CN112704774A - 一种填装有固定化l-天冬酰胺酶的血液灌流器及其制备方法和应用 - Google Patents

一种填装有固定化l-天冬酰胺酶的血液灌流器及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种填装有固定化L‑天冬酰胺酶的血液灌流器及其制备方法和应用，以共价键固载法、采用高分子载体固定化L‑天冬酰胺酶，以填充柱的形式填充至血液灌流器中，所制备的填装有固定化L‑天冬酰胺酶的血液灌流器在治疗急性淋巴细胞白血病方面安全、高效。

Description

一种填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于医疗器械领域，具体涉及一种固定化酶血液灌流器及其制备方法和应用。
背景技术
L-天冬酰胺酶可以将L-天门冬酰胺(CAS:70-47-3)水解成L-天门冬氨酸(CAS：56-84-8)，而避免了天门冬酰胺经美拉德反应进行褐变成丙烯酰胺。丙烯酰胺在体内是潜在致癌物质，它影响肿瘤抑制基因，导致白血病加速形成。因此，降低血液中天门冬酰胺含量，是治疗急性淋巴白血病的有效方法。法国科学家最早将L-天冬酰胺酶作为治疗儿童急性淋巴细胞白血病，这种酶可以水解血清中的L-天冬酰胺导致细胞凋亡和损害蛋白质的合成，但是法国这种药物将酶进入人体后存在严重的副作用，包括肾脏毒性、过敏反应、胰腺炎及中枢神经毒性等，并且会降低凝血因子的合成。
为了避免这些副作用，中科院化学研究所的发明专利CN102816693A采用纳米金吸附L-天门冬酰胺酶，再将纳米金吸附酶液后的聚集体固载在毛细管内壁上。该发明若应用在血液灌流中仍存在不足，在实际临床使用中，吸附型或包埋型酶液仍容易脱落进入人体，存在安全隐患。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器及其制备方法和应用，以共价键固载法、采用高分子载体固定化L-天冬酰胺酶，以填充柱的形式填充至血液灌流器中，所制备的填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器安全(颗粒粒径15μm以上颗粒低于300个，游离酶浓度低于1ppm)、高效(L-天门冬酰胺转化率97％以上)、催化效率高(酶活≥90u/g)。
本发明具体的技术方案是这样实现的：
一种填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器，将固定化酶装填至两端带有滤网的管中，滤网外部有上下封头，封头上有进出液体的接口；采用高分子载体固定化L-天冬酰胺酶，以填充柱的形式填充至血液灌流器中；
所述每只灌流器中装载量有5-500g固定化L-天冬酰胺酶；
所述血液灌流器中固定化L-天冬酰胺酶床层径高比为1/(1-50)，优选地，所述酶床层的径高比为1/(2-20)。
所述的高分子树脂载体为环氧型载体、胺基型载体、羟基型载体、离子交换型载体；优选胺基型载体。
所述胺基型载体与L-天冬酰胺酶在pH4-10介质中，在温度22-50℃下，反应12-72小时，将L-天冬酰胺酶固载于胺基型载体上，所述介质为pH为4-10的磷酸缓冲溶液。
所述固定化L-天冬酰胺酶的酶活为90-250u/g。所述一个酶活是指：在37℃下，起始底物质量分数为1％的天门冬酰胺，在1分钟内催化水解释放1μmol氨所需的酶量。
所述固定化L-天冬酰胺酶的制备方法，具体步骤包括：
(1)胺基型载体的制备
将单体和交联剂利用悬浮聚合法，制备环氧型基球，再将环氧型基球与有机胺进行反应，得到胺基型载体；
具体步骤为：将分散剂和去离子水作为分散相，将单体、交联剂、致孔剂、引发剂混合均匀，为有机相；将有机相加入至分散相中，在温度60-95℃下进行悬浮聚合；聚合反应结束，蒸出致孔剂或用丙酮或乙醇淋洗致孔剂，干燥后筛分出合适的粒度，得环氧型基球；将有机胺配置一定浓度，加入环氧型基球，在温度60-100℃下进行胺化反应；反应结束，用乙醇或水洗净残液，得胺基型载体。
所述分散剂选自明胶、聚乙烯醇、羟甲基纤维素、羧乙基纤维素等中的一种或两种。
