CN109557014A - 一种快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法 - Google Patents

一种快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法，含以下步骤：(1)采集发酵乳作为定标集样品，采用平板计数法对定标集样品进行分析检测，得乳酸菌数实测值，并转换成对数值，建立基础数据库；同步对定标集样品进行近红外光谱扫描，录制其近红外光谱数据，建立近红外光谱数据库；将基础数据库与近红外光谱数据库进行对应，建立乳酸菌数定标模型；(2)对定标模型进行验证；(3)将待测发酵乳样品进行近红外光谱扫描，得其近红外光谱数据，将数据导入定标模型，经换算得待测发酵乳样品的乳酸菌数预测值。该方法操作简捷，快速、无损、高效、准确、成本低，不污染环境，可多组分同时检测，能满足发酵乳产品在线质量检验的高效性和及时性要求。

Description

一种快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法
技术领域
本发明属于食品质量与安全检测，具体涉及一种快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法,更涉及一种基于近红外光谱技术实现发酵乳中乳酸菌数快速检测的方法。
背景技术
乳酸菌是一类能在可利用的碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌，作为益生菌，被广泛地应用于发酵制品和生物制品领域，具有调节肠道菌群的平衡、抑制肠道致病菌的感染、防治肿瘤、降低血清胆固醇水平、促进消化、提高机体免疫功能等健康功效。乳酸菌要发挥其保健功能，必须满足三个条件：其一，乳酸菌必须是活的；其二，摄入足够的量，人体必须每日摄入1～100亿或以上活性乳酸菌才会产生积极的功效；其三，乳酸菌的功效和益处必须是经过临床验证的。发酵乳是以新鲜牛乳为原料，经巴氏杀菌后添加乳酸菌发酵而成，比普通牛乳更营养，蛋白质和钙更易消化吸收。发酵乳被认为是乳酸菌传递到人体内的最理想载体。
发酵乳中乳酸菌数量是产品发挥益生功效的重要条件，国标GB 19302-2010《食品安全国家标准发酵乳》中规定，乳酸菌数不得低于106CFU/g(mL)。另外，在产品的安全性和功能性试验中也常以乳酸菌数量为评价指标。因此，乳酸菌数检测对企业质量控制和日常监督至关重要。
目前发酵乳中乳酸菌数的常规检测方法为平板计数法，其相关标准GB 4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》在2017年6月23日实施，新国标对乳酸菌总数的检测进行了较大改动。培养基由单一的MRS培养基增加MRS、MC、莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS三种培养基组合，培养条件由单一的厌氧培养增加为厌氧和需氧组合，培养时间由48h增加为72h。
该方法存在以下缺点：
(1)操作繁琐：包含样品制备、均质、6～8次10倍系列稀释、培养、计数、计算等步骤，对检测人员技术要求高；
(2)效率低，耗时长：培养时间长达72h，容易造成监控数据滞后现象，无法满足企业在线检测要求；
(3)检测成本高：无菌耗材消耗大，仪器设备要求高，需配套洁净室、厌氧箱等设备。
同时，由于发酵乳保质期短，只有21-28d，因此研发更加快速、准确的检测技术，对于产品的质量控制和在线监控具有重要意义。
近红外光谱方法(Near infrared reflection spectroscopy，NIRS)利用蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物等细胞大分子物质的结构和组成对近红外光产生特征吸收的原理，利用功能基团的差异作为鉴定微生物的基础，通过样品选择、化学计量学方法选择、光谱预处理、建模区间选择等步骤，建立微生物与光谱的定性或定量模型，从而实现用近红外光谱信息对微生物含量的快速检测。
因此，近红外光谱技术具有快速、无损、高效、成本低、可多组分同时检测等优点，利用近红外光谱技术建立快速检测乳酸菌数的方法具有重要意义和应用前景。但能否将近红外光谱方法用于检测发酵乳中乳酸菌数中并能达到在线检测的高效性和及时性要求尚未可知。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法，该方法操作简捷，快速、无损、高效、准确、成本低，不污染环境，且可多组分同时检测，能满足发酵乳产品在线质量检验的高效性和及时性要求。
