CN105424662A - 荧光生物检测系统 - Google Patents

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Abstract

荧光生物检测系统，包括发光模块、荧光接收模块和数据处理模块，在发光模块与荧光接收模块之间设有比色皿，比色皿内盛放有上转换荧光材料标记的检测试液；所述发光模块包括红外激发光源，所述红外激发光源发出的激发光束通过激发光路照射于盛放有检测试液的比色皿上，所述检测试液发出的荧光通过接收光路由荧光接收模块接收，所述激发光路与所述接收光路成直线或者直角设置；荧光接收模块为光强传感器，所述光强传感器的输出端连接数据处理模块。本发明基于上转换荧光技术即可实现对多种被检液中待检目标菌浓度的实时定量检测，整个检测系统无需免疫层析试纸，且激发光路和接收光路的设置更为简便。

Description

荧光生物检测系统
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及基于上转换荧光标记技术、对多种被检液中特定目标菌浓度进行实时定量检测的生物检测系统。
背景技术
上转换荧光技术是基于上转换荧光材料的标记技术。所谓上转换，是指长波长辐射通过上转换荧光材料(Up-ConvertingPhosphor,以下简称UCP)转换成短波长辐射，UCP是由几种稀土元素掺杂于某些晶体的晶格中构成的，其主要成分包括主基质、吸收子、发射子，在红外光激发下，UCP发射波长远短于激发光的可见光。将UCP制备成纳米级颗粒，标记于生物分子，在长波长光源激发下，发出可见荧光，根据荧光的有无及强弱，可判断被检生物分子的属性和含量。
以UCP作为标记物的生物检测技术可对被检物进行无损伤检测，且具有检测灵活、灵敏度高、使用安全等优点，同时，UCP标记物可与仪器结合对目标被检物进行多重定量检测。现有技术中，已经有使用UCP标记物与免疫层析试纸技术相结合的检测系统，其采用激发光源对带有多个功能带的试纸条进行照明，由成像系统和图像接收器接收试纸条上荧光图像，由图像处理系统对所接收的荧光图像进行分析处理，这种检测系统存在如下缺陷：第一，需要设计特定结构的试纸条，试纸条包括多个功能带，需要对多个功能带采集信号进行处理，试纸条结构复杂，制备繁琐；第二，由于试纸条是非透明的，由激发光源与试纸条之间的激发光路到试纸条与图像接收器之间的接收光路，二个光路之间必然存在一个以试纸条为转折点的折射角，且为了能够照明试纸条的多个功能带，需要两个夹角存在特定的数学关系，使得激发光路和接收光路的设置受限；第三，使用免疫层析试纸条，UCP与生物活性分子的结合物与被检物通过免疫反应固定于固相载体的表面，需要设置专门的固相载体；第四，试纸条为一次性使用产品，不能重复使用。
发明内容
本申请人针对现有技术中的上述缺点进行改进，提供一种荧光生物检测系统，其基于上转换荧光技术即可实现对多种被检液中待检目标菌浓度的实时定量检测，整个检测系统无需免疫层析试纸，且激发光路和接收光路的设置更为简便。
本发明的技术方案如下：
荧光生物检测系统，包括发光模块、荧光接收模块和数据处理模块，在发光模块与荧光接收模块之间设有比色皿，比色皿内盛放有上转换荧光材料标记的检测试液；所述发光模块包括红外激发光源，所述红外激发光源发出的激发光束通过激发光路照射于盛放有检测试液的比色皿上，所述检测试液发出的荧光通过接收光路由荧光接收模块接收，所述激发光路与所述接收光路成直线或者直角设置；荧光接收模块为光强传感器，所述光强传感器的输出端连接数据处理模块。
其进一步技术方案为：
所述检测试液由上转换荧光探针与病菌特异性适配体结合物、磁性探针与病菌特异性适配体结合物、待测病菌组成。
所述上转换荧光探针由上转换荧光材料经过氨基化和亲和素化制得，所述上转换荧光材料为NaY0.78F4:Yb0.2,Er0.02纳米颗粒。
所述磁性探针为亲和素化的磁珠，所述磁珠以六水合氯化高铁为铁源、1，6－己二胺作为氨基功能化试剂通过水热——溶剂热方法合成。
