CN115120614B

CN115120614B - 用于制备纳米银复合物的组合物、纳米银复合物及其应用

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Publication number: CN115120614B
Application number: CN202210803163.8A
Authority: CN
Inventors: 王勇; 潘章超; 曾念开; 邱军强; 陈娇曼; 曾蕾霞; �田润; 韩云霄
Original assignee: Hainan Medical College
Current assignee: Hainan Medical College
Priority date: 2022-07-07
Filing date: 2022-07-07
Publication date: 2023-08-22
Anticipated expiration: 2042-07-07
Also published as: CN115120614A; LU504646B1

Abstract

本发明属于纳米银粒子制备技术领域，具体涉及一种用于制备纳米银复合物的组合物、纳米银复合物及其应用。该组合物包括牛肝菌多糖与Ag⁺溶液，该组合物制备的纳米银复合物具有较高的DPPH和ABTS自由基清除能力，以及较强的铁离子还原能力，抗氧化活性好；具有良好的体外降血糖效果；还具有较好的抑菌作用，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌生长有明显的抑制作用，对四种不同的假丝酵母菌(白假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌和近平滑假丝酵母菌)的生长也有明显的抑制作用，表明合成的纳米银对细菌和真菌都有较强的抗菌效果。

Description

用于制备纳米银复合物的组合物、纳米银复合物及其应用

技术领域

本发明属于纳米银粒子制备技术领域，具体涉及一种用于制备纳米银复合物的组合物、纳米银复合物及其应用。

背景技术

纳米银(AgNPs)为金属银单质，一般尺寸为1nm-100nm。纳米银不仅显示出宏观的量子隧道效应、量子尺寸效应、表面效应以及体积效应等理化性质，而且还显示出优异的光学特性、化学稳定性和催化性能、优异的生物相容性以及抗菌性等；纳米银还具有抗菌、抗炎、抗病毒及神经再生等性能，且其理化性质及光学特性于传统金属银不同，尤其是色泽无银质而呈出黄色或棕色，这使得纳米银被广泛地应用于生物技术、生物工程科学、纺织、医学、化学、光学和水处理等领域。

现有纳米银的制备方法有化学法或物理法来实现纳米级别的尺寸，物理化学方法耗资巨大、耗能大、耗时耗力、需要高温真空条件，同时也会产生危害性更大的副产物，而且所制备的纳米银会残留部分化学试剂，有可能给人类造成危害并给环境带来多重威胁。

因此，现需要一种制备方法环保、简单，且抑菌作用效果好的纳米银复合物。

发明内容

针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种用于制备纳米银复合物的组合物，该组合物可作为制备纳米银复合物的原料，制备的纳米银复合物抗氧化性能和抗菌性能优异。

为了达到上述目的，可以采用以下技术方案：

本发明一方面提供了一种用于制备纳米银复合物的组合物，包括牛肝菌多糖与Ag⁺溶液。具体地，该组合物可以作为生物法制备纳米银复合物的原料，将牛肝菌多糖作为还原剂和稳定剂，通过AgNO₃溶液中的银离子还原成零价态的银原子，最后形成纳米银粒子；与物理化学法相比，生物法的优势在于高效快速，安全无毒，成本低，产物稳定。

进一步地，牛肝菌多糖优选暗褐脉柄牛肝菌(Phlebopus portentosus)多糖。褐脉柄牛肝菌Phlebopus portentosus(Berk.&Broome)Boedijn，俗称黑牛肝菌，隶属于牛肝菌目小牛肝菌科脉柄牛肝菌属，主要分布于广西、云南、海南等地。

具体地，牛肝菌含有生物碱、甾体、多糖、多酚、萜类化合物等多种活性物质。其中多糖是一类由不同的糖单元利用糖苷键连接而成且有三维立体结构的高聚物，具有调节免疫功能、抗病毒、延缓衰老、抗突变、抑菌等多种生物活性。在生物合成的过程中，维生素、氨基酸、多糖、蛋白质等植物化合物通过银离子还原成纳米银并阻止其聚集，起到还原和盖层作用。多糖中含有许多羟基、氨基以及羰基等活性基团，能够非常轻易地吸附于银离子上，因此银离子也被赋予了具有明显聚集的化学修饰功能，用以制备纳米银粒子或多糖的复合物；除此之外，真菌多糖具有高度的稳定性、亲水性、良好的生物相容性、生物可降解性等特点和抗氧化、抗癌、抗菌等生物活性。

进一步地，牛肝菌多糖水解后的单糖，按照重量份数计，包括：葡萄糖79-80份、半乳糖9份-10份、甘露糖2份-3份、核糖2份-3份％、鼠李糖0.01份-1份、葡萄糖醛酸1份-2份、半乳糖醛酸0.2份-0.3份、木糖0.1份-0.2份、阿拉伯糖0.8份-1份和岩藻糖2份-3份。需要说明的是，牛肝菌多糖是由多种单糖通过糖苷键连接而成的，单糖组分通过酸水解反应生成单糖再通过制备衍生物后进行测定。

进一步地，牛肝菌多糖溶液的浓度可以为4mg/mL-6mg/mL，比如5mg/mL；Ag⁺溶液浓度为9mmol/L-11mmol/L，比如10mmol/L；牛肝菌多糖溶液与Ag⁺溶液的体积比为1:9-11，比如1:10。

本发明另一方面提供了一种纳米银复合物，其制备方法包括：使用上述的组合物进行制备，将牛肝菌多糖与Ag⁺溶液混合反应得纳米银复合物。

具体地，上述纳米银复合物的制备是以牛肝菌多糖为还原剂，以硝酸银为银前躯体，制备出了稳定性好、粒径均匀的纳米银复合物，并且对纳米银复合物进行抑菌活性和降血糖等生物活性验证，表明上述纳米银复合物具有良好的抑菌活性和降血糖作用。

进一步地，上述制备方法的反应温度可以为85℃-95℃，比如86℃、89℃、90℃或94℃等，优选90℃。具体地，反应温度小于85℃，反应不完全，大于95℃，反应达到最高反应效率，不会随着温度的增加而增加。