所述单体选自甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸缩水甘油酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、乙二醇二丙烯酸酯、丙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇四甲基丙烯酸酯、季戊四醇三甲基丙烯酸酯、季戊四醇二甲基丙烯酸酯、葡萄糖五甲基丙烯酸酯、葡萄糖四甲基丙烯酸酯、葡萄糖三甲基丙烯酸酯、葡萄糖二甲基丙烯酸酯中的一种或几种；优选甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸缩水甘油酯中的一种或两种。
所选用的交联剂是二乙烯苯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、衣康酸烯丙酯、甲基丙烯酸烯丙酯、三聚异氰酸烯丙酯中的一种或多种；优选二乙烯苯。
所述致孔剂选自甲苯、甲基环己烷、200号汽油、液体石蜡、环己醇、异辛醇、异丁醇、二氯乙烷、甲基异丁基甲酮、甲基异丁基甲醇、二异丁基酮，正庚烷中的一种或多种。
所述引发剂为BPO或偶氮二异丁腈。
所述的有机胺为乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺、己二胺、甲基己二胺等一种或几种。所述有机胺与环氧型基球的重量比为1-10:1。
步骤(1)中所述的环氧型基球是苯乙烯系大孔吸附树脂、丙烯酸系大孔吸附树脂环氧型基球中的一种或两种组合；优选丙烯酸系环氧型基球。
所述的环氧型基球的环氧值在450-570μmol/g，平均数值在510μmol/g，环氧值高说明载体上的固定化基团较多，有利于酶的固定化，但环氧值过高，导致载体功能基团太多而交联度不够，影响载体的强度；孔径在50-100nm，孔径大有利于底物在孔道内的扩散，但孔径过大，载体强度低；强度测试时，浊度小于200，浊度越大，载体强度越差，破碎的镁颗粒影响固定化酶灌流器的使用安全性；粒径在100-1000μm；含水量在35-85％，所以优选丙烯酸系环氧型基球。
(2)胺基型载体的预处理
将步骤(1)所制得的胺基型载体用磷酸缓冲溶液进行处理，处理后，用戊二醛溶液进行活化。
具体步骤为：将胺基型载体放至层析柱中，用1-10倍载体床层体积的磷酸缓冲液从上往下淋洗；淋洗后，用真空抽去游离水；再把载体转移至1-10倍体积的戊二醛溶液(浓度为0.5-5％)中，在10-40℃下搅拌0.5-24h；过滤，用1-10倍体积的磷酸缓冲液冲洗，抽干。
(3)L-天冬酰胺酶酶液的固定化
将游离型的L-天冬酰胺酶酶液加入至磷酸缓冲溶液中溶解，再将步骤(2)中活化过的胺基型载体加至溶有L-天冬酰胺酶酶液的磷酸盐缓冲液中，活化后的胺基型载体占溶解后的L-天冬酰胺酶酶液重量的0.01-0.2倍，在25-50℃下振荡24-48h后过滤，用磷酸缓冲溶液进行冲洗，得到固定化的L-天冬酰胺酶。
步骤(3)中所述的游离型L-天冬酰胺酶酶液来源于大肠杆菌、黑曲霉、米曲霉、桔青霉、烟曲霉、构巢曲霉、土曲霉、菊欧文氏菌、嗜热栖热菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、枯草芽孢杆菌中的一种。
优选地，步骤(3)中所述的游离型L-天冬酰胺酶酶液来源于大肠杆菌、菊欧文氏菌、枯草芽孢杆菌中的一种。
步骤(3)所得到的固定化L-天冬酰胺酶的酶活为90-250u/g。
步骤(3)所述磷酸缓冲溶液的pH为4-10。
所述填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器的制备方法，具体步骤如下：
(1)将固定化L-天冬酰胺酶，进行包膜，净化；
(2)将净化后的固定化L-天冬酰胺酶装至两端带有滤网的管内；
(3)管两端滤网外部各有一个封头，封头留有可进出液体的接口。
步骤(2)中所述的将固定化L-天冬酰胺酶装至管中，其中管中酶床层的径高比为1/(1-50)，优选地，所述酶床层的径高比为1/(2-20)。
步骤(2)中所述的滤网为80-300目。