所述数据处理模块包括放大电路模块、抗干扰模块、单片机信号处理模块、液晶显示模块，所述放大电路模块用于放大接收的荧光信号，抗干扰模块用于将所述光强传感器输出的电压信号转换为电流信号传输，并在线路终端又转换为电压信号，所述单片机信号处理模块进行数据运算处理经将结果通过所述液晶显示模块进行实时显示。
所述数据处理模块包括通信模块，所述通信模块用于单片机与上位机之间的远程通信。
所述红外激发光源采用980nm近红外光。
本发明的技术效果：
相较于现有的采用免疫层析试纸条的检测系统，本发明采用比色皿盛放检测试液，通过比色皿来实现液相光谱检测，一方面，由于比色皿为透明的，且比色皿不存在免疫层析试纸的多个功能带需要照明的要求，相较于传统非透明试纸条的检测系统中激光光路与接收光路特定夹角的限制条件，本发明中红外光激发光路与荧光接收光路二者之间不再受到光学检测上的限制，本发明所述检测系统中，所述激发光路与接收光路采用180°直线设置或者直角设置，在同样光学检测功能的前提下，使得整个检测系统中的红外激发光源、比色皿、荧光接收模块三者的设置更为简便；第二，现有的免疫层析试纸检测系统需要设计特定结构的试纸条，试纸条包括多个功能带，需要对多个功能带采集信号进行处理，试纸条结构复杂，制备繁琐，且UCP结合物与被检物通过免疫反应固定于固相载体的表面，需要设置专门的固相载体，本发明采用比色皿省却了结构复杂、制作繁琐的免疫层析试纸，整个检测系统结构简单，制作更为简便；第三，传统免疫层析试纸条为一次性使用产品，重复检测需要不断更换及安装新的试纸条，而本发明使用比色皿，对比色皿清洗之后，即可进行重复使用。
本发明所述检测系统与传统平板菌落计数法相比，对被测试液中待检目标菌浓度的定量检测，更为快速、可靠，且稳定性好。
附图说明
图1为本发明实施例一的原理示意图。
图2为本发明实施例二的原理示意图。
图3为沙门氏菌检测荧光强度——浓度标准回归曲线。
图4为金黄色葡萄球菌检测荧光强度——浓度标准回归曲线。
其中：1、发光模块；2、荧光接收模块；3、数据处理模块；4、比色皿。
具体实施方式
下面结合附图，说明本发明的具体实施方式。
见图1、图2，本发明包括发光模块1、荧光接收模块2和数据处理模块3，在发光模块1与荧光接收模块2之间设有比色皿4，比色皿4内盛放有上转换荧光材料标记的检测试液；发光模块1包括红外激发光源，所述红外激发光源发出的激发光束通过激发光路照射于盛放有检测试液的比色皿4上，所述检测试液发出的荧光通过接收光路由荧光接收模块2接收，所述激发光路与所述接收光路成直线或者直角设置；荧光接收模块2为光强传感器，所述光强传感器的输出端连接数据处理模块3。
具体地，所述数据处理模块3包括放大电路模块、抗干扰模块、单片机信号处理模块、液晶显示模块，所述放大电路模块用于放大接收的荧光信号，所述抗干扰模块用于将光强传感器输出的电压信号转换为电流信号传输，并在线路终端又转换为电压信号输出，所述单片机信号处理模块进行数据运算处理经将结果通过液晶显示模块进行实时显示。
进一步地，所述数据处理模块3包括通信模块，所述通信模块用于单片机与上位机之间的远程通信。
检测时，将盛放有上转换荧光材料标记的检测试液的比色皿4安置好后，通过红外光源激发，比色皿4中检测试液产生与待测病菌浓度呈一定函数关系的荧光，所述荧光被荧光接收模块2检测接收转换成电信号，然后通过所述放大电路模块进行所述电信号的放大处理，同时考虑线路干扰，放大的电信号经过数抗干扰模块传输，配合所述光强传感器自身的A/D转换，转换的数字信号进入到所述单片机信号处理模块，进行数据的函数映射、算数、逻辑部分处理，由单片机将处理输出的结果通过所述液晶显示模块实时显示出待测病菌的菌类浓度，进一步地，本发明设有专门的RS232接口，可与32位上位机相连，通过远程通信技术，能够远程实时监测数据结果，并作终端数据分析。
