CN109609606B - 一种dna聚合酶的相对酶活的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种DNA聚合酶的相对酶活的测定方法。将待测的DNA聚合酶与对照酶在相同的实时荧光定量PCR反应体系中分别同时进行扩增反应，反应结束后以待测组和对照组得到的CT值进行一阶曲线拟合，根据拟合曲线的K值判定是否需要调节待测酶在反应体系中的工作浓度并再次进行实时荧光定量PCR反应，直到K值满足预先设定值要求、且曲线相关系数R2满足相关性要求时，依据此次待测酶和对照酶在反应体系中的工作浓度，计算待测酶相比于对照酶的相对酶活。该方法耗时短、成本低、无需专业设备和人员，能有效解决因批次间酶活差异导致的科研实验的结果异常、以及规模化生产中分子诊断试剂盒出现的批间差异。

Description

一种DNA聚合酶的相对酶活的测定方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新的DNA聚合酶的相对酶活的测定方法。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种体外快速扩增特定DNA片段的技术，是在由DNA模板、引物、dNTP、适当缓冲液等组成的反应混合物中，由DNA聚合酶催化，对一对寡核苷酸所界定的DNA片段进行扩增的反应。在此过程中，DNA聚合酶起着关键性的作用。因此该酶广泛应用于生命科学的研究领域和分子诊断领域。
但是，由于因DNA聚合酶的生产工艺较为复杂，生产时细微不同都会导致批次间酶活出现差异。且在运输过程和保存过程中，酶活也会出现减弱或衰减，进而直接影响PCR反应时引物与模板的结合效率和扩增效率。酶活差异将导致结果出现假阳性或假阴性，降低实验的可比性和重复性，也为DNA聚合酶应用于分子诊断试剂盒的批量化生产带来较大的批次间差异，制约了DNA聚合酶在分子诊断领域的大规模应用。
提高批次间酶活的稳定性固然重要，但由于DNA聚合酶工艺的复杂程度、运输过程的不稳定因素等客观原因，难以从根本上解决酶活批间差异的问题。因此，从厂家购买DNA聚合酶的科研单位、诊断试剂盒制造企业或其他使用者，有必要检测购买到的DNA聚合酶的真实酶活(相对酶活)，在使用时通过调整浓度来避免酶活差异造成的错误结果。
目前常用的检测方法是同位素标记法，该方法在恒定温度和时间段内，通过计算将一定量同位素标记的dNTP掺入到酸不溶物质中所需的酶量得到酶活；也有的方法利用DNA聚合酶催化DNA分子的聚合过程中，会伴随焦磷酸的生成，用ATP硫酰化酶将焦磷酸转化成ATP，再利用虫荧光素酶系统发光检测ATP的量，从而确定焦磷酸的量，以此来反应Taq酶的活性。但是，这些方法耗时长、操作步骤多，更重要的是，使用的设备成本非常高、专业性强，且对操作人员有一定伤害，难以普及。DNA聚合酶使用者要购买高昂专业设备、配备专业人员才能完成，可行性差。
因此，有必要建立一种能快速方便地对DNA聚合酶的相对酶活进行检测的方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种DNA聚合酶的相对酶活的测定方法。解决因批次间酶活差异导致的科研实验的结果异常、以及规模化生产中分子诊断试剂盒出现的批间差异。
本发明采用的技术方案如下：
一种DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，包括，将待测的DNA聚合酶与对照酶在相同的实时荧光定量PCR反应体系中分别同时进行扩增反应，反应结束后以待测组和对照组得到的CT值进行一阶曲线拟合，根据拟合曲线的K值判定是否需要调节待测酶在反应体系中的工作浓度并再次进行实时荧光定量PCR反应，直到K值满足预先设定值要求、且曲线相关系数R2满足相关性要求时，依据此次待测酶和对照酶在反应体系中的工作浓度，计算待测酶相比于对照酶的相对酶活。
进一步地，上述DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，所述调节待测酶在反应体系中的工作浓度并再次进行实时荧光定量PCR反应，包括：当拟合曲线的K值大于预先设定值时，减少待测组的DNA聚合酶工作浓度；当拟合曲线的K值小于预先设定值时，增加待测组的DNA聚合酶工作浓度。
进一步地，上述DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，所述K值的预先设定值根据科研或者试剂盒产品要求进行取值，本发明中优选的K值预先设定值为0.96<K<1.04。
进一步地，上述DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，所述反应体系包括引物、探针、dATP、dGTP、dCTP、dUTP和晶芯缓冲液；
进一步地，上述DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，所述扩增反应在若干个模板浓度下进行。设置的模板浓度组别越多，获得的数据量越多，拟合曲线准确性越高，但是操作也越繁琐。优选所述扩增反应在2～8个模板浓度下进行；更优选在3～5个模板浓度下进行，最优选在4个模板浓度下进行。
