CN107515633B - 一种单酶法生产海藻糖的监控方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单酶法生产海藻糖的监控方法,首先安装近红外实时监测与控制系统,采集样本并将各样本pH计实时测定的pH值、对应各样本高效液相色谱法测定的海藻糖含量等数据与对应采集的各样本的近红外光谱信息进行关联,建立起单酶法生产过程中单位时间内海藻糖含量及pH值的变化的定量模型并校正。利用所建立定量校正模型对单酶法生产过程中单位时间内海藻糖的含量及pH值的变化进行快速检测,利用控制系统稳定pH值在海藻糖合成酶活力最佳范围内。本发明方法不但可以对单酶法生产过程中的反应液进行实时监测,而且可自动控制pH值和海藻糖含量变化,结果准确可靠。
Description
技术领域
本发明属于一种关于海藻糖的发明,更具体地讲,本发明涉及一种有关单酶法生产海藻糖的监测和控制的方法。
背景技术
海藻糖Trehalose是由两分子葡萄糖以α,α-1,1-糖苷键相连而成的非还原性二糖,由于具有对生物体优良的抗逆保护作用等优良性能而被誉为“生命之糖”和“二十一世纪的新型糖类”,其大规模制造方法受到广泛关注;海藻糖的生产方法有天然生物提取法、微生物发酵法、化学合成法、基因工程法和酶转化法;目前工业化生产基本采用酶转化法,主要又分单酶法和双酶法;在单酶法生产海藻糖生产过程中,海藻糖合成酶将麦芽糖转化成海藻糖,其中海藻糖合成酶的性质决定了麦芽糖对海藻糖的转化率,该转化率的高低直接关系到后续海藻糖的结晶率及终产品海藻糖的成本;海藻糖生产企业一般用高效液相色谱HPLC来检测海藻糖的组分,以控制反应时间和产物质量,费时费事,成本较高,而且难以实时测出工艺过程中的成分变化,更难精确控制生产工艺;因此,发展形成单酶法生产海藻糖的在线监控技术,对于海藻糖生产技术进步和产品质量升级具有重大现实意义。
近红外光谱near-infraredspectroscopy,NIRS分析技术是上世纪90年代发展起来的一项现代分析技术,它综合运用了计算机技术、光谱技术和化学计量等多个学科的最新研究成果,以其独特的高效、快速、成本低、环保等突出优点,在农业、食品、石油化工和制药工程等学科中得到了广泛应用;文献“酿酒酵母胞内海藻糖的提取纯化及近红外检测,骆莹,2011”首次报道了近红外快速检测酿酒酵母内海藻糖含量是可行的,但由酿酒酵母提取海藻糖属于生物提取法,在海藻糖实际生产中没有产业化价值;目前尚无利用近红外检测酶法生产海藻糖含量的报道,更无利用近红外监控海藻糖生产的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是将单酶法生产海藻糖过程中需人工频繁进行的海藻糖含量检测改为近红外自动检测并根据其变化自动控制加碱量以实现生产最优化自动调控的目的,即提供一种方法:应用近红外实时检测单酶法生产海藻糖过程中海藻糖含量,通过计算分析其含量变化与pH值变化之间的关系建立模型并校正,进而确定加碱时间及加碱量以稳定反应液的pH值使之处于海藻糖合成酶活力最高的最适pH范围内,从而达到生产最优化自动调控的目的。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案包括以下步骤。
步骤一,安装近红外实时监测和控制系统,所述近红外实时监控系统由反应罐(1)、节流阀(2)、检测池(3)、光纤(4)、近红外光谱仪(5)、计算机(6)、加碱池(7)、节流阀(8)组成,在反应罐(1)流出口设置节流阀(2),检测池(3)两边连接光纤(4),光纤(4)与近红外光谱仪(5)连接,近红外光谱仪(5)与计算机(6)连接,计算机同时与加碱池(7)连接,加碱池(7)通过节流阀(8)与反应罐(1)相连。
步骤二,生产、采样、检测、建模、校正,包括:将麦芽糖浆放入反应罐(1)内,根据所用海藻糖合成酶的性质,调好温度、初始浓度和pH值后加入海藻糖合成酶进行催化反应,催化反应结束后,对反应液进行高温灭酶活,活性碳脱色、阴-阳离子交换、浓缩、结晶、干燥、包装,即得海藻糖产品;在催化反应过程中分时采样,并将用pH计实时测定各样本pH值、用高效液相色谱法实时测定各样本的海藻糖含量,用近红外光谱仪(5)经光纤(4)在检测池(3)实时扫描采集各样本的近红外光谱信息,其中,光谱采集条件为:扫描波数范围4000~10000cm-1,分辨率8cm-1,扫描次数32-96次,每个样品测定2-3次,取平均光谱用于近红外建模;然后通过计算分析,建立起单酶法生产过程中单位时间内光谱变化与海藻糖含量变化,海藻糖含量变化与pH值变化相关联的定量模型并校正。