本发明采用比色皿4盛放经过上转换荧光材料标记的检测试液，本发明只需制备好上转换荧光探针、磁性探针，通过待测病菌悬液、上转换荧光探针、磁性探针三者进行混合及常温孵育，形成三明治夹心复合物，通过与未结合的上转换荧光探针进行磁分离，倒掉上清液，用沉淀用BB(10mMTris–HCl,pH7.4,100mMKCl和1mMMgCl2)缓冲液重悬后，将重悬后的所述三明治夹心复合物试液置于比色皿4中，通过红外光源激发红外光对比色皿4照明，对所述三明治夹心复合物试液进行荧光强度测定，从而绘制待测病菌的荧光强度——浓度标准回归曲线，设置该标准回归曲线于本发明所述检测系统中，既能够进行未知浓度的样品的目标菌浓度测定，并同时与经典平板菌落计数法检测结果进行检测验证。相较于现有的采用免疫层析试纸条的检测系统，本发明采用比色皿盛放检测试液，通过比色皿来实现液相色谱检测，一方面，由于比色皿为透明的，且比色皿不存在免疫层析试纸的多个功能带需要照明的要求，相较于传统非透明试纸条的检测系统中激光光路与接收光路特定夹角的限制条件，本发明中红外光激发光路与荧光接收光路二者之间不再受到光学检测上的限制，根据比色皿的方形常用形状，本发明所述检测系统中，所述激发光路与接收光路采用180°直线设置或者直角设置，图1中所述检测系统为激发光路与接收光路成180°设置，图2中所述检测系统为激发光路与接收光路成直角设置，优选180°直线设置，使得整个检测系统中的红外激发光源、比色皿、荧光接收模块三者的设置更为简便；第二，现有的免疫层析试纸检测系统需要设计特定结构的试纸条，试纸条包括多个功能带，需要对多个功能带采集信号进行处理，试纸条结构复杂，制备繁琐，且UCP结合物与被检物通过免疫反应固定于固相载体的表面，需要设置专门的固相载体，本发明采用比色皿省却了结构复杂、制作繁琐的免疫层析试纸，整个检测系统结构简单，制作更为简便；第三，传统免疫层析试纸条为一次性使用产品，重复检测需要不断更换及安装新的试纸条，而本发明使用比色皿，对比色皿清洗之后，即可进行重复使用。
本发明所述红外激发光源采用980nm近红外激发光，其光化学稳定，环境适应性强，穿透力强且无伤害，成本相对低廉。
具体地，所述检测试液由上转换荧光探针与病菌特异性适配体结合物、磁性探针与病菌特异性适配体结合物、待测病菌组成。所述上转换荧光探针由上转换荧光材料经过氨基化和亲和素化制得，所述上转换荧光材料为NaY0.78F4:Yb0.2,Er0.02纳米颗粒；所述磁性探针为亲和素化的磁珠，所述磁珠以六水合氯化高铁为铁源、1，6－己二胺作为氨基功能化试剂通过水热——溶剂热方法合成。以下对所述上转换荧光探针和所述磁性探针的具体制备进行说明。
所述上转换荧光探针的制备过程如下：
第一步，采用水热——溶剂热方法合成NaY0.78F4:Yb0.2,Er0.02上转换纳米颗粒(以下简称为UCNPs)：取Y2O3、Yb2O3、Er2O3(Ln＝Y:Yb:Er＝78:0.2:0.02)，将三者混合物加入适量硝酸中加热溶解，并挥发掉多余硝酸，得到稀土元素的硝酸盐粉末；将稀土元素的硝酸盐粉末溶解在8mL去离子水中，再加入2.1273gEDTA(乙二胺四乙酸，其与RE3+的摩尔比为1:1)并调节pH至弱碱性，形成澄清透明的EDTA-Ln3+溶液；取25mL乙二醇，加入0.4gCTAB(十六烷基三甲基溴化铵)和前述所得的EDTA-Ln3+溶液，快速搅拌下逐滴加入HF(氢氟酸)约3mL，得到白色乳状胶体；最后，在前述所得的白色乳状胶体中加入5.5mL浓硝酸，搅拌均匀后，转移到50mL带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，195℃反应24小时。反应结束后，让其在空气中自然冷却至室温，弃上层液体，釜底的固体用热水冲洗到烧杯中，超声10分钟，然后静置数分钟，待固体沉淀至烧杯底部后，弃上层液体，再加热水超声，重复操作3次后，在烧杯中加入乙醇超声分散，最后离心所得的固体置于70℃烘箱干燥10小时，得到NaY0.78F4:Yb0.2,Er0.02上转换纳米颗粒(UCNPs)固体粉末并储存备用；
第二步，氨基化：取20mgUCNPs溶解于60mL异丙醇中，超声40分钟，然后加入2.5mL氨水和20mL水，在35℃下充分搅拌，然后一个小时内逐滴滴入溶有50uLTEOS(正硅酸乙酯)的20mL异丙醇，反应3个小时形成悬浮液，再将溶有200uLAPTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)的30mL异丙醇逐滴加入前述所得悬浮液中，反应一个小时；反应结束后在室温下熟化2小时，通过离心分离得到沉淀固体，对沉淀所得固体用乙醇洗三次，并在60℃下干燥12小时，则最终得到氨基化的上转换纳米材料；