本申请发明人经过研究发现，近红外光谱不仅能反映微生物细胞壁、细胞膜、细胞质甚至细胞核中的蛋白质、多糖、脂质、核酸及其大分子、水分等混合成分子的分子震动信息，而且能敏锐地探测分子基团及其周围环境的变化。通过测定微生物的近红外光谱图即可获得微生物及其生物大分子结构的信息，用于鉴别微生物的种类、微生物的状态和数量。找出不同微生物图谱间的细微差别，确定不同微生物的特征谱峰和图谱带，为微生物的判别、分类、鉴定和大范围筛选提供依据。
鉴于此，本申请发明人尝试使用相应的NIR化学计量学软件，建立含量-光谱对应的NIR定标模型。录制未知样品的NIR谱，调用NIR定标模型，定量发酵乳中的乳酸菌数。
进一步的，本发明提供的一种快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法，包括以下步骤：
(1)建立发酵乳中乳酸菌数定标模型：
采集发酵乳作为定标集样品，采用平板计数法对定标集样品进行分析检测，得出定标集样品的乳酸菌数实测值，并转换成对数值，建立基础数据库；
同步对定标集样品进行近红外光谱扫描，录制定标集样品的近红外光谱数据，建立近红外光谱数据库；
将所述定标集样品的乳酸菌数基础数据库与所述近红外光谱数据库进行一一对应，建立乳酸菌数定标模型；
(2)采用交叉验证法对步骤(1)中所述的乳酸菌数定标模型进行内部验证；
(3)待测发酵乳样品的检测：将待测发酵乳样品进行近红外光谱扫描，获得待测发酵乳样品的近红外光谱数据，将数据导入步骤(1)中建立的乳酸菌数定标模型，计算结果经换算得待测发酵乳样品的乳酸菌数的预测值。
在上述快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法中：
优选的，步骤(1)中所述乳酸菌数包括双歧杆菌和乳杆菌计数A、嗜热链球菌计数B以及乳酸菌总数C，其中乳酸菌总数C为双歧杆菌和乳杆菌计数A与嗜热链球菌计数B二者结果之和；步骤(1)中所述乳酸菌数定标模型包括双歧杆菌和乳杆菌计数A、嗜热链球菌计数B以及乳酸菌总数C的定标模型。
乳酸菌数实测值单位为CFU/g，定标集样品乳酸菌数范围在106-109CFU/g，原始数据太大，直接对应建模效果不理想，故把数据转化成log10CFU/g的模式，建立基础数据库，再将所述定标集样品的乳酸菌数基础数据库数据与所述近红外光谱数据库进行一一对应，建立乳酸菌数定标模型，再采用偏最小二乘法建立乳酸菌数的定标模型，并采用交叉验证法对该定标模型进行内部验证。
优选的，步骤(1)中对定标集样品进行近红外光谱扫描时，采用的近红外光谱仪为Thermo ANTARISⅡ，配制InGaAs检测器，透射采样模块、Result 3数据采集软件和TQAnalyst 8数据分析软件。
优选的，采用Result 3数据采集软件采集时，以积分球漫透射方式和空气为背景，设置分辨率8cm-1，扫描范围4000～10000cm-1，扫描次数为32。
由于发酵乳样品的粘度大，考虑到弃样的后处理方便，以及聚乙烯的NIR光谱吸收峰较少，干扰少，优选的，步骤(1)中对定标集样品进行近红外光谱扫描时，所述定标集样品采用聚乙烯密封袋采样，采样后密封并应在15min内采集近红外光谱数据，防止乳酸菌数在常温下发生变化。
由于发酵乳样品是半固体状态，具有流动性，与固体样品的采集数据方法不同，本发明在采集发酵乳近红外光谱信息时，需要对透射采样模块进行改进，优选的，本发明中所述的透射采样模块优选采用凹字形压块，所述定标集样品采用聚乙烯密封袋采样后密封，置于所述近红外光谱仪的积分球漫透射光孔上，然后采用凹字形压块压紧，其中凹字形压块的凹槽部正对聚乙烯密封袋，所述凹字形压块中的凹槽的深度为3mm，然后录制定标集样品的近红外光谱数据。
采用该透射采样模块采样，可以使发酵乳采集条件以及密封袋的厚度保持一致。
具体的，该透漫射采样模块可以是不锈钢材质，“[”型，长10cm×宽3cm×高3cm，反射凹面经镜面抛光处理，凹面深度3mm。采集方法可以使得样品厚度一致。
优选的，步骤(1)中对定标集样品进行近红外光谱扫描时，在温度为(23±2)℃、湿度为(50±5)％的恒温恒湿室中进行。
近红外光谱采集的发酵乳原始光谱信息中除包含与样品结构组成有关的信息外，还可能受测试条件、环境温度、仪器状态、样品状态等因素的影响。而且样品中不同成分也会互相干扰，导致谱线重叠，低含量成分光谱峰被高含量成分光谱峰掩盖等问题。因此，在建模时候，需要考虑多种因素。
建立乳酸菌数模型时，设定的建模条件通常包括：
(1)化学计量学方法：逐步多元线性回归法(Stepwise Multiple LinearRegression，SMLR)、偏最小二乘法(Partial Least Squares，PLS)、主成分回归法(Principal Component Regression，PCR)等；
(2)光程类型(Pathlength Type)：恒定光程(Constant)、多元散射校正(Multiplicative Signal Correction，MSC)、标准正态变量变换(Standard NormalVariate，SNV)等；