进一步地，上述制备方法的反应时间可以≥120min。具体地，反应小于120min，反应不完全，生成的纳米银复合物并未达到最高反应效率。

本发明再一方面提供了一种上述的纳米银复合物在作为或制备抗氧化的制剂中的应用。

进一步地，上述应用包括以下的一种或多种：(a)在作为或制备用于清除DPPH自由基的制剂中的应用；(b)在作为或制备用于清除ABTS自由基的制剂中的应用；(c)在作为或制备用于还原铁离子的制剂中的应用。

本发明再一方面提供了一种上述的纳米银复合物在作为或制备用于降血糖的制剂中的应用。

进一步地，上述应用可以包括：在作为或制备用于抑制α-葡萄糖苷酶的制剂中的应用。

本发明再一方面提供了一种上述的纳米银复合物在作为或制备用于抑制或杀灭细菌或真菌的制剂中的应用。

需要说明的是，虽然纳米银的抗菌机制尚不清楚，但是已经证明纳米银能够通过自身溶解或者释放Ag⁺起到抗菌效果；纳米银的抗菌活性不仅与细菌种类有关，而且受到纳米银颗粒粒径、形状、电位及浓度等因素的影响，本发明中的纳米银复合物具有良好的抗菌性能。

进一步地，上述应用可以包括以下的一种或多种：(a)在作为或制备用于抑制或杀灭金黄色葡萄球菌的制剂中的应用；(b)在作为或制备用于抑制或杀灭大肠杆菌的制剂中的应用；(c)在作为或制备用于抑制或杀灭白假丝酵母菌的制剂中的应用；(d)在作为或制备用于抑制或杀灭光滑假丝酵母菌的制剂中的应用；(e)在作为或制备用于抑制或杀灭克柔假丝酵母菌的制剂中的应用；(f)在作为或制备用于抑制或杀灭近平滑假丝酵母菌的制剂中的应用。

本发明有益效果至少包括：

(1)本发明提供的纳米银复合物具有较高的DPPH和ABTS自由基清除能力，以及较强的铁离子还原能力，抗氧化活性好；

(2)本发明提供的纳米银复合物还具有良好的体外降血糖效果；

(3)本发明提供的纳米银复合物还具有较好的抑菌作用，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌生长有明显的抑制作用，对四种不同的假丝酵母菌(白假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌和近平滑假丝酵母菌)的生长也有明显的抑制作用，表明合成的纳米银对细菌和真菌都有较强的抗菌效果。

附图说明

图1为暗褐脉柄牛肝菌多糖的TG-DTG图；

图2为暗褐脉柄牛肝菌多糖紫外可见吸收光谱；

图3为暗褐脉柄牛肝菌多糖红外光谱；

图4为暗褐脉柄牛肝菌多糖的GPC测定图；

图5为12种混合对照溶液和暗褐脉柄牛肝菌多糖溶液的色谱图；

图6为Congored和PPP-Congored复合物的最大吸收波长变化趋势图；

图7为PPP、AgNO₃和PPP@AgNO₃的紫外可见吸收光谱图；

图8为不同的反应温度下制备的PPP@AgNO₃的紫外可见吸收光谱；

图9为不同的反应时间下制备的PPP@AgNO₃的紫外可见吸收光谱；

图10为不同体积比下制备的PPP@AgNO₃的紫外可见吸收光谱；

图11为两两相互作用对吸光度值影响的响应曲面图；

图12为AgNPs和PPP的FTIR光谱图；

图13为PPP@AgNO₃的粒度分布图；

图14为PPP@AgNO₃的Zeta电位图；

图15为PPP@AgNO₃的透射电镜图谱；

图16为PPP@AgNO₃的X射线粉末衍射图谱；

图17为暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银(AgNPs)对DPPH自由基的清除率；

图18为暗褐脉柄牛肝菌多糖(PPP)对DPPH自由基的清除率；

图19为暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银(AgNPs)和多糖(PPP)对ABTS自由基的清除率；

图20为暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银(AgNPs)和多糖(PPP)的铁离子还原能力；

图21为不同浓度暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银(AgNPs)对α-葡萄糖苷酶的抑制率；

图22为不同浓度的纳米银复合物对大肠杆菌的抑菌圈(a，b)；

图23为不同浓度的纳米银复合物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈(a，b)；

图24为不同浓度的纳米银复合物对金黄色葡萄球菌(D)和大肠杆菌(J)的杀菌图；

图25为不同浓度的纳米银溶液对四种假丝酵母菌的杀菌效果；

其中，图5中，1.Man，2.Rib，3.Rha，4.GlcUA，5.GalUA，6.GlcNAc，7.Glc，8.GalNAc，9.Gal，10.Xyl，11.Ara，12.Fuc；图22中，(a)⑤＝0.2mg/mL、⑦＝0.1mg/mL、⑥＝0.05mg/mL、⑧＝0.025mg/mL；(b)8＝0.050mg/mL、7＝0.040mg/mL、6＝0.030mg/mL、5＝0.02mg/mL；图23中，(a)5＝0.3mg/mL、7＝0.2mg/mL、6＝0.1mg/mL、8＝0.05mg/mL；(b)8＝0.05mg/mL、7＝0.04mg/mL、6＝0.03mg/mL、5＝0.02mg/mL；图24中，(D)a＝0.2mg/mL、b＝0.1mg/mL、c＝0.05mg/mL；(J)a＝0.2mg/mL、b＝0.1mg/mL、c＝0.05mg/mL；图25中，(a)近平滑假丝酵母菌(Cp)a＝0.2mg/mL、b＝0.1mg/mL、c＝0.05mg/mL、d＝0.025mg/mL；(b)光滑假丝酵母菌(Cg)a＝0.2mg/mL、b＝0.1mg/mL、c＝0.05mg/mL、d＝0.025mg/mL；(c)克柔假丝酵母菌(Ck)a＝0.4mg/mL、b＝0.2mg/mL、c＝0.1mg/mL、d＝0.05mg/mL；(d)白假丝酵母菌(Ca)a＝0.2mg/mL、b＝0.1mg/mL、c＝0.05mg/mL、d＝0.025mg/mL。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。