第三步，亲和素化：根据戊二醛法，使第二步所得的氨基化的上转换纳米材料与亲和素相连，形成亲和素化的上转换纳米材料；
第四步，将第三步所得的亲和素化的上转换纳米材料，与相应病菌特异性适配体结合得到上转换荧光探针；
将第四步所得上转换荧光探针溶于5mlPBS(磷酸盐缓冲液)溶液，静置6小时，在4℃下保存待用。
所述磁性探针的制备过程如下：
第一步，采用水热——溶剂热方法合成磁珠：以六水合氯化高铁为铁源，以1，6－己二胺作为氨基功能化试剂，称取1，6－己二胺6.5g，无水醋酸钠2.0g、FeCl3·6H2O1.0g溶于30mL乙二醇，加入100mL圆底烧瓶中，50℃剧烈搅拌0.5小时左右至溶液较为透明，将溶液转移至带聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，放置在198℃高温反应6小时，反应结束后取出自然冷却至室温，将反应釜中液体倒在烧杯中，用无水乙醇和纯水交替清洗三次，将反应釜底部的黑色固体在50℃条件下干燥过夜，得到氨基化的磁性纳米粒子，即氨基化的磁珠；
第二步，亲和素化：根据戊二醛法，使第二步所得的氨基化的磁珠与亲和素相连，形成亲和素化的磁珠；
第三步，将第三步所得的亲和素化的磁珠，与相应病菌特异性适配体结合得到磁性探针；
将第三步所得磁性探针溶于10mL0.01mol/L的PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.4)溶液中，4℃保存备用。
实施例一沙门氏菌的检测
沙门氏菌经富集培养后，离心去除培养基，用平板法测定其浓度后，将其梯度稀释成不同标准浓度(cfu/ml)的菌悬液；分别取5μL沙门氏菌适配体，加入1mL浓度均为1mg/mL的亲和素化的磁珠和亲和素化的上转换纳米材料，摇床反应12小时，最后加入2％BSA(牛血清白蛋白)封闭液，得到磁性探针和上转换荧光探针；等体积的梯度沙门氏菌标准浓度菌悬液分别加入200μl上转换荧光探针和80μl磁性探针，37℃孵育40分钟后，形成三明治夹心复合物，通过与未结合的上转换荧光探针进行磁分离，倒掉上清液，用沉淀用BB缓冲液重悬后，将重悬后的所述三明治夹心复合物试液置于比色皿4中，通过红外光源激发红外光对比色皿4照明，对所述三明治夹心复合物试液进行荧光强度测定，从而绘制被测试液中沙门氏菌的荧光强度——浓度标准回归曲线见图3，图3中，横轴表示沙门氏菌菌悬液的浓度，数轴表示比色皿中所述三明治夹心复合物检测试液的荧光强度，从该回归曲线可见，比色皿中检测试液的荧光强度与沙门氏菌的浓度呈一定线性函数关系，且经统计拟合的荧光强度——浓度标准回归曲线的表达式为：Y＝169.66X-35.2，拟合系数的平方为0.9964，检出限为5cfu/ml；另一方面，通过该统计拟合的函数关系式，即能够使用本发明所述检测系统对未知浓度样品中的沙门氏菌浓度进行测定，并同时与经典平板法检测结果进行检测验证。其中，沙门氏菌适配体采用生工生物工程(上海)股份有限公司合成的沙门氏菌适配体：5'-biotin-C6-TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTATGGACATTACAG-3'。
对湖水、河水、小沟水分别取样，分别通过传统的平板菌落计数法和本发明所述检测系统检测其中沙门氏菌的浓度，二者检测结果比对如下表1：
表1平板菌落计数法与本发明所述检测系统对沙门氏菌检测的检测结果对比
根据上述表1实验数据比对可见，本发明所述检测系统与经典平板菌落计数法的检测结果基本吻合。
实施例二金黄色葡萄球菌的检测