(3)数据格式(Data Format)：原始光谱(Spectrum)、一阶导数(Firstderivative，1st Der)、二阶导数(Second derivative，2nd Der)；
(4)平滑类型(Smoothing)：不光滑(No Smoothing，NS)、卷积平滑滤波(Savizky-Golay Filter数据点为7，3项式平滑滤波，S-G)、Norris导数平滑滤波(Norris derivativefilter，ND)等；
(5)建模波段范围：4000～10000cm-1。
本发明通过对光谱信息的采集方法进行改良、数据的筛选、对检测数据进行多种预处理以达到消除随机噪声、样品背景干扰和测试条件引起的差异，通过对光谱信息进行有效提取和优化，提高了分辨率和运算效率，最终成功建立高效快速准确的定标模型。
即本申请发明人经过进一步的实验，发现以下条件建立模型时，获得的发酵乳中乳酸菌数的预测值与真实值更加接近。
优选的，步骤(1)中建立乳酸菌数定标模型时，采用偏最小二乘法，经过Savitzky-golay filter数据点为7，3项式平滑滤波处理，并结合一阶导数和多元散射校正(MSC)对近红外光谱的数据进行处理。
优选的，步骤(1)中建立乳酸菌数定标模型时，选取波段为5569-5716cm-1、5724-6403cm-1、7197-7506cm-1范围内的光谱数据建立模型。
步骤(2)中采用交叉验证法对该定标模型进行内部验证，交叉验证法的原理为：假设定标集有n个样品，可以每次从中取出m(m＝1,2.3,…)个样品，作为临时验证集，以其余的(n-m)个样品作为校正集进行建模，然后对这m个样品进行预测，如此循环，则分别得到n个样品的交叉预测值，再以交叉预测值与标准值作相关图，同样类似的可以计算校正集交互验证的根均方误差(RMSECV)和相关系数(Rcv)。
优选的，步骤(1)中采用主成分分析-马氏距离方法剔除发酵乳中异常数据，获得定标集样品，提高近红外光谱定量分析的可靠性；步骤(1)中所述发酵乳为含活乳酸菌的发酵乳，所述定标集样品包括校正集样品和验证集样品，步骤(2)中采用交叉验证法对所述的乳酸菌数定标模型进行内部验证时，从定标集样品中取出85％的样品作为校正集(Calibration)样品进行建模，以剩下的15％样品作为验证集(Validation)样品进行验证。
作为本发明的一种优选的实施方式，所述定标集样品为67批次，其中校正集样品为57批次，验证集样品为10批次。
选择具有代表性的样品作为定标集样品，如选择不同风味、黏度、颜色、添加物、乳酸菌数含量等发酵乳样品。
步骤(3)中所述乳酸菌数预测值包括双歧杆菌和乳杆菌A、嗜热链球菌计数B以及乳酸菌总数C的预测值，其中乳酸菌总数C为双歧杆菌和乳杆菌计数A与嗜热链球菌计数B二者结果之和。
因此，本发明研究了采用近红外光谱快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法，该方法利用具有代表性的发酵乳样品构成定标集样品，采用平板计数法对定标集样品的乳酸菌数进行分析检测，获得其实测值，再转换成对数值，建立基础数据库；同时采用近红外光谱仪在设定的建模条件下采集其近红外光谱信息，获得光谱数据，建立近红外光谱数据库；将基础数据库和近红外光谱数据库进行一一对应，采用PLS法建立发酵乳中乳酸菌数的定标模型，并验证；取待测样品，对其进行近红外光谱分析，将光谱数据导入定标模型，经换算得出待测样品的乳酸菌数。该方法具有快速、高效、准确、成本低、不污染环境等优点，能满足发酵乳产品在线质量检验的高效性和及时性要求。
本申请将上述近红外光谱方法直接应用于发酵乳中乳酸菌数检测时，在建模过程中遇到以下的困难：
(1)目前基于近红外技术快速检测微生物的方法研究中，由于微生物在样品中的分布中存在分布不均、含量低(一般低于103CFU/g)等特点，需要对微生物进行富集，常见的富集方法有对目标菌株进行分离、纯化、培养，制成粉末状菌体，或者采用膜过滤的方法收集菌体，其样品形态都是菌体粉末，通过对标准菌株或典型菌株的纯培养物制成，样品的纯度高，含量高，一般达109CFU/g以上，基质相似，近红外光谱信息不受样品基质的干扰，但以上方法不能实现真正意义上的在线快速检测。
(2)本发明定标集样品的乳酸菌数含量为106～109CFU/g，且分布均匀，具有在线快速检测的潜力。但发酵乳成分复杂，包含蛋白质、脂肪、乳糖、乳酸、盐分、食品添加剂等物质，乳酸菌数在发酵乳中所占含量较低。不同品牌不同口味的发酵乳还会添加果蔬或谷物，导致发酵乳的颗粒大小、黏度、颜色存在很大差异。因此利用近红外光谱分析技术对发酵乳中的微生物含量进行定量分析，属于从复杂、重叠、变动的背景中提取弱信息。直接扫描发酵乳获得的近红外光谱易受样品基质的干扰，多成分物质造成光谱的背景复杂，增加了近红外光谱分析的复杂性。
