CN115739032A - 用于分解精氨酸的血液灌流器石墨烯填料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了用于分解精氨酸的血液灌流器石墨烯填料的制备方法，包括如下步骤：步骤1、将石墨烯颗粒分散于冷硫酸中，依次加入硝酸钠、KMnO4和去离子水后继续反应；步骤2、依次加入蒸馏水和双氧水进行终止反应后，经过处理得到物质A；步骤3、将对‑(β‑硫酸乙酯砜基)苯胺加入去离子水中进行反应后，加入物质A；步骤4、依次加入去离子水、HCI、和NaNO2溶液反应后，经过处理得到物质B；步骤5、将γ‑氨丙基三乙氧基硅烷加入无水乙醇中并搅拌均匀后，加入物质B进行反应，反应完成后经过处理得到物质C；步骤6、将物质C加入磷酸缓冲液中，同时加入ADI进行反应后，经过处理得到成品，借此，本发明具有高效分解血液中精氨酸的优点。
Description
技术领域
本发明属于血液灌流器技术领域，特别涉及一种用于分解精氨酸的血液灌流器石墨烯填料的制备方法。
背景技术
目前，血液灌流是将血液引入装有固态吸附剂的灌流器中，通过吸附作用，清除血液中透析不能清除的外源性或内源性毒素、药物或代谢废物的一种血液净化技术。
由于灌流器内部填充的固态吸附剂吸附剂材质均为聚苯乙烯树脂或活性炭，目前大多依赖于供应商的直接供应，使用者的自主研发较少，吸附剂所能吸附的物质类型有限，被吸附的物质分子量不能较为准确的控制，使得血液灌流器大多为非特异性吸附。血液灌流器在使用过程中，经常会发生将某些致病物质有效吸附的同时，把分子量大小近似的其余体液成分也一并吸附的情况。这样会导致有益体液成分的丢失，引起一些潜在的风险。
目前有部分使用者对固态吸附剂作出了不同程度的修饰和再加工，但填料基材还是局限于树脂供应商的本身产品属性，在实际应用时难以灵活选择。现有的修饰或改性方法对树脂本身的基础结构并没有进行根本的改变，非特异性吸附的问题没有得到很好的解决，无法按照特定的需求来选择相应填料的灌流器，限制了灌流器的适用范围。
发明内容
本发明提出一种用于分解精氨酸的血液灌流器石墨烯填料的制备方法，解决了上述问题。
本发明的技术方案是这样实现的：用于分解精氨酸的血液灌流器石墨烯填料的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、将石墨烯颗粒分散于冷硫酸中，依次加入硝酸钠和KMnO4进行反应后，缓慢加入去离子水后继续反应；
步骤2、依次加入蒸馏水和双氧水进行终止反应后，分别经过抽滤、清洗和干燥后，得到表面活化的石墨烯颗粒；
步骤3、将对-(β-硫酸乙酯砜基)苯胺加入去离子水中进行反应后，加入表面活化的石墨烯颗粒继续反应；
步骤4、依次加入去离子水、HCI、和NaNO2溶液反应后，分别经过过滤、清洗和干燥后，得到表面功能化的氧化石墨烯颗粒；
步骤5、将γ-氨丙基三乙氧基硅烷加入无水乙醇中，并搅拌均匀后，加入表面功能化的氧化石墨烯颗粒进行反应，反应完成后分别经过过滤、清洗和干燥后，得到表面有机硅功能化的氧化石墨烯颗粒；
步骤6、将表面有机硅功能化的氧化石墨烯颗粒加入磷酸缓冲液中，同时加入ADI进行反应后，分别经过过滤、水洗和干燥，得到成品，成品为表面固定有精氨酸脱亚胺酶的改性石墨烯颗粒填料。
作为一种优选的实施方式，步骤1中冷硫酸的制备方法为，将98％的硫酸冰浴30min；
步骤1中依次加入硝酸钠和KMnO4进行反应的条件为，在水浴35℃的条件下，恒温搅拌30min；
步骤1中冷硫酸和石墨烯颗粒的加入比例为，冷硫酸(ml)：石墨烯颗粒(g)＝10:1；
步骤1中石墨烯颗粒、硝酸钠和KMnO4的加入比例为，石墨烯颗粒(g)：硝酸钠(g)：KMnO4(g)＝5:2:6；
步骤1中缓慢加入去离子水后继续反应的条件为，水浴温度调至90℃，恒温搅拌1h。
作为一种优选的实施方式，步骤2中蒸馏水和双氧水加入的体积比例为，蒸馏水：双氧水＝(10-15):1；
