JP2775929B2 - レシチンの精製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、医薬品分野、特に注射剤の用途に好適なエ
ンドトキシンフリーのレシチンを得る精製方法に関す
る。

［従来の技術］ レシチンは代表的なリン脂質であり、リポソーム（脂
質２分子膜小包体）を形成するので、薬剤のカプセルと
して用いることができ、しかもこのようなリン脂質２分
子構造は生体膜の主要成分であり、またレシチンは人体
に対する安全性が高いので、近年新しいドラッグ・デリ
バリー・システムの一つとしてレシチンをリポソーム製
剤へ応用する試みが盛んに行われている。

リポソーム製剤の投与方法としては種々の方法があ
り、現在静脈注射投与が主流であるが、静脈注射投与す
る場合、注射剤中にパイロジェン（発熱性物質）が含ま
れていないことが必須である。

パイロジェンとは発熱性を示す高分子性物質であり、
それが哺乳類の血管内に入ると一過性の発熱を引き起こ
し、時には当該動物をショック死させることもある有害
物質である。パイロジェンの中でもグラム陰性菌細胞壁
の外膜成分であるリポ多糖（LPS）を主成分とするエン
ドトキシン（内毒素）は、パイロジェンの中でも特に発
熱性が高く、普遍的に存在しているものである。

このため日本薬局方では発熱性物質の試験項目を設
け、製剤中のパイロジェン量を規制している。従って、
リポソーム製剤の基材として用いられるレシチンは発熱
性物質試験の結果が陰性のものでなければならない。

エンドトキシンの除去方法としては、加熱滅菌処
理、化学的処理、吸着剤処理、膜ろ過処理、蒸
留処理等が知られているが、そのうちの加熱滅菌処理
は、エンドトキシンが熱に対し比較的安定であるため、
250℃で一時間加熱する必要があり、またの化学的処
理も酸、アルカリや過酸化物を使用するため、レシチン
自体をも分解させてしまうので処理することが困難であ
り、の蒸留処理も物理的に極めて困難である。また、
の吸着剤処理としては活性炭、あるいはイオン交換樹
脂を用いることが知られているが、いずれも効果が少な
く、試料成分のロスが大きいという問題があった。さら
に、の膜ろ過処理としては、除菌フィルター（0.2ミ
クロンフィルター）ろ過、あるいは限外ろ過が知られて
いるが、除菌フィルターの効果は少なく、限外ろ過は通
常水溶液で行われるため水に難溶であるレシチンの処理
は困難であるという問題があった。

即ち、既存のエンドトキシンの除去方法は、一般に水
あるいはアミノ酸、糖、抗生物質、ビタミン等の水溶性
物質に対するもので、水に難溶であるレシチンからエン
ドトキシンを除去するための有効な方法はまだ知られて
いなかった。

また、油溶性物質中のエンドトキシンを定量する場
合、通常被検物質を有機溶剤に溶解させ、エンドトキシ
ンフリー水で抽出した水溶液をリムルス試験等で定量す
るが、被検物質がレシチンの場合、レシチンとエンドト
キシンの相溶性によりエンドトキシンフリー水による抽
出が困難なため、正確な定量ができないという問題もあ
った。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明は、これら上記の問題点を解決し、レシチンに
影響を及ぼすことなく、エンドトキシンフリーのレシチ
ンを得ることを目的としている。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは上記の目的を達成するために鋭意検討を
重ねた結果、レシチンをアルコールまたは水／アルコー
ル混合溶液に溶解させた後、エンドトキシンに親和性を
持つヒスチジンをリガンドとして固定化させた固定化ヒ
スチジンと接触させることにより、エンドトキシンを選
択的に吸着除去でき、しかもこの方法によればレシチン
に何等悪影響を及ぼさず、きわめて安全性が高いことを
見いだし本発明に到達した。

本発明において処理するレシチンは、既存の天然系あ
るいは合成系のあらゆるレシチンを用いることができる
が、本発明の目的である医薬品分野へ利用するためには
高純度に精製されたレシチンを用いることが好ましい。
ここで、レシチンの精製法は既存のいかなる精製法であ
っても差し支えない。例えば、溶剤抽出法、アセトン再
沈法、カラムクロマト分離法等のそれぞれ単独の精製方
法でも良いし、それらの数種類を組み合わせた精製方法
でも良い。

本発明において用いられる固定化ヒスチジンは、担体
にスペーサーを介して、エンドトキシンに親和性を持つ
ヒスチジンをリガンドとして固定化させたものが好まし
く、担体としては高分子多糖類、合成高分子担体、無機
担体等を用いることができるが、セルロース、アガロー
スのような高分子多糖類が好適である。このような固定
化ヒスチジンとして市販されている物では、例えばセフ
ァロース（架橋アガロースゲル）にヘキサメチレンジア
ミンをスペーサーとしてヒスチジンを共有結合させたダ
イセル化学工業（株）製「パイロセップ」がある。

