CN102879343B - 用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法；基于光吸收线性加和性及酶显色底物与其对应显色产物的等吸收波长，建立多波长吸收同步测量单通道同步测定多种酶活性所需显色底物组合设计原理及消除吸收光谱重叠干扰的数据处理方法，并以数值积分的速度方程分析酶反应过程测定最大反应速度消除各种底物及产物对待测酶活性的干扰，使单通道同步测定多种酶活性的范围及检测限都与单独测定时相当；该方法可用于同步测定生物样品多种酶活性、酶标记免疫分析同步测定多组分含量、同步筛选不同靶酶的抑制剂，可用于临床生化分析和临床免疫检验、卫生检验、酶抑制剂筛选等常规实践，也可用于这类酶法分析技术适用的各种基础研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种用多波长吸收同步测量技术实现多种酶活性同步测量方法，具体涉及一种单通道同步测定多波长吸收而同步测量多种酶活性的方法。
背景技术
定义酶活性测量灵敏度为吸收变化速度对酶量响应曲线斜率，酶活性测量的定量限(limitof quantification,LOQ)为上述响应曲线中直线部分截距加上回归估计标准差5倍对应酶量。测定酶活性都要求灵敏度尽量高、定量限尽量低而分析效率尽量高。用针对特定酶的高专一性显色底物可简便高灵敏度连续测定吸收变化反应曲线而测定酶活性；这类酶活性测定过程常规用于临床生化检验、卫生检验检测酶抑制剂类食品或环境污染物、高通量筛选酶抑制剂类组合库和酶标记免疫分析等。另一方面，酶活性测定的高特异性和高灵敏度使酶作为标记信号用于免疫分析，代表性技术即酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked immunoassay,ELISA)，这是临床检验领域选择性测定混合物中特定大分子或小分子的最常用方法之一。ELISA应用过程中需用捕获成分包被微孔板以便分离免疫反应复合物，并需洗涤过程，单次分析常需130min以上，分析效率低。所以，提高酶活性测量效率在应用中有重要意义。
连续跟踪酶反应曲线测定酶活性都每次使用一个显色底物测定一种酶活性，即每个反应通道每次只测定一种酶。在临床检验领域经常需测定相同标本中的两种甚至多种酶活性，如测定肝功状态需测定相同标本中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、γ-谷氨酰基转移酶、碱性磷酸酶等，诊断急性胰腺炎时需测定相同标本中的淀粉酶和脂肪酶。另一方面，ELISA技术主要缺点是其分析效率低，单次分析耗时长。再有，筛选酶抑制剂组合化学库时，每次只测定一种靶酶活性的筛选成本很高而效率低，对组合库样品的消耗量大。发展新技术显著提高测定酶活性效率，并保障测量酶活性的灵敏度和定量限与单组分测定时相当，无疑有重要意义。
提高酶法分析效率的最简单策略是在一个酶反应体系，即酶反应通道，每次使用多种显色底物实时同步或基本实时同步地连续跟踪多种酶显色产物吸收变化曲线同步测定多种酶活性。同步测定多波长吸收光度计已普及，如Biotek ELX800酶标仪可同步测量三波长吸收、美谱达UV1600PC普通光度计可同步测定七波长吸收。这些常规设备同步测定不同波长吸收实际上有较短时差；用有双单色器或用二极管阵列检测器的光度计可基本实时同步测量多波长吸收。所以，建立单通道同步测定多种酶的显色底物组合原理及所需数据处理方法，就有望实现单通道多波长吸收同步跟踪多种酶反应过程同步测量多种酶活性并保障与单组分测定定量限和灵敏度相当，此方法用于ELISA及酶抑制剂高内涵筛选都可显著提高效率。
很早报道用两种酶标记单通道测量两组分的ELISA技术，但没有实现单通道两种酶同步反应和吸收连续跟踪。Blake等1982年报道用碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶标记两种抗原竞争结合测定单通道同步测定半抗原(Clin Chem1982；28(7):1469-1473)。但这两种酶反应是在不同反应体系进行而非同步进行，且不能连续跟踪任一标记酶反应的过程，其使用酚酞单磷酸酯为碱性磷酸酶显色底物，比活性低于对硝基苯基磷酸酯为显色底物时比活性的7％而降低了灵敏度，而酚酞单磷酸酯的成本又很高，使得此技术没有得到实际应用。其它单通道检测两组分的ELISA技术中两种酶反应及两种酶显色产物检测都不同步，也不能连续跟踪两种酶反应曲线(Dean et al.,Clin Chem,1983；29(6):1051-1056。Ng,et al.Clin Chem,1987；33(12):2286-2288。Choi,et al.Clin Chem,1991；37(5):673-677。Porstmann T,et al.J Immunol Methods.1993；158:95-106。Krambovitis E,et al.Clin chem1995；41:48-53。Osuchowski,et al.Methods2006；38:304-311和Sun J,et al.Anal Chim Acta2010；666:76-82)。因此，现有ELISA技术都未实现单通道同步反应同步连续跟踪多种酶显色显色产物；在筛选酶抑制剂领域，也没有实现单通道同步测量多种酶活性筛选酶抑制剂的报道。
显然，需建立测定酶活性的显色底物设计组合原理及对应的特殊数据处理方法，才可能用常规设备多波长吸收单通道同步测量多种酶活性。在863项目2011AA02A108资助下，发明人建立了本发明权利要求书中所提出的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其基于无相互作用物质吸收的线性加和性、酶显色底物和相应显色产物的等吸收波长建立所需显色底物设计和组合应用的新原理，并建立多种物质吸收光谱重叠干扰的数据处理方法，以及消除不同酶的底物与产物之间相互干扰的数据处理方法，单通道多波长吸收同步测定多种酶活性。
本发明用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，包括下列步骤：
a.确定用多波长吸收单通道同步测定多种酶活性所需显色底物组合：
a1根据待测酶的专一性筛选满足下列条件的显色底物组合：所选显色团能分别用于制备待测酶的显色底物；所得这些显色底物组合中，将显色底物在对应待测酶作用下所得显色产物相对该显色底物的差吸收峰最大波长从大到小排列，相邻的显色产物差吸收峰最大波长之间相距大于30nm且尽量远；在按显色产物差吸收峰最大波长从大到小的排列中，除了显色产物差吸收峰最靠近红外端的显色底物外，每个显色底物在对应酶作用下所得显色产物差吸收峰最大波长，都与此排列中某个显色底物的最大等吸收波长相差小于25nm且尽量短；
a2用步骤a1所选显色团分别合成待测酶的对应显色底物并组合使用；
b.在一个反应混合物或酶反应体系即单反应通道中，同步启动多个待测酶针对组合使用的显色底物混合物对应显色底物的专一催化反应；
c.选择测量波长组合：以显色产物差吸收峰最靠近红外端的显色底物为显色底物A，在显色底物A的显色产物差吸收峰最大波长下测定该显色产物吸收；在显色底物A的等吸收波长处测定其余待测酶显色产物或显色底物的吸收；
d.在所选多个测量波长组合下，通过快速变换测量波长，多波长吸收同步测量实现同步跟踪单通道中多个待测酶的反应过程；
e.基于无相互作用物质吸收的线性加和性建立消除反应通道中显色物质吸收重叠干扰的数据处理方法，获得消除吸收光谱重叠干扰后每个待测酶的显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线；如某个待测酶不受反应体系其它酶的产物及底物的干扰且其底物浓度在对应酶米氏常数的3倍以上，用经典初速度法分析其显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线确定初速度；如某个待测酶不受反应体系其它酶的产物及底物的干扰但所用显色底物浓度在该酶米氏常数的5％以上而低于米氏常数的3倍，联用经典初速度法和反应过程分析法分析其显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线确定初速度；当某个待测酶受反应体系中其自身和/或其它酶的底物和/或产物的干扰时，将描述反应体系动力学的微分速度方程组数值积分后分析活性受到干扰待测酶反应的显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线，确定其最大反应速度表示其活性，或据其微分速度方程和所得最大反应速度换算成底物浓度为起始底物浓度93％时初速度表示酶活性。
进一步，应用该方法时，显色产物相对显色底物差吸收峰最大波长在300nm以上且其显色底物吸收峰最大波长小于相应显色产物吸收峰最大波长，否则用逆反应测定该酶的活性；对待测酶显色底物组合中显色产物差吸收峰最大波长相邻的任两个显色底物，显色产物差吸收峰最大波长更靠近红外端者的最大等吸收波长与显色产物差吸收峰最大波长更靠近紫外端者的差吸收峰最大波长相等或相距不超过5nm为优化组合；所用显色底物组合中每个显色底物都仅被样品中的一种待测酶作用生成显色产物，而不被样品中其它任何酶作用或作用效果不明显；此处所述不被其它任何酶作用或作用效果不明显，指当样品中酶I所对应显色底物的浓度与其米氏常数相差小于50％时，样品中其它任何酶作用于该显色底物的比活性都低于酶Ⅰ作用于该显色底物比活性的1％；权利要求1的步骤b中，选择适于同步测定活性的待测酶发挥作用的缓冲介质和反应条件，具体包括：缓冲介质pH位于pH5.0到9.0之间且接近比活性最低待测样品的最适pH，所用样品反应温度在摄氏20到40度之间。
进一步，该方法应用时所述显色底物包括天然显色底物和非天然显色底物；天然显色底物包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；非天然显色底物由显色团和被酶识别基团组成，显色团包括但不限于4-硝基苯酚、4-硝基苯硫酚、4-硝基苯胺、4-硝基-1-萘酚、4-硝基-1-萘硫酚、4-硝基-1-萘胺、2-萘酚、4-氯苯酚、玫红酸或其衍生物。
进一步，该方法应用于同步测量两种酶活性，步骤a中，所述样品中含两种待测酶分别命名为酶A和酶B，所需两种显色底物分别命名为显色底物A和显色底物B，在两种待测酶作用下生成两种显色产物分别命名为显色产物A和显色产物B，这些显色底物及显色产物的组合需满足下列条件：(1)显色产物A差吸收峰最大波长X1靠近红外端，显色产物B差吸收峰最大波长X2靠近紫外端，显色产物B差吸收峰最大波长X2与显色产物A差吸收峰最大波长X1相距大于30nm且尽量远；(2)显色产物A的最大等吸收波长为Y1且与显色产物B差吸收峰最大波长X2相距小于25nm且且尽量短。
该方法应用于同步测量两种酶活性的步骤b和c及d中，在一个反应通道同步启动样品中两种酶针对显色团A和显色团B合成的对应显色底物A和显色底物B的反应，并得到显色产物A和显色产物B；以显色产物A的最大等吸收波长Y1为λ2处测定显色产物B吸收，以显色产物A的差吸收峰最大波长X1为λ1处测定显色产物A吸收；通过快速变换测量波长，两波长吸收同步测量实现同步跟踪单个反应体系中两种待测酶的反应过程。
该方法应用于同步测量两种酶活性的步骤e中，基于吸收线性加和性建立数据解析消除多种物质吸收重叠干扰方法；以显色产物A差吸收峰最大波长前后不超过25nm的波长为λ1且在此波长下吸收为A1，以显色产物A和显色底物A最大等吸收波长附近不超过25nm的波长为λ2且此波长下吸收为A2，基于吸收线性加和性消除物质吸收重叠干扰需解如下二元一次方程组：A1＝A10+E31×P1+E34×P2
A2＝A20+E32×P1+E35×P2
进一步可转变成如下二元一次方程组
A1＝A10+A1a+R33×A2b A2＝A20+A2b+R31×A1a
R31＝E32/E31 R33＝E34/E35
P1为显色产物A瞬时浓度；P2为显色产物B瞬时浓度；E31为显色产物A与显色底物A在λ1下差摩尔消光系数；E32为显色产物A与显色底物A在λ2下差摩尔消光系数E32；E34为显色产物B与显色底物B在λ1下差摩尔消光系数；E35为显色产物B与显色底物B在λ2下差摩尔消光系数；A1为校正吸收干扰前在λ1瞬时总吸收，A2为校正吸收干扰前在λ2瞬时总吸收；A1a为校正吸收干扰后显色产物A在λ1瞬时净吸收，其等于P1和E31乘积，A2b为校正吸收干扰后显色产物B在λ2瞬时净吸收，其等于P2和E35乘积；A10为反应体系未生成任何显色产物前在λ1的吸收，为来自反应体系的本底，相当于含相同浓度全部显色底物反应体系在λ1吸收与含相同浓度样品反应体系在λ1吸收的加和；A20为反应体系未生成任何显色产物前在λ2的吸收，为来自反应体系的本底，相当于含浓度相同全部显色底物的反应体系在λ2吸收与含相同浓度样品反应体系在λ2吸收的加和；
当仅某种酶显色产物对另一种酶有竞争抑制作用时，确定显色产物A及显色产物B在λ1下和在λ2下的无干扰吸收变化曲线A1a和A2b；设初始显色底物A的浓度为C1，初始显色底物B的浓度为C2；设酶B最大反应速度为VmB，由VmB换算成初速度所用预设显色底物浓度等于C2的93％，酶B对显色底物B的米氏常数为KmB；如显色产物A对酶B为竞争性抑制，其竞争性抑制常数为Kia，酶B动力学方程为:
