CN117844796A - 一种生物酶的固定方法及应用 - Google Patents
一种生物酶的固定方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117844796A CN117844796A CN202311644212.9A CN202311644212A CN117844796A CN 117844796 A CN117844796 A CN 117844796A CN 202311644212 A CN202311644212 A CN 202311644212A CN 117844796 A CN117844796 A CN 117844796A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- carbon skeleton
- arabinose isomerase
- glutaraldehyde
- enzyme
- galactose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 86
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 86
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 149
- 108010018080 L-arabinose isomerase Proteins 0.000 claims abstract description 95
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 37
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 33
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000001027 hydrothermal synthesis Methods 0.000 claims abstract description 25
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims abstract description 12
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 claims description 130
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 97
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 45
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 42
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 claims description 42
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 34
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 25
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 claims description 20
- LKDRXBCSQODPBY-OEXCPVAWSA-N D-tagatose Chemical compound OCC1(O)OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-OEXCPVAWSA-N 0.000 claims description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 17
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 15
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 238000003763 carbonization Methods 0.000 claims description 12
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 12
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 10
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 claims description 8
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 7
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 7
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 6
- 238000010000 carbonizing Methods 0.000 claims description 6
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 abstract description 31
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 25
- 238000007711 solidification Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008023 solidification Effects 0.000 abstract description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 12
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 11
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 10
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 7
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 3
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 229910000000 metal hydroxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000004692 metal hydroxides Chemical class 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-UCORVYFPSA-N L-ribulose Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-UCORVYFPSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000272 alkali metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001860 alkaline earth metal hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 alkaline earth metal salt Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种生物酶的固定方法及应用，包括以下步骤：步骤一、将通过水热反应制得的具有氨基的碳骨架载体置于分散有游离的L‑阿拉伯糖异构酶的磷酸缓冲液中；均匀分散后静置，L‑阿拉伯糖异构酶通过碳骨架的吸附性分布在碳骨架载体的表面；步骤二、将步骤一所得混合体系中加入戊二醛溶液中得酶固化物料；步骤三、过滤分离步骤二所得固体颗粒，去除固体颗粒表面未结合的酶，得使用碳骨架载体固定化酶；本发明利用刚性的碳骨架配合氨基的存在有效与戊二醛的交联实现L‑阿拉伯糖异构酶的固化，在刚性骨架载体配合L‑阿拉伯糖异构酶与戊二醛之间的共价键连接有效提升固化的效果，方便实现固化酶分离的同时保持较高的酶活力。
Description
技术领域
本发明涉及生物糖制备技术领域，特别是涉及一种生物酶的固定方法及应用。
背景技术
D-塔格糖作为一种稀有糖，可以使用化学法合成也可以使用生物法合成。其中化学合成法是使用可溶性碱金属或者碱土金属盐为催化剂吗，在碱性条件下催化D-半乳糖与金属氢氧化物发生异构化反应，与碱金属或者碱土金属氢氧化物结合形成沉淀，而后利用例如磷酸的加入降低pH值解除D-塔格糖与金属氢氧化物的络合沉淀，在使用过程中需要使用大量的碱以及酸，且二者存在混合的过程，成本较高，后续的水处理也增加了生产的负担。
生物法制备D-塔格糖具体包括通过L-阿拉伯糖异构酶催化D-半乳糖异构化生成D-塔格糖，由于L-阿拉伯糖异构酶能够催化L-阿拉伯糖为L-核酮糖，而L-阿拉伯糖与D-半乳糖具有相似的结构。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物酶的固定方法，本发明利用刚性的碳骨架配合氨基的存在有效与戊二醛的交联实现L-阿拉伯糖异构酶的固化，在刚性骨架载体配合L-阿拉伯糖异构酶与戊二醛之间的共价键连接有效提升固化的效果，方便实现固化酶分离的同时保持较高的酶活力。
