CN105424688A - 一种金纳米粒子探针比色法检测久效磷残留的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金纳米粒子探针比色法检测久效磷残留的方法，由制备金纳米粒子、测定金钠米粒子溶胶的紫外吸收光谱、比色探针法检测久效磷的残留、抗干扰等研究步骤组成。本发明利用金纳米粒子的等离子共振吸收光学性质及久效磷农药能使乙酰胆碱酯酶的活性受到抑制而无法催化底物碘化硫代乙酰胆碱（ATChI）的水解反应，随之，底物会与金纳米粒子结合进而提高了金纳米粒子的聚集程度。农药浓度的不同，使得乙酰胆碱酯酶受抑制的程度不同，最终体系的颜色也就不同，根据此原理构建以金纳米粒子比色探针为依托的农药残留快速检测体系，本检测体系对食品中常见的物质具有较高的选择性，利用橘皮为原料制备的金纳米粒子绿色环保，降低成本。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种金纳米粒子探针比色法检测久效磷残留的方法。
背景技术
农药残留严重威胁着人类的生存环境和生命安全。因此，农药残留检测技术的开发一直是研究的热点。农药残留中以有机磷类农药污染最为严重，基于有机磷农药对乙酰胆碱酯酶（AChE）的抑制作用而发展的乙酰胆碱酯酶生物传感器已被广泛用于有机磷类农药的检测。但是此类方法往往存在着酶稳定性差，操作繁琐费时且成本较高的缺陷。将功能化的纳米材料引入食品质量安全检测的相关领域是目前研究的热点。金纳米粒子由于具有优良的光学性能而被用作比色探针，其溶液颜色与粒径及颗粒间距有关。当颗粒间距明显小于粒径，金纳米颗粒就容易发生团聚，宏观上溶液颜色由红色变为紫色或蓝色，利用这一性质，在控制金纳米粒子粒径的同时，结合各种表面改性方法就可以设计出多种多样的金纳米比色探针。基于乙酰胆碱酯酶活性抑制原理，以农药久效磷为模型，创新性的采用金纳米粒子作为比色探针，检测有机磷农药的残留，旨在构建出一套快速高效的农药残留检测新方法。
目前，随着纳米技术发展，人们更加注重为实现以最高限度利用纳米技术的优势和最低限度降低其对人类和环境破坏，追求绿色纳米科技为目标。本发明制备的金纳米粒子方法绿色环保，采用橘皮为制备原料，既是废物利用，又可降低生产成本，原料充足易获得。在离子溶液中制备纳米材料是一种常用方法，虽然部分有机溶剂作为还原剂或稳定剂在反应中被消耗，但其中仍有一些被浪费，这样就污染环境，很难达到零排放的目的。本方法采用水作为溶剂制备金纳米粒子，对环境和人类无毒无害。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述检测的缺点，构建出一套快速高效的久效磷残留的检测新方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
（1）制备金钠米粒子
将新鲜柑橘成熟果实的外皮烘干后粉碎，过40目筛，浸泡于去离子水中，橘子皮与去离子水质量比为1:10，浸泡1-2小时，再将浸泡液于4000rpm条件下，离心3分钟，取上清液，此上清液作为浸泡液母液。采用去离子水将浸泡液母液稀释1倍获得所需工作液，冰箱4℃条件下保存。
室温条件下，将4℃、浓度为1g/mL的氯金酸溶液置于反应皿中，伴随磁力搅拌器温和搅动100-150rpm；2分钟后，迅速将上述工作液加入氯金酸溶液中，氯金酸溶液与工作液的体积比为3:1-6:1即观察颜色的变化，即由黄色变为紫色再变为浅酒红色，当体系颜色出现酒红色时，搅拌速度提升到300-350rpm，10分钟后结束反应，获得金纳米粒子溶液，金纳米粒子溶液颜色为浅酒红色，置于冰箱4℃保存备用。
