CN110161231A - 实时灵敏生物大分子检测方法及试剂盒制备 - Google Patents

实时灵敏生物大分子检测方法及试剂盒制备 Download PDF

Info

Publication number
CN110161231A
CN110161231A CN201910133887.4A CN201910133887A CN110161231A CN 110161231 A CN110161231 A CN 110161231A CN 201910133887 A CN201910133887 A CN 201910133887A CN 110161231 A CN110161231 A CN 110161231A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nanoparticle
reaction
solution
gold
citric acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910133887.4A
Other languages
English (en)
Inventor
冷毅斌
吴娟
寇小娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Bafield Biotechnology Service Co Ltd
Original Assignee
Wuhan Bafield Biotechnology Service Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Bafield Biotechnology Service Co Ltd filed Critical Wuhan Bafield Biotechnology Service Co Ltd
Priority to CN201910133887.4A priority Critical patent/CN110161231A/zh
Publication of CN110161231A publication Critical patent/CN110161231A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明提供一种实时灵敏生物大分子检测方法及试剂盒制备，利用柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子，得到表面为柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子；氨基修饰的Fe3O4纳米微粒2g于室温下180r/min搅拌中迅速加入20mL所制备的金纳米粒子溶液中，混合溶液由棕色逐渐变淡，低速搅拌反应12h后，获得金磁微粒Fe3O4@Au，并制备纳米生物传感器；减少了常用生物大分子测定研究中抗体抗原之间的结合的时间，明显缩短了反应过程，提高反应的效率，有效提高了信噪比，实现了实时灵敏快速检测。

