CN112240876A - 一种基于近红外实时检测发酵过程参数的方法 - Google Patents
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
- G01N21/35—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry using infrared light
- G01N21/359—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry using infrared light using near infrared light
Abstract
本发明公开了一种基于近红外实时检测发酵过程参数的方法,包括:在线采集菌种的发酵液,利用非接触式近红外光谱平台获得发酵液图谱,分析发酵液中各个组分的含量。本发明基于近红外光谱技术原位实时检测发酵过程参数,分别建立酵母、霉菌(黑曲霉)和细菌(拟干酪乳杆菌)三种不同微生物系统发酵过程参数的近红外光谱检测模型。通过验证发现,近红外光谱模型能够实现对发酵过程参数实现实时、快速在线检测,具有很好的预测精度与可靠性。近一步说明,近红外光谱在不同类型物质,不同发酵体系中具有良好的稳定性和可行性,以便于在后续发酵优化过程中实现在线实时控制。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程及代谢工程技术领域,具体涉及一种基于近红外实时检测发酵过程参数的方法。
背景技术
在工业微生物发酵中,发酵调控技术是重要的组成部分,通过调控胞外的理化参数等条件变化,从而深入了解微生物细胞的代谢状态,是后续发酵工艺的改良,提高微生物产量及得率的基础。微生物生理状态的变化是发酵过程多参数相关性分析的基础,从宏观代谢参数的变化可以反映细胞内基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学的变化,因此发酵过程参数检测是指导发酵优化调控的基础。发酵过程是动态变化的,及时获取发酵过程参数检测,有助于及时掌握菌株的生长代谢状态,因此实现实时在线传感设备具有重要的意义。
近红外光谱(Near-infrared Spectroscopy,NIR)属于分子振动光谱,是基频分子振动的倍频和组合频。主要含氢基团X-H键(X为C、O、N、S等)的特征信息。美国试验和材料协会(ASTM)规定近红外波长范围为700nm至 2500nm。近红外光谱技术具有对不同物质组分的敏感性良好、非侵入检测、快速准确、低成本等优点,近年来除了医药、食品、石化等行业,也越来越多地用于发酵过程参数的检测。近红外光谱技术主要包含近红外设备、化学计量软件和近红外模型三者的有机结合。近红外光谱技术是依据样品中化学成分产生的光谱吸收峰位置和强度而进行的定量分析,其中关键技术在于将光谱信息与样品组分两者之间建立一种定量的函数关系。而近红外光谱技术具有实时在线检测发酵过程参数,为发酵过程优化提供数据基础。
近红外在发酵检测中的应用较早,对近红外在生物过程中的检测应用,按照采样方式分为三种:离线(off-line)、近线(at-line)和在线(on-line),其中在线还根据近红外探头是否与发酵液直接接触分为ex-sit(非原位)和in-situ (原位)。近年来近红外光谱在线分析并结合化学计量学建模的方法逐渐成为热点。相比之下,在线检测能够实现对发酵过程的实时监测,并且非原位检测对于近红外设备探头要求较低,不需要经过高温高压灭菌,对于发酵液对其影响较小。运用近红外光谱技术实时监测透明质酸发酵过程参数,利用偏最小二乘回归法建立定量分析模型,可以运用到其他重组菌株发酵生产透明质酸中。通过分析近红外在细胞生长和发酵过程中的应用,发现生物反应器中结构差异 (搅拌桨、挡板等)会引起发酵液中气泡大小及分布不均;而菌株的形态、底物和产物都会影响发酵液的流变特性(粘度、颜色等),进而影响光谱吸收。