对上述方程两边对反应时间从0～t进行积分得到
左边的积分项为反应时刻t和反应时刻0之间显色产物B的净吸收变化；方程右边积分项以dt内显色产物A浓度恒定进行数值积分，即计算
以dt为Δt，计算每个记录点的x，将所有x求和再减去起点和终点x得到sumx，用如下公式计算VmB并据其微分动力学方程得无干扰初速度s2。
上述计算公式中，酶A将显色底物A转变成显色产物A的计量关系为1:1，酶B将显色底物B转变成显色产物B的计量关系也为1:1；
当酶A的产物对酶B抑制作用类型不同时，所得酶B的米氏动力学方程不同而所需数值积分过程相同，并仍用93％C2为初始底物浓度计算s2；
进一步，该方法用于同步测量两种酶活性有如下特征：
步骤a中，如下选择显色团组合：显色团A和显色团B使显色产物A最大等吸收波长Y1与显色产物B差吸收峰最大波长X2相等或相距不超过5nm；
步骤c中，选择产物A差吸收峰最大波长X1为λ1后，如下选择测量波长λ2：显色产物B与显色底物B差摩尔消光系数在显色产物A最大等吸收波长Y1处高于在显色产物B差吸收峰最大波长X2处的30％，则选择显色产物A最大等吸收波长Y1为λ2，否则，用最靠近显色产物A最大等吸收波长Y1的显色产物B差吸收峰波长为λ2，或最靠近显色产物B差吸收峰且其它待测显色显色产物与显色显色底物差摩尔消光系数都小于显色产物B与显色底物B差摩尔消光系数20％的波长为λ2测量显色产物B吸收；
步骤e中，需测定R31为显色产物A吸收干扰的校正系数；测定R31时，仅用酶A所需的全部显色底物而不加其它待测酶的任何显色底物，使反应体系无来自显色底物B及显色产物B在两个测量波长λ1和λ2的吸收，此时同步测定反应通道中在两个测量波长下的吸收变化，直到在λ2吸收变化大于0.005或在λ1吸收变化大于0.500；以在λ1下吸收为横坐标，在λ2下吸收为纵座标进行回归分析，所得回归直线斜率为校正系数R31；
步骤e中，需测定R33为显色产物B吸收干扰的校正系数；测定R33时，仅用酶B所需的全部显色底物而不加其它待测酶的任何显色底物，使反应体系无来自显色底物A及显色产物A在两个测量波长λ1和λ2的吸收，此时同步测定反应通道中在两个测量波长下的吸收变化，直到在λ2吸收变化大于0.500或在λ1吸收变化大于0.005；以在λ2下吸收为横坐标，在λ1下吸收为纵座标进行回归分析，所得回归直线斜率为校正系数R33；
进一步，该方法用于同步测量两种酶活性时，酶A对应显色底物包括水解反应最大等吸收波长在310到330nm之间的4-硝基苯基乙酸酯，水解反应最大等吸收波长在330到350nm之间的4-硝基苯基磷酸酯、4-硝基苯基硫酸酯、4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷和γ-谷氨酰基-4-硝基苯胺，还原反应最大等吸收波长在350到370nm之间5-巯基-2-硝基苯甲酸及5-巯基-2-硝基苯乙酸，其显色底物为二硫化物被酶作用所释放的硫醇还原；与此类酶A的显色底物A对应的显色底物B主要是天然显色底物，包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；上述显色底物A对应的酶A包括但不限于芳香酯酶、磷酸酶、硫酸酯酶、γ-谷氨酰基转移酶、肽酶即天然氨基酸α-羧基对应的酰胺酶和糖苷酶；与此类酶A对应的酶B包括但不限于乳酸脱氢酶LDH、苹果酸脱氢酶MDH、偶联LDH的谷丙转氨酶和偶联MDH的谷草转氨酶。
进一步，该方法用于同步测量三种酶活性，三种待测酶分别命名为酶A、酶B和酶C，所需显色底物三种分别命名为显色底物A、显色底物B和显色底物C，在对应酶作用下生成显色产物分别命名为显色产物A、显色产物B和显色产物C；这些显色底物组合需满足下列条件：(1)显色产物A差吸收峰最大波长为X1且最靠近红外端，显色产物C差吸收峰最大波长为X3且最靠近紫外端，显色产物B差吸收峰最大波长为X2且位于X1和X3之间，X2与X1及X3相距都大于30nm且尽量远；(2)显色产物A的最大等吸收波长为Y1且次大等吸收波长为Ys；显色底物B生成显色产物B的最大等吸收波长为Y2且与Y1相距尽量远而和Ys相距尽量短；(3)Y1与X2相距小于25nm且相距尽量短；Y2和Ys及X3相距都小于25nm且相距尽量短；
该方法用于同步测量三种酶活性时，步骤b中，在一个反应通道同步启动三种酶针对显色底物A、显色底物B和显色底物C的反应，并得到显色产物A、显色产物B和显色产物C；
该方法用于同步测量三种酶活性时，步骤c中，选显色产物A最大等吸收波长Y1或相距25nm以内的波长为λ2测显色产物B吸收，选显色产物A差吸收峰最大波长X1或相距25nm以内波长为为λ1测显色产物A吸收，选显色产物B最大等吸收波长Y2或相距25nm以内的波长为λ3测显色产物C吸收；
该方法用于同步测量三种酶活性时，步骤d中，通过快速变换测量波长，三波长吸收同步测量实现同步跟踪单个反应体系中两种样品的反应过程；
该方法用于同步测量三种酶活性时，步骤e中，基于吸收的线性加和性建立数据解析消除多种物质吸收重叠干扰需解如下三元一次方程组：
A1＝A10+A1a+R33×A2b+R35×A3c
A2＝A20+A2b+R31×A1a+R36×A3c
A3＝A30+A3c+R32×A1a+R34×A2b
R31＝E32/E31 R32＝E33/E31 R33＝E34/E35
R34＝E36/E35 R35＝E37/E39 R36＝E38/E39
上述公式中，A1为校正吸收干扰前在λ1瞬时吸收，A2为校正吸收干扰前在λ2瞬时吸收，A3为校正吸收干扰前在λ3瞬时吸收；A1a为校正吸收干扰后显色产物A在λ1瞬时净吸收，A2b为校正吸收干扰后显色产物B在λ2瞬时净吸收，A3c为校正吸收干扰后显色产物C在λ3瞬时净吸收；A10为反应体系未生成任何显色产物前在λ1吸收，A20为反应体系未生成任何显色产物前在λ2吸收，A30为反应体系未生成任何显色产物前在λ3吸收；E31为显色产物A与显色底物A在λ1下差摩尔消光系数，E32为显色产物A与显色底物A在λ2下差摩尔消光系数，E33为显色产物A与显色底物A在λ3下差摩尔消光系数；E34为显色产物B与显色底物B在λ1下差摩尔消光系数，E35为显色产物B与显色底物B在λ2下差摩尔消光系数，E36为显色产物B与显色底物B在λ3下差摩尔消光系数；E37为显色产物C与显色底物C在测量波长λ1下差摩尔消光系数，E38为显色产物C与显色底物C在测量波长λ2下差摩尔消光系数，E39为显色产物C与显色底物C在测量波长λ3下差摩尔消光系数；上述公式中，显色底物A转变成显色产物A计量关系为1:1；显色底物B转变成显色产物B的计量关系为1:1；显色底物C转变成显色产物C的计量关系为1:1；
进一步，该方法用于同步测量三种酶活性时，步骤e中需显色产物A吸收干扰校正系数R31和R32；测定时仅用酶A的全部显色底物而不用其它待测酶的任何显色底物，使得反应体系无来自显色底物B及显色产物B、显色底物C及显色产物C在三个测量波长λ1、λ2和λ3吸收，同步测定反应通道中在三个测量波长下的吸收变化，直到在λ2及λ3吸收变化都大于0.005或在λ1吸收变化大于0.500；以在λ1下吸收变化为横坐标，在λ2下和在λ3下吸收变化为纵座标进行回归分析，所得在λ2下吸收变化回归直线斜率为校正系数R31，在λ3下吸收变化回归直线斜率为校正系数R32；
该方法用于同步测量三种酶活性时，步骤e中需要显色产物B吸收干扰校正系数R33和R34；测定时仅用酶B的全部显色底物而不用其它待测酶的任何显色底物，使得反应体系无来自显色底物A及显色产物A、显色底物C及显色产物C在三个测量波长λ1、λ2和λ3吸收贡献，同步测定反应通道中三个波长下的吸收变化，直到在λ2及λ3吸收变化都大于0.005或在λ1吸收变化大于0.500；以在λ2下吸收变化为横坐标，在λ1下和在λ3下吸收变化为纵座标进行回归分析，所得在λ1下吸收变化回归直线斜率为校正系数R33，在λ3下吸收变化回归直线斜率为校正系数R34；
该方法用于同步测量三种酶活性时，步骤e中需要显色产物C吸收干扰校正系数R35和R36；测定时仅用酶C的全部显色底物而不用其它待测酶的任何显色底物，使得反应体系无来自显色底物A及显色产物A、显色底物B及显色产物B在三个测量波长λ1、λ2和λ3吸收贡献，同步测定反应通道中三个波长下的吸收变化，直到在λ2及λ1吸收变化都大于0.005或在λ3吸收变化大于0.500；以在λ3下吸收变化为横坐标，在λ1下和在λ2下吸收变化为纵座标进行回归分析，所得在λ1下吸收变化回归直线斜率为校正系数R35，在λ2下吸收变化回归直线斜率为校正系数R36；
该方法用于同步测量三种酶活性时，步骤a中，可用如下原则选择显色底物组合：所用显色底物A、显色底物B及显色底物C应使显色产物A最大等吸收波长Y1与显色产物B差吸收峰最大波长X2相等或相距不超过5nm、显色产物B最大等吸收波长Y2和显色产物A次大等吸收波长Ys及显色产物C差吸收峰最大波长X3相等或任两者相距不超过5nm；
该方法用于同步测量三种酶活性时，步骤c中，选择显色产物A差吸收峰最大波长X1为λ1，还可按如下原则选择另外两个测量波长λ2和λ3：显色产物B与显色底物B差摩尔消光系数在显色产物A最大等吸收波长Y1处高于显色产物B与显色底物B在二者差吸收峰最大波长X2处差摩尔消光系数的30％时，选择Y1为测量波长λ2，否则，用最靠近显色产物A最大等吸收波长Y1的显色产物B差吸收峰波长，或靠近显色产物B差吸收峰且其它显色产物与显色显色底物差摩尔消光系数都小于显色产物B与显色底物B差摩尔消光系数20％的波长为λ2测量显色产物B吸收；显色产物C与显色底物C差摩尔消光系数在显色产物A次大等吸收波长Ys处或显色产物B与显色底物B最大等吸收波长Y2处应高于二者在其差吸收峰最大波长X3处差摩尔消光系数的30％时，则选择Y2或Ys为为λ3测量显色产物B吸收，否则用最靠近显色产物B最大等吸收波长Y2或显色产物A次大等吸收波长Ys或靠近显色产物C差吸收峰最大波长且其它显色产物与显色底物差摩尔消光系数都小于显色产物C与显色底物C差摩尔消光系数20％的波长为λ3测量显色产物C吸收；
进一步，该方法用于同步测量三种酶活性时，与酶A对应的显色底物A包括4-硝基-1-萘基磷酸酯且其水解的两个等吸收波长分别在315到335nm之间及395到415nm之间、4-硝基-1-萘基硫酸酯且其水解的两个等吸收波长分别在315到335nm之间及395到415nm之间、4-硝基-1-萘基乙酸酯且其水解时两个等吸收波长分别在310到330nm之间及375到395nm之间、4-硝基-1-萘基-D-半乳糖苷且其水解时两个等吸收波长分别在320到345nm之间及390到410nm之间、4-硝基-1-(N-赖氨酰)萘胺且其水解最大等吸收波长分别在385到410nm之间，这些显色底物A被酶A作用生成显色产物A为4-硝基-1-萘酚或4-硝基-1-萘胺或其衍生物；与此类显色底物A对应显色底物B主要是4-硝基苯酚或4-硝基苯胺衍生物，在相应酶B作用下生成显色产物B为4-硝基苯酚或4-硝基苯胺或4-硝基苯基硫醇；与此类显色底物A和显色底物B对应显色底物C包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；
该方法用于同步测量三种酶活性时，与显色底物A对应酶A包括但不限于芳香酯酶、磷酸酶、硫酸酯酶、γ-谷氨酰基转移酶、肽酶即天然氨基酸α-羧基对应的酰胺酶和糖苷酶；与显色底物B对应的酶B包括与已选酶A不同但属于酶A的其它水解酶；与显色底物C对应的酶包括但不限于乳酸脱氢酶LDH、苹果酸脱氢酶MDH、偶联LDH的谷丙转氨酶和偶联MDH的谷草转氨酶。
本发明的有益效果：本发明用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性，基于无相互作用物质吸收线性加和性及酶显色底物和相应显色产物等吸收波长特征，建立酶活性测定显色底物设计和组合应用的新原理及解决多种物质吸收光谱重叠干扰的数据处理方法，及消除不同酶的底物及产物之间相互干扰的数据处理方法，实现基于多波长吸收同步测量单通道同步测定多种酶活性；可同步测定生物样品中多种酶活性、酶标记免疫分析同步测定多种组分、同步筛选针对不同靶酶的抑制剂；可用于临床生化分析和临床免疫检验、卫生检验、筛选酶抑制剂等常规实践，也可用于这类酶法分析技术适用的基础研究。
用本发明所述方法单通道同步测定多种酶活性还有特殊情况需考虑。经典初速度法仅分析反应初始阶段显色产物吸收线性增加部分的平均速度为经典初速度表示酶活性。光度计可测吸收范围有限。用显色底物A和显色产物A等吸收波长Y1为λ2测定显色产物B吸收可降低干扰，但显色底物A吸收在Y1处构成本底；为使显色产物B吸收测量范围足够宽，来自显色底物A在Y1处或λ2的本底吸收就不能太高，所用显色显色底物A浓度范围就有限。在有限显色底物A浓度下，测定酶A的经典初速度上限就较低。为了在有限显色底物A浓度下拓宽测定酶A初速度的上限，可用分析酶反应过程获得计算初速度和经典初速度法联用的新策略测定酶活性；这种新策略不是本发明所要求保护的内容，而是授权中国发明专利(ZL 200710093081.4)已保护的内容；当需要应用这种新策略时，属于ZL 200710093081.4与本发明所述平台技术的交叉。