为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。

实施例1牛肝菌粗多糖的制备与结构表征

一、牛肝菌粗多糖的制备

将新鲜的暗褐脉柄牛肝菌子实体切成薄片后，置于烘干箱60℃下烘干(干燥情况为手掰可脆断)。将干燥的暗褐脉柄牛肝菌子实体用粉碎机粉碎，过40目筛，装入自封袋中储存备用。称取牛肝菌粉末50g，加1000mL95％乙醇，置于超声波提取仪中在40℃超声30min使乙醇和粉末充分接触(脱去部分脂溶性类成分、色素等)，用保鲜膜封口后常温浸泡静置过夜。经离心后弃去上清液，往滤渣中加入20倍体积蒸馏水，放置于水浴锅内，在80℃的条件下浸提2h，离心后对滤液和滤渣进行保留，再重复这个步骤提取2次。合并3次滤液，在60℃条件下对滤液进行浓缩，最后得到的滤液体积需为原体积的1/4即可。在磁力搅拌器上往浓缩液中加入浓缩液体积5％的氯化钙，用氢氧化钠溶液调节浓缩液的pH为8-9，再将其置于水浴锅内，加热至85℃(用温度计测量烧杯内浓缩液的温度)，取出冷却至室温后进行离心。用氯化钙处理后的浓缩液中加入4倍体积95％乙醇进行沉淀，封上保鲜膜，静置过夜，离心(4000r/min，15min)，弃上清液，得到沉淀，将醇沉离心所得沉淀先放入到-80℃的冰箱内进行预冷，再利用冷冻真空干燥机进行冷冻干燥24h便可获得暗褐脉柄牛肝菌多糖(以下也称牛肝菌多糖)。

二、牛肝菌粗多糖的结构表征

将上述制备得到的牛肝菌多糖进行以下表征：

(1)热重分析

取干燥的暗褐脉柄牛肝菌多糖4.39mg，用热重分析仪测定多糖样品的热稳定性；参数为氮气条件下，气体流速为70mL/min，以10℃/min的速度在25℃-600℃的范围内进行升温。

暗褐脉柄牛肝菌多糖的TG-DTG分析如图1所示，由图1可看出，暗褐脉柄牛肝菌多糖的热特性曲线按照质量损失大致可以划分为三个阶段：第一阶段25℃-140℃，质量损失率10.03％，此阶段损失的主要是水，DTG曲线在有一个较弱的吸热峰位于80.7℃处；第二阶段是在140℃-475℃，测得由于多糖结构经过了逐步链端降解而产生的质量损失率为64.34％。DTG曲线中暗褐脉柄牛肝菌多糖出现两个吸热峰，分别位于273.3℃和443.3℃，最大峰的峰值位于273.3℃，这个峰的出现是因为发生了分解反应导致了多糖结构中的碳链以及氢键断裂；第三阶段在475℃-547℃这一时期比较平稳，已无明显失重现象，已经达到了热稳定阶段。到了547℃时经计算得出PPP的残余质量大概为原始质量的25.63％，则总失重率在74.37％左右。

(2)紫外可见吸收光谱

将25mg暗褐脉柄牛肝菌多糖粉末溶于5mL水中，配成暗褐脉柄牛肝菌多糖溶液(5mg/mL)；先用超纯水进行基线校正，精密吸取3mL的多糖溶液和3mL的蒸馏水分别放置于石英比色皿中，在紫外分光光度计下以100nm/min的速度在300nm-800nm范围扫描，记录紫外可见吸收光谱；结果如图2所示。

(3)红外光谱(IR)

取1mg的暗褐脉柄牛肝菌多糖粉末与100mg-200mg的KBr粉末充分混合均匀后，压成透明薄片，进行红外光谱扫描，扫描范围为4000.00cm^-1-500.00cm^-1；结果如图3所示。

(4)利用水相GPC测定多糖分子量

取0.3g的PPP粉末加入到规格为5mL的样品瓶内，加超纯水(含有0.1mol/LNaNO₃)到样品瓶的刻度线上，超声将溶液分散后待测；色谱条件：色谱柱PLaquqgel-OHMIXED(7.8mm×300mm)，柱温30℃，流动相为0.2mol/LNaNO₃和0.01mol/LNaH₂PO₄，流速1mL/min，Waters2414示差折光检测器，进样量10μL，进行不同分子量的葡聚糖标准品(1×10³-1×10⁵)和样品的分析。

暗褐脉柄牛肝菌多糖的GPC测定结果见图4和表1，由图2和表1可看出，暗褐脉柄牛肝菌多糖的重均分子量(Mw)为27588Da，峰型为单一对称峰，说明暗褐脉柄牛肝菌多糖纯度较好，是一种均一多糖。

表1暗褐脉柄牛肝菌多糖的分子量测定结果

Mn(数均分子量)	Mw(重均分子量)	Mp(峰值分子量)	PDI(多分散指数)
				13847	27588	25215	1.99

(5)单糖组成

精密称取核糖(Rib)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、鼠李糖(Rha)、半乳糖(Gal)、半乳糖醛酸(GalUA)、甘露糖(Man)、N-乙酰-氨基葡萄糖(GlcNAc)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰-氨基半乳糖(GalNAc)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、岩藻糖(Fuc)对照品适量，加水进行溶解，并稀释到每1mL中各含50μg的混合对照品溶液；取一个10mL的安瓿瓶，加入约3.0mg的PPP粉末，再将3.0mL的TFA(2mol/L)加入到安瓿瓶中，然后进行封管，120℃酸解4h。取出加入甲醇，氮吹挥干TFA，加3.0mL的水再次溶解，得供试品溶液；吸取250μL混合对照溶液和250μL样品溶液分别精确转移到5mLEP管中，加入250μL0.6mol/LNaOH，500μL0.4mol/LPMP-甲醇，在70℃中反应1h。然后在冷水中冷却10min，加入0.3mol/L的HCl500μL进行中和，再加入1mL氯仿漩涡1min，以3000r/min的速度离心10min，得上清液，再萃取3次。均取上清液用于HPLC；色谱条件：色谱柱为Xtimate(C₁₈，4.6mm×200mm，5μm)；流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(用氢氧化钠溶液调pH为6.70)-乙腈＝83:17；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：250nm；进样体积：20μL；

12种单糖混合对照溶液和暗褐脉柄牛肝菌多糖溶液单糖组成结果见图5；单糖组成对多糖的结构具有重要意义，根据暗褐脉柄牛肝菌多糖溶液与混合对照溶液相对比，暗褐脉柄牛肝菌多糖是由10种多糖组成，其中主要由Glc和Gal组成，占比分别为79.56％、9.42％。除此之外还有少量的Man(2.52％)、Rib(2.81％)、Rha(0.05％)、GlcUA(1.52％)、GalUA(0.23％)、Xyl(0.15％)、Ara(0.80％)和Fuc(2.89％)。