所述的填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器的应用，是在治疗急性淋巴细胞白血病方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明所制备的填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器，以共价键固载法、采用胺基型载体固定化L-天冬酰胺酶，固载牢固，颗粒大小可控，以填充柱的形式填充至血液灌流器中，所制备的填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器安全(颗粒粒径15μm以上颗粒低于300个，游离酶浓度低于1ppm)、高效(L-天门冬酰胺转化率97％以上)、催化效率高(酶活≥90u/g)；
(2)所制备的填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器采用体外血液循环系统(ESS)，能够采用较高的酶量，既保证了疗效，又避免了将游离的酶液带入人体的副作用，将人体一些毒性或有害物质，在酶的催化下，转化为营养成分或低毒的物质，实现对疾病的治疗；
(3)采用低毒性的酶固定化材料、高通量的酶活，生物相容性良好，保证了将体内L-天门冬酰胺转化为天门冬氨酸的较高转化效果，大幅降低了天门冬酰胺的浓度；
(4)选用了高分子载体作为固定化L-天冬酰胺酶的载体，并提供了优选的胺基型载体的制备工艺；这种胺基型载体功能基团高，采用共价键进行酶的固定化，酶的稳定性好，酶不易脱落和衰减；因为载体强度好，不易破碎，使用中流失少；载体孔径大，有利于底物和产物的扩散，能提高L-天门冬酰胺转化率，减少杂质对酶的污染；
(5)目前市场上，未见有固定化L-天冬酰胺酶出售；本发明固定化L-天冬酰胺酶，首次以共价键载酶，连接载体和酶的共价键牢固，固定化酶的载体强度好，不易破碎流失，耐污染；大幅提高了使用中酶流失率，既提高了催化效果，也提高了在血液灌流中的安全性；
(6)以共价键固载法固定化L-天冬酰胺酶，以填充柱的形式填充至血液灌流器中，所制备的填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器，填充柱形式可以减弱反应产物对酶活性抑制作用，改善催化反应平衡，提高水解合成比值；
(7)所述的固定化L-天冬酰胺酶具有较高的酶活，底物L-天门冬酰胺在床层中能高效催化，从而在床层内的停留时间不需要很长，并且转化率更高，酶颗粒破碎更少。
附图说明
图1是所述血液灌流器的结构示意图；
图中1是进口(或出口)，2是封头，3是出口(或进口)，4是滤网，5是固定化L-天冬酰胺酶酶层。
具体实施方式
本发明通过图表对比和实施例来阐明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1
(1)胺基型载体的制备；
将聚乙烯醇和去离子水作为分散相；将甲基丙烯酸缩水甘油酯、二乙烯苯，甲苯为致孔剂，BPO为引发剂，混合均匀，为有机相。将有机相加入至分散相中，在温度90-95℃下进行悬浮聚合。聚合反应结束，用乙醇淋洗致孔剂。筛分出合适的粒度，得环氧型基球。环氧型基球的环氧值在540μmol/g；孔径90nm；强度测试时，浊度160；粒径300μm；含水量85％。将环氧型基球与乙二胺在90-100℃温度下进行反应，得到胺基型载体。
(2)胺基型载体的预处理；
将胺基型载体放至层析柱中，用4倍载体床层体积的磷酸缓冲液从上往下淋洗；淋洗后，用真空抽去游离水；再把载体转移至8倍载体床层体积的戊二醛溶液(浓度为3％)中，在35℃下搅拌25h；过滤，用3倍体积的磷酸缓冲液冲洗，抽干。
(3)L-天门冬酰胺酶酶液的固定化；
将游离型的来源于大肠杆菌的L-天冬酰胺酶液加入至磷酸缓冲溶液中溶解，再将步骤(2)中活化过的胺基型载体加至溶有L-天冬酰胺酶酶液的磷酸盐缓冲液pH6.8中，活化后的胺基型载体占溶解后的L-天冬酰胺酶酶液重量的0.1倍，在35℃下振荡40h后过滤，用磷酸缓冲溶液进行冲洗，得到固定化L-天冬酰胺酶，该固定化L-天冬酰胺酶的酶活为125u/g。
将固定化L-天冬酰胺酶，进行包膜，净化；将净化后的固定化L-天冬酰胺酶装至两端带有滤网的管内，装载量为75g固定化酶/只灌流器，酶床层径高比为1/10，滤网为200目，管两端滤网外部各有一个封头，封头留有可进出液体的接口，得到固定化L-天冬酰胺酶血液灌流器。