实时在线检测技术在发酵过程中具有重要的作用,发酵过程具有复杂性、不确定性等特点,对发酵调控作用有限,而发酵调控需要对发酵过程实时掌控。实时参数检测能够使发酵调控更加精确。而目前的传感器检测参数较为单一 (pH,DO等),无法实现多参数同时检测,需要开发一种能够实现在线多参数实时检测的平台,为发酵调控提供数据支持。
发明内容
本发明的目的是实现实时在线检测发酵过程参数,简化数据检测过程,有利于加强发酵过程的调控,验证近红外光谱技术在复杂的发酵环境中能够得到使用,其具有良好的稳定性和适用性。
目前对于近红外光谱技术并结合化学计量学的方法在发酵过程中的应用较少也较为单一,而本研究旨在以三种具有不同发酵特性的菌株为研究对象,对近红外光谱技术在不同发酵环境中的适用性进行研究。其中以拟干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei)发酵生产乳酸最为容易,其发酵过程以批发酵为主;其次为Starmerella bombicola发酵生产槐糖脂,由于油脂和葡萄糖作为底物添加,生产的槐糖脂为一种多种不同结构混合的表面活性剂槐糖脂,因此其中具有油,水,固体颗粒等多相的混合,对检测和发酵优化调控都带来很大难度;最后是黑曲霉(Aspergillus niger)生产葡萄糖酸钠发酵过程,由于丝状真菌的发酵会有贴壁、结团、菌丝断裂、高浓度葡萄糖发酵等特点,对发酵液的流变特性,产物和底物的检测有很大影响。
在本研究中针对拟干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)发酵生产乳,Starmerella bombicola发酵生产槐糖脂以及黑曲霉(Aspergillus niger)生产葡萄糖酸钠发酵过程,基于近红外光谱对葡萄糖浓度、产物浓度、底物浓度进行原位在线监测的实验平台,基于偏最小二乘回归法、内部交叉验证法等对发酵过程中采集的光谱数据建立定量分析模型。通过实验测试,验证说明近红外光谱技术能够在不同类型微生物菌株、不同发酵液流变特性、多种发酵液成分实现实时在线并行检测。对于生物过程具有普遍通用性。
本发明提供的一种基于近红外实时检测发酵过程参数的方法,技术方案如下:
在线采集菌种的发酵液,利用非接触式近红外光谱平台获得发酵液图谱,分析发酵液中各个组分的含量。
优选地,非接触式近红外光谱平台包括:
非接触式近红外光谱分析仪,用于扫描发酵液得到近红外光谱;
计算机,所述计算机与所述非接触式近红外光谱分析仪通讯连接,用于存储和显示所述近红外光谱的信号结果;
生物反应器,通过将发酵液置于所述生物反应器中使所述非接触式近红外光谱分析仪通过近红外照射获取发酵液的光谱数据并实时检测发酵液的发酵参数;
发酵控制计算机,所述发酵控制计算机与所述生物反应器通讯连接,用于接收并控制所述生物反应器的发酵参数。
优选地,所述非接触式近红外光谱分析仪包括:
近红外光照射发射接收处,所述近红外光照射发射接收处位于所述生物反应器内发酵液的液面以下且所述近红外光照射发射接收处距离所述生物反应器的距离为150-350mm。
优选地,所述生物反应器为一底部加热的石英玻璃发酵罐。
本技术方案中,采用石英玻璃作为发酵罐的材料,避免了采用有机玻璃的低透光率影响近红外线的问题,石英玻璃在近红外波长范围内具有良好的透过率,不会影响近红外光的波长,从而提高了检测的精准度。