(6)刚果红实验

将5.57mg的刚果红粉末加超纯水100mL定容成80μmol/L的刚果红溶液。制备6份由1.5mL的刚果红溶液(80μmol/L)与0.5mL多糖溶液(5mg/mL)混合而成的溶液，再制备6份2mL的刚果红溶液(80μmol/L)，然后每份溶液中分别加入不等量的NaOH溶液，使最后溶液中NaOH的浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L，再放入避光的条件下反应15min，最后将这12份溶液进行波谱扫描，测定其最大的吸收波长。

刚果红试剂及暗褐脉柄牛肝菌多糖(PPP)与刚果红复合物在不同浓度的氢氧化钠溶液中的最大吸收波长变化趋势图如图6所示；刚果红作为酸性染料能与具有三股螺旋构象的多糖发生络合，则络合物的最大吸收波长(λmax)相比较于刚果红溶液会产生红移，在碱性条件下，多糖的三股螺旋结构会发生解旋；刚果红实验结果如图6所示，在NaOH浓度为0-0.5mol/L的范围内，PPP刚果红络合物溶液最大吸收波长发生了红移现象，因此可以表明PPP具有三股螺旋构象；在NaOH浓度在0.1-0.5mol/L的范围内，PPP刚果红络合物溶液的λmax开始减小，表明PPP的三股螺旋结构就已经开始解体成单股结构，不再具有三股螺旋构象。

实施例2纳米银合成工艺参数试验

多糖溶液的制备：精密称取25mg的暗褐脉柄牛肝菌多糖置于烧杯中，加入5mL的水充分溶解，即可得到5mg/mL的暗褐脉柄牛肝菌多糖溶液。由于暗褐脉柄牛肝菌多糖溶液的不稳定性，需现配现用。

AgNO₃溶液的制备：精密称取850mgAgNO₃用蒸馏水充分溶解，并定容到50mL的棕色容量瓶中，可得100mmol/L的AgNO₃，避光保存。根据实验需要的量，加入蒸馏水稀释配制成10mmol/L的AgNO₃溶液；由于AgNO₃溶液不稳定，需现配现用。

纳米银复合物溶液的制备：精密量取8mL的浓度为10mmol/L的硝酸银溶液于50mL离心管中，逐滴加入1mL浓度为5mg/mL的暗褐脉柄牛肝菌多糖溶液，使之充分混合，加入超纯水至总体积25mL，放置于恒温振荡器内，在90℃条件下避光反应120min，得到暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银复合物溶液。精密吸取3mL溶液置于石英比色皿中，用蒸馏水作空白对照，在紫外分光光度计下，扫描并记录在300～800nm处的最大吸收峰的吸光度值。

其结果如图7所示，PPP@AgNO₃在出现了一个明显的吸收峰，其最大吸收波长为420.2nm，这个吸收峰是由于纳米银特征表面的等离子体共振吸收峰所致，然而PPP和AgNO₃的吸收峰较为平坦且420.2nm处并无明显的吸收。

一、单因素试验

(1)反应温度

将5mg/mL的牛肝菌多糖溶液与10mmol/L的AgNO₃溶液按1:10的比例混和置于50mL离心管中，加入超纯水至总体积25mL。制备4份两者的混合溶液，将4份溶液分别在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下反应120min，得到5份暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银复合物溶液；

检测结果如图8所示，由图8可看出，PPP@AgNO₃的制备过程中，在相同条件下，反应温度越高，纳米银复合物的生成速率越快，随着反应温度的升高，溶液的吸光度值也明显增加了；温度处于50℃时，并未反应完全，因此无最大吸收波长，峰型也很宽，随着反应温度的上升，吸光度值也在逐渐增加，并且峰型也越来越狭窄，当温度达到90℃的时，最大吸收波长为419.7nm，吸光度值为1.2407，且峰型较为狭窄，因此在响应面试验中选择90℃作为最佳条件。

(2)反应时间

将5mg/mL的牛肝菌多糖溶液与10mmol/L的AgNO₃溶液按1:10的比例混和置于50mL离心管中，加入超纯水至总体积25mL；制备5份两者的混合溶液，分别在90℃下反应30min、60min、90min、120min、150min、180min、240min；

检测结果如图9所示，由图9可看出，在相同条件下，反应时间的不同吸光度值也会不同；随着时间的不断增加，吸光度值也逐渐增加，生成的纳米银复合物也逐渐增多，其最大吸收波长都稳定在420nm附近，从30min到120min吸光度值明显逐渐升高，120min-240min的峰型几乎一致，相差较小，因此在响应面试验中选择120min作为最佳条件。

(3)PPP与AgNO₃的体积比

将六份1mL的浓度为5mg/L的牛肝菌多糖溶液分别加入到2mL、4mL、6mL、8mL、10mL、12mL的溶液中，即暗褐脉柄牛肝菌多糖溶液与AgNO₃溶液的体积比为1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:12；再加入超纯水至总体积25mL，在90℃下反应120min，得到六份暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银复合物溶液；

从图10中的光谱图得知，6种不同体积比的PPP@AgNO₃的吸收峰所对应的最大吸收波长分别为：403.4nm(1:2)、409.5nm(1:4)、415nm(1:6)、416nm(1:8)、419.7nm(1:10)、419.9nm(1:12)。随着比例的增加，最大吸收波长也随之升高，表明引起了波形红移，红移表明纳米银复合物的平均粒径增加，1:10和1:12的最大吸收波长都是接近于420nm且吸光度值最大，1:10和1:12的峰型基本一致，并无太大变化，因为在响应面试验中选1:10作为最佳条件。

二、响应面优化

通过单因素试验选取反应时间、反应温度、暗褐脉柄牛肝菌多糖溶液与AgNO₃溶液的体积比三个因素。再利用Design-expert11软件中Box-Behnken法，进行三因素三水平的优化试验，以吸光度值作为响应值，研究合成暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银复合物的最佳工艺条件；其中Box-Behnken中心试验因素水平如下表2所示，Box-Behnken试验设计方案及结果如下表3所示；