本发明通过收集各种类型样品，样品类型包括不同风味、黏度、颜色、添加物、乳酸菌数含量等，选择具有代表性的样品作为定标集样品，尽量保证样品的乳酸菌数在建模范围内分布均匀，且采用主成分分析-马氏距离方法剔除次异常数据，选择有效样品，提高模型的预测准确度。同时采用多元分析，利用特定波长短提取有效信息、运用校正技术等方法，成功提取有效信息，建立快速准确的乳酸菌数定标模型，可实现真正意义上的在线快速分析。
(3)近红外光谱采集的发酵乳原始光谱信息中除包含与样品结构组成有关的信息外，还可能受测试条件、环境温度、仪器状态、样品状态等因素的影响。而且样品中不同成分也会互相干扰，导致谱线重叠，低含量成分光谱峰被高含量成分光谱峰掩盖等问题。本发明通过对光谱信息的采集方法进行改良、数据的筛选、对检测数据进行多种预处理以达到消除随机噪声、样品背景干扰和测试条件引起的差异，通过对光谱信息进行有效提取和优化，提高了分辨率和运算效率，最终成功建立高效快速准确的定标模型。
(4)由于发酵乳是浑浊黏稠的半固体，样品的颗粒度不均匀会引起散射，当样品组成发生变化，其吸收系数和散射系数也随之变化，产生较大的散射误差，导致建模的准确性不高。本发明通过积分球漫透射的方式，同时采用凹字形透射采样模块采样，可以使发酵乳采集条件以及样品的厚度保持一致，大大增强了信号强度，改良了近红外吸收光谱采集形式，成功建立定标模型。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)操作简单便捷：本发明方法仪器的高度自动化降低了对操作者的技能要求，无需前处理和稀释，只需进行简单操作即可获得检测结果，易于推广；
(2)效率高，耗时短：近红外技术检测耗时少于一分钟，极大地缩短了检测时间，保障生产过程的连续性，且能用于多组分的同时检测，尤其适用于企业在线监测或快速检测；
(3)无需试剂，成本低，不污染环境：近红外光谱分析中只需要取得样品的光谱信号，不使用任何试剂，可以脱离试验试剂的影响，测试过程中不产生污染；
(4)因此，本发明方法结果表明使用近红外透射光谱快速测定发酵乳中的乳酸菌数值是可行的，为今后发酵乳中乳酸菌数的快速检测提供了理论依据。
附图说明
图1是本发明实施例2中发酵乳中乳酸菌数的NIR透射光谱图；
图2是本发明实施例2中发酵乳中嗜热链球菌数定标模型中预测值和真实值(测定值)的相关性关系；
图3是本发明实施例2中发酵乳中双歧杆菌和乳杆菌数定标模型中预测值和真实值(测定值)的相关性关系；
图4是本发明实施例2中发酵乳中乳酸菌总数定标模型中预测值和真实值(测定值)的相关性关系；
图5是本发明实施例2中发酵乳中嗜热链球菌数定标模型中预测值和真实值(测定值)的相对误差；
图6是本发明实施例2中发酵乳中双歧杆菌和乳杆菌数定标模型中预测值和真实值(测定值)的相对误差；
图7是本发明实施例2中发酵乳中乳酸菌总数定标模型中预测值和真实值(测定值)的相对误差；
图8是本发明实施例2中发酵乳中嗜热链球菌数定标模型的十字交叉验证图(Cross validation)；
图9是本发明实施例2中发酵乳中双歧杆菌和乳杆菌数定标模型的十字交叉验证图(Cross validation)；
图10是本发明实施例2中发酵乳中乳酸菌总数定标模型的十字交叉验证图(Crossvalidation)。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明中的发酵乳中乳酸菌数的检测方法：
实施例1
本实施例提供的快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法，包括以下步骤：
1仪器和材料
1.1仪器与设备
高压灭菌锅：CL-40M ALP
生物安全柜：AC2-6S1 ESCO
隔水式恒温培养箱：GHP-9160上海一恒科技有限公司
拍击式均质器：Easymax AES Chemunex
电子稀释器：dilumat S AES Chemunex
厌氧培养罐：AnaeroPack日本三菱MGC
近红外光谱仪Thermo ANTARISⅡ：InGaAs检测器，安装Result 3数据采集软件和TQ Analyst 8数据分析软件。
1.2材料
材料：聚乙烯密实袋(7cm×5cm)；无菌均质袋interscience；厌氧产气袋三菱瓦斯化学株式会社
样品：含活乳酸菌发酵乳样品；
试剂：氯化钠广州化学试剂厂
培养基：MRS(Man Rogosa Sharpe)培养基广东环凯微生物科技有限公司；MC(Modified Chalmers)培养基北京陆桥技术股份有限公司
2平板计数法检测发酵乳中乳酸菌数