Description

实时灵敏生物大分子检测方法及试剂盒制备
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种实时灵敏生物大分子检测方法及试剂盒制备。
背景技术
免疫印迹(Immunoblot)又称蛋白质印迹(Westernblot)，是分离和识别复杂样品中特定蛋白的常用技术，分辨率和实用性能高，特异性强，灵敏度高，应用于蛋白的定性和半定量分析等。但该技术步骤繁琐，耗时长，有机荧光发色团荧光稳定性低，难以长时间成像。不同的发色团需要不同波长的光源激发，使成像复杂化，且不能同时检测多种蛋白。
中国专利申请(公开日：2006年6月21日，CN1789425A)，公开了一种可调控分子马达微动力生物传感器，其包含以下部分：(1)旋转马达：F0F1-ATP酶；(2)光能转换装置：光反应中心与复合物(RC)和泛醌；(3)电子转换装置：与光能转换装置为同一体系；(4)信号分子输出装置：由光激发与发射装置和荧光探针组成；(5)能源系统：由水，ATP，ADP，无机磷，和可见光组成；(6)保护层：双层脂膜作位内膜的保护层；(7)支架材料和双层脂膜的固定材料。该专利公开了荧光探针可以是位于膜外侧的Lipids-荧光素，位于膜内侧的荧光素，分子马达旋转是由ATP水解驱动的，其中所述分子马达旋转是由能转换的跨膜电化学电位差驱动的，或者所述跨膜电化学电位差是由光能或化学能转换的。在该生物传感器中，负载是连接在生物传感器的分子马达的三个β亚基上。
荧光分析法是生命科学研究中十分重要的方法之一,其检测灵敏度很大程度上取决于标记物的发光强度和光化学稳定性。荧光标记的灵敏度很高,选择性好,是目前最常用“标记”手段。然而,目前使用的有机荧光染料由于其不可克服的荧光性能缺陷:激发光谱窄,发射光谱宽且拖尾,易光致漂白及化学稳定性不强、寿命短等,极大地限制了其应用。
发明内容
本发明提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的一种实时灵敏生物大分子检测方法及试剂盒制备，减少了常用生物大分子测定研究中抗体抗原之间的结合的时间，明显缩短了反应过程，提高反应的效率，有效提高了信噪比，实现了实时灵敏快速检测。
根据本发明实施例的第一个方面，提供一种纳米生物传感器制备方法，包括：
将10g新鲜橘子皮粉碎并浸泡于100mL的去离子水中，再将浸泡液于3600r/min条件下，离心3min，取上清液，此上清液即为原液，冰箱4℃条件下保存；室温条件下，将提前4℃预冷的20mL氯金酸溶液(1％，W/V)置于反应皿中，伴随磁力搅拌器温和搅动；2min后，迅速加入橘皮浸泡工作液5mL，工作液为20％原液，随即观察颜色的变化，即由黄色变为紫色再变为酒红色，当体系颜色出现酒红色时，搅拌速度提升，10min后结束反应，获得金纳米粒子，将反应液置于冰箱4℃条件下保存；利用柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子，得到表面为柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子；
取2g合成的Fe3O4纳米微粒超声分散在50mL含有20％乙醇水溶液中，逐滴加入1mLAPTES，室温下搅拌7h反应结束后得到浅棕色带细微颗粒的悬浊液，产物即为氨基化修饰后的Fe3O4纳米微粒；此产物用0.1mol/L的HCl－乙醇溶液磁分离清洗3次，烘干后备用；取上述制备的氨基修饰的Fe3O4纳米微粒2g于室温下180r/min搅拌中迅速加入20mL所制备的金纳米粒子溶液中，混合溶液由棕色逐渐变淡，低速搅拌反应12h后，获得金磁微粒Fe3O4@Au；
取金磁微粒，用偶联缓冲液平衡3次，将生物分子按20～500μg/mg金磁微粒的比例加入经平衡处理的金磁微粒中，置于20～40℃、180r/min的空气恒温振荡器中充分反应16h；
反应完毕，在磁性分离器上分离2～3min，弃上清，用清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分子；封闭：加入500μL～2mL的封闭剂到表面已固定生物分子的金磁微粒中，置于20～40℃、180r/min的空气恒温振荡器中充分混匀20min～12h进行封闭，得到纳米生物传感器。
可选的，利用柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子，得到表面为柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子，具体包括：
将以共沉淀合成方法制备得到的Fe3O4纳米粒子水相悬浮液加入反应器中，搅拌并通氮气后，加入柠檬酸水溶液，并在60℃的温度下反应；反应后冷却至室温，磁性分离，洗涤后，重新分散在超纯水中，作为磁性纳米粒子储备液。
可选的，柠檬酸溶液的浓度为0.05g/ml～0.15g/ml，Fe3O4纳米粒子浓度为0.006g/ml～0.02g/ml；Fe3O4纳米粒子与柠檬酸溶液的体积比为15:1～10:1；反应温度在65～75℃之间，反应保持10～15min。
根据本发明实施例的第二个方面，提供一种如本发明实施例第一方面所述方法制备的纳米生物传感器。
根据本发明实施例的第三个方面，提供一种试剂盒，包括如本发明实施例第二方面所述的纳米生物传感器。
根据本发明实施例的第四个方面，提供一种实时灵敏生物大分子检测方法，包括：
将固定好生物分子且已封闭的金磁微粒和待测溶液加入到偶联缓冲液中，置于20～40℃、180r/min的空气恒温振荡器中充分反应10min～12h；反应完毕，在磁性分离器上分离2～3min，用清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分子，并将金磁微粒复合物保存在保存缓冲液中；根据反应结果确定待测溶液是否含有待检测的目标分子。
本发明提出一种实时灵敏生物大分子检测方法及试剂盒制备，减少了常用生物大分子测定研究中抗体抗原之间的结合的时间，明显缩短了反应过程，提高反应的效率，有效提高了信噪比，实现了实时灵敏快速检测。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
一种纳米生物传感器制备方法，其特征在于，包括：
将10g新鲜橘子皮粉碎并浸泡于100mL的去离子水中，再将浸泡液于3600r/min条件下，离心3min，取上清液，此上清液即为原液，冰箱4℃条件下保存；室温条件下，将提前4℃预冷的20mL氯金酸溶液(1％，W/V)置于反应皿中，伴随磁力搅拌器温和搅动；2min后，迅速加入橘皮浸泡工作液5mL，工作液为20％原液，随即观察颜色的变化，即由黄色变为紫色再变为酒红色，当体系颜色出现酒红色时，搅拌速度提升，10min后结束反应，获得金纳米粒子，将反应液置于冰箱4℃条件下保存；利用柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子，得到表面为柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子；
取2g合成的Fe3O4纳米微粒超声分散在50mL含有20％乙醇水溶液中，逐滴加入1mLAPTES，室温下搅拌7h反应结束后得到浅棕色带细微颗粒的悬浊液，产物即为氨基化修饰后的Fe3O4纳米微粒；此产物用0.1mol/L的HCl－乙醇溶液磁分离清洗3次，烘干后备用；取上述制备的氨基修饰的Fe3O4纳米微粒2g于室温下180r/min搅拌中迅速加入20mL所制备的金纳米粒子溶液中，混合溶液由棕色逐渐变淡，低速搅拌反应12h后，获得金磁微粒Fe3O4@Au；
取金磁微粒，用偶联缓冲液平衡3次，将生物分子按20～500μg/mg金磁微粒的比例加入经平衡处理的金磁微粒中，置于20～40℃、180r/min的空气恒温振荡器中充分反应16h；
反应完毕，在磁性分离器上分离2～3min，弃上清，用清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分子；封闭：加入500μL～2mL的封闭剂到表面已固定生物分子的金磁微粒中，置于20～40℃、180r/min的空气恒温振荡器中充分混匀20min～12h进行封闭，得到纳米生物传感器。
可选的，利用柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子，得到表面为柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子，具体包括：
将以共沉淀合成方法制备得到的Fe3O4纳米粒子水相悬浮液加入反应器中，搅拌并通氮气后，加入柠檬酸水溶液，并在60℃的温度下反应；反应后冷却至室温，磁性分离，洗涤后，重新分散在超纯水中，作为磁性纳米粒子储备液。
可选的，柠檬酸溶液的浓度为0.05g/ml～0.15g/ml，Fe3O4纳米粒子浓度为0.006g/ml～0.02g/ml；Fe3O4纳米粒子与柠檬酸溶液的体积比为15:1～10:1；反应温度在65～75℃之间，反应保持10～15min。
一种根据本发明上述实施例所述方法制备的纳米生物传感器。
一种试剂盒，包括如上述各实施例所述的纳米生物传感器。
一种实时灵敏生物大分子检测方法，包括：
将固定好生物分子且已封闭的金磁微粒和待测溶液加入到偶联缓冲液中，置于20～40℃、180r/min的空气恒温振荡器中充分反应10min～12h；反应完毕，在磁性分离器上分离2～3min，用清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分子，并将金磁微粒复合物保存在保存缓冲液中；根据反应结果确定待测溶液是否含有待检测的目标分子。
综上所述，本发明提出一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用，能够以胞外分泌的方式大量生产外源目的蛋白，且易于纯化、操作简便，具有较高的推广和应用价值。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的实施例的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明的实施例进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明的实施例各实施例技术方案的范围。