表2 Box-Behnken中心试验因素水平表

表3 Box-Behnken试验设计方案及结果

基于响应面试验的结果，利用Design-expert11对表4中的数据进行了回归分析，得到反应时间(A)、反应温度(B)、PPP与AgNO₃的体积比(C)的二元一次回归方程为：Y＝1.26+0.1142A+0.1352B+0.1025C+0.1088AB+0.0558AC－0.0293BC－0.0379A²－0.0404B²+0.0006C²，由方程的一次项数值的绝对值可得，反应温度对吸光度值的影响最大，其次是反应时间，最后为PPP与AgNO₃的体积比；

回归方程方差显著性分析结果见表4，F值为87.85，P<0.0001表明该回归模型高度显著，这意味着所选因素对吸光度值的变化具有显著影响。失拟项P＝0.5277(>0.05)，不显著，表明该模型适合模拟响应值和各个因素间的关系。模型拟合的多元相关系数R²＝0.9912表明回归方程具有较高的拟合度和较低的试验误差，该响应面模型具有可靠性。调整性决定系数R² _Adj＝0.9799，也就是说97.99％的响应值变化能够通过这个模型来解释，则用该模型能代替真实试验点对暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银复合物形成的分析和预测。回归模拟二次项中的A、B、C、AB(P<0.0001)具有高度显著性，AC、BC、A²、B²具有显著性(P<0.05)，而C²不显著(P>0.05)，两个因素之间的交互作用可以通过响应面的3D模型图以一种直接的方式反映出来；当三维曲面图的走向越来越陡峭时，就表明这两个因素对于响应值的的作用程度越大。

根据图11可以看出反应时间与反应温度、体积比与反应温度这两个三维曲面图相对来说较为陡峭，表明其两个因素之间对响应值的影响较为显著，其中最为陡峭的是反应时间和反应温度的三维曲面图，表明其对暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银复合物的吸光值影响较大，因此影响暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银复合物因素的顺序为：反应温度>反应时间>暗褐脉柄牛肝菌多糖溶液与AgNO₃的体积比，与回归模型方差分析一致。

表4方差分析结果

三、合成工艺验证试验

应用分析软件Design-expert11，由RSM预测最优值，并重复进行三次验证试验，观察是否与预测值相近；使用Design-Expert11软件对二元一次回归方程进行计算得到最佳的合成工艺条件是：反应温度为93.78℃，反应时间为141.58min，暗褐脉柄牛肝菌多糖溶液与AgNO₃溶液的体积比为1:11.51，在此条件下暗褐脉柄纳米银复合物溶液得到的预测吸光度值为1.557，结合实际操作，将合成工艺进行了合理的优化之后，得到反应的温度为94℃，反应时间为140min，暗褐脉柄牛肝菌多糖溶液与AgNO₃溶液的体积比为1:11.5，在该条件下经三次验证性试验测得其平均吸光度值为1.584，实际值与预测值基本吻合，表明了模型对纳米银制备工艺条件优化的可行性与准确性。

实施例3纳米银复合物的结构表征

(1)红外光谱(IR)

取1mg暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银复合物溶液冷冻干燥得到的粉末与100mg-200mg的KBr粉末充分混合均匀后，压成透明薄片，对薄片进行红外光谱扫描，扫描范围为4000.00cm^-1-500.00cm^-1；多糖结构中特殊功能基团具有特殊的红外吸收光谱，在4000-500cm^-1的范围内对PPP和AgNPs进行傅里叶红外光谱(FTIR)的测定；利用反应前后红外光谱的变化分析参与PPP@AgNPs合成的化合物官能团；

检测结果如图12所示，在3380cm^-1附近出现较强的宽峰是由于OH的存在而产生的，在2930cm^-1区域的吸收峰是由于C-H的伸缩振动而产生的，在1577cm^-1处的吸收峰是由于C＝O键而形成，在波长为1035cm^-1的吸收峰表明吡喃环上有因C-O-C或C-O-H而产生的不对称伸缩振动，573cm^-1处的峰是生物分子银-配体相互拉伸作用的特征峰；PPP与AgNPs的FTIR光谱相比有一定的变化，但基本相似，说明PPP中的化学成分键合到了纳米银表面，起到了保护作用。

(2)Zeta电位与粒度分布

吸取1mL暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银复合物样品溶液，放于粒径专用比色皿中，在25℃下用粒度分析仪测定所得纳米银的粒度分布；再用MalvernZS90纳米粒径电位分析仪测定所得纳米银的电位。

检测结果如图13和图14所示，主要的粒径范围为68～78nm之间，Zeta电位为-4.32mV，多分散指数(PDI)为0.571。已知PDI越大，分子量越宽，Zeta电位值愈高，体系就愈稳定，然而在本次的实验结果中可看出PDI大于0.2，电位为－4.32mV，这说明所制备的PPP@AgNO₃的分布是不均匀的，性质也是很不稳定的；然而粒度分布的结果是流体力学粒径，因此其粒径结果和透射电镜(TEM)粒径的统计结果具有一定的区别。

(3)透射电镜(TEM)

取10μL暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银复合物溶液，滴加到负载碳膜的铜网上，静置10min，然后用滤纸吸去其剩余溶液，室温干燥后固定在仪器采样台，用透射电镜在加速电压200kV的条件下测试，观察AgNPs的形态特征；

检测结果如图15可所示，利用PPP可成功制备球形纳米银粒子，测得PPP@AgNO₃的平均粒径为64.5nm，未发现粒子团聚，但是分散不均，可以看到一些纳米银粒子外有一圈的黑色物质，这些物质有可能是因为PPP的有效成分与AgNPs表面相结合而导致的。

(4)X射线衍射(XRD)

将暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银复合物溶液冷冻干燥成粉末，取少量的粉末置于带凹槽的玻璃基片中心，用载玻片压平后，设定工作电压40kV、管电流为40mA、扫描范围为10°-80°、以Cu-_kα作为射线源(λ＝1.541866A)的条件下进行表征；

检测结果如图16所示，可看出与PPP@AgNO₃的衍射峰相对应的晶面分别为(111)、(200)、(220)、(331)，这与标准图谱(JCPDSNo.04-0783)上的数据相一致，表明样品溶液中有金属单质银的存在，由图可见部分杂峰，这可能是由于合成PPP@AgNO₃时操作不当而引入杂质所导致，或是由于提取多糖时未将脂类以及蛋白质等杂质除净所致；