采集具有代表性的发酵乳样品构成定标集样品，所有发酵乳样品均为含活乳酸菌的发酵乳，按照中国国家标准GB 4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》测定所述定标集样品的乳酸菌数，构成所述定标集样品的乳酸菌数平板计数法测定值，建立基础数据库。
其具体检验方法和计算方法如下：
2.1样品制备
样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序，以无菌生理盐水作为稀释液。称取25g样品，置于225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打2min制成1:10的样品稀释液。
2.2 10倍系列稀释
吸取2.1中1:10样品稀释液1mL，注入装有9mL稀释液的试管中，使用旋涡混合器振摇试管1min，使其混合均匀，制成1:100的样品稀释液。按照上述操作步骤，按10倍系列依次制备样品稀释液。
2.3双歧杆菌和乳杆菌计数A
依据待检样品标签声称的乳酸菌类别和含量，估算待检样品中是否含有双歧杆菌和乳杆菌及其数量，选择2个～3个合适的连续稀释度，每个稀释度吸取1mL样品稀释液置于无菌培养皿内，每个稀释度做两个平行。然后注入约15mL冷却至48℃±1℃的MRS培养基，转动培养皿使之混合均匀。待培养基凝固后置于36℃±1℃培养箱中厌氧培养72h±2h，培养后计数与计算。从制备样品到倾注平板要求在15min内完成，以防双歧杆菌和乳杆菌数量发生变化。
2.4嗜热链球菌计数B
依据待检样品标签声称的乳酸菌类别和含量，估算待检样品中是否含有嗜热链球菌及其数量，选择2个～3个合适的连续稀释度，每个稀释度吸取1mL样品稀释液置于无菌培养皿内，每个稀释度做两个平行。然后注入约15mL冷却至48℃±1℃的MC培养基，转动培养皿使之混合均匀。待培养基凝固后置于36℃±1℃培养箱中需氧培养72h±2h，培养后计数与计算。从制备样品到倾注平板要求在15min内完成，以防嗜热链球菌数量发生变化。
2.5乳酸菌总数计数C
乳酸菌总数C为双歧杆菌和乳杆菌计数A和嗜热链球菌计数B二者结果之和，即C＝A+B。双歧杆菌和乳杆菌计数A和嗜热链球菌计数B的计数范围均为30CFU～300CFU之间。
2.6结果计算
若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克中菌落数结果，按公式(1)计算。
式中：
N——样品中菌落数；
∑C——平板菌落数之和；
d——稀释因子。
若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式(2)计算。
式中：
N——样品中菌落数；；
∑C——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；
n1——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；
n2——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数；
d——稀释因子(第一稀释度)。
2.7修约原则与报告
修约原则：菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，用10的指数形式来表示，采用两位有效数字。
报告：根据菌落计数结果，报告单位以CFU/g表示。
3近红外光谱信息采集
采用近红外光谱仪在设定的建模条件下采集定标集样品的近红外光谱信息，构成所述定标集样品的近红外波段光谱信息，建立近红外光谱数据库。
3.1取样方法
使用聚乙烯密封袋(7cm×5cm)采样12g-15g，采样后密封并应在15min内完成检测，防止乳酸菌数在常温下发生变化而影响检测结果。
3.2采集方法
检测前开机预热30min，以空气为参比，扣除背景，性能测试后进行光谱扫描。测试过程环境温湿度控制在(23±2)℃，(50±5)％范围内。采用Result 3数据采集；采样方式：积分球漫透射；分辨率：8cm-1；波长范围：4000～10000cm-1；扫描次数：32次；信号增益：1X。
取均匀样品装进聚乙烯密实袋，密封后平铺于积分球漫透射光孔上，录制NIR谱。每个样品重复测定2次，取其平均光谱。采集的光谱数据用TQ Analyst 8数据分析软件进行处理和计算。采用积分球漫透射方法原因：减少散射误差。
4定标模型的评价指标
定标模型的评价指标直接影响模型的稳定性和准确性。本发明在模型建立和验证过程中使用的评价指标如下：
校正集根均方误差(Root Mean Square Error of Calibration，RMSEC)和预测集根均方误差(Root Mean Square Error of Prediction，RMSEP)：
校正集交互验证的根均方误差(Root Mean Square Error of CrossValidation，RMSECV)：