金黄色葡萄球菌经富集培养后，离心去除培养基，用平板法测定其浓度后，将其梯度稀释成不同标准浓度(cfu/ml)的菌悬液；分别取5μL金黄色葡萄球菌适配体，加入1mL浓度均为1mg/mL的亲和素化的磁珠和亲和素化的上转换纳米材料，摇床反应12小时，最后加入2％BSA(牛血清白蛋白)封闭液，得到磁性探针和上转换荧光探针；等体积的梯度金黄色葡萄球菌标准浓度菌悬液分别加入200μl上转换荧光探针和100μl磁性探针，37℃孵育40分钟后，形成三明治夹心复合物，通过与未结合的上转换荧光探针进行磁分离，倒掉上清液，用沉淀用BB缓冲液重悬后，将重悬后的所述三明治夹心复合物试液置于比色皿4中，通过红外光源激发红外光对比色皿4照明，对所述三明治夹心复合物试液进行荧光强度测定，从而绘制金黄色葡萄球菌的荧光强度——浓度标准回归曲线，绘制的金黄色葡萄球菌的荧光强度——浓度标准回归曲线见图4，图4中，横轴表示金黄色葡萄球菌菌悬液的浓度，数轴表示比色皿中所述三明治夹心复合物检测试液的荧光强度，从该回归曲线可见，比色皿中检测试液的荧光强度与被测试液中金黄色葡萄球菌的浓度呈一定线性函数关系，且经统计拟合的荧光强度——浓度标准回归曲线的表达式为：Y＝118.5X+15.6，拟合系数的平方为0.9936，检出限为8cfu/ml；另一方面，通过该统计拟合的函数关系式，即能够使用本发明所述检测系统对未知浓度样品中的金黄色葡萄球菌浓度进行测定，并同时与经典平板法检测结果进行检测验证.。其中，金黄色葡萄球菌适配体采用生工生物工程(上海)股份有限公司合成的金黄色葡萄球菌适配体：5’-biotin-C6-GCAATGGTACGGTACTTCCTCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCATCCCACAGCTACGTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'。
对湖水、河水、小沟水分别取样，分别通过传统的平板菌落计数法和本发明所述检测系统检测其中金黄色葡萄球菌的浓度，二者检测结果比对如下表2：
表1平板计数法与本发明所述检测系统对金黄色葡萄球菌检测结果对比
根据上述表2实验数据比对可见，本发明所述检测系统与经典平板菌落计数法的检测结果基本吻合。
以上描述是对本发明的解释，不是对发明的限定，本发明所限定的范围参见权利要求，在本发明的保护范围之内，可以作任何形式的修改。

Claims (7)

1.荧光生物检测系统，包括发光模块(1)、荧光接收模块(2)和数据处理模块(3)，其特征在于：在发光模块(1)与荧光接收模块(2)之间设有比色皿(4)，比色皿(4)内盛放有上转换荧光材料标记的检测试液；所述发光模块(1)包括红外激发光源，所述红外激发光源发出的激发光束通过激发光路照射于盛放有检测试液的比色皿(4)上，所述检测试液发出的荧光通过接收光路由荧光接收模块(2)接收，所述激发光路与所述接收光路成直线或者直角设置；荧光接收模块(2)为光强传感器，所述光强传感器的输出端连接数据处理模块(3)。
2.按权利要求1所述的荧光生物检测系统，其特征在于：所述检测试液由上转换荧光探针与病菌特异性适配体结合物、磁性探针与病菌特异性适配体结合物、待测病菌组成。
3.按权利要求2所述的荧光生物检测系统，其特征在于：所述上转换荧光探针由上转换荧光材料经过氨基化和亲和素化制得，所述上转换荧光材料为NaY0.78F4:Yb0.2,Er0.02纳米颗粒。
4.按权利要求2所述的荧光生物检测系统，其特征在于：所述磁性探针为亲和素化的磁珠，所述磁珠以六水合氯化高铁为铁源、1，6－己二胺作为氨基功能化试剂通过水热——溶剂热方法合成。
5.按权利要求1所述的荧光生物检测系统，其特征在于：所述数据处理模块(3)包括放大电路模块、抗干扰模块、单片机信号处理模块、液晶显示模块，所述放大电路模块用于放大接收的荧光信号，抗干扰模块用于将所述光强传感器输出的电压信号转换为电流信号传输，并在线路终端又转换为电压信号，所述单片机信号处理模块进行数据运算处理经将结果通过所述液晶显示模块进行实时显示。
6.按权利要求5所述的荧光生物检测系统，其特征在于：所述数据处理模块(3)包括通信模块，所述通信模块用于单片机与上位机之间的远程通信。
7.按权利要求1所述的荧光生物检测系统，其特征在于：所述红外激发光源采用980nm近红外光。
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