PPP在25℃-140℃的温度范围内呈现出良好的热稳定性。PPP为均一多糖，其相对分子质量为27588Da，经测定可知PPP中含量较高的是葡萄糖和半乳糖。经刚果红实验发现，PPP可以和刚果红在一定的条件下形成络合物，故推测PPP中有三股螺旋结构的存在。以暗褐脉柄牛肝菌多糖为还原剂成功制备了暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银复合物，且在暗褐脉柄牛肝菌多糖溶液(5mg/mL)与AgNO₃溶液体积比为1:11.5，94℃下反应140min条件下所制备的纳米银复合物多呈球状，粒径分布范围在68～78nm，平均粒径为64.5nm，但是性质不稳定，分布不均匀；

在实验过程可观察到反应前的纳米银复合物溶液为浅黄色，反应后变成了棕黄色，是由于纳米银表面的等离子体发生了共振而导致。所制备的PPP@AgNO₃多呈球状，平均粒径为64.5nm，粒度分布在68～78nm之间，导致PPP@AgNO₃的粒径差异有可能是因为PPP的结构中含有不同的官能团使还原成Ag⁰的速率不一样。

实施例4暗褐脉柄牛肝菌纳米银复合物的生物活性试验

一、纳米银复合物的制备

牛肝菌多糖溶液的制备：精密称取25mg牛肝菌多糖，置10mL离心管中，加5mL蒸馏水完全溶解，得5mg/mL的牛肝菌多糖溶液，注意牛肝菌多糖溶液的不稳定性，需现配现用；

硝酸银溶液的配制：精密称取85mgAgNO₃至棕色量瓶中，加蒸馏水定容至50mL，得10mmol/L硝酸银溶液，避光保存；

精密量取浓度为10mmol/L硝酸银溶液11.5mL至50mL离心管内，将1mL牛肝菌多糖溶(5mg/mL)液逐滴加到其中，混匀后用超纯水定容到25mL；将制备的硝酸银-多糖混合溶液置于恒温振荡器中，条件设定为94℃，振荡速度120r/min，避光反应140min，获得暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银复合物溶液；

将暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银复合物溶液于60℃下减压浓缩至原体积得1/4后分装于50mL离心管内，以10000r/min，15min离心分离出沉淀，以超纯水对沉淀进行重复多次吹干合并，再离心分离，并以超纯水对所得沉淀进行溶解，分装于2mL离心管内以13000r/min，10min离心分离出纳米银粉末，冷冻干燥24h，即得。

二、抗氧化实验

(1)DPPH自由基清除活性

DPPH母液的配制：精密称取19.7mgDPPH，用无水乙醇定容至100mL，得0.05mmol/L的DPPH溶液并装入棕色瓶中备用；

将制备的纳米银复合物配制成不同质量浓度梯度(0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL)的样品溶液，并配制不同浓度(0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL)的多糖溶液；在96孔板中加入样品溶液100μL，然后加入100μL制备好的DPPH溶液，混合均匀，用多糖溶液代替样品溶液做同样步骤，将96孔板放置在暗处室温反应25min后，酶标仪在517nm处测OD值。以抗坏血酸溶液做阳性对照，蒸馏水代替样品做空白对照，重复实验三次；根据如下公式计算出各溶液的清除率；

式中:A₀为100μLDPPH+100μL超纯水在517nm处的OD值；A₁为100μLDPPH+100μL样品溶液在517nm处的OD值；A₂为100μL样品+100μL乙醇在517nm处的OD值；

利用DPPH自由基的醇溶液显紫色且在517nm处有强吸收，加入纳米银会与其中的单电子配对使溶液吸收逐渐减弱导致褪色的现象。通过测量吸光度对样品进行DPPH自由基清除率分析，吸光度水平下降说明抗氧化性提高，以此对样品抗氧化能力进行评价；

通过图17可得线性方程y＝0.2829x+19.417可以计算出AgNPs的半数清除浓度(IC₅₀)为0.1082mg/mL；如图18所示，AgNPs对DPPH自由基有清除活性，当质量浓度为0.3mg/mL时，暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银颗粒清除DPPH自由基的能力比抗坏血酸(ASC)低，且不同质量浓度的多糖纳米银颗粒其清除能力不一样，随AgNPs浓度的升高，清除活性明显变强，暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银颗粒具有比暗褐脉柄牛肝菌多糖更高的清除DPPH自由基的活性。

(2)ABTS自由基清除活性

ABTS自由基工作液的配制：精密称取192mgABTS，超纯水溶解定容至50mL，得7mmol/L的ABTS溶液，精密称取过硫酸钾66.2mg，超纯水溶解定容至100mL，得到浓度为2.45mmol/L的过硫酸钾溶液。取7mmol/LABTS溶液50mL和880μL的2.45mmol/L过硫酸钾混合，暗处放置室温反应16h后得到ABTS自由基反应贮备液。在A₇₃₄ nm处，用95％乙醇将ABTS自由基反应贮备液稀释至吸光值为0.70±0.02作为工作液备用；

将制备的纳米银颗粒配制成不同质量浓度梯度的样品溶液(0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL)，并配制不同浓度的多糖溶液(0.625mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL)；取配制好的20μL样品溶液加入到96孔板中，再加ABTS自由基工作液180μL，混合均匀，多糖溶液代替样品溶液做相同步骤，用酶标仪测其在734nm处的OD值。抗坏血酸溶液为阳性对照，蒸馏水代替样品为空白对照，重复实验三次。根据如下公式计算出各溶液的清除率；

式中：A₀为180μLABTS自由基工作液+20μL超纯水在734nm处的OD值；A₁为180μLABTS自由基工作液+20μL样品溶液在734nm处的OD值；A₂为20μL样品+180μL超纯水在734nm处的OD值；

利用ABTS与过二硫酸钾(K₂S₂O₄)反应，生成绿色的ABTS⁺自由基，该自由基在734nm处有强吸收的原理，纳米银中的抗氧化物质能与ABTS⁺发生反应，使反应体系褪色。因此通过测定吸光度可分析样品清除ABTS⁺自由基的能力。