进一步地，上述DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，所述扩增反应的模板为正常人基因组。
进一步地，上述DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，所述扩增反应在正常人基因组浓度为50ng/uL、25ng/uL、10ng/uL、2ng/uL中进行。
进一步地，上述DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，所述对照组的DNA聚合酶工作浓度采用1.0U/测试进行配制。
进一步地，上述DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，所述CT值的阈值设置为0.02。
进一步地，前述DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，所述一阶曲线的拟合方程为y＝Kx+b，其中K为斜率，b为截距。
进一步地，所述截距b设置为0。
进一步地，上述DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，曲线相关系数R2满足相关性要求是指R2≥0.95。
进一步地，上述DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，所述待测酶相比于对照酶的相对酶活＝对照组DNA聚合酶工作浓度/待测组DNA聚合酶工作浓度。
本发明的有益效果在于：通过该测定方法，可以判断不同批次间的酶活差异，为科研实验、大规模分子诊断试剂盒的生产提供真实(相对)酶活参考，避免假阳性/假阴性结果出现，也为检测结果中出现的异常情况提供解决办法的溯源依据；此外，计算得到的相对酶活可以指导对DNA聚合酶的加入量进行调节，从根本上解决不同批次间酶活差异带来的问题。而且本发明的方法不需要特殊设备和专业人员，检测成本低，任何可进行PCR反应的环境中均可完成，在生物技术领域具有广泛适用性。
附图说明
图1是实施例1对照组与待测组第一次测试的CT值的一阶线性拟合曲线；
图2是实施例1对照组与待测组最后一次测试的CT值的一阶线性拟合曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，包括，将待测的DNA聚合酶与对照酶在相同的实时荧光定量PCR反应体系中分别同时进行扩增反应，反应结束后以待测组和对照组得到的CT值进行一阶曲线拟合，根据拟合曲线的K值判定是否需要调节待测酶在反应体系中的工作浓度并再次进行实时荧光定量PCR反应，直到K值满足预先设定值要求、且曲线相关系数R2满足相关性要求时，依据此次待测酶和对照酶在反应体系中的工作浓度，计算待测酶相比于对照酶的相对酶活。
本发明的测定方法适用于生命科学领域常用的DNA聚合酶，如rTaq DNA聚合酶、HotStarTaq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶等。这些DNA聚合酶不限于某个厂家所生产的具体品牌或具体规格。
本发明的测定方法优选在不同的PCR模板浓度下进行，然后将待测组和对照组各个浓度下获得的CT值进行一阶曲线拟合。在本发明的一个实施例中选用了正常人基因组4个浓度：50ng/uL、25ng/uL、10ng/uL、2ng/uL。
但该方法中的PCR扩增模板并不限于正常人基因组，甚至不限于人类基因，是根据试验目的可加以变换的。
本发明的测定方法在根据试验要求确定K的预先设定值和R2后，可以获得待测组相较于已知对照组的相对酶活，而非绝对酶活，规避了试验中若干主客观因素造成的误差，对实际生产和科学研究具有更可靠的指导意义。
以下实施例中所用的试剂都是本领域容易获得的产品，均可商购获得。
实施例1
以Qiagen公司生产的HotStarTaq DNA聚合酶的两个不同批次的酶为例进行相对酶活的测定：
1)配制一个公共的实时荧光定量扩增无酶体系，该体系包括引物、探针、dATP、dGTP、dCTP、dUTP、晶芯缓冲液，按照表1加入相应物料，其中引物和探针信息如表2所示；
表1无酶体系配制
序号 名称 初始浓度 每测试加入量(μl)
1 纯化水 / 10.8
2 晶芯缓冲液 / 2.5
3 上游引物 50μM 0.5
4 下游引物 50μM 0.5
5 探针 40μM 0.5
6 dATP 100mM 0.05
7 dGTP 100mM 0.05
8 dCTP 100mM 0.05
9 dUTP 100mM 0.05
Total / 15
表2引物和探针信息
Figure BDA0001882876710000041
Figure BDA0001882876710000051
2)配制一组正常人基因组作为扩增模板，浓度为50ng/μl、25ng/μl、10ng/μl、2ng/μl，所述的正常人基因组使用1×TE(10mM Tris-Cl，1mM EDTA，pH8.0)进行稀释；
3)从公共的无酶体系取等量体积，将待测酶和对照酶分别加入，使工作浓度均为1.0U/测试；