另外,传统发酵罐一般通过夹套控温,夹套中的水会影响光谱吸收,而本发明技术方案中采用了底座控温,不影响光谱的吸收,进一步提高了检测的准确性。
优选地,通过将离线采集发酵液得到的图谱及浓度数据导入到所述计算机中生成近红外光谱标定模型,利用所述非接触式近红外光谱分析仪扫描发酵液得到近红外光谱数据,将所述近红外光谱数据通过所述近红外光谱标定模型分析发酵液中各个组分的含量。
进一步,优选地,近红外光谱标定模型如下建立:
S1、离线检测已知浓度发酵液的组分得到所述已知浓度发酵液的组分的离线光谱数据;
S2、对所述离线光谱数据进行预处理消除基线和噪音;
S3、将预处理后的离线光谱数据分为训练样本和验证样本;
S4、采用偏最小二乘回归法对所述训练样本与其对应的已知浓度进行训练得到初步近红外光谱标定模型;
S5、将所述验证样本输入所述初步近红外光谱标定模型得到与其所对应的组分的含量预测值;
S6、求所有所述验证样本的含量预测值与与该验证样本对应的已知浓度的均方根误差和相关系数;
S7、判断均方根误差和相关系数是否满足条件:当均方根误差小于第一设定值,且相关系数大于第二设定值时,近红外光谱标定模型训练完成,反之,增加浓度已知的发酵液的样本量,返回所述步骤S1。
优选地,所述预处理的处理方式包括:
一阶导数、五点平滑、标准正态变量、去趋势算法。
本技术方案中,以均方根误差(RMSECV值)作为模型准确性,RMSECV 值越小,则该模型的准确性越高;
RMSEP值则作为检验模型的参考指标用于完善所建立的预测模型,其值表示真实值与预测值之间的相近程度,数值越小则证明其预测能力越高;
相关系数(RPD)同样是模型准确性和可靠性的参考指标,RPD值越大说明模型越好,所建模型的预测值与样品的实际值之间的关系用R2表示,其值越接近1,说明所建模型的拟合度越好。
本发明提供的一种基于近红外实时检测发酵过程参数的方法,能够带来以下有益效果:
1)本发明基于近红外光谱技术原位实时检测发酵过程参数,分别建立酵母、霉菌(黑曲霉)和细菌(拟干酪乳杆菌)三种不同微生物系统发酵过程参数的近红外光谱检测模型。通过验证发现,近红外光谱模型能够实现对发酵过程参数实现实时、快速在线检测,具有很好的预测精度与可靠性。近一步说明,近红外光谱在不同类型物质(底物、产物、营养成分),不同发酵体系(均匀体系和多相非均匀体系)中具有良好的稳定性和可行性,以便于在后续发酵优化过程中实现在线实时控制。
2)本发明通过非接触式的近红外光谱分析仪对发酵液参数进行实时检测,避免了仪器设备使用前的高温高压灭菌处理,与传统方法相比,使用近红外光谱检测技术具有检测快速、便捷、无损等优点。
附图说明
下面将以明确易懂的方式,结合附图说明优选实施方式,对本发明的技术特征、优点及其实现方式予以进一步说明。
图1是基于近红外光谱分析仪发酵过程参数检测实验平台;
图2是乳酸发酵过程实时测定发酵液近红外光谱吸收度;
图3是槐糖脂发酵过程实时检测发酵液近红外光谱吸收度;
图4是葡萄糖酸钠发酵过程实时检测发酵液近红外光谱吸收度;
图5(a)是乳酸发酵光谱模型中葡萄糖的近红外光谱检测结果;
图5(b)是乳酸发酵光谱模型中乳酸的近红外光谱检测结果;
图6(a)是槐糖脂发酵光谱模型中葡萄糖的近红外光谱检测结果;
图6(b)是槐糖脂发酵光谱模型中槐糖脂的近红外光谱检测结果;
图6(c)是槐糖脂发酵光谱模型中残油的近红外光谱检测结果;
图7(a)是葡萄糖酸钠发酵光谱模型中葡萄糖的近红外光谱检测结果;
图7(b)是葡萄糖酸钠发酵光谱模型中葡萄糖酸钠的近红外光谱检测结果;
图7(c)是葡萄糖酸钠发酵光谱模型中NH4 +的近红外光谱检测结果;
图7(d)是葡萄糖酸钠发酵光谱模型中P的近红外光谱检测结果;
图8(a)是乳酸发酵光谱模型中内部交叉法葡萄糖的近红外光谱检测结果;