步骤2中清洗的方法为，先用蒸馏水清洗，离心后倒去上清液，然后再用HCl清洗，最后用去离子水洗至PH7.0，并超声波清洗10min后进行离心；
步骤2中干燥的方式为室温干燥；
其中双氧水为30％的双氧水，HCl为5％的HCl。
作为一种优选的实施方式，步骤3中对-(β-硫酸乙酯砜基)苯胺和表面活化的石墨烯颗粒的加入比例为，对-(β-硫酸乙酯砜基)苯胺(ml)：表面活化的石墨烯颗粒(g)＝1:1；
步骤3中将对-(β-硫酸乙酯砜基)苯胺加入去离子水中进行反应的条件为，于40℃搅拌15min后，用Na2CO3调至PH 7.0；
步骤3中加入表面活化的石墨烯颗粒继续反应的条件为，搅拌30min后，用NaOH调至PH 12.0，置于100℃恒温油浴30min。
作为一种优选的实施方式，步骤4中去离子水、HCI和NaNO2的加入比例为，去离子水(ml)：HCI(ml)和NaNO2(g)＝2:1:1；
步骤4中依次加入去离子水、HCl、和NaNO2溶液反应的条件为，冰浴搅拌30min；
步骤4中清洗的方法为，先用HCI清洗后再用蒸馏水清洗；
步骤4中干燥的方法为，真空干燥；
其中NaNO2为5％的NaNO2。
作为一种优选的实施方式，步骤5中γ-氨丙基三乙氧基硅烷和无水乙醇搅拌均匀后形成混合溶液，混合溶液中γ-氨丙基三乙氧基硅烷和无水乙醇的加入比例为，γ-氨丙基三乙氧基硅烷(ml)：无水乙醇(ml)＝1:9；
混合溶液和表面功能化的氧化石墨烯颗粒的加入比例为，混合溶液(ml)：表面功能化的氧化石墨烯颗粒(g)＝20:1；
步骤5中加入表面功能化的氧化石墨烯颗粒进行反应的条件为，于室温下超声反应2min，取出后置于30℃水浴中振荡反应5h；
步骤5中清洗的方法为，先采用70％的乙醇溶液清洗后，再采用蒸馏水进行清洗；
步骤5中干燥的方法为，置于60℃的干燥箱中恒温干燥3h；
其中γ-氨丙基三乙氧基硅烷为98％的γ-氨丙基三乙氧基硅烷。
作为一种优选的实施方式，步骤6中表面有机硅功能化的氧化石墨烯颗粒、磷酸缓冲液和ADI的加入比例为，表面有机硅功能化的氧化石墨烯颗粒(g)：磷酸缓冲液(ml)：ADI(ml)＝1:10:(1-2)；
步骤6中表面有机硅功能化的氧化石墨烯颗粒加入磷酸缓冲液中，同时加入ADI进行反应的条件为，于室温下振荡反应1.5h；
步骤6中清洗的方法为，用去离子水进行水洗；
步骤6中干燥的方式为，真空干燥；
其中磷酸缓冲液为PH 7.0的磷酸缓冲液。
采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
1、本发明所制得的表面固定有精氨酸脱亚胺酶的改性石墨烯填料颗粒可快速高效分解血液中的精氨酸，扩大了以往血液灌流器的适应症范围；
2、与传统一次性使用血液灌流器填料相比，本发明固定化酶填料单一清除血液中的精氨酸，对血液中的其他物质成分没有影响，特异性更强；
3、石墨烯颗粒表面无大孔结构，血流动力学更稳定，减少血栓形成；
4、填料与血液中单一物质的反应更为高效，缩短整体血液灌流所需的时间，减少风险发生的可能性，创造更大的经济效益和社会效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
如图1所示，一种用于分解精氨酸的血液灌流器石墨烯填料的制备方法，其步骤如下：
取98％的硫酸500ml倒入烧杯中，冰浴30min后，将25g石墨烯颗粒分散在冷硫酸中，然后加入10g硝酸钠，在持续搅拌下将30g KMnO4缓慢加入。
将烧杯移至水浴锅中，于35℃下恒温搅拌反应30min，然后向烧瓶中缓慢加入500ml去离子水。调节水浴温度至90℃，恒温继续搅拌反应1小时后，依次加入400ml蒸馏水和30ml 30％的双氧水以终止反应。
终止反应结束后，将产物进行抽滤，并用蒸馏水清洗3次，离心后倒去上清液，然后用5％的HCl清洗3次，最后用去离子水将反应产物洗至PH为7.0。将PH为7.0的反应产物利用超声波清洗10min后，进行离心，即得到表面活化的石墨烯颗粒，室温干燥后备用。