Claims (6)

1.一种纳米生物传感器制备方法，其特征在于，包括：
将10g新鲜橘子皮粉碎并浸泡于100mL的去离子水中，再将浸泡液于3600r/min条件下，离心3min，取上清液，此上清液即为原液，冰箱4℃条件下保存；室温条件下，将提前4℃预冷的20mL氯金酸溶液(1％，W/V)置于反应皿中，伴随磁力搅拌器温和搅动；2min后，迅速加入橘皮浸泡工作液5mL，工作液为20％原液，随即观察颜色的变化，即由黄色变为紫色再变为酒红色，当体系颜色出现酒红色时，搅拌速度提升，10min后结束反应，获得金纳米粒子，将反应液置于冰箱4℃条件下保存；利用柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子，得到表面为柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子；
取2g合成的Fe3O4纳米微粒超声分散在50mL含有20％乙醇水溶液中，逐滴加入1mLAPTES，室温下搅拌7h反应结束后得到浅棕色带细微颗粒的悬浊液，产物即为氨基化修饰后的Fe3O4纳米微粒；此产物用0.1mol/L的HCl－乙醇溶液磁分离清洗3次，烘干后备用；取上述制备的氨基修饰的Fe3O4纳米微粒2g于室温下180r/min搅拌中迅速加入20mL所制备的金纳米粒子溶液中，混合溶液由棕色逐渐变淡，低速搅拌反应12h后，获得金磁微粒Fe3O4@Au；
取金磁微粒，用偶联缓冲液平衡3次，将生物分子按20～500μg/mg金磁微粒的比例加入经平衡处理的金磁微粒中，置于20～40℃、180r/min的空气恒温振荡器中充分反应16h；
反应完毕，在磁性分离器上分离2～3min，弃上清，用清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分子；封闭：加入500μL～2mL的封闭剂到表面已固定生物分子的金磁微粒中，置于20～40℃、180r/min的空气恒温振荡器中充分混匀20min～12h进行封闭，得到纳米生物传感器。
2.根据权利要求1所述的纳米生物传感器制备方法，其特征在于，利用柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子，得到表面为柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒子，具体包括：
将以共沉淀合成方法制备得到的Fe3O4纳米粒子水相悬浮液加入反应器中，搅拌并通氮气后，加入柠檬酸水溶液，并在60℃的温度下反应；反应后冷却至室温，磁性分离，洗涤后，重新分散在超纯水中，作为磁性纳米粒子储备液。
3.根据权利要求2所述的纳米生物传感器制备方法，其特征在于，柠檬酸溶液的浓度为0.05g/ml～0.15g/ml，Fe3O4纳米粒子浓度为0.006g/ml～0.02g/ml；Fe3O4纳米粒子与柠檬酸溶液的体积比为15:1～10:1；反应温度在65～75℃之间，反应保持10～15min。
4.一种根据权利要求1至3任一所述方法制备的纳米生物传感器。
5.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求4所述的纳米生物传感器。
6.一种实时灵敏生物大分子检测方法，其特征在于，包括：
将固定好生物分子且已封闭的金磁微粒和待测溶液加入到偶联缓冲液中，置于20～40℃、180r/min的空气恒温振荡器中充分反应10min～12h；反应完毕，在磁性分离器上分离2～3min，用清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分子，并将金磁微粒复合物保存在保存缓冲液中；根据反应结果确定待测溶液是否含有待检测的目标分子。
CN201910133887.4A 2019-02-22 2019-02-22 实时灵敏生物大分子检测方法及试剂盒制备 Pending CN110161231A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910133887.4A CN110161231A (zh) 2019-02-22 2019-02-22 实时灵敏生物大分子检测方法及试剂盒制备