图8(b)是乳酸发酵光谱模型中内部交叉法乳酸的近红外光谱检测结果;
图9(a)是槐糖脂发酵光谱模型中内部交叉法葡萄糖的近红外光谱检测结果;
图9(b)是槐糖脂发酵光谱模型中内部交叉法槐糖脂的近红外光谱检测结果;
图9(c)是槐糖脂发酵光谱模型中内部交叉法残油的近红外光谱检测结果;
图10(a)是葡萄糖酸钠发酵光谱模型中内部交叉法葡萄糖的近红外光谱检测结果;
图10(b)是葡萄糖酸钠发酵光谱模型中内部交叉法葡萄糖酸钠的近红外光谱检测结果;
图10(c)是葡萄糖酸钠发酵光谱模型中内部交叉法NH4 +的近红外光谱检测结果;
图10(d)是葡萄糖酸钠发酵光谱模型中内部交叉法P的近红外光谱检测结果;
图11(a)是乳酸发酵过程参数在线检测与离线结果对比;
图11(b)是槐糖脂发酵过程参数在线检测与离线结果对比;
图11(c)是葡萄糖酸钠发酵过程参数在线检测与离线结果对比;
附图标号说明:1、计算机;2、非接触式近红外光谱分析仪;21、近红外光照射发射接收处;3、生物反应器;4、发酵控制计算机。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对照附图说明本发明的具体实施方式。显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图,并获得其他的实施方式。
【实施例1】
在线采集菌种的发酵液,利用非接触式近红外光谱平台获得发酵液图谱,分析发酵液中各个组分的含量。
本实施例中,发酵过程具有复杂性、不确定性等特点,而发酵调控需要对发酵过程实时掌控。实时参数检测能够使发酵调控更加精确。而目前的传感器检测参数较为单一(pH,DO等),无法实现多参数同时检测。本文基于近红外光谱技术原位实时检测发酵过程参数,分别建立酵母、霉菌(黑曲霉)和细菌(拟干酪乳杆菌)三种不同微生物系统发酵过程参数的近红外光谱检测模型。通过验证发现,近红外光谱模型能够实现对发酵过程参数实现实时、快速在线检测,具有很好的预测精度与可靠性。近一步说明,近红外光谱在不同类型物质(底物、产物、营养成分),不同发酵体系(均匀体系和多相非均匀体系) 中具有良好的稳定性和可行性,以便于在后续发酵优化过程中实现在线实时控制。
【实施例2】
本具体实施例提供了实施例1中的非接触式近红外光谱平台,包括:
非接触式近红外光谱分析仪2,用于扫描发酵液得到近红外光谱;
计算机1,计算机1与非接触式近红外光谱分析仪2通讯连接,用于存储和显示近红外光谱的信号结果;
生物反应器3,通过将发酵液置于生物反应器3中使非接触式近红外光谱分析仪2通过近红外照射获取发酵液的光谱数据并实时检测发酵液的发酵参数;
发酵控制计算机4,发酵控制计算机4与生物反应器3通讯连接,用于接收并控制生物反应器3的发酵参数。
具体的,非接触式近红外光谱分析仪2包括:
近红外光照射发射接收处21,近红外光照射发射接收处21位于生物反应器3内发酵液的液面以下且近红外光照射发射接收处21距离生物反应器3的距离为150-350mm。
具体的,生物反应器3为一底部加热的石英玻璃发酵罐。
本实施例中,采用石英玻璃作为发酵罐的材料,避免了采用有机玻璃的低透光率影响近红外线的问题,石英玻璃在近红外波长范围内具有良好的透过率,不会影响近红外光的波长,从而提高了检测的精准度。
另外,传统发酵罐一般通过夹套控温,夹套中的水会影响光谱吸收,而本实施例中采用了底座控温,不影响光谱的吸收,进一步提高了检测的准确性。
具体的,通过将离线采集发酵液得到的图谱及浓度数据导入到计算机1中生成近红外光谱标定模型,利用非接触式近红外光谱分析仪2扫描发酵液得到近红外光谱数据,将近红外光谱数据通过近红外光谱标定模型分析发酵液中各个组分的含量。