为解决此技术问题，本发明的技术方案是：一种生物酶的固定方法，包括以下步骤：
步骤一、将通过水热反应制得的具有氨基的碳骨架载体置于分散有游离的L-阿拉伯糖异构酶的磷酸缓冲液中，其中碳骨架载体与游离的L-阿拉伯糖异构酶的用量比为1g：(1000U至1200U)；
均匀分散后静置，L-阿拉伯糖异构酶通过碳骨架的吸附性分布在碳骨架载体的表面；
步骤二、将步骤一所得混合体系中加入戊二醛溶液中得酶固化物料，将步骤二所得物料体系置于摇床130rpm至150rpm搅拌6小时至12小时进行固化反应；固化温度为25℃至30℃；
步骤三、过滤分离步骤二所得固体颗粒，使用磷酸缓冲液洗涤后使用去离子水去除固体颗粒表面未结合的酶，得使用碳骨架载体固化的L-阿拉伯糖异构酶。
优选所述碳骨架载体为具有网络结构的壳聚糖经水热碳化制得空心球状的网络结构。本发明中作为L-阿拉伯糖异构酶载体的具有球形结构的多孔中空碳骨架有效形成了分散的固液界面，增加了固化酶在异构化溶液中的分散空间，从而在一定程度降低了D-半乳糖的传质和富集，降低了传质的难度，缩短了固化酶与D-半乳糖接触的路径。
优选所述碳骨架载体的制备方法包括以下步骤：
S1、清洗作为壳聚糖和戊二醛交联模板的微米级二氧化硅微球，将二氧化硅微球置于壳聚糖、戊二醛以及十六烷基三甲基溴化铵水溶液中搅拌均匀；
S2、加热，壳聚糖与戊二醛交联反应于二氧化硅微球表面；
S3、将交联后的固体物质转移至水热釜进行水热反应，交联于二氧化硅表面的壳聚糖-戊二醛碳化形成包覆于二氧化硅微球的碳骨架；
S4、将S3所得二氧化硅颗粒-碳骨架置于氢氧化钾溶液中去除二氧化硅颗粒，得多孔且空心的碳骨架。
本发明获得较为完整的空心球状碳骨架载体，固体酶通过球状碳骨架的堆叠形成三维空间的连通，液相分散在连通的球状碳骨架和球状碳骨架之间，D-半乳糖与固化酶接触的可能性显著提升，且由于刚性碳骨架结构稳定，有效提升L-阿拉伯糖异构酶的固定化程度，所得固化酶反复使用数量显著提升。
优选S1中壳聚糖与戊二醛的质量比为1:(0.2至0.3)；壳聚糖与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1：(0.08至0.15)。
优选所述二氧化硅微球的直径为20微米至100微米。本发明的二氧化硅微球的制备方法参考CN102259873A或CN105271267B中的制备方法。
优选S2中交联反应的工艺条件为：加热至40℃至50℃，交联18h至24h。
优选S3中水热反应的温度为180℃至200℃，水热时间为12小时至18小时。本发明通过水热反应碳化在形成碳骨架的同时保留壳聚糖中的氨基，方便戊二醛的醛基与载体及酶分子中的氨基反应，将酶交联于载体，利用刚性载体结构的强度和稳定性将酶均匀分散的固定化。
优选用于去除二氧化硅球的氢氧化钾的浓度为6mol/L至10mol/L。
本发明的目的在于提供一种D-塔格糖的制备方法，本发明利用具有球形碳骨架的载体固化L-阿拉伯糖异构酶，通过碳骨架的堆叠促进D-半乳糖的传质以及与酶的接触提升异构化效果。
为解决此技术问题，本发明的技术方案是：一种D-塔格糖的制备方法，将本发明固定的L-阿拉伯糖异构酶置于浓度为50mmol/L的D-半乳糖溶液中，溶液的pH值为7.0至8.0，60℃至75℃水浴恒温反应30min至60min，沸水浴停止反应，离心除去固化的L-阿拉伯糖异构酶；
在D-半乳糖的异构化过程中，空心球状多孔碳骨架的堆叠形成的孔道连通碳骨架的中空结构形成液相中D-半乳糖扩散传质的连续空间；
同时碳骨架的吸附作用促进D-半乳糖富集于L-阿拉伯糖异构酶。
优选固化的L-阿拉伯糖异构酶的碳骨架质量与D-半乳糖溶液的体积比为1g：3ml。
通过采用上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明获得较为完整的空心球状碳骨架载体，固体酶通过球状碳骨架的堆叠形成三维空间的连通，液相分散在连通的球状碳骨架和球状碳骨架之间，D-半乳糖与固化酶接触的可能性显著提升，且由于刚性碳骨架结构稳定，有效提升L-阿拉伯糖异构酶的固定化程度，所得固化酶反复使用异构化效果稳定。
在D-半乳糖的异构化为D-塔格糖的过程中，空心球状多孔碳骨架的堆叠形成的孔道连通碳骨架的中空结构形成液相中D-半乳糖扩散传质的连续空间；同时碳骨架的吸附作用促进D-半乳糖富集于L-阿拉伯糖异构酶，从传质动力学的角度有效促进了异构化的进行。
附图说明
图1是本发明实施例2制得碳骨架的红外光谱图。
具体实施方式
为了进一步解释本发明的技术方案，下面通过具体实施例来对本发明进行详细阐述。
实施例1
本实施例公开一种生物酶的固定方法，包括以下步骤：
步骤一、将通过水热反应制得的具有氨基的碳骨架载体置于分散有游离的L-阿拉伯糖异构酶的磷酸缓冲液中，其中碳骨架载体与游离的L-阿拉伯糖异构酶的用量比为1g：1000U；
均匀分散后静置，L-阿拉伯糖异构酶通过碳骨架的吸附性分布在碳骨架载体的表面；