本发明提出通过单通道多波长吸收同步测量而同步跟踪多种酶反应过程，实现单通道多种酶活性同步测定的新方法学，其依赖于显色底物组合筛选、测量波长组合选择、快速变换吸收测量波长同步跟踪多波长吸收变化、消除吸收干扰的数据处理方法、消除不同酶的底物和产物间相互干扰的数据处理方法(图1)。
实现两波长吸收单通道同步测定两种酶活性的代表性过程如下：
(1)筛选显色团A和显色团B用于合成两种待测酶的显色底物，此两种显色团应同时满足如下要求：(a)显色产物A差吸收峰最大波长X1靠近红外端、显色产物B差吸收峰最大波长X2靠近紫外端，X2与X1相距大于30nm且越远越好，(b)显色底物A生成显色产物A的最大等吸收波长Y1与显色产物B差吸收峰最大波长X2相距小于25nm且相距越短越好(图1和表1)；(c)理想的显色团A和显色团B应使Y1与X2相等或相距不超过5nm；
(2)合成对应的两种显色显色底物；这些显色底物合成细节和合成工艺将作为其它发明申请保护的内容而不是本发明所要求保护的内容；
(3)在一个反应通道同步启动两种酶针对这两种显色显色底物的反应，以Y1为λ2测定显色产物B吸收，以X1处为λ1测定显色产物A吸收；通过快速变换测量波长，两波长吸收同步跟踪单个反应体系中两个酶的反应过程；
(4)建立消除多种物质吸收光谱重叠干扰的特殊数据处理方法，获得每种待测酶显色产物或底物的无干扰吸收变化曲线；
(5)建立消除不同酶的底物及产物间相互干扰的数据处理方法，分析两种酶反应的无干扰吸收变化曲线，数值积分拟合获得无干扰的酶最大反应速度；
上述第(4)条消除吸收重叠干扰的数据处理方法不依赖于测量波长组合，也不依赖于显色底物的组合；但是，当上述第(1)条的(c)不满足时，酶活性测量的定量限将逊于单组分测定；获得按上述第(1)条的(c)所述的理想显色底物A和B组合并按第(3)条所述选择测量波长组合，则此方法的性能与单组分测定相当。
在酶活性测定中常用显色产物主要是4-硝基苯酚、4-硝基苯胺及其衍生物和NADH及NADPH等(图2)。测定酶活性常用天然显色底物NADH和NADPH的测量波长可选320到355nm之间。4-硝基苯酚和4-硝基苯胺类显色底物在酶作用下的最大等吸收波长在310到350nm之间而显色产物差吸收峰最大波长接近400nm；在酶作用下，4-硝基苯酚或4-硝基苯胺在400nm附近吸收超过1.0时在其最大等吸收波长的吸收都无显著改变(图3)。所以，选用4-硝基苯酚、4-硝基苯胺类衍生物为显色底物A，以NADH或NADPH为显色产物B，选显色底物A的最大等吸收波长Y1为λ2测定显色产物B的吸收，可基本不受显色显色底物A及显色产物A浓度变化的干扰。所以，4-硝基苯酚和4-硝基苯胺显色团对应显色底物可与NADH或NADPH组合，单通道同步测量两种酶活性。
pH7.4时4-硝基-1-萘酚450nm附近摩尔消光系数约2.3×104(mol/L)-1×cm-1，4-硝基苯酚在405nm的摩尔消光系数约1.1×104(mol/L)-1×cm-1；免疫分析常用牛小肠粘膜碱性磷酸酶(calfintestinal alkaline phosphatase,简称CIAP)为工具酶，以4-硝基-1-萘基磷酸酯为显色底物，其米氏常数约10μmol/L；用4-硝基-1-萘基磷酸酯测定CIAP比活性可达到用4-硝基苯基磷酸酯为显色底物的40％左右；考虑显色产物消光系数差异，两种磷酸酯测量该碱性磷酸酶的定量限相当。所以，4-硝基-1-萘基磷酸酯可用于测定牛小肠粘膜碱性磷酸酶(图4)，与用4-硝基苯基-β-半乳糖苷测定β-半乳糖苷酶(β-D-galacotosidase,以下简称β-Gal)组合或其它生成4-硝基苯酚的酶组合，用于免疫分析单通道多波长吸收连续跟踪同步测量两组分含量。另外，糖苷酶专一性高、最适pH和缓冲液一致、不易受相互产物和底物的干扰；用4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷和4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷糖苷为底物，β-半乳糖苷酶和α-葡萄糖苷酶组合可用于单通道两组分ELISA；但其最优测量波长组合为400nm和460或450nm，用普通滤光片酶标仪仅提供405nm光源，不利于发挥其组合优势。
本发明所建立的校正吸收重叠干扰的数据处理方法及多种酶的底物和产物相互干扰时校正干扰作用的数据处理方法，对显色底物和显色产物稳定的酶反应体系通用，而本发明应用关键是筛选显色底物组合以使得单通道同步测定两种酶活性的灵敏度、定量限和线性范围与单独测定相当。本发明的代表性显色底物组合包括：4-硝基苯酚和4-硝基-1-萘酚的亲水衍生物为水解酶显色底物组合、4-硝基苯胺类显色底物与NADH或NADPH组合。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
图1单通道多波长吸收同步测量两种酶活性的原理示意图
图2测定酶活性常用显色团及常用显色显色底物
图3常见酶作用于4-硝基苯酚和4-硝基苯胺类显色底物的光谱特征
3-a.pH7.4,0.050mol/L Tris-HCl,0.50mmol/L4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷+大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶(Sigma G4155)反应过程中的吸收光谱
3-b.pH7.4,0.050mol/L Tris-HCl,0.50mmol/Lγ-谷氨酰基-(4-硝基)苯胺+兔肾脏匀浆中γ-谷氨酰基转移酶反应过程中的吸收光谱
3-c.pH7.4,0.050mol/L Tris-HCl,0.50mmol/L4-硝基苯基磷酸酯+牛小肠粘膜碱性磷酸酶(Sigma P0114)反应过程中的吸收光谱
3-d.pH8.5,0.050mol/L Tris-HCl,0.50mmol/L4-硝基苯基磷酸酯+牛小肠粘膜碱性磷酸酶(Sigma P0114)反应过程中的吸收光谱
3-e.pH7.4,0.050mol/L Tris-HCl,0.50mmol/L硫代乙酰胆碱+Ellman试剂5,5’-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)+乙酰胆碱酯酶(Sigma C2888)反应过程中的吸收光谱
3-f.pH7.4,0.050mol/L Tris-HCl,0.50mmol/L硫代乙酰胆碱+5,5’-二硫代-双(2-硝基苯乙酸)(DTNA)+乙酰胆碱酯酶(Sigma C2888)反应过程中的吸收光谱
3-g.pH7.4,0.050mol/L Tris-HCl,0.50mmol/L硫代乙酰胆碱+Ellman试剂5,5’-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)+乙酰胆碱酯酶(Sigma C2888)反应过程中的吸收光谱
3-h.pH7.4,0.050mol/L Tris-HCl,0.50mmol/L硫代乙酰胆碱+5,5’-二硫代-双(2-硝基苯乙酸)(DTNA)+乙酰胆碱酯酶(Sigma C2888)反应过程中的吸收光谱
图4常见酶作用于4-硝基-1-萘酚类显色底物的光谱特征
4-a.pH7.4,0.050mol/L Tris-HCl,0.25mmol/L(4-硝基-1-萘酚)-β-D-半乳糖苷+大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶(Sigma G4155)反应过程中的吸收光谱
4-b.pH7.4,0.050mol/L Tris-HCl,0.50mmol/L4-硝基-1-萘基磷酸酯+牛小肠粘膜碱性磷酸酶(Sigma P0114)反应过程中的吸收光谱
4-c.pH7.4,0.050mol/L Tris-HCl,0.50mmol/L4-硝基-1-萘基硫酸酯+蜗牛芳香硫酯酶(Sigma S9626)反应过程中的吸收光谱
图5.两组分同步酶联免疫吸附分析的操作过程示意图
图6.同步测量兔组织匀浆中的γ-谷氨酰基转移酶GGT和乳酸脱氢酶LDH
6-a.单用GGT显色底物测定4-硝基苯胺对344nm吸收干扰校正系数R31
回归分析得ΔA344＝0.0289×ΔA405+0.0167，R2>0.902，故R31＝0.0289。
6-b.单用LDH显色底物测定NADH对405nm吸收干扰校正系数R33
回归分析得ΔA405＝0.0088×ΔA344-0.0002，R2>0.993，故R31＝0.0088。
此干扰太小，故可不校正；分析实验数据校正与否结果无统计差异。
6-c.同步测量GGT和LDH中GGT校正效果比较
A:校正前 (ΔA/min) V1对酶量响应不成线性
B:校正后 (ΔA/min) s1＝2.6565×χ-0.0061， R2>0.996
C:单独测定(ΔA/min) s1＝2.6971×χ-0.0059， R2>0.997
6-d.同步测量GGT和LDH中LDH校正效果比较
A:校正前 (ΔA/min) V2对酶量响应不成线性
B:校正后 (ΔA/min) s2＝1.1028×χ+0.0025， R2>0.996
C:单独测定(ΔA/min) s2＝1.1715×χ+0.0016， R2>0.994
图7.用4-硝基-1-萘基磷酸酯和4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷同步测量碱性磷酸酶和β-D-半乳糖苷酶
7-a.单用碱性磷酸酶显色底物测定4-硝基-1-萘酚对测定405nm吸收干扰校正系数R31
回归分析得ΔA405＝-0.015×ΔA450+0.0107，R2>0.88，故R31＝-0.015。
7-b.单用β-D-半乳糖苷酶的显色底物测定4-硝基苯酚对测定450nm吸收的干扰校正系数R33
回归分析得ΔA450＝0.1931×ΔA405-0.0817，R2>0.999，故R33＝0.1931。
7-c.同步测量碱性磷酸酶和β-D-半乳糖苷酶中碱性磷酸酶校正效果比较
A:校正前 (ΔA/min) V1＝0.7425×χ-0.0003， R2>0.99
B:校正后 (ΔA/min) s1＝0.6333×χ-0.0008， R2>0.995
C:单独测定(ΔA/min) s1＝0.6200×χ+0.0009， R2>0.998
7-d.同步测量碱性磷酸酶和β-D-半乳糖苷酶中β-D-半乳糖苷酶校正效果比较
A:校正前 (ΔA/min) V2＝0.6267×χ+0.0017， R2>0.993
B:校正后 (ΔA/min) s2＝0.6067×χ+0.0023， R2>0.993
C:单独测定(ΔA/min) s2＝0.6133×χ+0.0021， R2>0.998
图8.用青霉素标记β-D-半乳糖苷酶和瘦肉精标记的α-D-葡萄糖苷酶
8-a.单用4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷单独测定β-D-半乳糖苷酶反应响应曲线时4-硝基-1-萘酚对同步测定405nm吸收干扰校正系数R31
回归分析得ΔA405＝0.0665×ΔA450+0.0015，R2>0.998，故R31＝0.0665。
8-b.用4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷单独测定α-D-葡萄糖苷酶反应时4-硝基苯酚对同步测定450nm吸收干扰校正系数R33
回归分析得ΔA450＝0.1957×ΔA405-0.0874，R2>0.992，故R33＝0.1957。
8-c.同步测量β-D-半乳糖苷酶和α-D-葡萄糖苷酶中β-D-半乳糖苷酶校正效果
A:校正前 (ΔA/min) V1＝2.2871×χ-0.0073， R2>0.997
B:校正后 (ΔA/min) s1＝1.9216×χ-0.0034， R2>0.996
C:单独测定(ΔA/min) s1＝2.0291×χ-0.0027， R2>0.999
8-d.同步测量β-D-半乳糖苷酶和α-D-葡萄糖苷酶中α-D-葡萄糖苷酶校正效果
A:校正前 (ΔA/min) V1＝1.9065×χ-0.0123， R2>0.989
B:校正后 (ΔA/min) s1＝1.7543×χ-0.0124， R2>0.989
C:单独测定(ΔA/min) s1＝1.7945×χ-0.0118， R2>0.992
8-e.同步测量时β-D-半乳糖苷酶标记物结合率校正前后结果比较
A:校正前 结合率(％)＝-6.4865×Ln(χ)+87.332， R2>0.987
B:校正后 结合率(％)＝-6.2685×Ln(χ)+86.886， R2>0.990
C:单独测β-D-半乳糖苷酶标记物(未加入α-D-葡萄糖苷酶显色底物)时的曲线为：结合率(％)＝-6.8541×Ln(χ)+87.689， R2>0.977
8-f.同步测量时α-D-葡萄糖苷酶标记物结合率校正前后结果比较
A:校正前 结合率(％)＝-11.3572×Ln(χ)+92.27， R2>0.991
B:校正后 结合率(％)＝-12.054×Ln(χ)+93.755， R2>0.955
C:单独测α-D-葡萄糖苷酶标记物(未加入β-D-半乳糖苷酶显色底物)时的曲线为：结合率(％)＝-13.145×Ln(χ)+104.47， R2>0.990
具体实施方式