通过图19可知线性方程y＝0.1516x-7.4289可以计算出AgNPs的半数清除浓度(IC₅₀)为0.3788mg/mL。AgNPs对ABTS⁺自由基有清除活性，暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银颗粒对ABTS⁺自由基的清除能力低于抗坏血酸，当质量浓度0.1mg/mL-0.2mg/mL时清除率上升较缓慢，当质量浓度为0.5mg/mL-0.6mg/mL时，清除能力明显较强。AgNPs各质量浓度之间的清除率差异显著，随AgNPs质量浓度增加，抗氧化活性明显增强。由图17可知，相比于暗褐脉柄牛肝菌多糖(PPP)，暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银颗粒具有更强的ABTS⁺自由基清除活性。

(3)铁离子还原能力试验

将制备的纳米银颗粒配制成不同质量浓度梯度(0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL)的样品溶液，并配制不同浓度(0.03125mg/mL、0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL)的多糖溶液，各个试管中加入配好的样品溶液1mL，同时向每支试管加入1mL的200mM的磷酸钠缓冲液(pH为7.2)和1％的铁氰化钾溶液2mL，充分混匀后放入50℃的恒温水浴锅20min，待试管完全冷却后加入10％的三氯乙酸溶液2mL，离心(3000r/min，10min)，取溶液上清液2mL，加入超纯水2mL后再加0.1％的三氯化铁溶液1mL，混合均匀，用移液枪移取200μL于96孔板中，用酶标仪在700nm处测其OD值。抗坏血酸溶液作阳性对照，超纯水代替样品作空白对照，平行实验三次；

结果如图20所示，随着浓度的增大，暗褐脉柄牛肝菌粗多糖(PPP)，AgNPs以及抗坏血酸(ASC)的亚铁离子还原能力也在不断增大，而暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银颗粒在700nm处的OD值明显大于暗褐脉柄牛肝菌多糖溶液在700nm处的OD值，通过实验原理在铁离子还原能力试验中，OD₇₀₀值越大，表示对亚铁离子的还原能力越强，可知暗褐脉柄牛肝菌提取的多糖合成的AgNPs的铁离子还原能力强于暗褐脉柄牛杆菌粗多糖，弱于抗坏血酸。

三、体外降血糖试验

将用于检测的20μg/mLAgNPs样品移至96孔板中，并依次用磷酸钠缓冲液(0.01M，pH7.2)稀释至50μL，然后加入浓度为0.5U/mL的α-葡萄糖苷酶50μL，充分混匀，室温下孵育(10min)。以50μL的3.0mM对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)作为底物，在37℃下反应20min，加入50μL的碳酸钠(0.1M)停止反应。因PNPG可被α-葡萄糖苷酶水解成葡萄糖和PNP，且PNP在405nm处存在最大吸收，故用酶标仪测在405nm溶液(反应混合物)的OD值(光密度)；96孔板中含有PBS缓冲液、底物和酶孔做阳性对照。根据如下公式计算出α-葡萄糖苷酶的抑制率；

式中：A₀为PBS缓冲液50μL+酶50μL+底物50μL+碳酸钠50μL在405nm处的OD值；A₁为样品溶液与PBS缓冲液50μL+酶50μL+底物50μL+碳酸钠50μL在405nm处的OD值。

实验中α-葡萄糖苷酶水解4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)，生成葡萄糖和对硝基苯酚，其中对硝基苯酚最大吸收波长为405nm，通过测定加入纳米银后的吸光度，能反映样品对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用；

通过图21得出线性方程y＝3.9148x+6.5746，可以计算出AgNPs的半数清除浓度(IC₅₀)为11.1μg/mL。表明暗褐脉柄牛肝菌粗多糖溶液制备的AgNPs对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制效果，具有体外降血糖活性。

四、抑菌实验

(1)对细菌的抑菌作用

1)培养基与菌悬液的制备

称取蛋白胨10g、牛肉膏5g和NaCl5g，放入1L超纯水加热搅拌至完全溶解，调节pH值到7.2-7.4，经0.1MPa、121℃灭菌20min后得营养肉汤培养基；以上操作继续加入20g琼脂灭菌之后倒平皿得到营养琼脂培养基；将保存好的菌种接种于营养肉汤培养基上，37℃恒温振荡培养24h，活化菌种，经过4℃，6000r/min离心10min，得到的沉淀用生理盐水稀释，使菌悬液浓度在5×10⁵-5×10⁶cfu/mL范围内。

2)抑菌圈测定

用打孔器对定性滤纸进行打孔制得直径6mm滤纸片，经灭菌处理后，将滤纸片浸泡于浓度为0.3mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL的AgNPs溶液24h，吸取200μL菌悬液涂布到营养琼脂培养基中，然后将浸泡过AgNPs的滤纸片贴于培养基上，以无菌生理盐水作为空白对照，头孢他啶作为阳性对照，37℃恒温培养箱内倒置培养24h，重复试验三次；

检测结果如图22、图23所示，暗褐脉柄牛肝菌粗多糖溶液制备的AgNPs对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌作用，当纳米银颗粒的浓度在0.2mg/mL、0.1mg/mL时对大肠杆菌有良好的抑菌效果，0.05mg/mL的纳米银颗粒对大肠杆菌也有抑菌效果；当银纳米颗粒的浓度在0.3mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL时对金黄色葡萄球菌有良好的抑菌效果，纳米银颗粒的浓度为0.05mg/mL时对金黄色葡萄球菌也有抑菌效果，而纳米银复合物浓度低于0.05mg/mL时，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均不再有抑菌效果。

3)最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC)的测定

在96孔细胞板中，加入浓度分别为0.4mg/mL、0.3mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL和0.05mg/mL的AgNPs溶液后各孔加入肉汤配制的10⁵cfu/mL的菌液100μL混匀，同时做阴性对照；96孔板放入37℃恒温培养箱内培养24h，记录实验孔和阴性对照孔的生长情况，以无菌生长孔(清澈透明)的最低纳米银浓度为MIC，重复实验3次；

取做MIC的96孔板中无菌生长孔的液体5μL滴定在培养基上，进行斑点检测。将培养皿放置在37℃的培养箱培养1天-2天，观察菌种的生长情况，以无菌生长的最低纳米银浓度为最小杀菌浓度(MBC)；