步骤三,将所装近红外监测系统和校正后模型用于催化反应在线监控,当海藻糖含量增速下降到设定值时,通过加碱池(7)经节流阀(8)加碱到反应罐(1)调节pH值稳定在海藻糖酶活力最高区间。
本发明与现有技术相比,具有如下优点:单酶法生产海藻糖现有技术为高效液相色谱检测海藻糖含量,费时费力,本发明方法可以对单酶法生产海藻糖的反应液进行实时取样,并利用近红外光谱仪实时监测反应液中的海藻糖的含量、自动调控稳定反应液的pH值,结果准确可靠,与不调控pH相比,明显提高了海藻糖得率并缩短了反应时间,与人工调控及检测相比,省时省力,既方便快捷又节省了人工,降低了监控和生产成本。
附图说明
图1为本发明近红外实时监控系统。
图2为单酶法生产海藻糖反应液近红外原始光谱。
图3为单酶法生产海藻糖反应液经一阶微分和平滑预处理后的近红外光谱。
图4为PLS模型的校正集和预测集海藻糖的预测值与真值的关系。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容,下面结合具体实施例作进一步说明;应理解,这些实施例仅用于对本发明进一步说明,而不用于限制本发明的范围;此外应理解,在阅读了本发明所述的内容后,该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整,仍属于本发明的保护范围。
实施例1监控系统安装:如图1所示,安装近红外实时监测和控制系统,包括反应罐(1)、节流阀(2)、检测池(3)、光纤(4)、近红外光谱仪(5)、计算机(6)、加碱池(7)、节流阀(8)组成,在反应罐(1)流出口设置节流阀(2),检测池(3)两边连接光纤(4),光纤(4)与近红外光谱仪(5)连接,近红外光谱仪(5)与计算机(6)连接,计算机同时与加碱池(7)连接,加碱池(7)通过节流阀(8)与反应罐(1)相连。
实施例2催化反应:将90%纯度的麦芽糖配成浓度为20%的麦芽糖浆放入反应罐(1)内,将反应液温度设定在34-36℃,按1:30重量比例加入来自灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)CCTCC AA92094的海藻糖合成酶进行催化反应,该海藻糖合成酶最适pH范围为7.2-7.8。
实施例3实测pH:分别对反应过程中不调pH及调pH的2个催化反应进行分时取样,用pH计实时测定各样本pH值,结果见表2。
实施例4用高效液相色谱法实时测定对应各样本的海藻糖含量,结果见表2,高效液相色谱条件:氨基柱—Agela Innoval NH2,5μm,4.6×250mm;流动相:乙腈/水,体积比为80/20;流速:1.0mL/min;检测器:视差折光检测器;进样量:10μL;柱温:35℃;参照海藻糖国标GB/T 23529-2009对各样本海藻糖含量进行检测。
实施例5-近红外光谱采集,仪器:用近红外光谱仪(5)经光纤(4)在检测池(3)实时扫描采集各样本的近红外光谱信息,其中近红外光谱仪为美国Thermo Nicolet公司AntarisⅡ型傅立叶变换近红外光谱仪,TE-InGaAs检测器,光谱采集及信息处理软件为TQanalyst软件,光谱采集条件:扫描范围4000~10000cm-1,分辨率8cm-1,扫描次数32次,增益为2,扫描2次,图2为波数在4000~10000cm-1的样本NIRS谱图,取平均光谱用于近红外建模。
实施例6-光谱数据处理:运用平滑、一阶微分、二阶微分等预处理方法处理样品的光谱数据,以消除光谱测量中引入的声影响;经偏最小二乘法算法分析PLS,剔除异常样品,从而提高校正模型的预测能力和稳定性。
实施例7评估:判定模型预测能力的基本参数,对建立模型的预测性能采用相关性(R)、交叉验证均方根误差(RMSECV)和预测均方根误差(RMSEP)的评价方式,计算方法依(I)~(III)所示:
式中:
yi——对应的参考值,g/mL
m——预测样品总数
n——校正样品的总数。
实施例8光谱预处理方法比较及模型选择:
表1不同预处理方法下单酶法生产海藻糖产物的PLS建模
预处理方法 | 主成分因子数 | RSMEC | Rc | RMSEP | Rp |
无处理 | 6 | 0.214 | 0.995 | 0.193 | 0.992 |
1D | 5 | 0.194 | 0.996 | 0.277 | 0.989 |
2D | 4 | 0.255 | 0.992 | 0.342 | 0.975 |
1D+SG | 5 | 0.188 | 0.995 | 0.089 | 0.989 |
2D+SG | 4 | 0.417 | 0.979 | 0.757 | 0.928 |