（2）测定金钠米粒子的紫外吸收光谱
吸取步骤（1）所制备的金纳米粒子溶液，加入到比色皿中，再加入去离子水，金纳米粒子溶液与蒸馏水体积比为1:2，混合均匀后，置于紫外-可见光分光光度计中测定吸光度，测得结果金纳米粒子吸收峰在520-550nm。
（3）比色探针法检测久效磷残留
底物的预处理：
首先选择碘化硫代乙酰胆碱（ATChI）作为反应底物，采用去离子水配置10mM的ATChI溶液100mL。向5ml的ATChI溶液中加入18mg硝酸银粉末，充分振荡10秒钟，竖直静置1分钟后离心去沉淀，取上清液。再向上清液中加入1mg氯化钠，充分振荡10秒钟，竖直静置1分钟后离心去沉淀，取上清液。此时上清液为含有ATCh+溶液。
②金纳米粒子比色法的建立：
分别向离心管中加入无菌水，久效磷工作液和乙酰胆碱酯酶缓冲液后等待10分钟，再加入ATCh+溶液，等待10分钟后，加入金纳米粒子溶液，记录颜色变化，伴随着久效磷浓度的提高，颜色逐渐由浅酒红色转变至紫色再变为深蓝色。
在本发明在检测久效磷残留的步骤中，用无菌水配制的久效磷工作液浓度为0.01mg/mL；用浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液配制浓度为2U/mL的乙酰胆碱酯酶缓冲液；0.1mol/L磷酸缓冲液的配制：100mL的磷酸缓冲液需0.1mol/LK2HPO4水溶液80.2mL和0.1mol/LKH2PO4的水溶液19.8mL。
金纳米粒子比色法的建立：无菌水、久效磷工作液、乙酰胆碱酯酶缓冲液、ATCh+溶液、金纳米粒子溶液的体积比为5：10：1：1：4。
制备后金纳米粒子在6天内具备稳定性，能够正常使用。
金纳米粒子探针比色法检测久效磷最低浓度为0.00005mg/mL。
乙酰胆碱酯酶能够特异性的催化底物碘化硫代乙酰胆碱（ATChI）水解为硫代乙酰胆碱与醋酸。当体系中特异性的去掉碘离子之后（碘离子能够与久效磷结合干扰检测体系），底物表面丰富的正电荷能够引起表面带有负电荷的金纳米粒子的聚集，出现等离子体共振现象，从而引起整个体系颜色的变化。然而，当体系中存在有久效磷的时候，乙酰胆碱酯酶的活性受到抑制而无法催化底物的水解反应，随之，底物会与金纳米粒子结合进入提高了金纳米粒子的聚集程度。久效磷浓度的不同，使得乙酰胆碱酯酶受抑制的程度不同，最终体系的颜色也就不同，根据此原理构建以金纳米粒子比色探针为依托的久效磷残留快速检测体系。
有益效果
本发明制备金纳米粒子方法绿色环保，采用橘皮为制备原料，既是废物利用，又可降低生产成本，原料充足易获得。本发明检测久效磷残留方法稳定、灵敏度高、选择性好。
附图说明
图1是采用实施例1检测不同浓度久效磷的直观图。
图2是采用实施例1检测不同浓度久效磷的紫外吸收变化线性曲线图。
图3是用透射电子显微镜表征不同浓度久效磷比色检测的体系中金纳米粒子的聚集程度。
图4是金纳米粒子检测久效磷的选择性研究。
图5是金纳米粒子的稳定性研究。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
本实施的金纳米粒子探针比色法检测久效磷残留的方法由下述步骤组成：
1.制备金钠米粒子