相关系数R：
式中：n表示样本数；yi表示第i个样品使用平板计数法获得的实测值；表示第i个样品的近红外预测值；表示样品使用平板计数法获得的实测值的平均值。RMSEC、RMSEP和RMSECV分别表示校正集、预测集样品和内部交叉验证时预测值和实测值偏离的大小，其值越小，表示所建模型的预测精度越大，且RMSEC、RMSEP和RMSECV之间的差异越小，模型的预测效果就越好。相关系数R表示样品参数指标的实测值和近红外预测值之间的相关程度，其值越接近于1，说明实测值与近红外预测值之间的相关程度越好。理想状态条件下，相关系数R的值为1，均方根误差为0。
5乳酸菌数实测值数据模式转换
按照中国国家标准GB 4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》测定所述定标集样品的乳酸菌数单位为CFU/g，定标集样品乳酸菌数范围在106-109CFU/g，原始数据太大，尝试直接建模效果不理想，故把数据转化成log10CFU/g的模式，再进行建模优化。利用TQ Analyst 8数据分析软件建立乳酸菌数的定标校正模型。
6建立模型的方法
6.1样品选择
在近红外光谱定量分析过程中，由于测量仪器、测试方法和环境等客观因素的影响以及技术人员本身主观因素的作用，再加上样本来源的多样性，用同一个模型分析不同来源的样品也可能存在模型不适应的问题。因此异常值的判别和处理是提高近红外分析质量的一个重要步骤。通过优化筛选，剔除偏离较大的样品，使其误判率为0，如采用主成分分析-马氏距离方法剔除异常数据，获得定标集样品，以提高近红外光谱定量分析的可靠性。
6.2化学计量学方法选择
在近红外分析中由于光谱吸收强度低，谱带较宽及光谱相互重叠非常严重，在进行定性及定量分析时需要化学计量学方法提取信息。在近红外光谱技术分析中经常采用的化学计量学方法有：逐步多元线性回归法(SMLR)、偏最小二乘法(PLS)、主成分回归法(PCR)等。本发明在建模过程中，以校正集根均方误差RMSEC及其相关系数Rc，预测集根均方误差RMSEP及其相关系数Rp为评价指标，对不同NIR分析方法比较，最终确定PLS为最佳处理方法。
6.3光谱数据预处理
近红外仪器自身的随机噪音，以及样品的不均匀、光散射等干扰，都会导致光谱偏移或漂移。光谱数据预处理可以降低样品表面不均匀和色差等因素的影响。光谱微分处理可以消除基线漂移、强化谱带特征、克服谱带重叠、提高分辨率和灵敏度。但与此同时导数的计算会引进噪音，降低信噪比，而平滑可以降低高频随机噪音。
发明以校正集根均方误差RMSEC及其相关系数Rc，预测集根均方误差RMSEP及其相关系数Rp为评价指标，比较了：(1)光程类型：恒定光程、多元散射校正(MSC)、标准正态变量变换(SNV)；(2)数据格式：原始光谱、一阶导数(1st Der)、二阶导数(2nd Der)；(3)平滑类型：不光滑(NS)、卷积平滑滤波(S-G)、Norris导数平滑滤波(ND)等三种光谱预处理方法，最终确定“MSC+1st Der+S-G”为最佳处理方法。
6.4建模波段选择
对反映样品参数信息突出的光谱区域进行优选，可以优化光谱范围，净化图谱信息，提高运算效率。获得近红外波段光谱信息中的波段范围为4000-10000cm-1。根据线性相关系数和NIR的吸光度，不断优化波段范围，最终选择定量光谱区间段为5569-5716cm-1、5724-6403cm-1、7197-7506cm-1。
7采用交叉验证法对定标模型进行内部验证
本实施例以定标集样品的85％作为校正集样品，定标集样品的15％作为验证集样品进行交叉验证。
8待测发酵乳样品的检测
取待测样品，对其进行近红外光谱分析，获得待测样品的近红外波段光谱信息，将光谱数据导入定标模型，结果经换算得待测样品的乳酸菌数预测值。
实施例2
本实施提供的快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法，包括以下步骤：
(1)建立发酵乳中乳酸菌数定标模型：
采集发酵乳作为定标集样品，采用平板计数法对定标集样品进行分析检测，得出定标集样品的乳酸菌数实测值，并转换成对数值，建立基础数据库；
同步对定标集样品进行近红外光谱扫描，录制定标集样品的近红外光谱数据，建立近红外光谱数据库；
将所述定标集样品的乳酸菌数基础数据库与所述近红外光谱数据库进行一一对应，建立乳酸菌数定标模型；
(2)采用交叉验证法对步骤(1)中所述的乳酸菌数定标模型进行内部验证；
(3)待测发酵乳样品的检测：将待测发酵乳样品进行近红外光谱扫描，获得待测发酵乳样品的近红外光谱数据，将数据导入步骤(1)中建立的乳酸菌数定标模型，结果经换算得待测发酵乳样品的乳酸菌数的预测值。
具体实施过程如下：
1实验部分
1.1材料和仪器
含活乳酸菌发酵乳样品共70批次，由国家食品产品质量监督检验中心(广东)提供。