本发明的用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，包括下列步骤：
a.确定用多波长吸收单通道同步测定多种酶活性所需显色底物组合：
a1根据待测酶的专一性筛选满足下列条件的显色底物组合：所选显色团能分别用于制备待测酶的显色底物；所得这些显色底物组合中，将显色底物在对应待测酶作用下所得显色产物相对该显色底物的差吸收峰最大波长从大到小排列，相邻的显色产物差吸收峰最大波长之间相距大于30nm且尽量远；在按显色产物差吸收峰最大波长从大到小的排列中，除了显色产物差吸收峰最靠近红外端的显色底物外，每个显色底物在对应酶作用下所得显色产物差吸收峰最大波长，都与此排列中某个显色底物的最大等吸收波长相差小于25nm且尽量短；
a2用步骤a1所选显色团分别合成待测酶的对应显色底物并组合使用；
b.在一个反应混合物或酶反应体系即单反应通道中，同步启动多个待测酶针对组合使用的显色底物混合物对应显色底物的专一催化反应；
c.选择测量波长组合：以显色产物差吸收峰最靠近红外端的显色底物为显色底物A，在显色底物A的显色产物差吸收峰最大波长下测定该显色产物吸收；在显色底物A的等吸收波长处测定其余待测酶显色产物或显色底物的吸收；
d.在所选多个测量波长组合下，通过快速变换测量波长，多波长吸收同步测量实现同步跟踪单通道中多个待测酶的反应过程；
e.基于无相互作用物质吸收的线性加和性建立消除反应通道中显色物质吸收重叠干扰的数据处理方法，获得消除吸收光谱重叠干扰后每个待测酶的显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线；如某个待测酶不受反应体系其它酶的产物及底物的干扰且其底物浓度在对应酶米氏常数的3倍以上，用经典初速度法分析其显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线确定初速度；如某个待测酶不受反应体系其它酶的产物及底物的干扰但所用显色底物浓度在该酶米氏常数的5％以上而低于米氏常数的3倍，联用经典初速度法和反应过程分析法分析其显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线确定初速度；当某个待测酶受反应体系中其自身和/或其它酶的底物和/或产物的干扰时，将描述反应体系动力学的微分速度方程组数值积分后分析活性受到干扰待测酶反应的显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线，确定其最大反应速度表示其活性，或据其微分速度方程和所得最大反应速度换算成底物浓度为起始底物浓度93％时初速度表示酶活性。
本实施例中，应用该方法时，显色产物相对显色底物差吸收峰最大波长在300nm以上且其显色底物吸收峰最大波长小于相应显色产物吸收峰最大波长，否则用逆反应测定该酶的活性；对待测酶显色底物组合中显色产物差吸收峰最大波长相邻的任两个显色底物，显色产物差吸收峰最大波长更靠近红外端者的最大等吸收波长与显色产物差吸收峰最大波长更靠近紫外端者的差吸收峰最大波长相等或相距不超过5nm为优化组合；所用显色底物组合中每个显色底物都仅被样品中的一种待测酶作用生成显色产物，而不被样品中其它任何酶作用或作用效果不明显；此处所述不被其它任何酶作用或作用效果不明显，指当样品中酶I所对应显色底物的浓度与其米氏常数相差小于50％时，样品中其它任何酶作用于该显色底物的比活性都低于酶Ⅰ作用于该显色底物比活性的1％；权利要求1的步骤b中，选择适于同步测定活性的待测酶发挥作用的缓冲介质和反应条件，具体包括：缓冲介质pH位于pH5.0到9.0之间且接近比活性最低待测样品的最适pH，所用样品反应温度在摄氏20到40度之间。
本实施例中，该方法应用时所述显色底物包括天然显色底物和非天然显色底物；天然显色底物包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；非天然显色底物由显色团和被酶识别基团组成，显色团包括但不限于4-硝基苯酚、4-硝基苯硫酚、4-硝基苯胺、4-硝基-1-萘酚、4-硝基-1-萘硫酚、4-硝基-1-萘胺、2-萘酚、4-氯苯酚、玫红酸或有取代基的这些芳香酚/胺衍生物。
本实施例中，该方法应用于同步测量两种酶活性，步骤a中，所述样品中含两种待测酶分别命名为酶A和酶B，所需两种显色底物分别命名为显色底物A和显色底物B，在两种待测酶作用下生成两种显色产物分别命名为显色产物A和显色产物B，这些显色底物及显色产物的组合需满足下列条件：(1)显色产物A差吸收峰最大波长X1靠近红外端，显色产物B差吸收峰最大波长X2靠近紫外端，显色产物B差吸收峰最大波长X2与显色产物A差吸收峰最大波长X1相距大于30nm且尽量远；(2)显色产物A的最大等吸收波长为Y1且与显色产物B差吸收峰最大波长X2相距小于25nm且且尽量短。
该方法应用于同步测量两种酶活性的步骤b和c及d中，在一个反应通道同步启动样品中两种酶针对显色团A和显色团B合成的对应显色底物A和显色底物B的反应，并得到显色产物A和显色产物B；以显色产物A的最大等吸收波长Y1为λ2处测定显色产物B吸收，以显色产物A的差吸收峰最大波长X1为λ1处测定显色产物A吸收；通过快速变换测量波长，两波长吸收同步测量实现同步跟踪单个反应体系中两种待测酶的反应过程。
该方法应用于同步测量两种酶活性的步骤e中，基于吸收线性加和性建立数据解析消除多种物质吸收重叠干扰方法；以显色产物A差吸收峰最大波长前后不超过25nm的波长为λ1且在此波长下吸收为A1，以显色产物A和显色底物A最大等吸收波长附近不超过25nm的波长为λ2且此波长下吸收为A2，基于吸收线性加和性消除物质吸收重叠干扰需解如下二元一次方程组：
A1＝A10+E31×P1+E34×P2
A2＝A20+E32×P1+E35×P2
进一步可转变成如下二元一次方程组
A1＝A10+A1a+R33×A2b A2＝A20+A2b+R31×A1a
R31＝E32/E31 R33＝E34/E35
P1为显色产物A瞬时浓度；P2为显色产物B瞬时浓度；E31为显色产物A与显色底物A在λ1下差摩尔消光系数；E32为显色产物A与显色底物A在λ2下差摩尔消光系数E32；E34为显色产物B与显色底物B在λ1下差摩尔消光系数；E35为显色产物B与显色底物B在λ2下差摩尔消光系数；A1为校正吸收干扰前在λ1瞬时总吸收，A2为校正吸收干扰前在λ2瞬时总吸收；A1a为校正吸收干扰后显色产物A在λ1瞬时净吸收，其等于P1和E31乘积，A2b为校正吸收干扰后显色产物B在λ2瞬时净吸收，其等于P2和E35乘积；A10为反应体系未生成任何显色产物前在λ1的吸收，为来自反应体系的本底，相当于含相同浓度全部显色底物反应体系在λ1吸收与含相同浓度样品反应体系在λ1吸收的加和；A20为反应体系未生成任何显色产物前在λ2的吸收，为来自反应体系的本底，相当于含浓度相同全部显色底物的反应体系在λ2吸收与含相同浓度样品反应体系在λ2吸收的加和；
当仅一种酶显色产物对另一种酶有竞争抑制作用时，确定显色产物A及显色产物B在λ1下和在λ2下的无干扰吸收变化曲线A1a和A2b；设初始显色底物A的浓度为C1，初始显色底物B的浓度为C2；设酶B最大反应速度为VmB，由VmB换算成初速度所用预设显色底物浓度等于C2的93％，酶B对显色底物B的米氏常数为KmB；如显色产物A对酶B为竞争性抑制，其竞争性抑制常数为Kia，酶B动力学方程为:
对上述方程两边对反应时间从0～t进行积分得到
左边的积分项为反应时刻t和反应时刻0之间显色产物B的净吸收变化；方程右边积分项以dt内显色产物A浓度恒定进行数值积分，即计算
以dt为Δt，计算每个记录点的x，将所有x求和再减去起点和终点x得到sumx，用如下公式计算VmB并据其微分动力学方程得无干扰初速度s2。
上述计算公式中，酶A将显色底物A转变成显色产物A的计量关系为1:1，酶B将显色底物B转变成显色产物B的计量关系也为1:1；
当酶A的产物对酶B抑制作用类型不同时，所得酶B的米氏动力学方程不同而所需数值积分过程相同，并仍用93％C2为初始底物浓度计算s2；
本实施例中，该方法用于同步测量两种酶活性有如下特征：
步骤a中，如下选择显色团组合：显色团A和显色团B使显色产物A最大等吸收波长Y1与显色产物B差吸收峰最大波长X2相等或相距不超过5nm；
步骤c中，选择产物A差吸收峰最大波长X1为λ1后，如下选择测量波长λ2：显色产物B与显色底物B差摩尔消光系数在显色产物A最大等吸收波长Y1处高于在显色产物B差吸收峰最大波长X2处的30％，则选择显色产物A最大等吸收波长Y1为λ2，否则，用最靠近显色产物A最大等吸收波长Y1的显色产物B差吸收峰波长为λ2，或最靠近显色产物B差吸收峰且其它待测显色显色产物与显色显色底物差摩尔消光系数都小于显色产物B与显色底物B差摩尔消光系数20％的波长为λ2测量显色产物B吸收；
步骤e中，需测定R31为显色产物A吸收干扰的校正系数；测定R31时，仅用酶A所需的全部显色底物而不加其它待测酶的任何显色底物，使反应体系无来自显色底物B及显色产物B在两个测量波长λ1和λ2的吸收，此时同步测定反应通道中在两个测量波长下的吸收变化，直到在λ2吸收变化大于0.005或在λ1吸收变化大于0.500；以在λ1下吸收为横坐标，在λ2下吸收为纵座标进行回归分析，所得回归直线斜率为校正系数R31；
步骤e中，需测定R33为显色产物B吸收干扰的校正系数；测定R33时，仅用酶B所需的全部显色底物而不加其它待测酶的任何显色底物，使反应体系无来自显色底物A及显色产物A在两个测量波长λ1和λ2的吸收，此时同步测定反应通道中在两个测量波长下的吸收变化，直到在λ2吸收变化大于0.500或在λ1吸收变化大于0.005；以在λ2下吸收为横坐标，在λ1下吸收为纵座标进行回归分析，所得回归直线斜率为校正系数R33；
本实施例中，该方法用于同步测量两种酶活性时，酶A对应显色底物包括水解反应最大等吸收波长在310到330nm之间的4-硝基苯基乙酸酯，水解反应最大等吸收波长在330到350nm之间的4-硝基苯基磷酸酯、4-硝基苯基硫酸酯、4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷和γ-谷氨酰基-4-硝基苯胺，还原反应最大等吸收波长在350到370nm之间5-巯基-2-硝基苯甲酸及5-巯基-2-硝基苯乙酸，其显色底物为二硫化物被酶作用所释放的硫醇还原；与此类酶A的显色底物A对应的显色底物B主要是天然显色底物，包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；上述显色底物A对应的酶A包括但不限于芳香酯酶、磷酸酶、硫酸酯酶、γ-谷氨酰基转移酶、肽酶即天然氨基酸α-羧基对应的酰胺酶和糖苷酶；与此类酶A对应的酶B包括但不限于乳酸脱氢酶LDH、苹果酸脱氢酶MDH、偶联LDH的谷丙转氨酶和偶联MDH的谷草转氨酶。
本实施例中，该方法用于同步测量三种酶活性，三种待测酶分别命名为酶A、酶B和酶C，所需显色底物三种分别命名为显色底物A、显色底物B和显色底物C，在对应酶作用下生成显色产物分别命名为显色产物A、显色产物B和显色产物C；这些显色底物组合需满足下列条件：(1)显色产物A差吸收峰最大波长为X1且最靠近红外端，显色产物C差吸收峰最大波长为X3且最靠近紫外端，显色产物B差吸收峰最大波长为X2且位于X1和X3之间，X2与X1及X3相距都大于30nm且尽量远；(2)显色产物A的最大等吸收波长为Y1且次大等吸收波长为Ys；显色底物B生成显色产物B的最大等吸收波长为Y2且与Y1相距尽量远而和Ys相距尽量短；(3)Y1与X2相距小于25nm且相距尽量短；Y2和Ys及X3相距都小于25nm且相距尽量短；
该方法用于同步测量三种酶活性时，步骤b中，在一个反应通道同步启动三种酶针对显色底物A、显色底物B和显色底物C的反应，并得到对应的显色产物A、显色产物B和显色产物C；
该方法用于同步测量三种酶活性时，步骤c中，选显色产物A最大等吸收波长Y1或相距25nm以内的波长为λ2测显色产物B吸收，选显色产物A差吸收峰最大波长X1或相距25nm以内波长为为λ1测显色产物A吸收，选显色产物B最大等吸收波长Y2或相距25nm以内的波长为λ3测显色产物C吸收；
该方法用于同步测量三种酶活性时，步骤d中，通过快速变换测量波长，三波长吸收同步测量实现同步跟踪单个反应体系中两种样品的反应过程；
该方法用于同步测量三种酶活性时，步骤e中，基于吸收的线性加和性建立数据解析消除多种物质吸收重叠干扰需解如下三元一次方程组：
A1＝A10+A1a+R33×A2b+R35×A3c
A2＝A20+A2b+R31×A1a+R36×A3c
A3＝A30+A3c+R32×A1a+R34×A2b
其中
R31＝E32/E31
R32＝E33/E31
R33＝E34/E35
R34＝E36/E35
R35＝E37/E39
R36＝E38/E39