取25g对-(β-硫酸乙酯砜基)苯胺，加入250ml去离子水中，在40℃条件下搅拌15min。用Na2CO3将溶液PH调至7.0后，加入25g表面活化的石墨烯颗粒，继续搅拌30min，然后用NaOH将反应溶液PH调至12.0，置于100℃恒温油浴30min。
之后加入250ml去离子水，125ml HCl，125ml 5％的亚硝酸钠(NaNO2)溶液，置于冰浴搅拌反应30min，反应完成后将产物滤出，用稀盐酸反复清洗后再用蒸馏水清洗3次，真空干燥，即得到表面功能化的氧化石墨烯颗粒。
将50ml 98％的γ-氨丙基三乙氧基硅烷加入450ml无水乙醇中，搅拌均匀。取25g上述表面功能化的氧化石墨烯颗粒均匀分散加入，将混合物溶液在超声下室温反应2小时。取出后置于30℃水浴锅恒温振荡反应5小时。反应完成后将产物滤出，用70％的乙醇溶液和蒸馏水分别清洗3次后，置于60℃干燥箱恒温干燥3小时，得到表面有机硅功能化的氧化石墨烯颗粒。
取25g上述表面有机硅功能化的氧化石墨烯颗粒加入250ml PH 7.0的磷酸缓冲液中，再加入精氨酸脱亚胺酶(ADI)40mg，室温下振荡反应1.5小时，反应完成后将产物滤出，水洗3次后真空干燥，得到表面固定有精氨酸脱亚胺酶的改性石墨烯颗粒填料。
正常情况下，体内精氨酸可由细胞自身的尿素循环酶即精氨酸代琥珀酸合成酶和精氨酸琥珀酸裂解酶合成，但具有代谢缺陷的某些恶性肿瘤，如黑色素瘤、肺癌、前列腺癌和肝细胞癌则经常缺乏这些酶，不能自身合成精氨酸。故上述肿瘤细胞的生长依赖于细胞周围环境中的精氨酸，所以降低细胞周围精氨酸的含量对这些精氨酸营养缺陷型肿瘤有影响。而精氨酸脱亚胺酶(ADI)可以快速高效的将精氨酸分解成瓜氨酸和氨。精氨酸脱亚胺酶(ADI)虽然有较好的肿瘤杀伤力，但由于其强抗原性和循环半衰期短(半衰期为4h)，在体内效果不明显。本发明利用固定化精氨酸脱亚胺酶的石墨烯颗粒灌装成一次性血液灌流器，使血液中的精氨酸在体外与固定化的精氨酸脱亚胺酶发生催化反应而被分解。
实验例
血液灌流器包括柱体，柱体内填充有填料，柱体的顶部通过上盖体螺纹连接设置，上盖体的顶部设置有入口，柱体的底部通过下盖体螺纹连接设置，下盖体的底部设置有出口。
本对比例中将血浆经由蠕动泵输入血液灌流器中，对血浆进行过滤吸附后输出，并通过精氨酸检测试剂盒对输出的血浆进行检测，血液灌流器的柱体内分别放置有表面固定有精氨酸脱亚胺酶的改性石墨烯颗粒填料和普通填料，其检测效果如下表所示。
表1血浆经过改性石墨烯颗粒填料的灌流实验结果
表2血浆经过普通石墨烯颗粒填料的灌流实验结果
由上表可知，本发明所用方法制备的表面固定有精氨酸脱亚胺酶的改性石墨烯颗粒填料对血浆中的精氨酸有良好的分解效果。
本发明是利用精氨酸脱亚胺酶对精氨酸的催化反应对精氨酸进行分解，属于特异性的催化反应，而不是非特异性的吸附，与市面上常用的吸附填料有原理上的本质区别。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.用于分解精氨酸的血液灌流器石墨烯填料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、将石墨烯颗粒分散于冷硫酸中，依次加入硝酸钠和KMnO4进行反应后，缓慢加入去离子水后继续反应；
步骤2、依次加入蒸馏水和双氧水进行终止反应后，分别经过抽滤、清洗和干燥后，得到表面活化的石墨烯颗粒；
步骤3、将对-(β-硫酸乙酯砜基)苯胺加入去离子水中进行反应后，加入表面活化的石墨烯颗粒继续反应；
步骤4、依次加入去离子水、HCl、和NaNO2溶液反应后，分别经过过滤、清洗和干燥后，得到表面功能化的氧化石墨烯颗粒；
步骤5、将γ-氨丙基三乙氧基硅烷加入无水乙醇中，并搅拌均匀后，加入表面功能化的氧化石墨烯颗粒进行反应，反应完成后分别经过过滤、清洗和干燥后，得到表面有机硅功能化的氧化石墨烯颗粒；