表1中比较了无预处理、一阶微分处理1D、二阶微分处理2D、平滑SG互相组合后的建模效果,发现经1D+SG组合光谱预处理后的校正集均方根误差RSMEC、预测集均方根误差RMSEP值最接近于0,训练集相关系数Rc、预测集相关系数Rp最接近于1,效果最优;即经PLS、1D+SG平滑组合处理,初步得到校正模型,反复筛选并剔除预测值与真实值差距较大、对模型的稳定性有强烈扰动作用的样本,剩余有代表性的样本用于建模,其中校正集涵盖预测集的浓度范围,减少了建模的工作量,剔除后,模型的预测能力得到提高,海藻糖模型的RMSEP达到0.089;图3为原光谱经一阶微分和SG平滑预处理后的海藻糖浆NIRS谱图,光谱基线在5100~5400cm-1,7000~7200cm-1波数范围内波动明显;故不采用全光谱,只选取此两处波段范围可降低背景噪声的影响;图4为海藻糖PLS模型的预测值与真实值散点图;图中,模型的Rc 0.995,Rp为0.989。
实施例9应用及效果:将上述所得校正模型和数据用于所装近红外监测系统进行催化反应在线监控,设定10分钟为单位反应时间,在反应最初5小时内,当海藻糖含量增速下降到≤0.2g/50mL/10min,通过加碱池(7)经节流阀(8)按50mmol/LNaOH自动加碱,使海藻糖含量增速>0.2g/50mL/10min,pH值稳定在海藻糖酶活力最高区间,由表2可以看出,自控调节pH的反应与不调pH的反应相比,其海藻糖转化率提高(70.89-64.33)/64.33=10.2%,反应时间缩短(8-5)/8=37.5%,具有明显的改善效果,
表2根据海藻糖含量变化调控pH及其对照结果
说明:TH为海藻糖含量高效液相色谱HPLC测定值g/50mL,TN为海藻糖含量近红外预测值g/50mL;pH为pH计实测值,ΔpH为单位时间内pH的增减值,ΔTN为单位时间内海藻糖近红外预测值的变化量,g/50mL/h,海藻糖转化率=最后两个分时样本海藻糖含量均值/初始麦芽糖含量。
实施例10后续加工处理:将上述催化反应液灭酶活进行95℃灭酶30分钟或者100℃高温灭酶10分钟、脱色、阴-阳离子交换、浓缩、结晶、干燥、包装,即可得海藻糖产品。
Claims (3)
1.一种单酶法生产海藻糖的监控方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一,安装近红外实时监测和控制系统,所述近红外实时监控系统由反应罐(1)、节流阀(2)、检测池(3)、光纤(4)、近红外光谱仪(5)、计算机(6)、加碱池(7)、节流阀(8)组成,在反应罐(1)流出口设置节流阀(2),检测池(3)两边连接光纤(4),光纤(4)与近红外光谱仪(5)连接,近红外光谱仪(5)与计算机(6)连接,计算机同时与加碱池(7)连接,加碱池(7)通过节流阀(8)与反应罐(1)相连;
步骤二,生产、采样、检测、建模、校正,包括:将麦芽糖浆放入反应罐(1)内,根据所用海藻糖合成酶的性质,调好温度、初始浓度和pH值后加入海藻糖合成酶进行催化反应,催化反应结束后,对反应液进行高温灭酶活,脱色、阴-阳离子交换、浓缩、结晶、干燥,即得海藻糖产品;在催化反应过程中分时采样,并将用pH计实时测定各样本pH值、用高效液相色谱法实时测定各样本的海藻糖含量,用近红外光谱仪(5)经光纤(4)在检测池(3)实时扫描采集各样本的近红外光谱信息,其中,光谱采集条件为:扫描波数范围4000~10000cm-1,分辨率8cm-1,扫描次数32-96次,每个样品测定2-3次,取平均光谱用于近红外建模;然后通过计算分析,建立起单酶法生产过程中单位时间内光谱变化与海藻糖含量变化,海藻糖含量变化与pH值变化相关联的定量模型并校正;
步骤三,将所装近红外监测系统和校正后模型用于催化反应在线监控,当海藻糖含量增速下降到设定值时,通过加碱池(7)经节流阀(8)加碱到反应罐(1)调节pH值稳定在海藻糖酶活力最高区间。
2.根据权利要求1所述的一种单酶法生产海藻糖的监控方法,其特征在于,所述步骤二中催化反应所加的海藻糖合成酶为来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)CCTCCAA92094的海藻糖合成酶,其最适pH为7.2-7.8。
3.根据权利要求1所述的一种单酶法生产海藻糖的监控方法,其特征在于,所述步骤二中,所述高效液相色谱法测定海藻糖的色谱条件为:氨基柱—Agela Innoval NH2,5μm,4.6×250mm;流动相:乙腈/水,体积比为80/20;流速:1.0mL/min;检测器:视差折光检测器;进样量:10μL;柱温:35℃。
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