将100g新鲜柑橘成熟果实的外皮烘干后粉碎，过40目筛，浸泡于去离子水中，橘子皮与去离子水质量比为1：10，浸泡1小时，再将浸泡液于4000rpm条件下，离心3分钟，取上清液，此上清液作为浸泡液母液。采用去离子水将浸泡液母液稀释1倍获得所需工作液，冰箱4℃条件下保存。
室温条件下，将4℃、浓度为1g/mL的氯金酸溶液置于反应皿中，伴随磁力搅拌器温和搅动100rpm；2分钟后，迅速将上述工作液加入氯金酸溶液中，氯金酸溶液与工作液的体积比为4:1，随即观察颜色的变化，即由黄色变为紫色再变为浅酒红色，当体系颜色出现酒红色时，搅拌速度提升到300rpm，10分钟后结束反应，获得金纳米粒子溶液，金纳米粒子溶液颜色为浅酒红色，置于冰箱4℃保存备用。
2.测定金钠米粒子的紫外吸收光谱
吸取步骤（1）所制备的金纳米粒子溶液，加入到比色皿中，再加入去离子水，金纳米粒子溶液与蒸馏水体积比为1:2，混合均匀后，置于紫外-可见光分光光度计中测定吸光度，测得结果金纳米粒子吸收峰在530nm。
3.比色探针法检测久效磷残留
底物的预处理：
首先选择碘化硫代乙酰胆碱（ATChI）作为反应底物，采用去离子水配置10mM的ATChI溶液100mL。向5ml的ATChI溶液中加入18mg硝酸银粉末，充分振荡10秒钟，竖直静置1分钟后离心去沉淀，取上清液。再向上清液中加入1mg氯化钠，充分振荡10秒钟，竖直静置1分钟后离心去沉淀，取上清液。此时上清液为含有ATCh+的溶液。
金纳米粒子比色法的建立：
用无菌水配制的久效磷工作液浓度为0.01mg/mL，用浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液配制浓度为2U/mL的乙酰胆碱酯酶缓冲液；0.1mol/L磷酸缓冲液的配制：100mL的磷酸缓冲液需0.1mol/LK2HPO4水溶液80.2mL和0.1mol/LKH2PO4的水溶液19.8mL。
向离心管中分别加入2.5mL的无菌水，5mL无菌水（空白对照）及5ml不同浓度的久效磷溶液（0.00001、0.00005、0.0001、0.00025、0.0005、0.001、0.0025、0.005和0.01mg/mL）和0.5mL乙酰胆碱酯酶缓冲液（2U/mL）充分反应10分钟后，再加入0.5mLATCh+溶液，待10分钟后，加入2mL金纳米粒子溶液，后记录各个浓度反应液颜色变化。采用紫外-可见光分光光度计扫描不同比色体系的吸收光谱的变化。
从左至右依次为：含久效磷浓度0.01、0.005、0.0025、0.001、0.0005、0.00025、0.0001、0.00005、0.00001mg/mL.、空白对照（5ml无菌水）。
由图1可知，伴随着农药浓度的提高，颜色逐渐由酒红色转变至紫色再变为深蓝色，说明体系中乙酰胆碱酯酶的活性逐渐受到抑制，底物的含量逐渐增高造成了金纳米粒子的粒径逐渐增大，出现不同程度的聚集。在久效磷农药浓度为0.01mg/mL的比色体系中，金纳米粒子甚至出现了沉淀。在久效磷农药浓度为0.00001mg/mL的比色体系中，整体颜色与对照几乎没有差异。当久效磷农药浓度为0.00005mg/mL时，体系颜色开始出现淡紫色，呈现出鲜明的比色结果。