步骤二、将步骤一所得混合体系中加入戊二醛溶液中得酶固化物料，将步骤二所得物料体系置于摇床130rpm搅拌6小时进行固化反应；固化温度为25℃；
步骤三、过滤分离步骤二所得固体颗粒，使用磷酸缓冲液洗涤后使用去离子水去除固体颗粒表面未结合的酶，得使用碳骨架载体固化的L-阿拉伯糖异构酶。
本实施例中所述碳骨架载体为具有网络结构的壳聚糖经水热碳化制得空心球状的网络结构。本发明中作为L-阿拉伯糖异构酶载体的具有球形结构的多孔中空碳骨架有效形成了分散的固液界面，增加了固化酶在异构化溶液中的分散空间，从而在一定程度降低了D-半乳糖的传质和富集，降低了传质的难度，缩短了固化酶与D-半乳糖接触的路径。
本实施例中L-阿拉伯糖异构酶为发酵方法制得，使用咔唑法检测每升发酵液中L-阿拉伯糖异构酶的酶活性为24947U。其中酶活性单位U的计算方式如下：在L-阿拉伯糖异构酶的作用下，每分钟转化D-半乳糖生成1μg D-塔格糖的酶量为1单位L-阿拉伯糖异构酶。
本实施例中所述碳骨架载体的制备方法包括以下步骤：
S1、清洗作为壳聚糖和戊二醛交联模板的微米级二氧化硅微球，将二氧化硅微球置于壳聚糖、戊二醛以及十六烷基三甲基溴化铵水溶液中搅拌均匀；
S1中壳聚糖与戊二醛的质量比为1:0.2；壳聚糖与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1：0.08。
所述二氧化硅微球的直径为20微米至100微米。
S2、加热，壳聚糖与戊二醛交联反应于二氧化硅微球表面；交联反应的工艺条件为：加热至40℃，交联18h。
S3、将交联后的固体物质转移至水热釜进行水热反应，交联于二氧化硅表面的壳聚糖-戊二醛碳化形成包覆于二氧化硅微球的碳骨架；水热反应的温度为180℃，水热时间18小时。本发明通过水热反应碳化在形成碳骨架的同时保留壳聚糖中的氨基，方便戊二醛的醛基分别与载体及酶分子中的氨基反应，将酶交联于载体，利用刚性载体结构的强度和稳定性将酶均匀分散的固定化。
S4、将S3所得二氧化硅颗粒-碳骨架置于6mol/L的氢氧化钾溶液中去除二氧化硅颗粒，得多孔且空心的碳骨架。
本实施例获得较为完整的空心球状碳骨架载体，固体酶通过球状碳骨架的堆叠形成三维空间的连通，液相分散在连通的球状碳骨架和球状碳骨架之间，D-半乳糖与固化酶接触的可能性显著提升，且由于刚性碳骨架结构稳定，有效提升L-阿拉伯糖异构酶的固定化程度，所得固化酶反复使用数量显著提升。
本实施例还公开一种D-塔格糖的制备方法，将本实施例固定的L-阿拉伯糖异构酶置于浓度为50mmol/L的D-半乳糖溶液中，溶液的pH值为7.5，75℃水浴恒温反应60min，沸水浴停止反应，离心除去固化的L-阿拉伯糖异构酶；
在D-半乳糖的异构化过程中，空心球状多孔碳骨架的堆叠形成的孔道连通碳骨架的中空结构形成液相中D-半乳糖扩散传质的连续空间；
同时碳骨架的吸附作用促进D-半乳糖富集于L-阿拉伯糖异构酶。
本实施例中固化的L-阿拉伯糖异构酶的碳骨架质量与D-半乳糖溶液的体积比为1g：3ml。
实施例2
本实施例公开一种生物酶的固定方法，包括以下步骤：
步骤一、将通过水热反应制得的具有氨基的碳骨架载体置于分散有游离的L-阿拉伯糖异构酶的磷酸缓冲液中，其中碳骨架载体与游离的L-阿拉伯糖异构酶的用量比为1g：1000U；
均匀分散后静置，L-阿拉伯糖异构酶通过碳骨架的吸附性分布在碳骨架载体的表面；
步骤二、将步骤一所得混合体系中加入戊二醛溶液中得酶固化物料，将步骤二所得物料体系置于摇床130rpm搅拌12小时进行固化反应；固化温度为25℃；
步骤三、过滤分离步骤二所得固体颗粒，使用磷酸缓冲液洗涤后使用去离子水去除固体颗粒表面未结合的酶，得使用碳骨架载体固化的L-阿拉伯糖异构酶。
本实施例中所述碳骨架载体为具有网络结构的壳聚糖经水热碳化制得空心球状的网络结构。本发明中作为L-阿拉伯糖异构酶载体的具有球形结构的多孔中空碳骨架有效形成了分散的固液界面，增加了固化酶在异构化溶液中的分散空间，从而在一定程度降低了D-半乳糖的传质和富集，降低了传质的难度，缩短了固化酶与D-半乳糖接触的路径。
本实施例中L-阿拉伯糖异构酶为发酵方法制得，使用咔唑法检测每升发酵液中L-阿拉伯糖异构酶的酶活性为24947U。其中酶活性单位U的计算方式如下：在L-阿拉伯糖异构酶的作用下，每分钟转化D-半乳糖生成1μg D-塔格糖的酶量为1单位L-阿拉伯糖异构酶。
本实施例中所述碳骨架载体的制备方法包括以下步骤：
S1、清洗作为壳聚糖和戊二醛交联模板的微米级二氧化硅微球，将二氧化硅微球置于壳聚糖、戊二醛以及十六烷基三甲基溴化铵水溶液中搅拌均匀；
S1中壳聚糖与戊二醛的质量比为1:0.3；壳聚糖与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1：0.10。
所述二氧化硅微球的直径为50微米。
S2、加热，壳聚糖与戊二醛交联反应于二氧化硅微球表面；交联反应的工艺条件为：加热至50℃，交联24h。
