摩尔吸光系数。测试结果表明，A₂₈₀、M洗、M琼分别为2.849、6.013g、0.690g，从而算得所发明的仿生物特异性免疫吸附材料（Sep-triazole-His）对人血浆中IgG的吸附容量为18.39mg/g，与蛋白A免疫吸附材料（22.97mg/g）接近。说明Sep-triazole-His上固载的组氨酸对IgG有较高的亲合作用力，组氨酸主要通过疏水和静电作用与蛋白质分子结合。

免疫吸附材料吸附选择性研究

十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS–PAGE）用于分析免疫吸附材料对人血浆中IgG的吸附选择性。被测样品与十二烷基硫酸钠上样缓冲液以1∶1的体积比混合后在100°C的水中煮5min，样品与蛋白质分子量标准的上样量均是10μL，所用染色剂为考马斯亮蓝R-250。附图6中的第1～3条泳带分别表示标准蛋白质、Sep-PA和Sep-triazole-His洗脱液，SDS–PAGE测试表明所发明的仿生物特异性免疫吸附材料Sep-triazole-His对人血浆中的IgG有非常高的选择性，略高于蛋白A免疫吸附材料Sep-PA且非特异性吸附几乎没有。

免疫吸附材料吸附稳定性研究

为了评价免疫吸附材料的重复使用性能，对样品进行了10次吸附—解吸循环。解吸仍然用0.02M，pH为2.5的柠檬酸缓冲液，然后再用0.02M，pH为7.0的磷酸缓冲液平衡，每一次吸附—解吸过程后对IgG的浓度进行测试。测试结果表明所发明的仿生物特异性免疫吸附材料Sep-triazole-His经过10次使用后其IgG吸附容量从18.39mg/g略微下降到16.49mg/g，说明这种免疫吸附材料在一定程度上可以重复使用而其对IgG的吸附能力可基本维持稳定。

实施例二：

叠氮化琼脂糖凝胶的制备

在100mL锥形瓶中加入4.0g抽干的琼脂糖凝胶，8mL环氧氯丙烷和8mL 1.5M氢氧化钠溶液。混合物在室温下搅拌反应4h后，以水洗涤抽干直到在洗涤液中加入1.3M硫代硫酸钠后酚酞不变红为止，即得环氧化琼脂糖。将0.78g叠氮化钠溶于10mL水，再加入4.0g环氧化琼脂糖，40°C反应30h。反应完毕，洗涤抽干得叠氮化琼脂糖凝胶。

炔酸的合成

将10.0g丁二酸酐，10.1g三乙胺，1.22g 4-二甲氨基吡啶和250mL二氯甲烷入到200mL圆底烧瓶中。10°C时逐滴加入20mL含16.8g炔丙醇的二氯甲烷溶液。滴加完毕，锥形瓶中的混合物在10°C下保温反应3h后再于40°C回流12h。所得产物依次用盐酸溶液和水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液旋蒸后得黄色固体。

制备炔酸的活性酯

将上一步反应所制备的12.49g炔酸和27.63g N-羟基丁二酰亚胺溶于80mL 1,4-二氧六环，再加入49.50g DCC，所得反应液在10°C下保温反应0.5h，然后升温至60°C反应12h。过滤除去混合物中的不溶物，所得滤液旋蒸并真空干燥。粗产品用硅胶柱色谱进行柱层析纯化，所选淋洗剂为石油醚∶乙酸乙酯=1∶2的混合溶剂。过柱后得白色的结晶体。

炔化苯丙氨酸的合成

将12.66g炔酸的活性酯溶于125mL 1,4-二氧六环后与溶有24.78g L-苯丙氨酸的300mL水溶液混合。用三乙胺调溶液pH至9.0，然后在50°C反应48h室温下反应过夜。反应完毕以饱和柠檬酸水溶液调混合液的pH至2.0左右。旋蒸后的产物用乙酸乙酯萃取三次，所得有机相浓缩后用硅胶柱色谱进行柱层析纯化，所选淋洗剂为石油醚∶乙酸乙酯=1∶6的混合溶剂。过柱后得黄色的粘稠体。附图3所示的¹H NMR图表明所制备的样品中含有炔基、酯基和苯环等特征峰，且各峰的位置和积分面积与理论相符，证明成功合成了炔化苯丙氨酸。

点击反应制备免疫吸附材料

将9mmol炔化苯丙氨酸溶于9mLDMF，加入3g叠氮化的琼脂糖。二者混合均匀后，依次加入溶有50mg五水硫酸铜的水溶液2.5mL和溶有79mg抗坏血酸钠的水溶液2.5mL。混合物在20°C反应72h后依次用水，0.1M EDTA和水洗涤抽干得目标产物Sep-triazole-Phe，其中Phe表示L-苯丙氨酸。附图5所示的红外光谱图表明以苯丙氨酸为配基的免疫吸附材料在2100cm^-1处的叠氮峰消失，说明叠氮化琼脂糖上的叠氮基反应完全，结合图1和图3证明通过点击反应成功合成了目标产物。