采用紫外-可见光吸收光谱表征不同浓度久效磷的比色检测结果，进一步论证金纳米粒子粒径的变化过程。由图2可知，紫外-可见光吸收光谱基本呈现出与直观比色相似的结果。当久效磷的浓度逐渐增加时，波长530nm处金纳米粒子特征峰的峰值开始下降；与此同时，在波长650-780nm的范围内出现新的吸收峰。结果说明，不同浓度的久效磷可以引起不同程度的金纳米粒子的聚集，形成不同粒径大小的金纳米粒子，进而造成金纳米粒子特征吸收峰的波长不同。其中，在久效磷农药浓度为0.00001mg/mL的体系的吸收峰的峰值相比于对照的峰值出现明显的下降，但是在比色体系中颜色变化并不明显。
采用透射电子显微镜进一步表征不同浓度久效磷比色检测的体系（挑选三个体系，分别含久效磷浓度为0.00001、0.001和0.01mg/mL）中金纳米粒子的聚集过程，结果见图3可知，A：含久效磷浓度0.00001mg/mL；B：含久效磷浓度0.001mg/mL；C含久效磷浓度0.01mg/mL；D：空白对照，选择含有不同浓度久效磷的三个比色体系参与形貌表征，金纳米粒子的聚集程度呈现出明显的差别。当体系中含有0.00001mg/mL的久效磷时，金纳米粒子相比于没有添加久效磷（空白对照）的体系彼此间距离缩小，但是没能引起明显的聚集。当体系中含有0.001mg/mL的久效磷时，表面带有负电荷的金纳米粒子被表面带有正电荷的底物ATCh+吸引在一起，进而呈现出了聚集现象。而当体系中含有0.01mg/mL的久效磷时，金纳米粒子的聚集情况加剧，甚至出现了板结成块儿的现象，形成大粒径颗粒，出现沉淀。此结果与之前比色反应和紫外-可见光吸收光谱的结果基本对应。
实施例2
本实施的金纳米粒子探针比色法检测久效磷残留的方法由下述步骤组成：
1.制备金钠米粒子
将100g新鲜柑橘成熟果实的外皮烘干后粉碎，过40目筛，浸泡于去离子水中，橘子皮与去离子水质量比为1：10，浸泡1.5小时，再将浸泡液于4000rpm条件下，离心3分钟，取上清液，此上清液作为浸泡液母液。采用去离子水将浸泡液母液稀释1倍获得所需工作液，冰箱4℃条件下保存。
室温条件下，将4℃、浓度为1g/mL的氯金酸溶液置于反应皿中，伴随磁力搅拌器温和搅动125rpm；2分钟后，迅速将上述工作液加入氯金酸溶液中，氯金酸溶液与工作液的体积比为3:1，随即观察颜色的变化，即由黄色变为紫色再变为浅酒红色，当体系颜色出现酒红色时，搅拌速度提升到325rpm，10分钟后结束反应，获得金纳米粒子溶液，金纳米粒子溶液颜色为浅酒红色，置于冰箱4℃保存备用。
2.测定金钠米粒子的紫外吸收光谱
吸取步骤（1）所制备的金纳米粒子溶液，加入到比色皿中，再加入去离子水，金纳米粒子溶液与蒸馏水体积比为1:2，混合均匀后，置于紫外-可见光分光光度计中测定吸光度，测得结果金纳米粒子吸收峰在520nm。其它步骤与实施例1相同。
实施例3
本实施的金纳米粒子探针比色法检测久效磷残留的方法由下述步骤组成：
1.制备金钠米粒子
将100g新鲜柑橘成熟果实的外皮烘干后粉碎，过40目筛，浸泡于去离子水中，橘子皮与去离子水质量比为1：10，浸泡2小时，再将浸泡液于4000rpm条件下，离心3分钟，取上清液，此上清液作为浸泡液母液。采用去离子水将浸泡液母液稀释1倍获得所需工作液，冰箱4℃条件下保存。
室温条件下，将4℃、浓度为1g/mL的氯金酸溶液置于反应皿中，伴随磁力搅拌器温和搅动150rpm；2分钟后，迅速将上述工作液加入氯金酸溶液中，氯金酸溶液与工作液的体积比为5:1，随即观察颜色的变化，即由黄色变为紫色再变为浅酒红色，当体系颜色出现酒红色时，搅拌速度提升到350rpm，10分钟后结束反应，获得金纳米粒子溶液，金纳米粒子溶液颜色为浅酒红色，置于冰箱4℃保存备用。
2.测定金钠米粒子的紫外吸收光谱