所述的填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器的应用，是在治疗急性淋巴白血病方面的应用。
实施例2
(1)胺基型载体的制备；
将分散剂和去离子水作为分散相；将乙二醇二甲基丙烯酸酯、三聚异氰酸烯丙酯、二乙烯苯、致孔剂异丁醇、引发剂BPO混合均匀，为有机相。将有机相加入至分散相中，在温度60-70℃下进行悬浮聚合。聚合反应结束，用丙酮淋洗致孔剂。筛分出合适的粒度，得环氧型基球。环氧型基球的环氧值在480μmol/g；孔径50nm；强度测试时，浊度190；粒径300μm；含水量55％。将环氧型基球与丁二胺80-90℃温度下进行反应，得到胺基型载体。
(2)胺基型载体的预处理；
将胺基型载体放至层析柱中，用4倍载体床层体积的磷酸缓冲液从上往下淋洗；淋洗后，用真空抽去游离水；再把载体转移至8倍载体床层体积的戊二醛溶液(浓度为1％)中，在25℃下搅拌32h；过滤，用8倍体积的磷酸缓冲液冲洗，抽干。
(3)L-天门冬酰胺酶酶液的固定化；
将游离型的来源于菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶液加入至磷酸缓冲溶液中溶解，再将步骤(2)中活化过的胺基型载体加至溶有L-天冬酰胺酶酶液的磷酸盐缓冲液pH5中，活化后的胺基型载体占溶解后的L-天冬酰胺酶酶液重量的0.1倍，在25℃下振荡20h后过滤，用磷酸缓冲溶液进行冲洗，得到固定化L-天冬酰胺酶，该固定化L-天冬酰胺酶的酶活为111u/g。
将固定化L-天冬酰胺酶，进行包膜，净化；将净化后的固定化L-天冬酰胺酶装至两端带有滤网的管内，装载量为90g固定化酶/只灌流器，酶床层径高比为1/1，滤网为200目，管两端滤网外部各有一个封头，封头留有可进出液体的接口，得到固定化L-天冬酰胺酶血液灌流器。
所述的填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器的应用，是在治疗急性淋巴白血病方面的应用。
实施例3
(1)胺基型载体的制备；
将分散剂和去离子水作为分散相；将甲基丙烯酸缩水甘油酯、二乙烯苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、三聚异氰酸烯丙酯、致孔剂甲基环己烷、引发剂BPO，混合均匀，为有机相。将有机相加入至分散相中，在温度70-80℃下进行悬浮聚合。聚合反应结束，用丙酮淋洗致孔剂。筛分出合适的粒度，得环氧型基球。环氧型基球的环氧值在500μmol/g；孔径70nm；强度测试时，浊度170；粒径310μm；含水量75％。将环氧型基球与己二胺60-70℃温度下进行反应，得到胺基型载体。
(2)胺基型载体的预处理；
将胺基型载体放至层析柱中，用6倍载体床层体积的磷酸缓冲液从上往下淋洗；淋洗后，用真空抽去游离水；再把载体转移至8倍载体床层体积的戊二醛溶液(浓度为3％)中，在25℃下搅拌24h；过滤，用6倍体积的磷酸缓冲液冲洗，抽干。
(3)L-天门冬酰胺酶酶液的固定化；
将游离型的来源于枯草芽孢杆菌的L-天冬酰胺酶液加入至磷酸缓冲溶液中溶解，再将步骤(2)中活化过的胺基型载体加至溶有L-天冬酰胺酶酶液的磷酸盐缓冲液pH4中，活化后的胺基型载体占溶解后的L-天冬酰胺酶酶液重量的0.1倍，在25℃下振荡24h后过滤，用磷酸缓冲溶液进行冲洗，得到固定化L-天冬酰胺酶，该固定化L-天冬酰胺酶的酶活为118u/g。
将固定化L-天冬酰胺酶，进行包膜，净化；将净化后的固定化L-天冬酰胺酶装至两端带有滤网的管内，装载量为200g固定化酶/只灌流器，酶床层径高比为1/30，滤网为120目，管两端滤网外部各有一个封头，封头留有可进出液体的接口，得到固定化L-天冬酰胺酶血液灌流器。
所述的填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器的应用，是在治疗急性淋巴白血病方面的应用。
实施例4
(1)胺基型载体的制备；
将分散剂和去离子水作为分散相；将甲基丙烯酸缩水甘油酯、二乙烯苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、致孔剂液体石蜡、引发剂偶氮二异丁腈，混合均匀，为有机相。将有机相加入至分散相中，在温度90-95℃下进行悬浮聚合。聚合反应结束，用丙酮淋洗致孔剂。筛分出合适的粒度，得环氧型基球。环氧型基球的环氧值在490μmol/g；孔径60nm；强度测试时，浊度180；粒径320μm；含水量65％。将环氧型基球与丁二胺70-80℃温度下进行反应，得到胺基型载体。