本实施例中,本实验采用瑞典波通(Perten)公司制造的DA7440在线近红外分析仪如图9(a)、图9(b)、图9(c),属于非接触式漫反射检测器,并由瑞典波通公司的Unscrambler10.3定量分析软件进行光谱预处理、谱区选择 (删除1350-1410nm波长段水蒸气的干扰)和剔除异常样品。近红外分析仪工作温度为0℃-40℃,工作波长范围是900-1700nm,波长准确性<0.3nm,波长稳定性小于0.2nm/年,光谱采集速度约为30次全光谱和测量/秒,检测器为电致冷256二极管阵列铟镓砷检测器。
如图1所示,基于近红外光谱技术的发酵过程在线监测实验平台,近红外分析仪主要由支架固定,设备到样品表面的安装距离在250土100mm,接受的所有光谱信号结果在相连的计算机1上储存和显示。使用底座加热的石英玻璃发酵罐,实时检测pH、溶氧等在线数据,并在传送到Biostar软件。
【实施例3】
本具体实施例公开了实施例2中近红外光谱建模的方法:
近红外光谱标定模型如下建立:
S1、离线检测已知浓度发酵液的组分得到已知浓度发酵液的组分的离线光谱数据;
S2、对离线光谱数据进行预处理消除基线和噪音;
S3、将预处理后的离线光谱数据分为训练样本和验证样本;
S4、采用偏最小二乘回归法对训练样本与其对应的已知浓度进行训练得到初步近红外光谱标定模型;
S5、将验证样本输入初步近红外光谱标定模型得到与其所对应的组分的含量预测值;
S6、求所有验证样本的含量预测值与与该验证样本对应的已知浓度的均方根误差和相关系数;
S7、判断均方根误差和相关系数是否满足条件:当均方根误差小于第一设定值,且相关系数大于第二设定值时,近红外光谱标定模型训练完成,反之,增加浓度已知的发酵液的样本量,返回步骤S1。
优选地,预处理的处理方式包括:
一阶导数、五点平滑、标准正态变量、去趋势算法。
本技术方案中,为了消除发酵过程中环境条件变化对光谱测量带来的干扰,本发明采用一阶导数、五点平滑、标准正态变量(SNV)、去趋势算法 (De-trending)等方法对光谱数据进行预处理,消除基线和噪音等其他光谱变异来源,从而可以提高检测精度和可靠性。
偏最小二乘回归法(PLSR)是一种新型的多元统计数据分析法,该算法建立的模型是多个或单个因变量Y对多自变量X的回归模型,在建模的过程中,既包含主成分分析的尽量提取Y和X中的主成分的思想,又考虑使分别从X和 Y提取出的主成分之间的相关性最大化这种典型关联分析的思想。因此,偏最小二乘回归是PCA法、CCA法和多元线性回归分析法这三种分析方法组合而成的算法。其数学模型为:
X=TP+E
Y=UQ+F
其中矩阵X和Y为自变量矩阵和因变量矩阵,矩阵T和U为X和Y的得分矩阵;矩阵P和Q为X和Y的载荷矩阵;E和F为误差。PLSR对光谱矩阵和浓度矩阵同时进行分解,并考虑分解时二者之间的关系,加强对应机损,从而保证获得最佳校正模型。
交叉验证法是一种常用的统计学方法,常将数据样本切割成较小子集的实用方法,在给定的建模样本中,拿出大部分样本进行建模,留小部分样本用建立的模型进行评估。在本研究中以内部交叉验证法确定数学模型所用的最佳因子数,将样品分割成K个子样本,一个单独的子样本被保留作为验证模型的数据,其他K-1个样本用来训练。交叉验证重复K次,每个子样本验证一次,平均K次的结果或者使用其它结合方式,最终得到一个单一估测。
【实施例4】
本具体实施例公开了拟干酪乳杆菌发酵液的培养过程:
(1)菌株
本发明使用的菌株为拟干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei NCBIO01),由华东理工大学国家生化工程技术研究中心保藏。
(2)培养基