S3、将交联后的固体物质转移至水热釜进行水热反应，交联于二氧化硅表面的壳聚糖-戊二醛碳化形成包覆于二氧化硅微球的碳骨架；水热反应的温度为200℃，水热时间为18小时。本发明通过水热反应碳化在形成碳骨架的同时保留壳聚糖中的氨基，方便戊二醛的醛基分别与载体及酶分子中的氨基反应，将酶交联于载体，利用刚性载体结构的强度和稳定性将酶均匀分散的固定化。
S4、将S3所得二氧化硅颗粒-碳骨架置于6mol/L的氢氧化钾溶液中去除二氧化硅颗粒，得多孔且空心的碳骨架。
本实施例获得较为完整的空心球状碳骨架载体，固体酶通过球状碳骨架的堆叠形成三维空间的连通，液相分散在连通的球状碳骨架和球状碳骨架之间，D-半乳糖与固化酶接触的可能性显著提升，且由于刚性碳骨架结构稳定，有效提升L-阿拉伯糖异构酶的固定化程度，所得固化酶反复使用数量显著提升。
本实施例还公开一种D-塔格糖的制备方法，将本实施例固定的L-阿拉伯糖异构酶置于浓度为50mmol/L的D-半乳糖溶液中，溶液的pH值为7.5，70℃水浴恒温反应60min，沸水浴停止反应，离心除去固化的L-阿拉伯糖异构酶；
在D-半乳糖的异构化过程中，空心球状多孔碳骨架的堆叠形成的孔道连通碳骨架的中空结构形成液相中D-半乳糖扩散传质的连续空间；
同时碳骨架的吸附作用促进D-半乳糖富集于L-阿拉伯糖异构酶。
本实施例中固化的L-阿拉伯糖异构酶的碳骨架质量与D-半乳糖溶液的体积比为1g：3ml。
实施例3
本实施例公开一种生物酶的固定方法，包括以下步骤：
步骤一、将通过水热反应制得的具有氨基的碳骨架载体置于分散有游离的L-阿拉伯糖异构酶的磷酸缓冲液中，其中碳骨架载体与游离的L-阿拉伯糖异构酶的用量比为1g：1200U；
均匀分散后静置，L-阿拉伯糖异构酶通过碳骨架的吸附性分布在碳骨架载体的表面；
步骤二、将步骤一所得混合体系中加入戊二醛溶液中得酶固化物料，将步骤二所得物料体系置于摇床150rpm搅拌12小时进行固化反应；固化温度为30℃；
步骤三、过滤分离步骤二所得固体颗粒，使用磷酸缓冲液洗涤后使用去离子水去除固体颗粒表面未结合的酶，得使用碳骨架载体固化的L-阿拉伯糖异构酶。
本实施例中所述碳骨架载体为具有网络结构的壳聚糖经水热碳化制得空心球状的网络结构。本发明中作为L-阿拉伯糖异构酶载体的具有球形结构的多孔中空碳骨架有效形成了分散的固液界面，增加了固化酶在异构化溶液中的分散空间，从而在一定程度降低了D-半乳糖的传质和富集，降低了传质的难度，缩短了固化酶与D-半乳糖接触的路径。
本实施例中L-阿拉伯糖异构酶为发酵方法制得，使用咔唑法检测每升发酵液中L-阿拉伯糖异构酶的酶活性为24947U。其中酶活性单位U的计算方式如下：在L-阿拉伯糖异构酶的作用下，每分钟转化D-半乳糖生成1μg D-塔格糖的酶量为1单位L-阿拉伯糖异构酶。
本实施例中所述碳骨架载体的制备方法包括以下步骤：
S1、清洗作为壳聚糖和戊二醛交联模板的微米级二氧化硅微球，将二氧化硅微球置于壳聚糖、戊二醛以及十六烷基三甲基溴化铵水溶液中搅拌均匀；
S1中壳聚糖与戊二醛的质量比为1:0.2；壳聚糖与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1：0.15。
所述二氧化硅微球的直径为50微米。
S2、加热，壳聚糖与戊二醛交联反应于二氧化硅微球表面；交联反应的工艺条件为：加热至40℃，交联18h。
S3、将交联后的固体物质转移至水热釜进行水热反应，交联于二氧化硅表面的壳聚糖-戊二醛碳化形成包覆于二氧化硅微球的碳骨架；水热反应的温度为180℃，水热时间为18小时。本发明通过水热反应碳化在形成碳骨架的同时保留壳聚糖中的氨基，方便戊二醛的醛基分别与载体及酶分子中的氨基反应，将酶交联于载体，利用刚性载体结构的强度和稳定性将酶均匀分散的固定化。
S4、将S3所得二氧化硅颗粒-碳骨架置于6mol/L的氢氧化钾溶液中去除二氧化硅颗粒，得多孔且空心的碳骨架。
本实施例获得较为完整的空心球状碳骨架载体，固体酶通过球状碳骨架的堆叠形成三维空间的连通，液相分散在连通的球状碳骨架和球状碳骨架之间，D-半乳糖与固化酶接触的可能性显著提升，且由于刚性碳骨架结构稳定，有效提升L-阿拉伯糖异构酶的固定化程度，所得固化酶反复使用数量显著提升。
本实施例还公开一种D-塔格糖的制备方法，将本实施例固定的L-阿拉伯糖异构酶置于浓度为50mmol/L的D-半乳糖溶液中，溶液的pH值为7.5，70℃水浴恒温反应60min，沸水浴停止反应，离心除去固化的L-阿拉伯糖异构酶；
在D-半乳糖的异构化过程中，空心球状多孔碳骨架的堆叠形成的孔道连通碳骨架的中空结构形成液相中D-半乳糖扩散传质的连续空间；
同时碳骨架的吸附作用促进D-半乳糖富集于L-阿拉伯糖异构酶。
本实施例中固化的L-阿拉伯糖异构酶的碳骨架质量与D-半乳糖溶液的体积比为1g：3ml。
实施例4
本实施例公开一种生物酶的固定方法，包括以下步骤：
步骤一、将通过水热反应制得的具有氨基的碳骨架载体置于分散有游离的L-阿拉伯糖异构酶的磷酸缓冲液中，其中碳骨架载体与游离的L-阿拉伯糖异构酶的用量比为1g：1200U；