上述公式中，A1为校正吸收干扰前在λ1瞬时吸收，A2为校正吸收干扰前在λ2瞬时吸收，A3为校正吸收干扰前在λ3瞬时吸收；A1a为校正吸收干扰后显色产物A在λ1瞬时净吸收，A2b为校正吸收干扰后显色产物B在λ2瞬时净吸收，A3c为校正吸收干扰后显色产物C在λ3瞬时净吸收；A10为反应体系未生成任何显色产物前在λ1吸收，A20为反应体系未生成任何显色产物前在λ2吸收，A30为反应体系未生成任何显色产物前在λ3吸收；E31为显色产物A与显色底物A在λ1下差摩尔消光系数，E32为显色产物A与显色底物A在λ2下差摩尔消光系数，E33为显色产物A与显色底物A在λ3下差摩尔消光系数；E34为显色产物B与显色底物B在λ1下差摩尔消光系数，E35为显色产物B与显色底物B在λ2下差摩尔消光系数，E36为显色产物B与显色底物B在λ3下差摩尔消光系数；E37为显色产物C与显色底物C在测量波长λ1下差摩尔消光系数，E38为显色产物C与显色底物C在测量波长λ2下差摩尔消光系数，E39为显色产物C与显色底物C在测量波长λ3下差摩尔消光系数；上述公式中，显色底物A转变成显色产物A计量关系为1:1；显色底物B转变成显色产物B的计量关系为1:1；显色底物C转变成显色产物C的计量关系为1:1。
本实施例中，该方法用于同步测量三种酶活性时，步骤e中需显色产物A吸收干扰校正系数R31和R32；测定时仅用酶A的全部显色底物而不用其它待测酶的任何显色底物，使得反应体系无来自显色底物B及显色产物B、显色底物C及显色产物C在三个测量波长λ1、λ2和λ3吸收，同步测定反应通道中在三个测量波长下的吸收变化，直到在λ2及λ3吸收变化都大于0.005或在λ1吸收变化大于0.500；以在λ1下吸收变化为横坐标，在λ2下和在λ3下吸收变化为纵座标进行回归分析，所得在λ2下吸收变化回归直线斜率为校正系数R31，在λ3下吸收变化回归直线斜率为校正系数R32；
该方法用于同步测量三种酶活性时，步骤e中需要显色产物B吸收干扰校正系数R33和R34；测定时仅用酶B的全部显色底物而不用其它待测酶的任何显色底物，使得反应体系无来自显色底物A及显色产物A、显色底物C及显色产物C在三个测量波长λ1、λ2和λ3吸收贡献，同步测定反应通道中三个波长下的吸收变化，直到在λ2及λ3吸收变化都大于0.005或在λ1吸收变化大于0.500；以在λ2下吸收变化为横坐标，在λ1下和在λ3下吸收变化为纵座标进行回归分析，所得在λ1下吸收变化回归直线斜率为校正系数R33，在λ3下吸收变化回归直线斜率为校正系数R34；
该方法用于同步测量三种酶活性时，步骤e中需要显色产物C吸收干扰校正系数R35和R36；测定时仅用酶C的全部显色底物而不用其它待测酶的任何显色底物，使得反应体系无来自显色底物A及显色产物A、显色底物B及显色产物B在三个测量波长λ1、λ2和λ3吸收贡献，同步测定反应通道中三个波长下的吸收变化，直到在λ2及λ1吸收变化都大于0.005或在λ3吸收变化大于0.500；以在λ3下吸收变化为横坐标，在λ1下和在λ2下吸收变化为纵座标进行回归分析，所得在λ1下吸收变化回归直线斜率为校正系数R35，在λ2下吸收变化回归直线斜率为校正系数R36；
该方法用于同步测量三种酶活性时，步骤a中，可如下选择显色底物组合：所用显色底物A、显色底物B及显色底物C应使显色产物A的最大等吸收波长Y1与显色产物B差吸收峰最大波长X2相等或相距不超过5nm、显色产物B最大等吸收波长Y2和显色产物A次大等吸收波长Ys及显色产物C差吸收峰最大波长X3之间相等或任两者相距都不超过5nm；
该方法用于同步测量三种酶活性时，步骤c中，选择显色产物A差吸收峰最大波长X1为λ1，还可按如下原则选择另外两个测量波长λ2和λ3：显色产物B与显色底物B差摩尔消光系数在显色产物A最大等吸收波长Y1处高于显色产物B与显色底物B在二者差吸收峰最大波长X2处差摩尔消光系数的30％时，选择Y1为测量波长λ2，否则，用最靠近显色产物A最大等吸收波长Y1的显色产物B差吸收峰波长，或靠近显色产物B差吸收峰且其它显色产物与显色显色底物差摩尔消光系数都小于显色产物B与显色底物B差摩尔消光系数20％的波长为λ2测量显色产物B吸收；显色产物C与显色底物C差摩尔消光系数在显色产物A次大等吸收波长Ys处或显色产物B与显色底物B最大等吸收波长Y2处应高于二者在其差吸收峰最大波长X3处差摩尔消光系数的30％时，则选择Y2或Ys为为λ3测量显色产物B吸收，否则用最靠近显色产物B最大等吸收波长Y2或显色产物A次大等吸收波长Ys或靠近显色产物C差吸收峰最大波长且其它显色产物与显色底物差摩尔消光系数都小于显色产物C与显色底物C差摩尔消光系数20％的波长为λ3测量显色产物C吸收；
本实施例中，该方法用于同步测量三种酶活性时，与酶A对应的显色底物A包括4-硝基-1-萘基磷酸酯且其水解的两个等吸收波长分别在315到335nm之间及395到415nm之间、4-硝基-1-萘基硫酸酯且其水解的两个等吸收波长分别在315到335nm之间及395到415nm之间、4-硝基-1-萘基乙酸酯且其水解时两个等吸收波长分别在310到330nm之间及375到395nm之间、4-硝基-1-萘基-D-半乳糖苷且其水解时两个等吸收波长分别在320到345nm之间及390到410nm之间、4-硝基-1-(N-赖氨酰)萘胺且其水解最大等吸收波长分别在385到410nm之间，这些显色底物A被酶A作用生成显色产物A为4-硝基-1-萘酚或4-硝基-1-萘胺或其衍生物；与此类显色底物A对应显色底物B主要是4-硝基苯酚或4-硝基苯胺衍生物，在相应酶B作用下生成显色产物B为4-硝基苯酚或4-硝基苯胺或4-硝基苯基硫醇；与此类显色底物A和显色底物B对应显色底物C包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；
该方法用于同步测量三种酶活性时，与显色底物A对应酶A包括但不限于芳香酯酶、磷酸酶、硫酸酯酶、γ-谷氨酰基转移酶、肽酶即天然氨基酸α-羧基对应的酰胺酶和糖苷酶；与显色底物B对应的酶B包括与已选酶A不同但属于酶A的其它水解酶；与显色底物C对应的酶包括但不限于乳酸脱氢酶LDH、苹果酸脱氢酶MDH、偶联LDH的谷丙转氨酶和偶联MDH的谷草转氨酶。
以下为本发明具体实验数据及实施例
应用实施例所需新型显色底物用常规有机合成方法制备、过硅胶柱纯化，用高分辨质谱和NMR确定结构；这些新型显色底物的合成方法和工艺不在本发明专利的保护范围之内，将作为另行申请的发明专利的保护内容。适用于本发明常见显色团见图2；常见酶反应的等吸收波长见图3和4；两种酶同步测量ELISA操作流程见图5。
实施例中，测定反应过程的吸收光谱变化都用波长未校准的Shimadzu UV2550光度计。测定酶活性时在MapAda UV1600PC上用对应控制软件进行，或在Biotek ELX800酶标仪上用Gene5.0软件控制仪器测定。如未说明，以下所有测定温度为室温即25度。
实施例一：单通道两波长吸收同步测定兔肾脏匀浆中LDH和GGT
本应用实例中测定乳酸脱氢酶(简称LDH，上海生工，编号NB0642)显色底物为丙酮酸和还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸即NADH，均为国产分析纯；测定γ-谷氨酰基转移酶(简称GGT)显色底物为γ-谷氨酰基-(4-硝基)苯胺(Sigma,编号49525)，双甘肽为国产分析纯；所用缓冲液为0.10mol/L且pH为7.0磷酸钠；将GGT显色底物溶解于缓冲液为显色底物溶液A、LDH显色底物固体称量溶解于缓冲液为显色底物溶液B；含有LDH和GGT显色底物的混合物为显色底物溶液C；GGT的显色底物γ-谷氨酰基-(4-硝基)苯胺为显色底物A，对应显色产物A为4-硝基苯胺；NADH为LDΗ显色底物但当作显色产物B；所用溶液中只含有GGT显色底物而不含有NADH时将系统光吸收本底调零；GGT来自兔子肾脏，用0.1％表面活性剂NP40和pH7.0的0.10mol/L酸盐缓冲液制备兔肾脏匀浆，4℃以10000rpm离心后20min后取上清液为富含GGT的待测样品，不加表面活性剂所得匀浆离心后上清为含低活性GGT的样品。
测定GGT活性方法为发明专利ZL 200710093081.4和J Zhejiang Univ Sci B,2011,12(3):180-188所述；数据处理时设定GGT显色产物对GGT抑制常数为185μmol/L，GGT对γ-谷氨酰基-(4-硝基)苯胺米氏常数为1.00mmol/L，所用软件同J Zhejiang Univ Sci B,2011,12(3):180-188。本应用实例中，GGT为酶A、LDH为酶B；显色产物A为4-硝基苯胺、显色产物B为ΝADΗ但实际其为显色底物；测量波长中λ1为405nm、测量波长λ2为344nm(见图3b)。
应用本发明同步测定兔子肾脏GGT和兔子肌肉LDH的代表性过程如下：
1.配制缓冲液：按《生物化学与分子生物学实验常用数据手册》(科学出版社，2000)配制0.20mol/L且pH为7.0磷酸钠缓冲液稀释到0.10mol/L；25度恒温；
2.配制显色底物溶液：共配制显色底物的三种溶液；显色底物储备液A含有1.5mmol/Lγ‐谷氨酰基‐(4‐硝基)苯胺和0.70mmol/L双甘肽；显色底物储备液B含有1.50mmol/L的NADH和30.0mmol/L丙酮酸；显色底物储备液C为显色底物储备液A和显色底物储备液B的等比例混合物；所有测定反应总体积1.0ml，γ‐谷氨酰基‐(4‐硝基)苯胺终浓度为0.15mmol/L而双甘肽为70mmol/L，NADH为0.15mmol/l而丙酮酸3.0mmol/L，其余为缓冲液和适度稀释的样品；
3.制备样品：用0.1％的NP40和pH7.0的0.10mol/L磷酸钠缓冲液，在冰水浴中制备兔肾脏的匀浆，4℃高速离心，10000rmp×20min后取上清液为富含GGT样品；稀释时用所配制磷酸钠缓冲液；用LDH与此GGT混合为含两种酶的样品；
4.多波长吸收干扰校正系数：用显色底物储备液A加适量缓冲液和样品使双甘肽终浓度为70mmol/L且显色底物A为0.15mmol/L，测定λ1和λ2下吸收变化之间的联系(图6a)，反应时间10.0min使得在405nm吸收增加0.55以上；用显色底物储备液B补适量缓冲液和LDH样品溶液，测定λ1和λ2下吸收变化之间的联系(图6b)，反应时间10.0min使得在344nm吸收降低0.55以上；图7a和图7b中有统计意义的响应曲线斜率分别为干扰校正系数R31和R33；
5.LDH和GGT的单通道同步测定：用显色底物储备液C加缓冲液和适量样品到1.0ml且含有γ‐谷氨酰基‐(4‐硝基)苯胺为0.15mmol/L而双甘肽为70mmol/L，NADH为0.15mmol/l而丙酮酸3.0mmol/L；旋涡振荡混匀后，同步启动两种酶反应测量波长λ1和λ2下吸收变化，共测定15.0min以便分析反应过程；NADH在405nm基本无吸收，故所测定的405nm吸收来自本底和显色产物4-硝基苯胺，不需要校正NADH吸收对405nm吸收的干扰；在不同加样量时分别测定样品及显色底物A在405nm吸收之和为本底，在405nm的吸收扣除本底后为4-硝基苯胺的吸收，用于校正4-硝基苯胺对LDH活性的干扰；记录间隔20s共记录15min；所得两波长吸收变化数据的具体处理方法如下：
(1)获得两个波长下无干扰吸收变化数据
设未加酶样品时独立测定显色底物浓度全部相同的反应体系中来自两种显色显色底物在λ1吸收为A10、在λ2吸收为A20；校正吸收干扰前在λ1瞬时吸收为A1，在λ2瞬时吸收为A2；校正吸收干扰后显色产物A4-硝基苯胺在λ1瞬时吸收为A1a，显色产物B即NADH在λ2瞬时吸收为A2b；据无相互作用稳定显色团吸收的线性加和性有如下方程：
A1＝A10+A1a+R33×A2b
A2＝A20+A2b+R31×A1a
解此二元一次方程组，可获得无干扰的两波长下两种显色产物吸收无干扰数据；独立测量显色产物A相对显色底物A在λ1差摩尔小光系数、显色产物B相对于显色底物B在λ2差摩尔小光系数，可获得反应体系显色产物A和显色产物B瞬时浓度；可再用经典初速度法或过程分析法分别处理无干扰吸收变化或显色产物浓度数据，从而单通道同步测定两种酶活性；
(2)联用法分析GGT反应过程测定其活性
用发明专利ZL 200710093081.4和J Zhejiang Univ Sci B,2011,12(3):180-188所述方法用分析过程和经典初速度法联用测定GGT初速度(这不是本发明所需保护的权利要求，而是专利ZL 200710093081.4在本发明中的应用)；数据处理时设转谷氨酰基显色产物对GGT抑制常数为185μmol/L，GGT对γ‐谷氨酰基‐(4‐硝基)苯胺米氏常数为1.00mmol/L，所用软件同J ZhejiangUniv Sci B,2011,12(3):180-188；将最大反应速度转变成初速度所用显色底物浓度为0.14mmol/L；所得GGT活性有很宽线性范围；结果见图6c；
(3)消除4-硝基苯胺干扰测定LDH活性
将无干扰并扣除样品本底405nm吸收A1a用9.87L·(mmol.cm)-1换算成4-硝基苯胺的浓度；测得对硝基苯胺对LDH竞争性抑制常数为0.024mmol/L，LDH对NADH米氏常数为0.040mmol/L；对硝基苯胺在405nm毫摩尔差消光系数为9.87L·(mmol.cm)-1，NADH在344nm毫摩尔差消光系数为6.25L·(mmol.cm)-1，反应体系丙酮酸浓度比NADH高二十倍，LDH为作用于NADH单显色底物酶；设计算LDH活性时NADH初始浓度为0.14mmol/L；LDH最大反应速度为VmB；校正干扰后，NADH在344nm瞬时吸收为A2b，按照如下公司分析关联的GGT和LDH反应过程，如下方程用于获得LDH的VmB：