仪器同实施例1。
1.2平板计数法检测样品中乳酸菌数同实施例1。
1.3采集发酵乳样品近红外光谱信息
1.3.1取样方法
使用聚乙烯密封袋(7cm×5cm)采样12g-15g，采样后密封并应在15min内完成检测，防止乳酸菌数在常温下发生变化而影响检测结果。
采用聚乙烯密实袋装样原因：样品的粘度大、弃样的后处理方便，聚乙烯的NIR光谱吸收峰较少，干扰少。
1.3.2采集方法
ANTARISⅡ仪器采用Result 3操作系统采集光谱，智能透射方式，以积分球漫透射方式和空气为背景，设置分辨率8cm-1，扫描范围4000～10000cm-1，扫描次数为32。根据发酵乳的透明度和遮盖率，确定信号增益为1X。取均匀样品装进聚乙烯密实袋，密封后平铺于积分球漫透射光孔上，录制NIR谱。测试过程在温度(23±2)℃、湿度(50±5)％的恒温恒湿室中进行。每个样品重复测定2次，取其平均光谱。采集的光谱数据用TQ Analyst 8数据分析软件进行处理和计算。
1.4乳酸菌数实测值数据模式转换
把乳酸菌数实测值数据转化成log10CFU/g的模式，再进行建模优化。
1.5建立模型
将所述定标集样品的乳酸菌数基础数据库与所述近红外光谱数据库进行一一对应，以RMSEC、RMSEP、RMSECV及其相关系数Rc、Rp、Rcv为评价指标，通过剔除异常数据、选择化学计量学方法、光程类型、数据格式、平滑类型等光谱数据预处理、建模波段优化等步骤，建立乳酸菌数定标模型，并采用交叉验证法对定标模型进行内部验证。
2结果与讨论
2.1剔除异常数据
采用主成分分析-马氏距离方法剔除3批次异常数据，提高近红外光谱定量分析的可靠性，以剩余的67批次样品进行建模。NIR透射光谱叠加谱如图1所示。
2.2化学计量学方法选择
以RMSEC、RMSEP及其相关系数Rc、Rp为评价指标，对SMLR、PLS、PCR分析方法比较，结果如表1～2所示。由表1～2可知，PLS建模方法的RMSEC、RMSEP最小，Rc、Rp最接近1，故PLS为最佳处理方法。
表1 SMLR、PLS、PCR建模方法的RESEC和Rc
表2 SMLR、PLS、PCR建模方法的RESEP和Rp
2.3光谱数据预处理
以RMSEC、RMSEP及其相关系数Rc、Rp为评价指标，对恒定光程、MSC、SNV、一阶导数(S-G)、二阶导数(S-G)、一阶导数+MSC(S-G)、二阶导数+MSC(S-G)、一阶导数+SNV(S-G)、二阶导数+SNV(S-G)分析方法比较，结果如表3～4所示。综合考虑双歧杆菌和乳杆菌A、嗜热链球菌B和乳酸菌数C的RMSEC、RMSEP及其相关系数Rc、Rp，一阶导数+MSC(S-G)为最佳预处理方法。
表3近红外光谱数据预处理方法的RESEC和Rc
表4近红外光谱数据预处理方法的RESEP和Rp
2.4建模波段选择
发酵乳成分复杂，各种基质在近红外区域吸收丰富，吸收强度大，吸收峰宽，故相互干扰。通过选择高波数的定量波段5569-5716cm-1、5724-6403cm-1、7197-7506cm-1，不选择低波数干扰波段4000～5200cm-1和高波段干扰波段8900～9500cm-1，去除无关信息，提取有用信息，降低数据分析的计算量，达到优化光谱范围，提高运算效率的目的。
2.5采用交叉验证法对定标模型进行内部验证
以定标集样品中的57批次作为校正集样品，另外的10批次作为验证集样品，进行多变量建立乳酸菌数的定标模型，嗜热链球菌计数B、双歧杆菌和乳杆菌计数A、乳酸菌总数计数C的预测值和真实值的相关性关系如图2～4所示。
由图2～4可知校正集和预测集中实际测定值和模型预测值之间的相关系数都达到了0.91以上，模型的拟合度和预测精度都比较好。其预测值和真实值的相对误差如图5～7所示。
乳酸菌数定标模型的十字交叉验证图(Cross validation)如图8～10所示。由图8～10可知RMSEC、RMSEP、RMSECV的值都小于0.2，且相互之间差异很小，Rc、Rp、Rcv的值都大于0.89，说明模型的预测值和实测值相关性好。定标模型的RMSEC都小于RMSEP，说明样品代表性好，样品信息提取充分；RMSEP和RMSECV数值相近，说明建模样品与验证样品都具有代表性，模型信息拟合充分，模型预测性好。
3独立样品预测
从图2～10可知，经过剔除异常数据、化学计量学方法优选、光谱数据预处理、光谱波段优化等步骤建立的乳酸菌数定标模型，具有较好的预测能力，为进一步说明模型的可行性，本发明利用独立样品对近红外的准确性进行了考察。
准备10个含活乳酸菌发酵乳样品，按照1.2平板计数法检测样品中乳酸菌数的实测值，按1.3采集其近红外光谱信息，将光谱数据导入定标模型，得出样品的乳酸菌数预测值，同时将定标模型预测值和平板计数法实测值对比，分析其误差是否在允许范围内，要求两种方法的检测结果的绝对差值不超过0.45，具体结果见表5。