(2)胺基型载体的预处理；
将胺基型载体放至层析柱中，用4倍载体床层体积的磷酸缓冲液从上往下淋洗；淋洗后，用真空抽去游离水；再把载体转移至4倍载体床层体积的戊二醛溶液(浓度为4％)中，在28℃下搅拌30h；过滤，用4倍体积的磷酸缓冲液冲洗，抽干。
(3)L-天门冬酰胺酶酶液的固定化；
将游离型的来源于大肠杆菌的L-天冬酰胺酶液加入至磷酸缓冲溶液中溶解，再将步骤(2)中活化过的胺基型载体加至溶有L-天冬酰胺酶酶液的磷酸盐缓冲液pH10中，活化后的胺基型载体占溶解后的L-天冬酰胺酶酶液重量的0.1倍，在30℃下振荡36h后过滤，用磷酸缓冲溶液进行冲洗，得到固定化L-天冬酰胺酶，该固定化L-天冬酰胺酶的酶活为120u/g。
将固定化L-天冬酰胺酶，进行包膜，净化；将净化后的固定化L-天冬酰胺酶装至两端带有滤网的管内，装载量为180g固定化酶/只灌流器，酶床层径高比为1/50，滤网为180目，管两端滤网外部各有一个封头，封头留有可进出液体的接口，得到固定化L-天冬酰胺酶血液灌流器。
所述的填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器的应用，是在治疗急性淋巴白血病方面的应用。
实施例5
(1)环氧型载体的预处理；
选用某市售的环氧型载体(粒径300-500μm，环氧值500μmol/g，含水量56％)，将环氧型载体放至层析柱中，用4倍载体床层体积的磷酸缓冲液从上往下淋洗；淋洗后，用真空抽去游离水，抽干。
(2)L-天门冬酰胺酶酶液的固定化；
将游离型的来源于大肠杆菌的L-天冬酰胺酶液加入至pH为8的磷酸缓冲溶液中溶解，再将步骤(1)中预处理过的环氧型载体加至溶有L-天冬酰胺酶酶液的磷酸盐缓冲液中，活化后的环氧型载体占溶解后的L-天冬酰胺酶酶液重量的0.1倍，在25℃下振荡36h后过滤，用磷酸缓冲溶液进行冲洗，得到固定化L-天冬酰胺酶，该固定化L-天冬酰胺酶的酶活为100u/g。
将固定化L-天冬酰胺酶，进行包膜，净化；将净化后的固定化L-天冬酰胺酶装至两端带有滤网的管内，装载量为150g固定化酶/只灌流器，酶床层径高比为1/50，滤网为150目，管两端滤网外部各有一个封头，封头留有可进出液体的接口，得到固定化L-天冬酰胺酶血液灌流器。
所述的填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器的应用，是在治疗急性淋巴白血病方面的应用。
实施例6
将游离型的来源于大肠杆菌的L-天冬酰胺酶液加入至磷酸缓冲溶液中溶解，再将步骤(2)中活化过的羟基型载体加至溶有L-天冬酰胺酶酶液的pH为8磷酸盐缓冲液中，活化后的羟基型载体占溶解后的L-天冬酰胺酶酶液重量的0.07倍，在32℃下振荡32h后过滤，用磷酸缓冲溶液进行冲洗，得到固定化L-天冬酰胺酶，该固定化L-天冬酰胺酶的酶活为102u/g。
将固定化L-天冬酰胺酶，进行包膜，净化；将净化后的固定化L-天冬酰胺酶装至两端带有滤网的管内，装载量为200g固定化酶/只灌流器，酶床层径高比为1/30，滤网为150目，管两端滤网外部各有一个封头，封头留有可进出液体的接口，得到固定化L-天冬酰胺酶血液灌流器。
所述的填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器的应用，是在治疗急性粒细胞型白血病方面的应用。
实验例
对实施例1-4所得的固定化L-天冬酰胺酶进行性能测试，性能参数见下表：
Figure BDA0002856662610000101
根据一次性血液灌流器行业标准YY/T0464-2019规定，粒径15μm以上颗粒流失个数不得超过300个，否则存在安全风险。
固定化酶血液灌流器中流出的蛋白浓度代表了酶的流失情况，酶流失后，会随血液进入人体，引起副作用，流出蛋白越低，说明酶固定化程度越牢固，使用越安全。
天门冬酰胺转化率越高，说明酶的催化专一性能好。
酶活越高，催化速率越快，疗效更好。