取采样间隔内对硝基苯胺浓度恒定，数值积分获其积分为Sumx；可得LDH的VmB并用0.14mmol/L初始NADH浓度得LDH初速度；所得响应曲线见图6d；校正对硝基苯胺干扰的效果见表2；此校正使两酶同步与单独测定定量限相当。
6.无LDH时GGT定量限为0.11μmol·(L·min)-1；在用显色底物溶液B测定LDH为8.2μmol·(L·min)-1时，GGT定量限为0.14μmol·(L·min)-1；在LDH活性为20μmol·(L·min)-1时，GGT定量限为0.17μmol·(L·min)-1(表1)。无GGT时LDH定量限为0.7μmol·(L·min)-1，在用显色底物溶液A测定GGT为1.7μmol·(L·min)-1时LDH定量限为0.6μmol·(L·min)-1，在用显色底物溶液A测定GGT为10.7μmol·(L·min)-1时LDH定量限为0.5μmol·(L·min)-1；结果比较见表3。
实施例2：单通道多波长吸收同步测定碱性磷酸酶和天然β-半乳糖苷酶混合物
本应用实例中以牛小肠粘膜碱性磷酸酶(Sigma P0114,CIAP)为酶A、大肠杆菌细胞株BL21(DE3)裂解液中天然β-D-半乳糖苷酶(β-Gal)过Sephadex G25柱除去小分子物质后为酶B(Sephadex G25柱高15cm内径10mm容积约10ml，用50mmol/L且pH为7.5的三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl平衡洗脱)。4-硝基-1-萘基磷酸酯为显色底物A并按文献所示合成(MM Mhala,Purna Nand.Hydrolysis of organic phosphatases.Part Ⅸ-hydrolysis of 1-nitro-2-naphthyl-and4-nitro-1-naphthyl-phosphate moniesters[J].Indian Journal of Chemistry,1976,Vol 14A:344-346)后用硅胶柱层析纯化(用含10％氯仿的甲醇洗脱，薄板层析无其它成分；用碱性磷酸酶将其全部水解后测定所释放4-硝基-1-萘酚在460nm吸收定含量；以4-硝基-1-萘酚(Alfa-Aesar编号L19782)为标准品，得此4-硝基-1-萘基磷酸酯中有效显色底物含量约为68％，含游离4-硝基-1-萘酚小于2％；按钠离子算氯化钠约27％)，4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷为BBI产品(BBI，编号NB2361-1g)。显色产物A为4-硝基-1-萘酚，显色产物B为4-硝基苯酚；波长λ1为450nm(酶标仪)、λ2为405nm(图4b和图3a)。
所用酶标仪为Biotek ElX800及配套Gene5.0软件。所用缓冲液为pH为7.5并含5.0μmol/L柠檬酸50mmol/L Tris-HCl；将显色底物A溶解于此缓冲液为显色底物溶液A、显色底物B称量溶解于此缓冲液为显色底物溶液B；含酶A和酶B的显色底物混合物为显色底物溶液C。
应用本发明所述方法同步测定CIAP和β-Gal的代表性过程如下：
1.配制缓冲液：按《生化实验方法和技术》(高等教育出版社，1981；第一版，第374页)配制50mmol/L且pH为7.5含5umol/L柠檬酸的Tris-HCl缓冲液；摄氏25度水浴恒温备用；
2.配制显色底物溶液：显色底物溶液A仅含终浓度为0.20mmol/L的4-硝基-1-萘基磷酸酯，该显色底物溶液用二甲亚砜配制成20mmol/L储备液，在临用前用上述Tris-HCl缓冲液稀释到0.20mmol/L；显色底物溶液B仅含6.0mmol/L的4-硝基苯基‐β‐D‐半乳糖苷，直接用缓冲液溶解，配制后当天用；显色底物溶液C含有0.20mmol/L4-硝基-1-萘基磷酸酯和6.0mmol/L的4‐硝基苯基‐β‐半乳糖苷，配制方法参照显色底物溶液A和B，当天配置后也仅在当天使用；
3.制备样品：将CIAP按商家标示活性浓度用Tris-HCl缓冲液稀释到约800U/L，将β‐Gal用Tris-HCl缓冲液稀释到约600U/L；两种酶液等比例混合为含两种酶的混合样品；
4.多波长吸收干扰校正系数：用相同浓度的4-硝基-1-萘基磷酸酯和CIAP，连续记录450nm和405nm吸收变化，所用条件下在450nm吸收增加0.60以前基本呈线性，分析405nm吸收对450nm吸收的响应曲线，所得斜率为干扰校正系数R31(图7a)；用4‐硝基苯基‐β‐D-半乳糖苷和β-Gal连续测定450nm和405nm吸收变化，在405nm吸收增加到1.00以前都成线性，分析450nm吸收对405nm吸收的响应，所得曲线的斜率为干扰校正系数R33(图7b)；
5.碱性磷酸酶和β‐半乳糖苷酶的单通道同步测定：用显色底物溶液C稀释到两种显色底物达到测定酶活性的终浓度时，用于将测量波长405nm和450nm下吸收同步调零；取显色底物C共1.50ml，加混合样品20到400μl并补充缓冲液到2.0ml；旋涡振荡混匀后，摄氏25度同步测量波长405nm和450nm下吸收变化，记录间隔20s，共测定3.0min；两波长下吸收在90s以内都是线性变化，可用如下的简便方法计算表观初速度对酶量的响应(图7c和图7d)；
6.解下列方程组消除干扰后得450nm无干扰吸收变化初速度s1、405nm无干扰吸收变化初速度s2(图7c和图7d)；可见经干扰校正后单独测定和两种酶同步测定响应曲线斜率无差异；
V1＝s1+R33×s2
V2＝s2+R31×s1
7.无β‐D‐半乳糖苷酶时，碱性磷酸酶定量限约0.06μmol·(L·min)-1；β‐D‐半乳糖苷酶活性为0.6μmol·(L·min)-1时，两种酶同测碱性磷酸酶定量限约为0.06μmol·(L·min)-1；β‐D‐半乳糖苷酶活性为2.5μmol·(L·min)-1时，两种酶同测时碱性磷酸酶定量限约为0.08μmol·(L·min)-1；无碱性磷酸酶时，β‐D‐半乳糖苷酶定量限约为0.07μmol·(L·min)-1；用显色底物溶液A测定碱性磷酸酶的活性为0.7μmol·(L·min)-1时，两种酶单通道同测时β‐D-半乳糖苷酶定量限为0.09μmol·(L·min)-1；碱性磷酸酶的活性为5.6μmol·(L·min)-1时，两种酶单通道同测时β‐D-半乳糖苷酶定量限为0.08μmol·(L·min)-1。结果比较见表4。
实施例3：酶联免疫吸附分析单通道同步测定牛奶中青霉素和瘦肉精
本应用实例中以β-D-半乳糖苷酶(Sigma G4155，β-Gal))为酶A、α-D-葡萄糖苷酶(SigmaG0660，α-Glu)为酶B；4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷为显色底物A，按合成4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷的路线合成、过胶柱层析纯化(用β-D-半乳糖苷酶将显色底物完全水解后测定所生成的4-硝基-1-萘酚确定纯度)，4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷(Sigma N1377)为显色底物B；所用缓冲液pH为7.4的100mmol/L磷酸盐缓冲液。显色产物A为4-硝基-1-萘酚，显色产物B为4-硝基苯酚；测量波长λ1为450nm、测量波长λ2为405nm(Biotek ELX800酶标仪标准配置中提供的滤光片，附图4a)。本应用实施例中的混合物酶样品为经过酶联免疫吸附分析(ELISA)过程后，分离出来但结合在微孔板上的酶A和酶B混合物。
本实施例中使用Pierce的预包被羊抗小鼠IgG的多克隆抗体的微孔板(产品编号15134，结合容量每孔7pmole)；用Abcam的抗青霉素鼠源IgG单抗ab15070、抗瘦肉精鼠源IgG单抗ab32005；用青霉素G修饰β-D-半乳糖苷酶完全同应用实施例3；修饰显色产物过Sephadex G25柱除去游离的半抗原；瘦肉精修饰α-Glu见如下所述，并过Sephadex G25柱纯化。用本发明所述的方法单通道同步测定纯牛奶中外加的青霉素G和瘦肉精过程如下：
1.配制缓冲液：按《生物化学与分子生物学实验常用数据手册》(科学出版社，2000)所述配制100mmol/L且pH为7.4磷酸钠缓冲液；摄氏25度水浴恒温备用；
2.配置显色底物溶液A、显色底物溶液B和显色底物溶液C：显色底物A用二甲亚砜配制成20mmol/L的显色底物A储备液，用磷酸钠缓冲液稀释到0.20mmol/L为显色底物溶液A；显色底物B用20％的二甲亚砜配制成50mmol/L的显色底物B储备液，用磷酸钠缓冲液稀释到2.6mmol/L为显色底物溶液B；将显色底物A的储备液和显色底物B的储备液用磷酸钠缓冲液稀释到显色底物A浓度为0.20mmol/L且显色底物B为2.6mmol/L，得到显色底物溶液C；
3.青霉素G标记β‐D-半乳糖苷酶：
a)青霉素G活化：0.73g青霉素G钠盐溶于2.0ml N,N’-二甲基甲酰胺，加入0.40g 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)-碳酰二亚胺(缩写为EDC)盐酸盐，及0.30g 1-羟基苯并三唑反应30min得深黄色反应液；取4ul上述深黄色溶液用54ul缓冲液稀释到58ul为活化青霉素G溶液；
b)取上述稀释活化青霉素G溶液50ul，与用0.10mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.4)共0.50ml融解并稀释的β‐D‐半乳糖苷酶0.44mg混匀；摄氏4度反应120min；过Sephadex G25柱(高15cm内径10mm容积约10ml，pH7.5的50mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡)，用280nm吸收监测，收集相同Tris-HCl缓冲液的第一个洗脱峰为青霉素G修饰的β‐D‐半乳糖苷酶，所得青霉素G修饰β‐D‐半乳糖苷酶溶液共2.0ml含有0.22mg蛋白质；
c)标记后比活性：在pH7.5的50mmol/L Tris-HCl缓冲液中，用终浓度为6.0mmol/L的4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷时酶比活性为30μmol·(L·min·mg)-1，活性保留近100％；用4-硝基-1-萘基-β‐D-半乳糖苷为显色底物测定比活性为100μmol·(L·min·mg)-1，保留约70％活性；
d)用量：应用时；优化单抗用量后，逐步提高青霉素标记β‐D-半乳糖苷酶溶液用量，直到结合的半抗原标记β‐D-半乳糖苷酶活性达到饱和；在96孔板体系，用20ul稀释500倍的单抗时加入青霉素标记β‐D-半乳糖苷酶溶液20ul，即可达到饱和；
4.瘦肉精标记α‐D-葡萄糖苷酶：
a)瘦肉精0.8g溶于1.0ml pH1.0的盐酸水溶液中，加24ul亚硝酸钠水溶液(1.0mol/L)，室温反应30min；用淀粉-碘化钾试纸检测为蓝色表明反应完全，即为活化瘦肉精重氮盐；
b)用pH7.8的200mmol/L磷酸盐缓冲液(含10％甘油)溶解α‐D‐葡萄糖苷酶到2.0mg/ml；取此α‐D-葡萄糖苷酶100ul加入2ul活化瘦肉精重氮盐，摄氏4度反应12h；过Sephadex G25柱(高15cm内径10mm容积约10ml，用pH7.4的100mmol/L磷酸钠缓冲液平衡)，用280nm吸收监测，收集此磷酸盐缓冲液第一个洗脱峰2.0ml为瘦肉精标记α‐D-葡萄糖苷酶溶液；
c)标记后比活性：用终浓度为2.6mmol/L的4-硝基苯基-α‐D-葡萄糖苷pH7.4的100mmol/L磷酸盐缓冲液测得比活性为90μmol·(L·min·mg)-1，保留85％；
d)将抗瘦肉精单抗稀释5000倍后取80ul/孔，加入瘦肉精标记α‐D-葡萄糖苷酶溶液10ul，结合的瘦肉精标记α-D-葡萄糖苷酶活性即达到饱和；
5.优化检测单抗ab15070和ab32005的混合比例：青霉素单抗稀释比例1:500；瘦肉精单抗稀释比例为1:5000；上述稀释的单抗从20ul到80ul优化组合，加入上述瘦肉精标记α‐D-葡萄糖苷酶溶液及青霉素标记β‐半乳糖苷酶溶液各40ul；当反应体系在405nm和450nm吸收变化速度相当时，所需抗青霉素单抗为20ul且抗瘦肉精单抗也为80ul；以下实验中，两种单抗即以此比例混匀后，在96孔板上每孔加入100ul单抗混合物；
6.优化两种酶标半抗原混合比例：取上述瘦肉精标记α‐D‐葡萄糖苷酶300ul和青霉素标记β‐半乳糖苷酶溶液600ul混合后，用pH7.4的100mmol/L磷酸盐缓冲液稀释到3.0ml；以下实验中每孔加入100ul半抗原标记酶混合物；
7.在Pierce的预包被羊抗小鼠IgG多克隆抗体96孔板上如下操作：(1)每孔加入100ul单抗混合物与捕获多抗在25度低速震荡60min；(2)用含0.05％吐温-20的pH7.4的100mmol/L磷酸盐缓冲液为洗涤液，每孔每次加入洗涤液0.20ml，每次洗涤3min后去洗涤液，共重复三次；(3)将纯牛奶在4度8000rpm离心30min去上层脂肪获得脱脂牛奶，用pH7.4的100mmol/L磷酸盐缓冲液稀释1倍加入不同比例青霉素和瘦肉精为样品；(4)用步骤(2)洗涤液洗涤3次；