在96孔细胞板中，通过微量肉汤稀释的方法来测定纳米银对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度，以无菌生长孔(清澈透明)的最小纳米银浓度为MIC；检测结果如下表5所示，暗褐脉柄牛肝菌粗多糖溶液制备的AgNPs对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC相同均为0.05mg/mL；

表5不同浓度纳米银对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果

纳米银浓度(mg/mL)

0.4

0.3

0.2

0.1

0.05

0.025

0.0125

大肠杆菌

清澈

浑浊

金黄色葡萄球菌

清澈

浑浊

通过斑点检测法来研究暗褐脉柄牛肝菌粗多糖溶液合成的AgNPs对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效果，检测结果图24所示，当纳米银浓度为0.2mg/mL时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌完全停止生长，但纳米银的浓度低于0.2mg/mL时，能够抑制其生长但不能完全杀死大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，所以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌仍然会在平板上生长。因此，暗褐脉柄牛肝菌粗多糖溶液制备的AgNPs对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MBC也相同均为0.2mg/mL；制备的纳米银颗粒对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有良好的抑菌作用。

(2)对真菌的抑菌效果

通过测定暗褐脉柄牛肝菌粗多糖溶液合成的纳米银颗粒对四种不同的白假丝酵母菌的最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC)来研究其对真菌的抑菌效果；

将0.4mg/mL的纳米银用肉汤培养基在96孔板中等倍稀释。然后各孔加入肉汤配制的10⁵cfu/mL的白假丝酵母菌菌液100μL，同时做阴性对照；将96孔板放入37℃孵箱培养24h，观察实验孔和阴性对照孔的生长情况，以无菌生长孔(清澈透明)的最低纳米银浓度为MIC，实验重复3次。取无菌生长孔的液体5μL滴定在MH培养基表面，进行斑点检测；均匀涂布，放入培养箱中培养24h后观察白假丝酵母菌的生长情况，以无菌生长的最低纳米银浓度为其MBC；

在96孔细胞板中，通过微量肉汤稀释的方法来测定纳米银对四种假丝酵母菌的最小抑菌浓度，以无菌生长孔(清澈透明)的最小纳米银浓度为MIC；结果如下表6所示，暗褐脉柄牛肝菌粗多糖溶液制备的AgNPs对克柔假丝酵母菌的MIC为0.1mg/mL，对白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌和近平滑假丝酵母菌的MIC相同均为0.05mg/mL。

表6不同浓度纳米银对四种假丝酵母菌的抑菌效果

通过斑点检测法来研究暗褐脉柄牛肝菌粗多糖溶液合成的AgNPs对四种不同的假丝酵母菌的杀菌效果，结果如图25所示，当纳米银浓度为0.2mg/mL时，四种假丝酵母菌完全停止生长；纳米银浓度为0.1mg/mL时，克柔假丝酵母菌在平板上长出菌落，白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌和近平滑假丝酵母菌无菌落生长；在纳米银浓度为0.05mg/mL时，四种假丝酵母菌都长出菌落；因此，暗褐脉柄牛肝菌粗多糖溶液制备的AgNPs对克柔假丝酵母菌的MBC为0.2mg/mL，对白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌和近平滑假丝酵母菌的MBC为0.1mg/mL。制备的暗褐脉柄牛肝菌纳米银颗粒对四种不同的假丝酵母菌都有良好的抑菌效果。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。

Claims

1.纳米银复合物，其特征在于，其制备方法包括：将牛肝菌多糖与Ag+溶液混合反应得纳米银复合物；牛肝菌多糖为暗褐脉柄牛肝菌多糖；暗褐脉柄牛肝菌多糖的制备方法包括：称取牛肝菌粉末50g，加1000mL95％乙醇，置于超声波提取仪中在40℃超声30min使乙醇和粉末充分接触，用保鲜膜封口后常温浸泡静置过夜；经离心后弃去上清液，往滤渣中加入20倍体积蒸馏水，放置于水浴锅内，在80℃的条件下浸提2h，离心后对滤液和滤渣进行保留，再重复这个步骤提取2次；合并3次滤液，在60℃条件下对滤液进行浓缩，最后得到的滤液体积需为原体积的1/4即可；在磁力搅拌器上往浓缩液中加入浓缩液体积5％的氯化钙，用氢氧化钠溶液调节浓缩液的pH为8-9，再将其置于水浴锅内，加热至85℃，取出冷却至室温后进行离心；用氯化钙处理后的浓缩液中加入4倍体积95％乙醇进行沉淀，封上保鲜膜，静置过夜，离心，弃上清液，得到沉淀，将醇沉离心所得沉淀先放入到-80℃的冰箱内进行预冷，再利用冷冻真空干燥机进行冷冻干燥24h便可获得暗褐脉柄牛肝菌多糖；纳米银复合物的制备方法包括：精密量取浓度为10mmol/L硝酸银溶液11.5mL至50mL离心管内，将1mL 5mg/mL牛肝菌多糖溶液逐滴加到其中，混匀后用超纯水定容到25mL；将制备的硝酸银-多糖混合溶液置于恒温振荡器中，条件设定为94℃，振荡速度120r/min，避光反应140min，获得暗褐脉柄牛肝菌多糖纳米银复合物溶液。

2.权利要求1所述的纳米银复合物在制备抗氧化的制剂中的应用；应用包括以下的一种或多种：(a)在制备用于清除DPPH自由基的制剂中的应用；(b)在制备用于清除ABTS自由基的制剂中的应用；(c)在制备用于还原铁离子的制剂中的应用。

3.权利要求1所述的纳米银复合物在制备用于通过抑制α-葡萄糖苷酶降血糖的制剂中的应用。

4.权利要求1所述的纳米银复合物在制备用于抑制或杀灭细菌或真菌的制剂中的应用，应用包括以下的一种或多种：(a)在制备用于抑制或杀灭金黄色葡萄球菌的制剂中的应用；(b)在制备用于抑制或杀灭大肠杆菌的制剂中的应用；(c)在制备用于抑制或杀灭白假丝酵母菌的制剂中的应用；(d)在制备用于抑制或杀灭光滑假丝酵母菌的制剂中的应用；(e)在制备用于抑制或杀灭克柔假丝酵母菌的制剂中的应用；(f)在制备用于抑制或杀灭近平滑假丝酵母菌的制剂中的应用。