从上表可以看出：固定化L-天冬酰胺酶血液灌流器安全(15μm以上颗粒低于300个，游离酶浓度低于1ppm)、高效(天门冬酰胺转化率97％以上)、催化效率高(酶活≥90u/g)。因此本发明的固定化L-天冬酰胺酶血液灌流器性能较好。

Claims (10)

1.一种填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器，将固定化酶装填至两端带有滤网的管中，滤网外部有上下封头，封头上有进出液体的接口，其特征在于：
采用高分子树脂载体固定化L-天冬酰胺酶，以填充柱的形式填充至血液灌流器中；
所述每只灌流器中装载量有5-500g固定化L-天冬酰胺酶；
所述血液灌流器中固定化L-天冬酰胺酶床层径高比为1/(1-50)。
2.根据权利要求1所述填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器，其特征在于：所述的高分子树脂载体为环氧型载体、胺基型载体、羟基型载体、离子交换型载体。
3.根据权利要求2所述填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器，其特征在于：所述的高分子树脂载体为胺基型载体；所述胺基型载体与L-天冬酰胺酶在pH4-10介质中，在温度22-50℃下，反应12-72小时，将L-天冬酰胺酶固载于胺基型载体上。
4.根据权利要求1所述填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器，其特征在于：所述固定化L-天冬酰胺酶的酶活为90-250u/g。
5.根据权利要求1所述填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器，其特征在于：所述固定化L-天冬酰胺酶的制备方法，具体步骤包括：
(1)胺基型载体的制备
将单体和交联剂利用悬浮聚合法，制备环氧型基球，再将环氧型基球与有机胺进行反应，得到胺基型载体；
(2)胺基型载体的预处理
将步骤(1)所制得的胺基型载体用磷酸缓冲溶液进行处理，处理后，用戊二醛溶液进行活化；
(3)L-天冬酰胺酶酶液的固定化
将游离型的L-天冬酰胺酶酶液加入至磷酸缓冲溶液中溶解，再将步骤(2)中活化过的胺基型载体加至溶有L-天冬酰胺酶酶液的磷酸盐缓冲液中，活化后的胺基型载体占溶解后的L-天冬酰胺酶酶液重量的0.01-0.2倍，在22-50℃下振荡12-72h后过滤，用磷酸缓冲溶液进行冲洗，得到固定化的L-天冬酰胺酶。
6.根据权利要求5所述的填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器，其特征在于：步骤(1)中所述的环氧型基球是苯乙烯系大孔吸附树脂、丙烯酸系大孔吸附树脂环氧型基球中的一种或两种组合。
7.根据权利要求5所述的填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器，其特征在于：步骤(3)中所述的游离型L-天冬酰胺酶酶液来源于大肠杆菌、黑曲霉、米曲霉、桔青霉、烟曲霉、构巢曲霉、土曲霉、菊欧文氏菌、嗜热栖热菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、枯草芽孢杆菌中的一种。
8.根据权利要求5所述的填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器，其特征在于：步骤(3)所述磷酸缓冲溶液的pH为4-10。
9.制备如权利要求1所述的填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器的方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)将固定化L-天冬酰胺酶，进行包膜，净化；
(2)将净化后的固定化L-天冬酰胺酶装至两端带有滤网的管内；
(3)管两端滤网外部各有一个封头，封头留有可进出液体的接口。
10.如权利要求1所述的填装有固定化L-天冬酰胺酶的血液灌流器的应用，其特征在于：在治疗急性淋巴细胞白血病方面的应用。
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