免疫吸附材料吸附容量研究

测试方法同实施例一。测试结果表明，A₂₈₀、M洗、M琼分别为1.990、6.010g、0.689g，从而算得所发明的仿生物特异性免疫吸附材料Sep-triazole-Phe对人血浆中IgG的吸附容量为12.86mg/g，对比Sep-triazole-His有所下降，说明苯丙氨酸对IgG有较高的亲和力但不及组氨酸。

免疫吸附材料吸附选择性研究

测试方法同实施例一。SDS-PAGE测试表明所发明的仿生物特异性免疫吸附材料Sep-triazole-Phe对人血浆中的IgG有较高的选择性。

免疫吸附材料吸附稳定性研究

测试方法同实施例一。测试结果表明所发明的仿生物特异性免疫吸附材料Sep-triazole-Phe经过10次使用后其IgG吸附容量从12.86mg/g略微下降到10.75mg/g，说明这种免疫吸附材料在一定程度上可以重复使用而其对IgG的吸附能力可基本维持稳定。

实施例三：

叠氮化琼脂糖凝胶的制备

在100mL锥形瓶中加入4.0g抽干的琼脂糖凝胶，8mL环氧氯丙烷和6mL 2.5M氢氧化钠溶液。混合物在室温下搅拌反应3.5h后，以水洗涤抽干直到在洗涤液中加入1.3M硫代硫酸钠后酚酞不变红为止，即得环氧化琼脂糖。将3.9g叠氮化钠溶于25mL水，再加入4.0g环氧化琼脂糖，60°C反应6h。反应完毕，洗涤抽干得叠氮化琼脂糖凝胶。

炔酸的合成

将10.0g丁二酸酐，5.05g三乙胺，0.61g 4-二甲氨基吡啶和150mL二氯甲烷入到200mL圆底烧瓶中。0°C时逐滴加入15mL含11.2g炔丙醇的二氯甲烷溶液。滴加完毕，锥形瓶中的混合物在0°C下保温反应2h后再于40°C回流36h。所得产物依次用盐酸溶液和水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液旋蒸后得黄色固体。

制备炔酸的活性酯

将上一步反应所制备的12.49g炔酸和18.42g N-羟基丁二酰亚胺溶于60mL 1,4-二氧六环，再加入33.00g DCC，所得反应液在0°C下保温反应1.5h，然后升温至40°C反应48h。过滤除去混合物中的不溶物，所得滤液旋蒸并真空干燥。粗产品用硅胶柱色谱进行柱层析纯化，所选淋洗剂为石油醚∶乙酸乙酯=1∶2的混合溶剂。过柱后得白色的结晶体。

炔化色氨酸的合成

将12.66g炔酸的活性酯溶于25mL 1,4-二氧六环后与溶有10.21g L-色氨酸的400mL水溶液混合。用三乙胺调溶液调pH至10.0，然后在室温下反应过夜。反应完毕以饱和柠檬酸水溶液调混合液的pH至4.0左右。旋蒸后的产物用乙酸乙酯萃取三次，所得有机相浓缩后用硅胶柱色谱进行柱层析纯化，所选淋洗剂为石油醚∶乙酸乙酯=1∶6的混合溶剂。过柱后得黄色的粘稠体。附图4所示的¹H NMR图表明所制备的样品中含有炔基、酯基和吲哚基等特征峰，且各峰的位置和积分面积与理论相符，证明成功合成了炔化色氨酸。

点击反应制备免疫吸附材料

将30mmol炔化色氨酸溶于50mL 1,4-二氧六环，加入3g叠氮化的琼脂糖。二者混合均匀后，依次加入溶有250mg五水硫酸铜的水溶液6mL和溶有395mg抗坏血酸钠的水溶液6mL。混合物在80°C反应12h后依次用水，0.1M EDTA和水洗涤抽干得目标产物Sep-triazole-Trp，其中Trp表示L-色氨酸。附图5所示的红外光谱图表明以色氨酸为配基的免疫吸附材料在2100cm^-1处的叠氮峰消失，说明叠氮化琼脂糖上的叠氮基反应完全，结合图1和图4证明通过点击反应成功合成了目标产物。

免疫吸附材料吸附容量研究

测试方法同实施例一。测试结果表明，A₂₈₀、M洗、M琼分别为1.670、6.005g、0.680g，从而算得所发明的仿生物特异性免疫吸附材料Sep-triazole-Trp对人血浆中IgG的吸附容量为11.02mg/g，对比Sep-triazole-His所下降，说明色氨酸对IgG有较高的亲和力但不及组氨酸。

免疫吸附材料吸附选择性研究

测试方法同实施例一。SDS–PAGE测试表明所发明的仿生物特异性免疫吸附材料Sep-triazole-Trp对人血浆中的IgG有较高的选择性。

免疫吸附材料吸附稳定性研究

测试方法同实施例一。测试结果表明所发明的仿生物特异性免疫吸附材料Sep-triazole-Trp经过10次使用后其IgG吸附容量从11.02mg/g略微下降到8.95mg/g，说明这种免疫吸附材料在一定程度上可以重复使用而其对IgG的吸附能力可基本维持稳定。