本発明においてレシチンを固定化ヒスチジンで処理す
る方法としては、固定化ヒスチジンを充填剤としてカラ
ムに充填した後、レシチン溶液を溶出させるカラムクロ
マトグラフィー法、または吸着剤としてレシチン溶液に
添加し撹拌した後、ろ過して固定化ヒスチジンを除去す
るという方法などを用いることができ、エンドトキシン
はカラム中または溶液中で選択的に吸着され除去され
る。

使用した固定化ヒスチジンは洗浄等の処理により再生
し、繰り返し使用することができる。

本発明において使用するアルコールとしては、メタノ
ール、エタノールおよびイソプロパノールを用いること
ができ、それぞれを単独で用いても良いし混合して用い
ても良い。

本発明において使用する水／アルコール混合溶液の組
成は、処理するレシチンを完全に溶解する組成であれば
いかなる組成であっても良いが、水の割合が多い場合脱
溶剤が困難になるため、水／エタノール＝０〜10/90〜1
00容量％が望ましい。また、水／アルコール混合溶液中
のレシチン濃度は、処理するレシチンを完全に溶解する
濃度であればいかなる組成であっても良いが、作業性を
良くするために５〜20重量％であることが望ましい。

［発明の効果］ 本発明のエンドトキシンフリーのレシチンの製造法
は、レシチンをアルコールまたは水／アルコール混合溶
液に溶解させた後、固定化ヒスチジンと接触させること
によって、効果的にレシチン中のエンドトキシンを吸着
除去する事ができ、安全性が高いので、医薬品分野、特
に注射剤への利用が可能となるため、産業上極めて益す
ること大である。

また、本発明のエンドトキシン除去処理法は、固定化
ヒスチジンをカラムに充填し、レシチンの水／エタノー
ル混合溶液を通過させるという方法、またはレシチンの
水／エタノール混合溶液中に固定化ヒスチジンを添加し
撹拌・ろ過するという、いずれも比較的簡単な方法であ
るため、大量生産が可能となり、また吸着体として用い
られる固定化ヒスチジンは再生により繰り返し使用でき
るので工業的に極めて有用である。

［実施例］ 本発明を実施例および比較例を用いて具体的に説明す
る。

なお、ここに実施例および比較例で使用する器具は、
すべて250℃で２時間以上乾熱滅菌、あるいは0.2モルの
NaOH水溶液（20vol％のエタノールを含む）に12時間以
上浸漬し、エンドトキシンフリーの水（注射用蒸留水）
で洗浄してから使用した。

また、用いた被処理レシチンはいずれもリムルス試験
（使用試薬：生化学工業（株）製パイロディップ）に陽
性であることを確認した後使用した。

また、リムルス試験を行う場合、レシチン中のエンド
トキシンを注射用蒸留水で抽出することが困難なため、
すべて被検レシチンを20mg精秤し注射用蒸留水を1ml加
えた後、50〜60℃にて30分超音波分散させた水懸濁溶液
を検定試料として用いた。

また、すべての処理はクラス100のクリーンベンチに
て行った。

実施例１ 50mlのビーカーに、レシチン純度99.0重量％の精製卵
黄レシチンを2.06g秤取り、次いで水／メタノール＝5/9
5容量％の混合溶液をレシチン濃度が10重量％となるよ
うに加え完全に溶解した。次にこのレシチン溶液を、あ
らかじめ固定化ヒスチジン（ダイセル化学工業（株）製
「パイロセップ」）10mlを充填した内径1cmのオープン
ガラスカラムにて、溶出速度1.0ml/分（SV＝６）で溶出
させた後、水／メタノール＝5/95容量％の混合溶液30ml
を1.0ml/分で溶出させた。溶出液をすべて100mlナスフ
ラスコに回収し、エバポレーターにて脱溶剤し固形分1.
98g（回収率96.1％）を得た。得られた固形分中のレシ
チン純度は99.0重量％であり、リムルス試験（使用試
薬：生化学工業（株）製パイロディップ）で陰性（N.
D.）であった。

実施例２ 50mlのビーカーに、レシチン純度99.1重量％の大豆水
添レシチンを2.12g秤取り、次いで水／エタノール＝5/9
5容量％の混合溶液をレシチン濃度が５重量％となるよ
うに加え完全に溶解した、次にこのレシチン溶液を、あ
らかじめ固定化ヒスチジン（ダイセル化学工業（株）製
「パイロセップ」）10mlを充填した内径1cmのオープン
ガラスカラムにて、溶出速度0.5ml/分（SV＝３）で溶出
させた後、水／エタノール＝5/95容量％の混合溶液30ml
を0.5ml/分で溶出させた。溶出液をすべて100mlナスフ
ラスコに回収し、エバポレーターにて脱溶剤し、固形分
2.05g（回収率96.7％）を得た。得られた固形分中のレ
シチン純度は99.1重量％であり、リムルス試験（使用試
薬：生化学工業（株）製パイロディップ）で陰性（N.
D.）であった。