吸取步骤（1）所制备的金纳米粒子溶液，加入到比色皿中，再加入去离子水，金纳米粒子溶液与蒸馏水体积比为1:2，混合均匀后，置于紫外-可见光分光光度计中测定吸光度，测得结果金纳米粒子吸收峰在540nm。其它步骤与实施例1相同。
实施例4
本实施的金纳米粒子探针比色法检测久效磷残留的方法由下述步骤组成：
1.制备金钠米粒子
将100g新鲜柑橘成熟果实的外皮烘干后粉碎，过40目筛，浸泡于去离子水中，橘子皮与去离子水质量比为1：10，浸泡1.4小时，再将浸泡液于4000rpm条件下，离心3分钟，取上清液，此上清液作为浸泡液母液。采用去离子水将浸泡液母液稀释1倍获得所需工作液，冰箱4℃条件下保存。
室温条件下，将4℃、浓度为1g/mL的氯金酸溶液置于反应皿中，伴随磁力搅拌器温和搅动130rpm；2分钟后，迅速将上述工作液加入氯金酸溶液中，氯金酸溶液与工作液的体积比为6:1，随即观察颜色的变化，即由黄色变为紫色再变为浅酒红色，当体系颜色出现酒红色时，搅拌速度提升到330rpm，10分钟后结束反应，获得金纳米粒子溶液，金纳米粒子溶液颜色为浅酒红色，置于冰箱4℃保存备用。
2.测定金钠米粒子的紫外吸收光谱
吸取步骤（1）所制备的金纳米粒子溶液，加入到比色皿中，再加入去离子水，金纳米粒子溶液与蒸馏水体积比为1:2，混合均匀后，置于紫外-可见光分光光度计中测定吸光度，测得结果金纳米粒子吸收峰在550nm。其它步骤与实施例1相同。
为了验证本发明的有益效果，发明人进行了大量的实验室研究实验，各种试验情况如下：
1、检测灵敏度
检测灵敏度试验方法与实施例1的步骤相同。根据实施例1的实验结果可以看出当久效磷浓度在0.00001mg/mL时，肉眼无法识辨颜色的变化，整体颜色与对照几乎没有差异，但是通过紫外-可见光吸收光谱表征的比色检测结果来看0.00001mg/mL的久效磷体系吸收峰的峰值相比于空白对照的峰值出现明显的下降，由此我们确定通过颜色变化观察金纳米粒子探针比色法检测久效磷残留的检测限可达0.00005mg/mL。实验结果表明，本发明检测均相溶液中久效磷的灵敏度较高。
2、选择性
将实施例1中的久效磷工作液分别用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖；金属离子类：Na+、K+、Mg2+、Ca2+和Zn2+；以0.01mg/mL的久效磷工作液作为阳性对照，无菌水作为空白对照，每种干扰物质的浓度为久效磷浓度的10倍，即0.1mg/mL，观察颜色变化。
由图4可知，添加0.01mg/mL久效磷的体系颜色仍旧为深蓝色且具有轻微沉淀；与此同时，在各添加0.1mg/mL葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、Na+、K+、Mg2+、Ca2+和Zn2+的检测体系中，反应后颜色未发生变化，说明这些物质未能抑制乙酰胆碱酯酶的活性来减弱体系中的底物浓度，说明本发明检测均相溶液中久效磷具有较好的选择性。
3、稳定性
针对所制备的金纳米粒子进行稳定性的评估。分别选取2小时（h）、2天（2d）、4天（4d）、6天（6d）、8天（8d）、10天（10d）时间间隔，吸取1mL不同时间间隔的金纳米粒子溶胶，加入到比色皿中，再加入2mL去离子水，混合均匀后，置于紫外-可见光分光光度计中，扫描获得金纳米粒子的吸收光谱，比较分析最大吸收峰峰值及波长的变化，进而评估金纳米粒子的稳定性。