均匀分散后静置，L-阿拉伯糖异构酶通过碳骨架的吸附性分布在碳骨架载体的表面；
步骤二、将步骤一所得混合体系中加入戊二醛溶液中得酶固化物料，将步骤二所得物料体系置于摇床150rpm搅拌12小时进行固化反应；固化温度为30℃；
步骤三、过滤分离步骤二所得固体颗粒，使用磷酸缓冲液洗涤后使用去离子水去除固体颗粒表面未结合的酶，得使用碳骨架载体固化的L-阿拉伯糖异构酶。
本实施例中所述碳骨架载体为具有网络结构的壳聚糖经水热碳化制得空心球状的网络结构。本发明中作为L-阿拉伯糖异构酶载体的具有球形结构的多孔中空碳骨架有效形成了分散的固液界面，增加了固化酶在异构化溶液中的分散空间，从而在一定程度降低了D-半乳糖的传质和富集的难度，缩短了固化酶与D-半乳糖接触的路径。
本实施例中L-阿拉伯糖异构酶为发酵方法制得，使用咔唑法检测每升发酵液中L-阿拉伯糖异构酶的酶活性为24947U。其中酶活性单位U的计算方式如下：在L-阿拉伯糖异构酶的作用下，每分钟转化D-半乳糖生成1μg D-塔格糖的酶量为1单位L-阿拉伯糖异构酶。
本实施例中所述碳骨架载体的制备方法包括以下步骤：
S1、清洗作为壳聚糖和戊二醛交联模板的微米级二氧化硅微球，将二氧化硅微球置于壳聚糖、戊二醛以及十六烷基三甲基溴化铵水溶液中搅拌均匀；
S1中壳聚糖与戊二醛的质量比为1:0.3；壳聚糖与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1：0.10。
所述二氧化硅微球的直径为20微米至100微米，即多种尺寸的二氧化硅微球混合。
S2、加热，壳聚糖与戊二醛交联反应于二氧化硅微球表面；交联反应的工艺条件为：加热至50℃，交联24h。
S3、将交联后的固体物质转移至水热釜进行水热反应，交联于二氧化硅表面的壳聚糖-戊二醛碳化形成包覆于二氧化硅微球的碳骨架；水热反应的温度为200℃，水热时间为18小时。本发明通过水热反应碳化在形成碳骨架的同时保留壳聚糖中的氨基，方便戊二醛的醛基分别与载体及酶分子中的氨基反应，将酶交联于载体，利用刚性载体结构的强度和稳定性将酶均匀分散的固定化。
S4、将S3所得二氧化硅颗粒-碳骨架置于6mol/L的氢氧化钾溶液中去除二氧化硅颗粒，得多孔且空心的碳骨架。
本实施例获得较为完整的空心球状碳骨架载体，固体酶通过球状碳骨架的堆叠形成三维空间的连通，液相分散在连通的球状碳骨架和球状碳骨架之间，D-半乳糖与固化酶接触的可能性显著提升，且由于刚性碳骨架结构稳定，有效提升L-阿拉伯糖异构酶的固定化程度，所得固化酶反复使用数量显著提升。
本实施例还公开一种D-塔格糖的制备方法，将本实施例固定的L-阿拉伯糖异构酶置于浓度为50mmol/L的D-半乳糖溶液中，溶液的pH值为7.5，70℃水浴恒温反应60min，沸水浴停止反应，离心除去固化的L-阿拉伯糖异构酶；
在D-半乳糖的异构化过程中，空心球状多孔碳骨架的堆叠形成的孔道连通碳骨架的中空结构形成液相中D-半乳糖扩散传质的连续空间；
同时碳骨架的吸附作用促进D-半乳糖富集于L-阿拉伯糖异构酶。
本实施例中固化的L-阿拉伯糖异构酶的碳骨架质量与D-半乳糖溶液的体积比为1g：3ml。
对比例
本对比例公开一种使用海藻酸钠固定L-阿拉伯糖异构酶的方法及应用，L-阿拉伯糖异构酶的固定方法如下：
将10mL充分溶解的海藻酸钠溶液(质量分数为2.0％)与5mL的游离酶液混合搅拌，再加入5mL明胶溶液(质量分数为2.0％)，混合乳化30min。用带有内径为0.6mm针头的注射器将上述混合液以60滴/min的速度滴入CaCl2(质量分数为4.0％)溶液中，即形成大小均一的光滑颗粒，0～4℃条件下静置硬化。将固定化颗粒洗涤、抽滤干燥。再加入到质量分数为0.02％的戊二醛溶液中，25℃下振荡交联1h，倾去溶液，分别用0.9％NaCl溶液和去离子水洗涤固定化颗粒，抽滤干燥即得固定化酶。
本实施例中L-阿拉伯糖异构酶为发酵方法制得，使用咔唑法检测每升发酵液中L-阿拉伯糖异构酶的酶活性为24947U。其中酶活性单位U的计算方式如下：在L-阿拉伯糖异构酶的作用下，每分钟转化D-半乳糖生成1μg D-塔格糖的酶量为1单位L-阿拉伯糖异构酶。
将本对比例固定的L-阿拉伯糖异构酶置于浓度为50mmol/L的D-半乳糖溶液中，溶液的pH值为7.5，70℃水浴恒温反应60min，沸水浴停止反应，离心除去固化的L-阿拉伯糖异构酶；本实施例中固化的L-阿拉伯糖异构酶的碳骨架质量与D-半乳糖溶液的体积比为1g：3ml。
分别测试实施例1至4以及对比例所得固定化酶的酶活力，具体数据详见表1所示。
表1实施例1至4以及对比例所得固定化酶的酶活力
| 项目 | 酶活力 |
| 实施例1 | 512U/g碳骨架 |
| 实施例2 | 567U/g碳骨架 |
| 实施例3 | 584U/g碳骨架 |
| 实施例4 | 603U/g碳骨架 |
| 对比例 | 324U/g海藻酸钠 |
将实施例1至4以及对比例所得固定化酶反复进行10次和20次的D-半乳糖异构，分别测定第十次以及第二十次异构化的酶活力如表2所示。