4)按照每个测试加入5μl模板、20μl体系的比例，将所述的正常人基因组分别加入到上述的两个体系中，进行实时荧光定量PCR反应，反应程序设置见表3；
表3 PCR扩增程序
Figure BDA0001882876710000052
5)反应完成后，设置阈值为0.02，导出所有测试的CT值，对待测组和对照组的CT值进行截距为0的一阶线性曲线拟合，结果如图1所示；
6)上述的曲线拟合结果，本次实例中斜率K＝1.1623不满足预设值0.96<K<1.04的条件，应依据K值大小重新调整待测酶加入到公共无酶体系中的工作浓度。K<0.96，则增加工作浓度，K>1.04，则减少工作浓度。
7)重新调整待测酶浓度后再次进行测定，重复步骤4)～6)，直至满足0.96<K<1.04且R2≥0.95。此时待测酶的工作浓度为1.5U/测试时，进行曲线拟合后斜率K＝1.0327，R2＝0.9924，如图2；
8)按照相对酶活计算公式(相对酶活＝对照组DNA聚合酶工作浓度/待测组DNA聚合酶工作浓度)进行计算，待测酶的相对酶活＝1.0/1.5＝0.667。
该相对酶活测定后可以很好地指导研究人员或生产人员通过调整聚合酶浓度弥补购买产品酶活差异导致的试验结果差异或者试剂盒检测结果差异。

Claims (12)

1.一种DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，其特征在于，包括：将待测的DNA聚合酶与对照酶在相同的实时荧光定量PCR反应体系中分别同时进行扩增反应，反应结束后以待测组和对照组得到的CT值进行一阶曲线拟合，根据拟合曲线的K值判定是否需要调节待测酶在反应体系中的工作浓度并再次进行实时荧光定量PCR反应，直到K值满足预先设定值要求、且曲线相关系数R2满足相关性要求时，依据此次待测酶和对照酶在反应体系中的工作浓度，计算待测酶相比于对照酶的相对酶活；
所述扩增反应的模板为人类基因组，
扩增引物、探针包括：
上游引物：AGCCATTTACCGTACATAGCA，
下游引物：GGGATATTGATTTCACGGAGG，
探针：NED-CCATGGATGACCC-MGB；
所述扩增反应的扩增程序为：
Figure FDF0000020448850000011
2.根据权利要求1所述的DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，其特征在于，所述调节待测酶在反应体系中的工作浓度并再次进行实时荧光定量PCR反应，包括：当拟合曲线的K值大于预先设定值时，减少待测组的DNA聚合酶工作浓度；当拟合曲线的K值小于预先设定值时，增加待测组的DNA聚合酶工作浓度。
3.根据权利要求1所述的DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，其特征在于，所述K值的预先设定值为0.96<K<1.04。
4.根据权利要求1所述的DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，其特征在于，所述反应体系包括引物、探针、dATP、dGTP、dCTP、dUTP和晶芯缓冲液。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，其特征在于，所述扩增反应在2～8个模板浓度下进行。
6.根据权利要求1～4任意一项所述的DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，其特征在于，所述扩增反应的模板为正常人基因组，且扩增反应在正常人基因组浓度为50ng/uL、25ng/uL、10ng/uL、2ng/uL中进行。
7.根据权利要求1～4任意一项所述的DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，其特征在于，所述对照组的DNA聚合酶工作浓度采用1.0U/测试进行配制。
8.根据权利要求1～4任意一项所述的DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，其特征在于，所述CT值的阈值设置为0.02。
9.根据权利要求1～4任意一项所述的DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，其特征在于，所述一阶曲线的拟合方程为y＝Kx+b，其中K为斜率，b为截距。
10.根据权利要求9所述的DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，其特征在于，所述b设置为0。
11.根据权利要求1～4任意一项所述的DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，其特征在于，所述一阶曲线的相关系数R2满足相关性要求是指R2≥0.95。
12.根据权利要求1～4任意一项所述的DNA聚合酶的相对酶活的测定方法，其特征在于，所述相对酶活＝对照组DNA聚合酶工作浓度/待测组DNA聚合酶工作浓度。
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