実施例３ 50mlのビーカーに、レシチン純度99.8重量％の合成DM
PC（ジミリストイルフォスファチジルコリン）を2.10g
秤取り、次いで水／イソプロパノール＝5/95容量％の混
合溶液をレシチン濃度が５重量％となるように加え完全
に溶解した、次にこのレシチン溶液を、あらかじめ固定
化ヒスチジン（ダイセル化学工業（株）製「パイロセッ
プ」）10mlを充填した内径1cmのオープンガラスカラム
にて、溶出速度0.5ml/分（SV＝３）で溶出させた後、水
／イソプロパノール＝5/95容量％の混合溶液30mlを0.5m
l/分で溶出させた。溶出液をすべて100mlナスフラスコ
に回収し、エバポレーターにて脱溶剤し固形分2.05g
（回収率97.6％）を得た。得られた固形分中のレシチン
純度は99.8重量％であり、リムルス試験（使用試薬：生
化学工業（株）製パイロディップ）で陰性（N.D.）であ
った。

実施例４ 100mlのビーカーに、レシチン純度99.6重量％の合成D
PPC（ジパルミトイルフォスファチジルコリン）を10.04
g秤取り、次いで水／エタノール＝0.2/99.8容量％の混
合溶液をレシチン濃度が20重量％となるように加え完全
に溶解した、次にこのレシチン溶液を、あらかじめ固定
化ヒスチジン（ダイセル化学工業（株）製「パイロセッ
プ」）10mlを充填した内径1cmのオープンガラスカラム
にて、溶出速度2.0ml/分（SV＝12）で溶出させた後、水
／エタノール＝0.2/99.8容量％の混合溶液30mlを2.0ml/
分で溶出させた。溶出液をすべて100mlナスフラスコに
回収し、エバポレーターにて脱溶剤し固形分9.87g（回
収率98.3％）を得た。得られた固形分中のレシチン純度
は99.6重量％であり、リムルス試験（使用試薬：生化学
工業（株）製パイロディップ）で陰性（N.D.）であっ
た。

実施例５ 100mlのビーカーに、レシチン純度99.6重量％の合成D
PPC（ジパルミトイルフォスファチジルコリン）を10.11
g秤取り、次いで水／エタノール＝0.2/99.8容量％の混
合溶液をレシチン濃度が20重量％となるように加え完全
に溶解した、次にこのレシチン溶液に、あらかじめパイ
ロセップを水／エタノール＝0.2/99.8容量％の混合溶液
で10mlとなるように湿潤させたものを添加し、25℃で１
時間撹拌した。次にPTFE製0.2ミクロンの除菌フィルタ
ーにて溶出速度2.0ml/分でろ過させた後、水／エタノー
ル＝0.2/99.8容量％の混合溶液30mlを2.0ml/分洗浄ろ過
させた。ろ液をすべて100mlナスフラスコに回収し、エ
バポレーターにて脱溶剤し固形分9.83g（回収率97.2
％）を得た。得られた固形分中のレシチン純度は99.6重
量％であり、リムルス試験（使用試薬：生化学工業
（株）製パイロディップ）で陰性（N.D.）であった。

比較例１ 50mlのビーカーに、レシチン純度99.6重量％の合成DP
PC（ジパルミトイルフォスファチジルコリン）を10.09g
秤取り、次いで水／エタノール＝0.2/99.8容量％の混合
溶液をレシチン濃度が20重量％となるように加え完全に
溶解した。次にこのレシチン溶液を、PTFE製0.2ミクロ
ンの除菌フィルターにて、溶出速度2.0ml/分でろ過させ
た後、水／エタノール＝0.2/99.8容量％の混合溶液30ml
を2.0ml/分洗浄ろ過させた。ろ液をすべて100mlナスフ
ラスコに回収し、エバポレーターにて脱溶剤し固形分9.
91g（回収率98.2％）を得た。得られた固形分中のレシ
チン純度は99.6重量％であったが、リムルス試験（使用
試薬：生化学工業（株）製バイロディップ）で陽性であ
った。

これらの各実施例および比較例の結果から明らかなよ
うに、固定化ヒスチジンで処理する本発明方法によりレ
シチンを精製した場合、レシチンに悪影響を及ぼすこと
なく、効率よくエンドトキシンを除去できるのに対し、
固定化ヒスチジンによる処理を行なわず、除菌フィルタ
ーでろ過しただけでは、効率よくエンドトキシンを除去
することができないことがわかる。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】レシチンをアルコールまたは水／アルコー
   ル混合溶液に溶解し、固定化ヒスチジンで処理すること
   を特徴とするレシチンの精製方法。