从图5可知，制备的金纳米粒子在6天内的稳定性变化不大，吸收峰的峰值下降了0.05，大约10%左右，说明部分金纳米粒子开始发生聚集现象。在贮存时间延伸到8天以后，稳定性下降较为明显，10天后峰值下降程度大约为47%。结果表明，该方法所制备的金纳米粒子稳定性较高，足够在其多项应用领域的使用。
Claims (5)
1.一种金纳米粒子探针比色法检测久效磷残留的方法，由下述步骤组成：
（1）制备金钠米粒子
将新鲜柑橘成熟果实的外皮烘干后粉碎，过40目筛，浸泡于去离子水中，橘子皮与去离子水质量比为1：10，浸泡1-2小时，再将浸泡液于4000rpm条件下，离心3分钟，取上清液，此上清液作为浸泡液母液；采用去离子水将浸泡液母液稀释1倍获得所需工作液，冰箱4℃条件下保存；
室温条件下，将4℃、浓度为1g/ml的氯金酸溶液置于反应皿中，伴随磁力搅拌器温和搅动100-150rpm；2分钟后，迅速将工作液加入氯金酸溶液中，氯金酸溶液与工作液的体积比为3:1-6:1，随即观察颜色的变化，即由黄色变为紫色再变为浅酒红色，当体系颜色出现浅酒红色时，搅拌速度提升到300-350rpm，10分钟后结束反应，获得金纳米粒子溶液，金纳米粒子溶液颜色为浅酒红色，置于冰箱4℃保存备用；
（2）测定金钠米粒子的紫外吸收光谱
吸取步骤（1）所制备的金纳米粒子溶液，加入到比色皿中，再加入去离子水，金纳米粒子溶液与蒸馏水体积比为1:2，混合均匀后，置于紫外-可见光分光光度计中测定吸光度，测得结果金纳米粒子吸收峰在520-550nm；
（3）比色探针法检测久效磷残留
底物的预处理：
首先选择碘化硫代乙酰胆碱作为反应底物，采用去离子水配置10mM的ATChI溶液100mL，向5ml的ATChI溶液中加入18mg硝酸银粉末，充分振荡10秒钟，竖直静置1分钟后离心去沉淀，取上清液，再向上清液中加入1mg氯化钠，充分振荡10秒钟，竖直静置1分钟后离心去沉淀，取上清液，此时上清液为含有ATCh+的溶液；
金纳米粒子比色法的建立：
分别向离心管中加入无菌水，久效磷工作液和乙酰胆碱酯酶缓冲液后等待10分钟，再加入ATCh+溶液，等待10分钟后，加入金纳米粒子溶液，记录颜色变化，伴随着久效磷浓度的提高，颜色逐渐由浅酒红色转变至紫色再变为深蓝色。
2.根据权利要求1所述的一种金纳米粒子探针比色法检测久效磷残留的方法，其特征在于：用无菌水配制的久效磷工作液浓度为0.01mg/mL；用浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液配制浓度为2U/mL的乙酰胆碱酯酶缓冲液；0.1mol/L磷酸缓冲液的配制：100mL的磷酸缓冲液需0.1mol/LK2HPO4水溶液80.2mL和0.1mol/LKH2PO4的水溶液19.8mL。
3.根据权利要求1所述的一种金纳米粒子探针比色法检测久效磷残留的方法，其特征在于：金纳米粒子比色法的建立：无菌水、久效磷工作液、乙酰胆碱酯酶缓冲液、ATCh+溶液、金纳米粒子溶液的体积比为5：10：1：1：4。
4.根据权利要求1所述的一种金纳米粒子探针比色法检测久效磷残留的方法，其特征在于：制备后金纳米粒子在6天内具备稳定性，能够正常使用。
5.根据权利要求1所述的一种金纳米粒子探针比色法检测久效磷残留的方法，其特征在于：金纳米粒子探针比色法检测久效磷最低浓度为0.00005mg/mL。
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