由上述实例可知，本发明提供了三种以不同氨基酸为配基的仿生物特异性免疫吸附材料，对其吸附性能进行测试后表明它们能够安全、选择性、重复性地从人血浆中吸附IgG，部分材料的整体吸附性能可与蛋白A免疫吸附材料媲美，其低廉的价格和良好的性能使其具有取代蛋白A免疫吸附材料的潜能，并有望应用于临床。

Claims (8)

1.一种仿生物特异性免疫吸附材料，其特征在于具有如下的化学结构：

其中，Sep代表琼脂糖凝胶。

2.权利要求1所述的仿生物特异性免疫吸附材料的制备方法，其特征在于包括如下步骤和工艺条件：

（a）叠氮化琼脂糖凝胶的制备

向环氧化琼脂糖中加入叠氮化钠的水溶液，每克环氧化琼脂糖中加入叠氮化钠3～15mmol，20～60°C反应6～60h后，洗涤抽干得产物；

（b）炔酸的合成

将丁二酸酐溶于二氯甲烷后和炔丙醇于－10～10°C下混合，丁二酸酐与炔丙醇的摩尔比为1～3∶1；然后加入催化剂4-二甲氨基吡啶及缚酸剂三乙胺或吡啶，催化剂、缚酸剂与炔丙醇的摩尔比为0.01～0.1∶0.1～1.0∶1，保温反应0.5～3h后回流12～72h，洗涤干燥得炔酸；

（c）制备炔酸的活性酯

将所述炔酸和N-羟基丁二酰亚胺溶于1,4-二氧六环后，加入缩合剂N,N′-二环己基碳二亚胺并于－10～10°C下保温反应0.5～3h后，升温至20～60°C反应12～72h，过滤、旋蒸，并进行柱层析纯化得炔酸的活性酯；其中N-羟基丁二酰亚胺、N,N′-二环己基碳二亚胺与炔酸的摩尔比为1～3∶1～3∶1；

（d）炔化氨基酸的合成

将炔酸的活性酯溶于1,4-二氧六环后与配基的水溶液混合；用碳酸钠溶液或三乙胺调pH至9.0～12.0，然后于20～80°C反应12～72h；反应完毕以盐酸或饱和柠檬酸水溶液调混合液的pH至2.0～5.0，再用乙酸乙酯及水萃取后进行柱层析纯化得产物；其中氨基酸与炔酸的活性酯的摩尔比为1～3∶1；所述配基为L-组氨酸、苯丙氨酸或色氨酸；

（e）点击反应制备免疫吸附材料

将炔化氨基酸的溶液加入叠氮化琼脂糖中，每克叠氮化琼脂糖加入3～10mmol炔化氨基酸，然后依次加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠作催化剂，五水硫酸铜、抗坏血酸钠与炔化氨基酸的摩尔比为0.01～0.05∶0.02～0.1∶1；混合物于20～80°C反应12～72h后，洗涤抽干得产物。

3.根据权利要求2所述的仿生物特异性免疫吸附材料的制备方法，其特征在于：所述环氧化琼脂糖通过如下方法制备：按每克琼脂糖凝胶加入2mL环氧氯丙烷和1～2mL氢氧化钠溶液的比例，将琼脂糖凝胶、环氧氯丙烷和氢氧化钠溶液混合后室温下搅拌反应3～4h，以水洗涤，抽干直到在洗涤液中加入1.3M硫代硫酸钠后酚酞不变红为止，即得环氧化琼脂糖；所述氢氧化钠溶液的浓度为1.5～3M。

4.根据权利要求2所述的仿生物特异性免疫吸附材料的制备方法，其特征在于：所述丁二酸酐溶于二氯甲烷中，每1mmol丁二酸酐中二氯甲烷加入量为0.5~2.5mL。

5.根据权利要求2所述的仿生物特异性免疫吸附材料的制备方法，其特征在于：所述炔酸和N-羟基丁二酰亚胺溶于1,4-二氧六环中，每1mmol炔酸中1,4-二氧六环的加入量为0.2~1.0mL。

6.根据权利要求2所述的仿生物特异性免疫吸附材料的制备方法，其特征在于：所述炔酸的活性酯溶于1,4-二氧六环中，每1mmol炔酸的活性酯中1,4-二氧六环的加入量为0.5~2.5mL。

7.根据权利要求2所述的仿生物特异性免疫吸附材料的制备方法，其特征在于：所述炔化氨基酸溶于DMF或1,4-二氧六环中，每1mmol炔化氨基酸中DMF或1,4-二氧六环的加入量为1.0~3.0mL。

8.权利要求1所述的仿生物特异性免疫吸附材料在IgG分离中的应用。

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