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910133887.4A CN110161231A (zh) 2019-02-22 2019-02-22 实时灵敏生物大分子检测方法及试剂盒制备

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110161231A true CN110161231A (zh) 2019-08-23

Family

ID=67645386

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910133887.4A Pending CN110161231A (zh) 2019-02-22 2019-02-22 实时灵敏生物大分子检测方法及试剂盒制备

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110161231A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101165487A (zh) * 2006-10-19 2008-04-23 陕西西大北美基因股份有限公司 利用纳米金磁微粒进行生物分子检测的方法
CN103128307A (zh) * 2013-02-05 2013-06-05 西安金磁纳米生物技术有限公司 一种金磁微粒的制备方法
CN105424688A (zh) * 2015-11-13 2016-03-23 哈尔滨商业大学 一种金纳米粒子探针比色法检测久效磷残留的方法
KR101747282B1 (ko) * 2016-03-28 2017-06-14 부산대학교 산학협력단 에너제틱 자성 복합체, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 폭발체

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101165487A (zh) * 2006-10-19 2008-04-23 陕西西大北美基因股份有限公司 利用纳米金磁微粒进行生物分子检测的方法
CN103128307A (zh) * 2013-02-05 2013-06-05 西安金磁纳米生物技术有限公司 一种金磁微粒的制备方法
CN105424688A (zh) * 2015-11-13 2016-03-23 哈尔滨商业大学 一种金纳米粒子探针比色法检测久效磷残留的方法
KR101747282B1 (ko) * 2016-03-28 2017-06-14 부산대학교 산학협력단 에너제틱 자성 복합체, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 폭발체

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
韩博林等: "金磁微粒的制备及其固定牛血清蛋白的研究", 《哈尔滨商业大学学报(自然科学版)》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wu et al. Bioconjugated persistent luminescence nanoparticles for Föster resonance energy transfer immunoassay of prostate specific antigen in serum and cell extracts without in situ excitation
CN101545007B (zh) 一种纳米金生物复合探针、检测方法及其应用
CN105259158B (zh) 一种表面增强拉曼散射免疫层析试纸条及制备方法与应用
Peng et al. Highly luminescent green-emitting Au nanocluster-based multiplex lateral flow immunoassay for ultrasensitive detection of clenbuterol and ractopamine
CN106680496B (zh) 一种比色荧光双信号纳米球的制备及其在免疫层析定量检测中的应用
CN108080042A (zh) 结合时间分辨荧光技术的微流控芯片及其制备方法和应用
CN103197074A (zh) 基于近红外荧光纳米微球标记物的免疫层析定量检测试剂
US20140170674A1 (en) Membraine-Based Assay Devices Utilizing Time-Resolved Up-Converting Luminescence
Wang et al. Fluorescence for the determination of protein with functionalized nano-ZnS
CN111334282B (zh) Pth稀土检测试剂盒及检测卡及其微球及制备与检测方法
CN110596060B (zh) 一种检测前列腺特异性抗原的光谱分析中荧光传感器的构建方法及其应用
WO2005101015A1 (ja) 無細胞タンパク質合成系で作られた蛍光を利用した効率的なタンパク質の機能解析スクリーニングの方法
KR101701885B1 (ko) 업컨버팅 나노입자 및 특이적 리셉터를 포함하는 당뇨병 진단용 복합체
CN112362867A (zh) 一种使用聚集诱导发光联合免疫磁珠的检测方法及其试剂盒
CN110220957A (zh) 基于NiFe2O4纳米管的异鲁米诺全功能探针的双模式电致化学发光-温度免疫传感器
CN103940798A (zh) 一种实体荧光纳米微球及其制备方法和应用
Wang et al. Preparation and application of functionalized nanoparticles of CdS as a fluorescence probe
CN107238709A (zh) 基于荧光共振能量转移的afp检测法
CN101988898A (zh) 量子点编码微球的液相芯片
Xiao et al. Integration of a 3D-printed read-out platform with a quantum dot-based immunoassay for detection of the avian influenza A (H7N9) virus
BR112020002241B1 (pt) Método para detecção ultrassensível usando partículas fotoluminescentes
CN108828231A (zh) 一种心肺功能标志物磁微粒微流控生物芯片、检测方法
CN105424662A (zh) 荧光生物检测系统
Yasuda et al. Rapid construction of fluorescence quenching-based immunosensor Q-bodies using α-helical coiled-coil peptides
CN108845146A (zh) 一种用于心肌五项标志物检测的生物芯片、检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190823

RJ01 Rejection of invention patent application after publication