表2实施例1至4以及对比例所得固定化酶的酶活力保持情况
| 项目 | 第10次的酶活力 | 第20次的酶活力 |
| 实施例1 | 486U/g碳骨架 | 445U/g碳骨架 |
| 实施例2 | 544U/g碳骨架 | 488U/g碳骨架 |
| 实施例3 | 560U/g碳骨架 | 514U/g碳骨架 |
| 实施例4 | 573U/g碳骨架 | 525U/g碳骨架 |
| 对比例 | 183U/g载体 | 128U/g载体 |
表3实施例1至4以及对比例60min内的D-塔格糖转化率
| 项目 | 第十次的转化率 | 第二十次的转化率 |
| 实施例1 | 23.1％ | 21.8％ |
| 实施例2 | 25.5％ | 24.2％ |
| 实施例3 | 25.1％ | 24.0％ |
| 实施例4 | 25.3％ | 24.2％ |
| 对比例 | 16.2％ | 7.9％ |
从图1可知，3435cm-1处为O-H、N-H的伸缩振动峰，在1633cm-1处有N-H2特征峰，有效表明通过水热反应碳化形成碳骨架的同时保留了壳聚糖中的氨基，方便戊二醛的醛基与载体及酶分子中的氨基反应，将酶交联于载体，利用刚性载体结构的强度和稳定性将酶均匀分散的固定化。
从表1至表3可知，实施例1至4以及对比例所得固定化酶的酶活力在多次使用过程中仍能保持稳定，D-塔格糖的转化率稳定。本发明获得较为完整的空心球状碳骨架载体，固体酶通过球状碳骨架的堆叠形成三维空间的连通，液相分散在连通的球状碳骨架和球状碳骨架之间，D-半乳糖与固化酶接触的可能性显著提升，且由于刚性碳骨架结构稳定，有效提升L-阿拉伯糖异构酶的固定化程度，所得固化酶反复使用异构化效果稳定。在D-半乳糖的异构化为D-塔格糖的过程中，空心球状多孔碳骨架的堆叠形成的孔道连通碳骨架的中空结构形成液相中D-半乳糖扩散传质的连续空间；同时碳骨架的吸附作用促进D-半乳糖富集于L-阿拉伯糖异构酶，从传质动力学的角度有效促进了异构化的进行。
Claims (10)
1.一种生物酶的固定方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、将通过水热反应制得的具有氨基的碳骨架载体置于分散有游离的L-阿拉伯糖异构酶的磷酸缓冲液中，其中碳骨架载体与游离的L-阿拉伯糖异构酶的用量比为1g：(1000U至1200U)；
均匀分散后静置，L-阿拉伯糖异构酶通过碳骨架的吸附性分布在碳骨架载体的表面；
步骤二、将步骤一所得混合体系中加入戊二醛溶液中得酶固化物料，将步骤二所得物料体系置于摇床130rpm至150rpm搅拌6小时至12小时进行固化反应；固化温度为25℃至30℃；
步骤三、过滤分离步骤二所得固体颗粒，使用磷酸缓冲液洗涤后使用去离子水去除固体颗粒表面未结合的酶，得使用碳骨架载体固化的L-阿拉伯糖异构酶。
2.如权利要求1所述的一种生物酶的固定方法，其特征在于：所述碳骨架载体为具有网络结构的壳聚糖经水热碳化制得空心球状的网络结构。
3.如权利要求2所述的一种生物酶的固定方法，其特征在于：所述碳骨架载体的制备方法包括以下步骤：
S1、清洗作为壳聚糖和戊二醛交联模板的微米级二氧化硅微球，将二氧化硅微球置于壳聚糖、戊二醛以及十六烷基三甲基溴化铵水溶液中搅拌均匀；
S2、加热，壳聚糖与戊二醛交联反应于二氧化硅微球表面；
S3、将交联后的固体物质转移至水热釜进行水热反应，交联于二氧化硅表面的壳聚糖-戊二醛碳化形成包覆于二氧化硅微球的碳骨架；
S4、将S3所得二氧化硅颗粒-碳骨架置于氢氧化钾溶液中去除二氧化硅颗粒，得多孔且空心的碳骨架。
4.如权利要求3所述的一种生物酶的固定方法，其特征在于：S1中壳聚糖与戊二醛的质量比为1:(0.2至0.3)；壳聚糖与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1：(0.08至0.15)。
5.如权利要求3所述的一种生物酶的固定方法，其特征在于：所述二氧化硅微球的直径为20微米至100微米。
6.如权利要求3所述的一种生物酶的固定方法，其特征在于：S2中交联反应的工艺条件为：加热40℃至50℃，交联18h至24h。
7.如权利要求3所述的一种生物酶的固定方法及应用，其特征在于：S3中水热反应的温度为180℃至200℃，水热时间为12小时至18小时。
8.如权利要求3所述的一种生物酶的固定方法，其特征在于：用于去除二氧化硅球的氢氧化钾的浓度为6mol/L至10mol/L。
9.一种D-塔格糖的制备方法，其特征在于：
将权利要求1至8任一项所述的固定方法固定的L-阿拉伯糖异构酶置于浓度为50mmol/L的D-半乳糖溶液中，溶液的pH值为7.0至8.0，60℃-75℃水浴恒温反应30min至60min，沸水浴停止反应，离心除去固化的L-阿拉伯糖异构酶；
在D-半乳糖的异构化过程中，空心球状多孔碳骨架的堆叠形成的孔道连通碳骨架的中空结构形成液相中D-半乳糖扩散传质的连续空间；