发酵培养基:葡萄糖250g/L,酵母粉13.33g/L,蛋白胨13.33g/L,牛肉膏 13.33g/L,无水乙酸钠0.67g/L,NaCl 0.0133g/L,FeSO4 0.0133g/L,MnSO4 0.0133g/L,MgSO4·7H2O0.0133g/L。
(3)培养条件
在5L的发酵罐中培养,初始体积为4L,接种量为20%。发酵温度为37℃,通气量为0.25vvm,初始转速为150rpm。培养过程中通过25%氨水调节使pH 维持在6.0。
(4)离线测试方法
葡萄糖和乳酸浓度采用生物传感分析仪(SBA-40C,山东省科学院,中国) 检测。
利用实施例2中的实验平台采集七批乳酸发酵过程中乳酸、葡萄糖的浓度数据用于建立近红外光谱标定模型。如表1所示,在乳酸发酵中每个取样时间点(取样间隔为6h)采集数据和三组样品作为离线参考数据。由图2可以看出,在波长为950nm-1040nm、1130nm-1250nm、1410nm-1500nm范围内的近红外光谱相比其他波长有明显变化。
成分 | 样品数量 | 定标范围 |
葡萄糖(Glu) | 38 | 2-256 |
乳酸 | 38 | 6.3-156 |
表1乳酸发酵过程数据
【实施例5】
本具体实施例公开了槐糖脂发酵液的培养过程:
(1)菌株
槐糖脂(S.bombicola ATCC 22214)是从广州市菌种保藏中心购买,20%的甘油管保藏在-80℃。
(2)培养基
发酵培养基:葡萄糖100g/L,KH2PO4 1g/L,(NH4)2SO4 4g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,玉米浆10g/L。
(3)培养条件
槐糖脂在5L的发酵罐中,初始体积为2.5L,接种量为2.9%(OD600为 80)。发酵温度为25℃,通气量为0.5vvm,初始转速为200rpm。培养过程中通过4M NaOH调节使pH维持在3.5。溶氧(DO)通过调节转速在0-36h维持在40%以上,36h后维持在25%左右。菜籽油通过补料泵添加到培养基中,葡萄糖则通过每24h添加一次固体葡萄糖,使浓度维持在30g/L-80g/L。
(4)离线测试方法
葡萄糖浓度采用生物传感分析仪(SBA-40C,山东省科学院,中国)检测。
发酵液中的残油的含量传统上使用称重法检测。首先,取三个平行样品(2mL)添加相同体积的正己烷,振荡离心,萃取两遍,取上清80℃烘箱烘干。
发酵液中的槐糖脂采用高效液相色谱(HPLC),在2mL发酵液中加入2 mLKOH/MeOH溶液,混合均匀后80℃水浴加热15min。然后冷却至室温,用甲醇定容到10mL,用NaH2PO4缓冲液(0.2M)中和。最后用流动相稀释到合适倍数。HPLC的条件,流动相(75%甲醇,0.02mol/L甲酸铵,0.1%甲酸), C18柱(4.6mm*250mm,Acchrom),示差折光检测器(RID),流速为0.9mL/min,进样量为20μL,柱温为50℃,检测温度为35℃。
利用实施例2中的实验平台采集六批槐糖脂发酵过程中槐糖脂、葡萄糖、残油的浓度数据用于建立近红外光谱标定模型。如表2所示,在槐糖脂发酵中每个取样时间点(取样间隔为12h)采集三次光谱数据和三组样品作为离线参考数据。由图3可以看出,在波长为950nm-1040nm、1130nm-1250nm、1410n m-1560nm范围内的近红外光谱相比其他波长有明显变化。
成分 | 样品数量 | 定标范围 |
葡萄糖(Glu) | 34 | 8.34-110.96 |
槐糖脂(Sls) | 34 | 3.59-151.97 |
残油(Oil) | 34 | 0.57-29.05 |
表2槐糖脂发酵过程数据
【实施例6】
本具体实施例公开了黑曲霉发酵液的培养过程:
(1)菌株
黑曲霉(Aspergillus niger),由山东福洋生物科技有限公司提供。
(2)培养基
发酵培养基:葡萄糖250g/L,(NH4)2SO4 2.355g/L,KH2PO4 0.5g/L,(NH4)2HPO41.8g/L。
(3)培养条件
葡萄糖酸钠发酵在5L发酵罐中,初始体积为3L,接种量为10%,发酵温度为38℃,通气量为2vvm,转速为700rpm,培养过程用7.5M NaOH调节使 pH维持在5.3。
(4)离线测试方法
葡萄糖浓度采用生物传感分析仪(SBA-40C,山东省科学院,中国)检测。
葡萄糖酸钠含量通过高效液相色(HPLC)测定。具体检测条件为:色谱分离柱为C18柱(4.6mm*250mm,Sepax Technologies);流动相为V(甲醇): V(磷酸)=1:1(10%甲醇,2.4%磷酸),进样量为20μL,流速设置为1mL/min,紫外检测波长为210nm,柱温控制在26℃。
P离线检测:在1mL发酵液中加入800μL的钼酸铵溶液,混匀后定容到5 mL,再加入400μL抗坏血酸溶液,100℃下水浴10-15min,冷却后定容至10mL,在825nm下测定吸光度。
NH4 +离线检测:在1mL发酵液中加入1mL酚溶液,混匀,定容到5mL,再加入1mLNaClO溶液,35℃水浴15min,冷却后,在625nm下测定吸光度。
(5)利用实施例2中的试验平台采集四批葡萄糖酸钠发酵过程中葡萄糖、葡萄糖酸钠、铵离子和无机磷的浓度数据用于建立近红外光谱标定模型。如表 3所示,在槐糖脂发酵中每个取样时间点(取样间隔为3h)采集三次光谱数据和三组样品作为离线参考数据。由图4可以看出,在波长为950nm-1060nm、1130nm-1250nm、1410nm-1480nm范围内的近红外光谱相比其他波长有明显变化。
表3葡萄糖酸钠发酵过程数据
【实施例7】
为了评估实施例3中近红外光谱对发酵过程参数的预测功能的优劣,本实施例中采用预测集均方根误差RMSEP,相关系数R2,其计算公式分别为:
其中yi为验证集的第i个样本参考值,为验证集的第i个样本预测值,ym 是待预测样本均值。其中RMSEP用于评价预测值和参考值得偏差。R2表示预测值和参考值之间的相关性,SEP越小,R2越大说明近红外模型准确性越高。
如表4所示,用PLSR算法和内部交叉验证法建立的光谱标定模型,然后用已知的验证集数据对模型进行验证。如图5(a)和图5(b)所示,乳酸的发酵过程相对简单,近红外光谱模型预测葡萄糖和乳酸具有良好的效果,R2分别为0.99和0.96。利用内部交叉验证法后,其验证集与预测集没有明显的差异。
如图6(b)和图6(c)所示,在槐糖脂发酵过程中,利用近红外光谱模型预测其葡萄糖、槐糖脂合残油的含量,其中槐糖脂与残油具有较好的预测效果,R2分别为0.98和0.97,但是如图6(a)所示,葡萄糖的预测效果较差, R2为0.90。主要原因可能是在发酵过程中通过直接补加固体葡萄糖来维持发酵液的糖浓度,对近红外检测有影响,另外高浓度葡萄糖在发酵过程中集中在菌体生长期(前48h)较少,而低浓度葡萄糖较多。
如图7(a)所示,葡萄糖酸钠发酵过程中,葡萄糖的预测效果较好,R2为0.92,而如图7(c)和图7(d)所示NH4 +和P的R2分别为0.84和0.91。主要原因为发酵液中NH4 +和P的浓度较低,离线检测的数据误差相对较大。而如图7(b)所示,葡萄糖酸钠的近红外光谱预测效果较差,其R2仅为0.66。主要原因是葡萄糖酸钠的浓度变化较大,范围较宽以及离线检测的误差较大,导致葡萄糖酸钠的近红外光谱检测效果较差。
图中横坐标为离线检测的参考值,纵坐标为基于近红外光谱数据的预测值。