8.在96孔板中每孔加入显色底物溶液A、显色底物溶液B或显色底物溶液C中的一种共200ul；中速震荡10min，在Biotek ELX800酶标仪上，用仪器配套软件同步测量405nm和450nm吸收，每隔3min读数跟踪反应过程，共记录30min；
9.干扰校正系数的测定：操作同应用实施例2；用相同终浓度4-硝基-1-萘基-β‐D-半乳糖苷为显色底物和β‐Gal，连续记录450nm和405nm吸收变化，间隔20s，共记录3.0min，使得在450nm吸收增加到0.80之前都成线性，回归分析405nm吸收对450nm吸收的响应曲线，所得斜率为干扰校正系数R31(图8a)；用相同浓度的α‐D-葡萄糖苷和α‐Glu，连续记录450nm和405nm吸收变化，间隔20s，共记录3.0min，使得在405nm吸收增加到0.80之前都成线性，回归分析450nm吸收对405nm吸收的响应曲线，所得斜率为干扰校正系数R33(图8b)；
10.两种糖苷酶同步测定与单独测定的比较：用显色底物溶液C稀释到两种显色底物达到测定酶活性的终浓度时，用于将测量波长405nm和450nm下吸收同步调零；取显色底物C共1.50ml，加混合样品20到400μl并补充缓冲液到2.0ml；旋涡振荡混匀后，摄氏25度同步测量波长405nm和450nm下吸收变化，记录间隔20s，共测定3.0min；两波长下吸收在90s以内都是线性变化，可用如下的简便方法计算表观初速度对酶量的响应(图8c和图8d)；
11.响应曲线制作：按照实施例2中所用校正系数，将450nm吸收变化表观初速度V1和405nm吸收变化表观初速度V2换算成无干扰的吸收变化速度并扣除自发反应本底；以无外加标准品混合物时两种酶活性为100％，计算加入两种抗生素标准品混合物后的酶活性剩余率；
12.抗生素标记酶结合率；以此结合率对反应体系的抗生素标准品浓度对数作图；结果在结合率在10％到85％之间为线性响应(图8e和8f)；
13.数据处理和结果报告：两种糖苷酶标记单通道ELISA同步测定两种半抗原的定量限比较见表5、回收率比较见表6。
表1 单通道多波长吸收同步测量三种酶活性所需物质、参数表
表2 校正对硝基苯胺(PNA)干扰对测定LDH活性的影响(n>5)
表3 同步测定GGT和LDH的定量限(n>3)
表4 同步测定CIAP和β-Gal的定量限(n>3)
表5用β-Gal和α-Glu为标记酶单通道同步测定瘦肉精和青霉素的结合率定量限和半抗原定量限(n>5)
表6 用β-Gal和α-Glu标记记单通道同步测定瘦肉精和青霉素的回收率(n>5)
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制；本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术原理，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中；除了容易获得的4-硝基-1-萘酚、4-硝基苯酚、4-硝基苯胺、4-硝基-1-萘胺类显色团，其它满足光谱特征要求的显色团也可用于特定酶所需要的显色底物，用于实现多波长吸收单通道同步测定多种酶活性，并使其定量限、灵敏度和线性测量范围与用相同浓度底物在相同波长下测定单个酶活性时相当。
Claims (9)
1.一种用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其特征在于：包括下列步骤：
a.确定用多波长吸收单通道同步测定多种酶活性所需显色底物组合：
a1根据待测酶的专一性筛选满足下列条件的显色底物组合：所选显色团能分别用于制备待测酶的显色底物；所得这些显色底物组合中，将显色底物在对应待测酶作用下所得显色产物相对该显色底物的差吸收峰最大波长从大到小排列，相邻的显色产物差吸收峰最大波长之间相距大于30nm且尽量远；在按显色产物差吸收峰最大波长从大到小的排列中，除了显色产物差吸收峰最靠近红外端的显色底物外，每个显色底物在对应酶作用下所得显色产物差吸收峰最大波长，都与此排列中某个显色底物的最大等吸收波长相差小于25nm且尽量短；
a2用步骤a1所选显色团分别合成待测酶的对应显色底物并组合使用；
b.在一个反应混合物或酶反应体系即单反应通道中，同步启动多个待测酶针对组合使用的显色底物混合物对应显色底物的专一催化反应；
c.选择测量波长组合：以显色产物差吸收峰最靠近红外端的显色底物为显色底物A，在显色底物A的显色产物差吸收峰最大波长下测定该显色产物吸收；在显色底物A的等吸收波长处测定其余待测酶显色产物或显色底物的吸收；
d.在所选多个测量波长组合下，通过快速变换测量波长，多波长吸收同步测量实现同步跟踪单通道中多个待测酶的反应过程；
e.基于无相互作用物质吸收的线性加和性建立消除反应通道中显色物质吸收重叠干扰的数据处理方法，获得消除吸收光谱重叠干扰后每个待测酶的显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线；如某个待测酶不受反应体系其它酶的产物及底物的干扰且其底物浓度在对应酶米氏常数的3倍以上，用经典初速度法分析其显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线确定初速度；如某个待测酶不受反应体系其它酶的产物及底物的干扰但所用显色底物浓度在该酶米氏常数的5％以上而低于米氏常数的3倍，联用经典初速度法和反应过程分析法分析其显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线确定初速度；当某个待测酶受反应体系中其自身和/或其它酶的底物和/或产物的干扰时，将描述反应体系动力学的微分速度方程组数值积分后分析活性受到干扰待测酶反应的显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线，确定其最大反应速度表示其活性，或据其微分速度方程和所得最大反应速度换算成底物浓度为起始底物浓度93％时初速度表示该待测酶的活性。
2.根据权利要求1所述用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其特征在于：显色产物相对显色底物差吸收峰最大波长在300nm以上且其显色底物吸收峰最大波长小于其对应显色产物吸收峰最大波长，否则测定该酶催化逆反应的速度表示该酶的活性；显色产 物差吸收峰最大波长相邻的任两个显色底物中，显色产物差吸收峰最大波长更靠近红外端显色底物的最大等吸收波长与显色产物差吸收峰最大波长更靠近紫外端显色产物的差吸收峰最大波长相等或相距不超过5nm为优化的显色底物组合；所用显色底物组合中每个显色底物都仅被样品中的一种待测酶作用生成对应显色产物，而不被样品中其它任何酶作用或作用效果不明显；此处所述不被其它任何酶作用或作用效果不明显，指当样品中酶I所对应显色底物的浓度与其米氏常数相差小于50％时，样品中其它任何酶作用于该显色底物的比活性都低于酶Ⅰ作用于该显色底物比活性的1％；步骤b中，选择适于同步测定活性的待测酶发挥作用的缓冲介质和反应条件，即缓冲介质pH位于pH5.0到9.0之间且接近比活性最低待测样品的最适pH，所用反应温度在摄氏20到40度之间。
3.根据权利要求2所述的用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其特征在于：所述显色底物包括天然显色底物和非天然显色底物；天然显色底物包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；非天然显色底物由显色团和被酶识别基团组成，显色团包括但不限于4-硝基苯酚、4-硝基苯硫酚、4-硝基苯胺、4-硝基-1-萘酚、4-硝基-1-萘硫酚、4-硝基-1-萘胺、2-萘酚、4-氯苯酚、玫红酸或这些芳香酚及芳香胺的衍生物。
4.根据权利要求1、2或3所述的用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其特征在于：采用两波长吸收单通道同步测量两种酶活性：
步骤a中，将两种待测酶分别命名为酶A和酶B，所需两种显色团分别为显色团A和显色团B，对应的两种显色底物分别为显色底物A和显色底物B，在两种待测酶作用下生成的两种显色产物分别为显色产物A和显色产物B，这些显色底物及显色产物的组合需满足下列条件：(1)显色产物A差吸收峰最大波长X1靠近红外端，显色产物B差吸收峰最大波长X2靠近紫外端，显色产物B差吸收峰最大波长X2与显色产物A差吸收峰最大波长X1相距大于30nm且尽量远；(2)显色产物A的最大等吸收波长为Y1且与显色产物B差吸收峰最大波长X2相距小于25nm且尽量短；
步骤b、c和d中，在一个反应通道同步启动样品中两种酶针对显色底物A和显色底物B的反应，并得到显色产物A和显色产物B；选择显色产物A的差吸收峰最大波长X1为λ1测定显色产物A吸收，选择显色产物A的最大等吸收波长Y1为λ2处测定显色产物B吸收；通过快速变换测量波长，两波长吸收同步测量同步跟踪单通道中两种待测酶的反应过程；
步骤e中，基于吸收的线性加和性建立消除多种物质吸收重叠干扰的数据处理方法，获得消除吸收光谱重叠后两个待测酶的显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线；如某个待测酶不受反应体系其它酶的产物及底物的干扰且其底物浓度在对应酶米氏常数的3倍以上，则用经典初速度法分析其显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线确定初速度；如某 个待测酶不受反应体系其它酶的产物及底物的干扰但所用底物浓度在该酶米氏常数的5％以上而低于米氏常数的3倍，联用经典初速度法和反应过程分析法分析其显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线确定初速度；当某个待测酶受到反应体系中其自身或其它酶的底物或产物的干扰时，将描述反应体系动力学的微分速度方程组数值积分后分析活性受到干扰待测酶反应的显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线，确定其最大反应速度表示其活性，或据其微分速度方程和所得最大反应速度换算成底物浓度为起始底物浓度93％时初速度表示酶活性；以显色产物A差吸收峰最大波长前后不超过25nm的波长为λ1并测定在此波长下吸收为A1，以显色产物A和显色底物A最大等吸收波长附近不超过25nm的波长为λ2下并测定此波长下吸收为A2，基于吸收线性加和性消除多种物质吸收重叠干扰计算无干扰的显色产物或底物吸收，需解下列二元一次方程组：
A1＝A10+E31×P1+E34×P2
A2＝A20+E32×P1+E35×P2
进一步可转变成如下二元一次方程组
A1＝A10+A1a+R33×A2b
A2＝A20+A2b+R31×A1a
其中
R31＝E32/E31
R33＝E34/E35
上述公式中，P1为显色产物A瞬时浓度；P2为显色产物B瞬时浓度；E31为显色产物A与显色底物A在λ1下差摩尔消光系数；E32为显色产物A与显色底物A在λ2下差摩尔消光系数E32；E34为显色产物B与显色底物B在λ1下差摩尔消光系数；E35为显色产物B与显色底物B在λ2下差摩尔消光系数；A1为校正吸收干扰前在λ1瞬时总吸收，A2为校正吸收干扰前在λ2瞬时总吸收；A1a为校正吸收干扰后显色产物A在λ1瞬时净吸收，其等于P1和E31乘积，A2b为校正吸收干扰后显色产物B在λ2瞬时净吸收，其等于P2和E35乘积；A10为反应体系未生成任何显色产物前在λ1的吸收，为来自反应体系的本底，相当于含相同浓度全部显色底物反应体系在λ1吸收与含相同浓度样品反应体系在λ1吸收的加和；A20为反应体系未生成任何显色产物前在λ2的吸收，为来自反应体系的本底，相当于含浓度相同全部显色底物的反应体系在λ2吸收与含相同浓度样品反应体系在λ2吸收的加和；
如反应通道中某种酶的底物或产物抑制或激活另一种酶，则如下测量被干扰酶活性：
获得两种显色底物或显色产物的无干扰吸收变化曲线，据此换算出产生干扰作用物质的浓度变化曲线；用含干扰作用微分动力学方程数值积分计算理论反应曲线拟合被干扰酶 显色底物或显色产物的无干扰吸收变化曲线，对应最好拟合的最大反应速度Vm为无干扰时的待测酶活性；据该酶的微分动力学方程、Vm和其初始底物浓度的93％，计算在刚启动反应时干扰物质还没有明显积累的初速度表示该待测酶活性；
当仅一种酶显色产物对另一种酶有竞争抑制作用时，先确定显色产物A及显色产物B在λ1下和在λ2下的无干扰吸收变化曲线A1a和A2b；设初始显色底物A的浓度为C1，初始显色底物B的浓度为C2；设酶B最大反应速度为VmB，由VmB换算成初速度所用预设显色底物浓度等于C2的93％，酶B对显色底物B的米氏常数为KmB；如显色产物A对酶B为竞争性抑制，其竞争性抑制常数为Kia，酶B动力学方程为:
对上述方程两边对反应时间从0～t进行积分得到
左边的积分项为反应时刻t和反应时刻0之间显色产物B的净吸收变化；方程右边积分项以dt内显色产物A浓度恒定进行数值积分，即计算
以dt为Δt，计算每个记录点的x，将所有x求和再减去起点和终点x得到sumx，用如下公式计算VmB并据其微分动力学方程得无干扰初速度s2；
s2＝0.93×C2×VmB/(KmB+0.93×C2)