同时碳骨架的吸附作用促进D-半乳糖富集于L-阿拉伯糖异构酶。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：
固化的L-阿拉伯糖异构酶的碳骨架质量与D-半乳糖溶液的体积比为1g：3m l。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311644212.9A CN117844796A (zh) | 2023-12-04 | 2023-12-04 | 一种生物酶的固定方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311644212.9A CN117844796A (zh) | 2023-12-04 | 2023-12-04 | 一种生物酶的固定方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117844796A true CN117844796A (zh) | 2024-04-09 |
Family
ID=90529557
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311644212.9A Pending CN117844796A (zh) | 2023-12-04 | 2023-12-04 | 一种生物酶的固定方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117844796A (zh) |
-
2023
- 2023-12-04 CN CN202311644212.9A patent/CN117844796A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101113433B (zh) | 一种壳聚糖微球固定化脂肪酶制备工艺 | |
| CN107012138B (zh) | 硅/碳基复合固定化酶环保材料及其制备方法 | |
| CN101285060B (zh) | 壳聚糖-精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法 | |
| CN105950604B (zh) | 一种酶的固定化方法 | |
| CN103525800A (zh) | 一种聚乙烯醇固定化酰化酶的制备方法及其应用 | |
| CN102952792B (zh) | 凹凸棒土负载海藻酸钠固定β-葡萄糖苷酶的制备方法 | |
| CN102505008A (zh) | 一种磁性固定化交联脂肪酶聚集体及其制备方法与应用 | |
| Vorlop et al. | [22] Entrapment of microbial cells in chitosan | |
| CN101721977B (zh) | 载钯螯合树脂及其制备方法 | |
| CN117844796A (zh) | 一种生物酶的固定方法及应用 | |
| CN112980826B (zh) | 一种脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料及其制备方法和应用 | |
| CN100522246C (zh) | 一种壳聚糖微球/微囊及其制备方法 | |
| CN113231049B (zh) | 一种交联琼脂糖亲和介质及其制备方法与应用 | |
| CN117887785A (zh) | 一种刚性载体固定生物酶在d-塔格糖转化中的应用 | |
| CN114317513A (zh) | 一种壳聚糖-羧甲基纤维素固定化酶及其制备方法 | |
| CN112704774A (zh) | 一种填装有固定化l-天冬酰胺酶的血液灌流器及其制备方法和应用 | |
| CN107326021B (zh) | 一种磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂的制备方法 | |
| CN102433317B (zh) | 一种嗜热菌蛋白酶的固定化方法 | |
| CN1149284C (zh) | 以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶及制法 | |
| CN101671664B (zh) | 一种固定化氨基酰化酶的制备方法及其产品和应用 | |
| CN113046233B (zh) | 一种微球-膜集成酶反应器及其制备方法和应用 | |
| CN109852660B (zh) | 头孢羟氨苄制备方法 | |
| JP2595004B2 (ja) | 酵素固定化用担体とその酵素固定化方法および酵素脱着方法 | |
| JP2665791B2 (ja) | α―グルカンの製造法 | |
| CN102174499A (zh) | 一种树脂-酶复合催化剂及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |