CN103196841A - 一种利用近红外光谱在线分析丁二酸发酵液的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用近红外光谱在线分析丁二酸发酵液的方法，包括如下步骤：在线收集微生物不同培养时间的近红外图谱；同时取样后采用常规方法测定细胞干重、葡萄糖和丁二酸；对近红外光谱图进行预处理，并采用化学计量学方法分别建立细胞干重、葡萄糖和丁二酸模型；将待测样品的谱图代入模型中得到待测样品的发酵液成分信息。本方法快速，准确性高，重复性好，操作简便。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程领域，特别涉及一种利用近红外光谱在线分析丁二酸发酵液的方法。
背景技术
丁二酸是生物炼制产品工程中重要的C4平台化合物，不仅在食品、医药、化工、材料等领域有着广泛的用途，还可用于合成1,4-丁二醇，四氢呋喃，γ-丁内酯，N-甲基吡咯烷酮等大宗化学品以及PBS类生物可降解聚酯。微生物发酵法制备丁二酸以可再生生物质资源为原料，并可实现温室气体CO2的固定，整个生产工艺过程具有绿色、能耗低、原子经济性高、废弃物少等优点，社会效益、环境效益显著。目前，在丁二酸发酵过程中，发酵液中细胞量采用离线取样后经过离心、烘干等步骤测定细胞干重，操作费时；发酵液中的葡萄糖、乙酸、丁二酸等通过离线取样后经过稀释、离心后去上清夜通过液相色谱仪测定，操作繁琐、费时。而在丁二酸发酵过程中，通常需要补糖，好氧-厌氧两阶段培养等操作，需要及时了解发酵液中的实时信息，然而目前采用的方法不利于发酵过程控制。近红外光谱（NIR）检测技术，具有分析速度快、效率高、成本低、对样品无损检测、可以多组分同时测定等优点，在食品、农业、石油化工等领域得到了广泛应用。但目前未见用于在线测定丁二酸发酵液的技术方案，有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、快捷又可靠的丁二酸发酵液检测方法，利用近红外光谱技术测定在线测定丁二酸发酵液中细胞量、底物、产物等含量，有利于对发酵过程进行控制，从而实现在线快速测定丁二酸发酵液成分的目的。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用近红外光谱在线分析丁二酸发酵液的方法，包括如下步骤：
（1）微生物培养发酵丁二酸；
（2）在线收集微生物不同培养时间的近红外图谱；收集近红外图谱的同时取样，测定细胞干重、各中间产物和/或终产物的含量；
（3）对近红外光谱图进行预处理，并采用化学计量学方法分别建立细胞干重、葡萄糖和丁二酸模型，并结合起来形成总标准模型；
（4）将待测样品的近红外谱图代入总标准模型中得到待测样品的发酵液成分信息。
其中，所述近红外图谱采用12,000–4,000的波长范围扫描。
其中，所述步骤2中，近红外图谱的收集和取样次数不低于30次，优选30-60次，更优选在在不同培养阶段均匀采集。
其中，所述步骤2中，中间产物和/或终产物包括却不限于葡萄糖、丙酮酸、丁二酸、甲酸、乙酸、木糖、阿拉伯糖。
其中，所述步骤3的预处理为对近红外光谱数据进行包括却不限于一阶微分和/或小波去噪。
其中，所述步骤3中所述的化学计量学方法包括但不限于偏最小二乘、人工神经网络和支持向量回归。
本发明所述化学计量学方法为本领域技术人员所理解和掌握，本发明优选采用现有的多变量化学计量学分析软件The UnscramblerV9.8来实现。
此外，本发明所述的方法中，对步骤1中微生物的培养过程不作特别限定，本领域技术人员知道，本发明是针对发酵培养过程中对发酵液进行分析的技术方案，因此，理论上任意培养过程都可以通过本发明来实现检测发酵液成分从而控制发酵过程的目的。进一步地，本发明优选适用于丁二酸的发酵过程。
采用上述技术方案，本发明可以在线分析丁二酸发酵液中的成分含量，本方法快速，准确性高，重复性好，操作简便。
具体实施方式
以下所述实施例对本发明作了详细说明，但对本发明没有限制。
实施例1
（1）微生物培养
菌种：E.coli BA103（CCTCC2012032)。
斜面培养基：LB培养基加氨苄青霉素、氯霉素、卡拉霉素各50μg/mL。
种子培养基：LB培养基加氨苄青霉素、氯霉素、卡拉霉素各50μg/mL。
发酵培养基：葡萄糖100g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，MnCl20.05g/L，FeCl20.05g/L，CaCl20.05g/L，K2HPO42.0g/L，MgCO380g/L，pH7.0。灭菌后加加氨苄青霉素、氯霉素、卡拉霉素各50μg/mL。
7.5L发酵罐培养时培养基装液量为4.5L。将菌株在种子斜面培养基中进行平板划线后，在培养箱中培养，37℃培养36h后的菌株用接种环接一环到含有50mL种子液体培养基的500mL摇瓶中，转速300rpm，37℃培养12h后用于上述发酵培养基接种（7.5L发酵罐），接种量为5%（v/v），搅拌转速在300rpm，37℃发酵培养，通气量为0.5vvm，当OD（660nm）至0.6时加入0.5mM的IPTG诱导，当OD（660nm）达到20时，转至厌氧培养。厌氧培养搅拌转速在300rpm，37℃发酵培养，CO2通气量为0.25vvm。
（2）测定细胞量、丁二酸、丙酮酸和葡萄糖的含量。
细胞量测定：细胞量通过菌体细胞干重测定。干燥的5mL离心管称重（G1），取4mL发酵液置于离心管中，10000r/min离心5min，弃上清液；再用4mL生理盐水清洗一次重复离心步骤；将沉淀物连同离心管置于烘箱中，50℃干燥至恒重，称重（G2）。菌体干重（g/L）＝（G2－G1）/4。
丁二酸、丙酮酸含量的测定：将发酵液经冷冻离心机以8000转/分钟的速率离心15分钟后，上清液稀释20倍，经0.22μm微孔滤膜过滤后，进样20μL，在相同色谱条件下，将样品色谱图与丁二酸、甲酸、乙酸标准液色谱图进行对照，根据保留时间确定样品中各有机酸的峰。丁二酸、甲酸、乙酸的定量在色谱条件相同的情况下，对照有机酸标准曲线确定。色谱条件如下：色谱柱：Alltech Prevail OrganicAcid（250mm*4.6mm,5μm）；紫外检测波长215nm；流速1mL/min，进量20μL，流动相25mmol/LKH2PO4(pH2.5)；柱温：室温。）
葡萄糖的测定：样品稀释25倍后采用葡萄糖分析仪（SBA-40C，山东省科学院生物研究所）测定葡萄糖浓度。
（3）近红外光谱数据采集
在步骤2采样的同时，使用近红外光谱仪（中国聚光科技生产，SupNIR-4000在线近红外分析仪）在线采集不同时间段的近红外光谱。
（4）建立数学模型
使用多变量化学计量学分析软件（The Unscrambler V9.8）处理图谱和采用步骤（2）测定的数据。使用片最小二乘法建立光谱与细胞量、丁二酸、丙酮酸、葡萄糖的模型关系。选择模型相关系数R最高和模型标准偏差RMSECV最小的模型。本方法建立的模型测定的细胞量、丁二酸、丙酮酸及葡萄糖标准平均偏差小于0.18g/L。此处数学模型的建立为现有技术，本发明对此不作特别限定。
（5）将在线采集的待测样品图谱带入步骤4所建立的总标准模型，利用软件自动对图谱进行分析，求出细胞量、丁二酸、丙酮酸、葡萄糖的含量。
实施例2
（1）微生物培养
菌种：产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113（CGMCCNo.1716）
斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl1g/L，NaHCO310g/L，Na2HPO415g/L，KH2PO44g/L，琼脂20g/L。
种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl1g/L，NaHCO310g/L，Na2HPO415g/L，KH2PO44g/L，通入CO2气体2min，121℃灭菌15min，冷却。
发酵培养基：玉米皮水解液100g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，MnCl20.05g/L，FeCl20.05g/L，CaCl20.05g/L，K2HPO42.0g/L，MgCO380g/L，pH7.0。
7.5L发酵罐培养时培养基装液量为4.5L。将菌株在种子斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，控制培养箱中混合气比例为N2:CO2:H2=8:1:1，37℃培养36h后的菌株用接种环接一环到含有50mL种子液体培养基的100mL血清瓶中，转速300rpm，37℃培养12h后用于上述发酵培养基接种（7.5L发酵罐），接种量为5%（v/v），搅拌转速在300rpm，37℃发酵培养，CO2通气量为0.25vvm。
（2）细胞量、有机酸、糖分的常规测定方法
细胞量测定：同实施例1
有机酸、糖分含量的测定：将发酵液经冷冻离心机以8000转/分钟的速率离心15分钟后，上清液稀释20倍，经0.22μm微孔滤膜过滤后，进样20μL，在相同色谱条件下，将样品色谱图与有机酸（丁二酸、甲酸与乙酸）与糖分（葡萄糖、木糖与阿拉伯糖）标准液色谱图进行对照，根据保留时间确定样品中各有机酸的峰。有机酸与糖分的定量在色谱条件相同的情况下，对照有机酸和糖分标准曲线确定。测有机酸色谱条件如下：色谱柱：Alltech Prevail Organic Acid（250mm*4.6mm,5μm）；紫外检测波长215nm；流速1mL/min，进量20μL，流动相25mmol/LKH2PO4(pH2.5)；柱温：室温。糖分测定色谱条件：色谱柱：Aminex HPC-87H，Bio-Rad.,Richmond；检测器为折光示差仪；进样量：20μL，流动相：5mmol/LH2SO4；流速：0.6ml/min，温度：65℃。
（3）近红外光谱数据采集
在步骤2采样的同时，使用近红外光谱仪（中国聚光科技生产，SupNIR-4000在线近红外分析仪）在线采集不同时间段的近红外光谱。
（4）建立数学模型
使用多变量化学计量学分析软件（The Unscrambler V9.8）处理图谱和采用步骤（2）测定的数据。使用片最小二乘法建立光谱与细胞量、丁二酸、甲酸、乙酸、葡萄糖、木糖、阿里伯糖的模型关系。选择模型相关系数R最高和模型标准偏差RMSECV最小的模型。本方法建立的模型测定的细胞量、丁二酸、甲酸以及乙酸标准平均偏差小于0.21g/L。
（5）将在线采集的待测样品图谱带入步骤4所建立的总标准模型，利用软件自动对图谱进行分析，求出细胞量、丁二酸、甲酸、乙酸、葡萄糖、木糖、阿里伯糖的含量。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种利用近红外光谱在线分析丁二酸发酵液的方法，包括如下步骤：
（1）微生物培养发酵丁二酸；
（2）在线收集微生物不同培养时间的近红外图谱；收集近红外图谱的同时取样，测定细胞干重、各中间产物和/或终产物的含量；
（3）对近红外光谱图进行预处理，并采用化学计量学方法分别建立细胞干重、葡萄糖和丁二酸模型，并结合起来形成总标准模型；
（4）将待测样品的近红外谱图代入总标准模型中得到待测样品的发酵液成分信息。
2.根据权利1所述的的方法，其特征在于，所述近红外图谱采用12,000–4,000的波长范围扫描。
3.根据权利1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤2中，近红外图谱的收集和取样次数不低于30次。
4.根据权利1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤2中，中间产物和/或终产物包括却不限于葡萄糖、丙酮酸、丁二酸、甲酸、乙酸、木糖、阿拉伯糖。
5.根据权利1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3的预处理为对近红外光谱数据进行包括却不限于一阶微分和/或小波去噪。
6.根据权利1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3中所述的化学计量学方法包括但不限于偏最小二乘、人工神经网络和支持向量回归。
7.根据权利1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述化学计量学方法采用多变量化学计量学分析软件The Unscrambler V9.8 来实现。
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