表4光谱预测模型性能指标
【实施例8】
本实施例用于对槐糖脂发酵、乳酸发酵和葡萄糖酸钠发酵实验对上述模型进行验证。如图11(a),图11(b),图11(c)所示,其中线条数据为基于近红外光谱模型,实时预测结果,散点数据为采样离线检测参考值。
可以看出,近红外光谱模型实时检测结果与离线检测的参考值比较接近,其R2均在0.98以上,除了葡萄糖酸钠的R2为0.90,不过从图8(c)中可知葡萄糖酸钠较低时,近红外光谱模型预测值与实际值相差较大;高浓度时,相差较小。另一方面,相比于模型建立过程中的RMSEP,如图8(a),图8(b),图8(c)中所对应的RMSEP值都相对偏小。由此进一步说明近红外光谱模型对发酵过程参数检测具有很好的预测准确性。
应当说明的是,上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种基于近红外实时检测发酵过程参数的方法,其特征在于:
在线采集菌种的发酵液,利用非接触式近红外光谱平台获得发酵液图谱,分析发酵液中各个组分的含量。
2.如权利要求1所述的一种基于近红外实时检测发酵过程参数的方法,其特征在于,所述非接触式近红外光谱平台包括:
非接触式近红外光谱分析仪,用于扫描发酵液得到近红外光谱;
计算机,所述计算机与所述非接触式近红外光谱分析仪通讯连接,用于存储和显示所述近红外光谱的信号结果;
生物反应器,通过将发酵液置于所述生物反应器中使所述非接触式近红外光谱分析仪通过近红外照射获取发酵液的光谱数据并实时检测发酵液的发酵参数;
发酵控制计算机,所述发酵控制计算机与所述生物反应器通讯连接,用于接收并控制所述生物反应器的发酵参数。
3.如权利要求2所述的一种基于近红外实时检测发酵过程参数的方法,其特征在于,所述非接触式近红外光谱分析仪包括:
近红外光照射发射接收处,所述近红外光照射发射接收处位于所述生物反应器内发酵液的液面以下且所述近红外光照射发射接收处距离所述生物反应器的距离为150-350mm。
4.如权利要求2所述的一种基于近红外实时检测发酵过程参数的方法,其特征在于:
所述生物反应器为一底部加热的石英玻璃发酵罐。
5.如权利要求2所述的一种基于近红外实时检测发酵过程参数的方法,其特征在于:
通过将离线采集发酵液得到的图谱及浓度数据导入到所述计算机中生成近红外光谱标定模型,利用所述非接触式近红外光谱分析仪扫描发酵液得到近红外光谱数据,将所述近红外光谱数据通过所述近红外光谱标定模型分析发酵液中各个组分的含量。
6.如权利要求5所述的一种基于近红外实时检测发酵过程参数的方法,其特征在于,所述的近红外光谱标定模型如下建立:
S1、离线检测已知浓度发酵液的组分得到所述已知浓度发酵液的组分的离线光谱数据;
S2、对所述离线光谱数据进行预处理消除基线和噪音;
S3、将预处理后的离线光谱数据分为训练样本和验证样本;
S4、采用偏最小二乘回归法对所述训练样本与其对应的已知浓度进行训练得到初步近红外光谱标定模型;
S5、将所述验证样本输入所述初步近红外光谱标定模型得到与其所对应的组分的含量预测值;
S6、求所有所述验证样本的含量预测值与与该验证样本对应的已知浓度的均方根误差和相关系数;
S7、判断均方根误差和相关系数是否满足条件:当均方根误差小于第一设定值,且相关系数大于第二设定值时,近红外光谱标定模型训练完成,反之,增加浓度已知的发酵液的样本量,返回所述步骤S1。
7.如权利要求6所述的一种基于近红外实时检测发酵过程参数的方法,其特征在于,所述预处理的处理方式包括:
一阶导数、五点平滑、标准正态变量、去趋势算法。
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