步骤6、将表面有机硅功能化的氧化石墨烯颗粒加入磷酸缓冲液中，同时加入ADI进行反应后，分别经过过滤、水洗和干燥，得到成品，成品为表面固定有精氨酸脱亚胺酶的改性石墨烯颗粒填料。
2.根据权利要求1所述的用于分解精氨酸的血液灌流器石墨烯填料的制备方法，其特征在于，所述步骤1中冷硫酸的制备方法为，将98％的硫酸冰浴30min；
步骤1中依次加入硝酸钠和KMnO4进行反应的条件为，在水浴35℃的条件下，恒温搅拌30min；
步骤1中冷硫酸和石墨烯颗粒的加入比例为，冷硫酸(ml)：石墨烯颗粒(g)＝10:1；
步骤1中石墨烯颗粒、硝酸钠和KMnO4的加入比例为，石墨烯颗粒(g)：硝酸钠(g)：KMnO4(g)＝5:2:6；
步骤1中缓慢加入去离子水后继续反应的条件为，水浴温度调至90℃，恒温搅拌1h。
3.根据权利要求1所述的用于分解精氨酸的血液灌流器石墨烯填料的制备方法，其特征在于，所述步骤2中蒸馏水和双氧水加入的体积比例为，蒸馏水：双氧水＝(10-15):1；
步骤2中清洗的方法为，先用蒸馏水清洗，离心后倒去上清液，然后再用HCl清洗，最后用去离子水洗至PH 7.0，并超声波清洗10min后进行离心；
步骤2中干燥的方式为室温干燥；
其中双氧水为30％的双氧水，HCl为5％的HCl。
4.根据权利要求1所述的用于分解精氨酸的血液灌流器石墨烯填料的制备方法，其特征在于，所述步骤3中对-(β-硫酸乙酯砜基)苯胺和表面活化的石墨烯颗粒的加入比例为，对-(β-硫酸乙酯砜基)苯胺(ml)：表面活化的石墨烯颗粒(g)＝1:1；
步骤3中将对-(β-硫酸乙酯砜基)苯胺加入去离子水中进行反应的条件为，于40℃搅拌15min后，用Na2CO3调至PH 7.0；
步骤3中加入表面活化的石墨烯颗粒继续反应的条件为，搅拌30min后，用NaOH调至PH12.0，置于100℃恒温油浴30min。
5.根据权利要求1所述的用于分解精氨酸的血液灌流器石墨烯填料的制备方法，其特征在于，所述步骤4中去离子水、HCl和NaNO2的加入比例为，去离子水(ml)：HCl(ml)：NaNO2(g)＝2:1:1；
步骤4中依次加入去离子水、HCl、和NaNO2溶液反应的条件为，冰浴搅拌30min；
步骤4中清洗的方法为，先用HCl清洗后再用蒸馏水清洗；
步骤4中干燥的方法为，真空干燥；
其中NaNO2为5％的NaNO2。
6.根据权利要求1所述的用于分解精氨酸的血液灌流器石墨烯填料的制备方法，其特征在于，所述步骤5中γ-氨丙基三乙氧基硅烷和无水乙醇搅拌均匀后形成混合溶液，混合溶液中γ-氨丙基三乙氧基硅烷和无水乙醇的加入比例为，γ-氨丙基三乙氧基硅烷(ml)：无水乙醇(ml)＝1:9；
混合溶液和表面功能化的氧化石墨烯颗粒的加入比例为，混合溶液(ml)：表面功能化的氧化石墨烯颗粒(g)＝20:1；
步骤5中加入表面功能化的氧化石墨烯颗粒进行反应的条件为，于室温下超声反应2min，取出后置于30℃水浴中振荡反应5h；
步骤5中清洗的方法为，先采用70％的乙醇溶液清洗后，再采用蒸馏水进行清洗；
步骤5中干燥的方法为，置于60℃的干燥箱中恒温干燥3h；
其中γ-氨丙基三乙氧基硅烷为98％的γ-氨丙基三乙氧基硅烷。
7.根据权利要求1所述的用于分解精氨酸的血液灌流器石墨烯填料的制备方法，其特征在于，所述步骤6中表面有机硅功能化的氧化石墨烯颗粒、磷酸缓冲液和ADI的加入比例为，表面有机硅功能化的氧化石墨烯颗粒(g)：磷酸缓冲液(ml)：ADI(ml)＝1:10:(1-2)；
步骤6中表面有机硅功能化的氧化石墨烯颗粒加入磷酸缓冲液中，同时加入ADI进行反应的条件为，于室温下振荡反应1.5h；
步骤6中清洗的方法为，用去离子水进行水洗；
步骤6中干燥的方式为，真空干燥；
其中磷酸缓冲液为PH 7.0的磷酸缓冲液。
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