上述计算公式中，酶A将显色底物A转变成显色产物A的计量关系为1:1，酶B将显色底物B转变成显色产物B的计量关系也为1:1。
5.根据权利要求4所述的用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，特征在于：
步骤a中，如下选择显色团A和显色团B组合：显色产物A的最大等吸收波长Y1与显色产物B差吸收峰最大波长X2相等或相距不超过5nm；
步骤c中，选择产物A差吸收峰最大波长X1为λ1后，如下选择测量波长λ2：显色产物B与显色底物B差摩尔消光系数在显色产物A最大等吸收波长Y1处高于在显色产物B差吸收峰最大波长X2处的30％，则选择显色产物A最大等吸收波长Y1为λ2，否则，用最靠近显色产物A最大等吸收波长Y1的显色产物B差吸收峰波长为λ2，或最靠近显色产物B差 吸收峰且其它待测显色显色产物与显色显色底物差摩尔消光系数都小于显色产物B与显色底物B差摩尔消光系数20％的波长为λ2测量显色产物B吸收；
步骤e中，需测定R31为显色产物A吸收干扰的校正系数；测定R31时，仅用酶A所需的全部显色底物而不加其它待测酶的任何显色底物，使反应体系无来自显色底物B及显色产物B在两个测量波长λ1和λ2的吸收，此时同步测定反应通道中在两个测量波长下的吸收变化，直到在λ2吸收变化大于0.005或在λ1吸收变化大于0.500；以在λ1下吸收为横坐标，在λ2下吸收为纵座标进行回归分析，所得回归直线斜率为校正系数R31；
步骤e中，需测定R33为显色产物B吸收干扰的校正系数；测定R33时，仅用酶B所需的全部显色底物而不加其它待测酶的任何显色底物，使反应体系无来自显色底物A及显色产物A在两个测量波长λ1和λ2的吸收，此时同步测定反应通道中在两个测量波长下的吸收变化，直到在λ2吸收变化大于0.500或在λ1吸收变化大于0.005；以在λ2下吸收为横坐标，在λ1下吸收为纵座标进行回归分析，所得回归直线斜率为校正系数R33。
6.根据权利要求5所述的用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其特征在于：
与酶A对应的显色底物包括水解反应最大等吸收波长在310到330nm间的4-硝基苯基乙酸酯，水解反应最大等吸收波长在330到350nm间的4-硝基苯基磷酸酯、4-硝基苯基硫酸酯、4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷和γ-谷氨酰基-4-硝基苯胺，还原反应最大等吸收波长在350到370nm间的5-巯基-2-硝基苯甲酸及5-巯基-2-硝基苯乙酸对应显色底物为二硫化物可被酶作用所释放的硫醇还原；与此类酶A的显色底物A对应的酶B的显色底物B主要是天然显色底物，包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；
与显色底物A对应的酶A包括但不限于芳香酯酶、磷酸酶、硫酸酯酶、γ-谷氨酰基转移酶、天然氨基酸α-羧基对应的酰胺酶和糖苷酶；与此类酶A对应的酶B包括但不限于乳酸脱氢酶LDH、苹果酸脱氢酶MDH、偶联LDH的谷丙转氨酶和偶联MDH的谷草转氨酶。
7.根据权利要求1、2或3所述的用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其特征在于：采用三波长吸收单通道同步测量三种酶活性：
步骤a中，将三种待测酶分别命名为酶A、酶B和酶C，所需显色底物分别为显色底物A、显色底物B和显色底物C，在对应酶作用下生成显色产物分别为显色产物A、显色产物B和显色产物C；这些显色底物和显色产物的组合需满足下列条件：(1)显色产物A差吸收峰最大波长为X1且最靠近红外端，显色产物C差吸收峰最大波长为X3且最靠近紫外端，显色产物B差吸收峰最大波长为X2且位于X1和X3之间，X2与X1及X3相距都大于30nm且尽量远；(2)显色产物A的最大等吸收波长为Y1且次大等吸收波长为Ys；显色底物B 生成显色产物B的最大等吸收波长为Y2且与Y1相距尽量远而和Ys相距尽量短；(3)Y1与X2相距小于25nm且相距尽量短；Y2和Ys及X3相距都小于25nm且相距尽量短；
步骤b中，在一个反应通道同步启动三种酶针对显色底物A、显色底物B和显色底物C的反应，并得到对应的显色产物A、显色产物B和显色产物C；
步骤c中，以显色产物A差吸收峰最大波长X1或相距25nm以内波长为λ1测定显色产物A吸收，选择显色产物A最大等吸收波长Y1或相距25nm以内波长为λ2测定显色产物B吸收，选择显色产物B最大等吸收波长Y2或相距25nm以内波长为λ3测定显色产物C吸收；
步骤d中，通过快速变换测量波长，三波长吸收同步测量实现同步跟踪单个反应体系中两种样品的反应过程；
步骤e中，先建立消除多种物质吸收重叠干扰的数据处理方法，获得消除吸收光谱重叠后每个待测酶的显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线；某个待测酶不受反应体系其它酶的产物及底物的干扰且其底物浓度在对应酶米氏常数的3倍以上，则用经典初速度法分析其显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线确定初速度；如某个待测酶不受反应体系其它酶的产物及底物的干扰但所用底物浓度在该酶米氏常数的5％以上而低于米氏常数的3倍，联用经典初速度法和反应过程分析法分析其显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线确定初速度；当某个待测酶受到反应体系中其自身或其它酶的底物或产物的干扰时，将描述反应体系动力学的微分速度方程组数值积分后分析活性受到干扰待测酶反应的显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线，确定其最大反应速度表示其活性，或据其微分速度方程和所得最大反应速度换算成底物浓度为起始底物浓度93％时初速度表示酶活性；基于吸收线性加和性消除多种物质吸收重叠干扰需解如下三元一次方程组：
A1＝A10+A1a+R33×A2b+R35×A3c
A2＝A20+A2b+R31×A1a+R36×A3c
A3＝A30+A3c+R32×A1a+R34×A2b
其中
R31＝E32/E31
R32＝E33/E31
R33＝E34/E35
R34＝E36/E35
R35＝E37/E39
R36＝E38/E39
上述公式中，A1为校正吸收干扰前在λ1瞬时吸收，A2为校正吸收干扰前在λ2瞬时吸收，A3为校正吸收干扰前在λ3瞬时吸收；A1a为校正吸收干扰后显色产物A在λ1瞬时净吸 收，A2b为校正吸收干扰后显色产物B在λ2瞬时净吸收，A3c为校正吸收干扰后显色产物C在λ3瞬时净吸收；A10为反应体系未生成任何显色产物前在λ1吸收，A20为反应体系未生成任何显色产物前在λ2吸收，A30为反应体系未生成任何显色产物前在λ3吸收；E31为显色产物A与显色底物A在λ1下差摩尔消光系数，E32为显色产物A与显色底物A在λ2下差摩尔消光系数，E33为显色产物A与显色底物A在λ3下差摩尔消光系数；E34为显色产物B与显色底物B在λ1下差摩尔消光系数，E35为显色产物B与显色底物B在λ2下差摩尔消光系数，E36为显色产物B与显色底物B在λ3下差摩尔消光系数；E37为显色产物C与显色底物C在测量波长λ1下差摩尔消光系数，E38为显色产物C与显色底物C在测量波长λ2下差摩尔消光系数，E39为显色产物C与显色底物C在测量波长λ3下差摩尔消光系数；上述公式中，显色底物A转变成显色产物A计量关系为1:1；显色底物B转变成显色产物B的计量关系为1:1；显色底物C转变成显色产物C的计量关系为1:1；
如反应通道中某种酶的底物或产物抑制或激活另一种酶，则如下测量被干扰酶活性：
获得两种显色底物或显色产物的无干扰吸收变化曲线，据此换算出产生干扰作用物质的浓度变化曲线；用含干扰作用微分动力学方程数值积分计算理论反应曲线拟合被干扰酶显色底物或显色产物的无干扰吸收变化曲线，对应最好拟合的最大反应速度Vm为无干扰时的待测酶活性；据该酶的微分动力学方程、Vm和其初始底物浓度的93％，计算在刚启动反应时干扰物质还没有明显积累的初速度表示该待测酶活性。
8.根据权利要求7所述的用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其特征在于：采用三波长吸收单通道同步测量三种酶活性：
步骤a中，用如下原则选择显色底物组合：所用显色底物A、显色底物B及显色底物C使显色产物A的最大等吸收波长Y1与显色产物B差吸收峰最大波长X2相等或相距不超过5nm、显色产物B最大等吸收波长Y2和显色产物A次大等吸收波长Ys及显色产物C差吸收峰最大波长X3之间相等或任两者相距都不超过5nm；
步骤c中，选择显色产物A差吸收峰最大波长X1为λ1后，按如下原则选择另外两个测量波长λ2和λ3：显色产物B与显色底物B差摩尔消光系数在显色产物A最大等吸收波长Y1处高于显色产物B与显色底物B在二者差吸收峰最大波长X2处差摩尔消光系数的30％时，选择Y1为测量波长λ2，否则，用最靠近显色产物A最大等吸收波长Y1的显色产物B差吸收峰波长，或靠近显色产物B差吸收峰且其它显色产物与显色显色底物差摩尔消光系数都小于显色产物B与显色底物B差摩尔消光系数20％的波长为λ2测量显色产物B吸收；显色产物C与显色底物C差摩尔消光系数在显色产物A次大等吸收波长Ys处或显色产物B与显色底物B最大等吸收波长Y2处应高于二者在其差吸收峰最大波长X3处差 摩尔消光系数的30％时，则选择Y2或Ys为为λ3测量显色产物B吸收，否则用最靠近显色产物B最大等吸收波长Y2或显色产物A次大等吸收波长Ys或靠近显色产物C差吸收峰最大波长且其它显色产物与显色底物差摩尔消光系数都小于显色产物C与显色底物C差摩尔消光系数20％的波长为λ3测量显色产物C吸收；
步骤e中需测定显色产物A吸收干扰校正系数R31和R32；测定时仅用酶A的全部显色底物而不用其它待测酶的任何显色底物，使反应体系无来自显色底物B及显色产物B、显色底物C及显色产物C在λ1、λ2和λ3的吸收，同步测定反应通道中三个波长下的吸收变化，直到在λ2及λ3吸收变化都大于0.005或在λ1吸收变化大于0.500；以在λ1下吸收变化为横坐标，在λ2下和在λ3下吸收变化为纵座标进行回归分析，所得在λ2下吸收变化回归直线斜率为校正系数R31，在λ3下吸收变化回归直线斜率为校正系数R32；
步骤e中需测定显色产物B吸收干扰校正系数R33和R34；测定时仅用酶B的全部显色底物而不用其它待测酶的任何显色底物，使反应体系无来自显色底物A及显色产物A、显色底物C及显色产物C在λ1、λ2和λ3的吸收，同步测定反应通道中三个波长下的吸收变化，直到在λ2及λ3吸收变化都大于0.005或在λ1吸收变化大于0.500；以在λ2下吸收变化为横坐标，在λ1下和在λ3下吸收变化为纵座标进行回归分析，所得在λ1下吸收变化回归直线斜率为校正系数R33，在λ3下吸收变化回归直线斜率为校正系数R34；
步骤e中需测定显色产物C吸收干扰校正系数R35和R36；测定时仅用酶C的全部显色底物而不用其它待测酶的任何显色底物，使反应体系无来自显色底物A及显色产物A、显色底物B及显色产物B在λ1、λ2和λ3的吸收，同步测定反应通道中三个波长下的吸收变化，直到在λ2及λ1吸收变化都大于0.005或在λ3吸收变化大于0.500；以在λ3下吸收变化为横坐标，在λ1下和在λ2下吸收变化为纵座标进行回归分析，所得在λ1下吸收变化回归直线斜率为校正系数R35，在λ2下吸收变化回归直线斜率为校正系数R36。
9.根据权利要求8所述的用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其特征在于：
步骤a中，与酶A对应显色底物A包括4-硝基-1-萘基磷酸酯且其水解两个等吸收波长分别在315到335nm之间及395到415nm之间、4-硝基-1-萘基硫酸酯且其水解两个等吸收波长分别在315到335nm之间及395到415nm之间、4-硝基-1-萘基乙酸酯且其水解时两个等吸收波长分别在310到330nm之间及375到395nm之间、4-硝基-1-萘基-D-半乳糖苷且其水解时两个等吸收波长分别在320到345nm之间及390到410nm之间、4-硝基-1-(N-赖氨酰)萘胺且其水解的最大等吸收波长分别在385到410nm之间，这些显色底物A被酶A作用生成4-硝基-1-萘酚或4-硝基-1-萘胺或其衍生物作为显色产物A；与此类显色底物A 对应的显色底物B主要是4-硝基苯酚或4-硝基苯胺衍生物，在相应的酶B作用下生成显色产物B为4-硝基苯酚或4-硝基苯胺或4-硝基苯基硫醇；与此类显色底物A和显色底物B对应的显色底物C包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；
与显色底物A对应酶A包括但不限于芳香酯酶、磷酸酶、硫酸酯酶、γ-谷氨酰基转移酶、肽酶即天然氨基酸α-羧基对应的酰胺酶和糖苷酶；与显色底物B对应的酶B包括与已选酶A不同但属于酶A的其它水解酶；与显色底物C对应的酶包括但不限于乳酸脱氢酶LDH、苹果酸脱氢酶MDH、偶联LDH的谷丙转氨酶和偶联MDH的谷草转氨酶。
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