表5发酵乳样品的乳酸菌数定标模型预测值和平板计数法实测值比较(log10CFU/g)
由表5可知，10组数据的平板计数法实测值和模型预测值的绝对差值都小于0.45，均在允许范围内。
最后需要说明的是，虽然本发明以较佳实施例揭露如上，但并非用以限定本发明的范围。任何本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的范围内，当可作些许的改进，即凡是依照本发明所做的同等改进，应为本发明的范围所涵盖。

Claims (10)

1.一种快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法，包括以下步骤：
(1)建立发酵乳中乳酸菌数定标模型：
采集发酵乳作为定标集样品，采用平板计数法对定标集样品进行分析检测，得出定标集样品的乳酸菌数实测值，并转换成对数值，建立基础数据库；
同步对定标集样品进行近红外光谱扫描，录制定标集样品的近红外光谱数据，建立近红外光谱数据库；
将所述定标集样品的乳酸菌数基础数据库与所述近红外光谱数据库进行一一对应，建立乳酸菌数定标模型；
(2)采用交叉验证法对步骤(1)中所述的乳酸菌数定标模型进行内部验证；
(3)待测发酵乳样品的检测：将待测发酵乳样品进行近红外光谱扫描，获得待测发酵乳样品的近红外光谱数据，将数据导入步骤(1)中建立的乳酸菌数定标模型，结果经换算得待测发酵乳样品的乳酸菌数的预测值。
2.根据权利要求1所述的快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法，其特征是：步骤(1)中所述乳酸菌数包括双歧杆菌和乳杆菌计数A、嗜热链球菌计数B以及乳酸菌总数C，其中乳酸菌总数C为双歧杆菌和乳杆菌计数A与嗜热链球菌计数B二者结果之和；步骤(1)中所述乳酸菌数定标模型包括双歧杆菌和乳杆菌计数A、嗜热链球菌计数B以及乳酸菌总数C的定标模型。
3.根据权利要求1所述的快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法，其特征是：步骤(1)中对定标集样品进行近红外光谱扫描时，采用的近红外光谱仪为Thermo ANTARIS Ⅱ，配制InGaAs检测器，透射采样模块、Result 3数据采集软件和TQ Analyst 8数据分析软件。
4.根据权利要求3所述的快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法，其特征是：采用Result 3数据采集软件采集时，以积分球漫透射方式和空气为背景，设置分辨率8cm-1，扫描范围4000～10000cm-1，扫描次数为32。
5.根据权利要求3所述的快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法，其特征是：步骤(1)中对定标集样品进行近红外光谱扫描时，所述定标集样品采用聚乙烯密封袋采样，采样后密封并应在15min内采集近红外光谱数据，防止乳酸菌数在常温下发生变化而影响结果。
6.根据权利要求5所述的快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法，其特征是：所述的透射采样模块为凹字形压块，所述定标集样品采用聚乙烯密封袋采样后密封，置于所述近红外光谱仪的积分球漫透射光孔上，然后采用凹字形压块压紧，其中凹字形压块的凹槽部正对聚乙烯密封袋，所述凹字形压块中的凹槽的深度为3mm，录制定标集样品的近红外光谱数据。
7.根据权利要求1所述的快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法，其特征是：步骤(1)中对定标集样品进行近红外光谱扫描时，在温度为(23±2)℃、湿度为(50±5)％的恒温恒湿室中进行。
8.根据权利要求1所述的快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法，其特征是：步骤(1)中建立乳酸菌数定标模型时，采用偏最小二乘法，经过savitzky-golay filter数据点为7，3项式平滑滤波处理，并结合一阶导数和多元散射校正对近红外光谱的数据进行处理。
9.根据权利要求1所述的快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法，其特征是：步骤(1)中建立乳酸菌数定标模型时，选取波段为5569-5716cm-1、5724-6403cm-1、7197-7506cm-1范围内的光谱数据建立模型。
10.根据权利要求1所述的快速检测发酵乳中乳酸菌数的方法，其特征是：步骤(1)中采用主成分分析-马氏距离方法剔除发酵乳中异常数据，获得定标集样品，提高近红外光谱定量分析的可靠性；步骤(1)中所述发酵乳为含活乳酸菌的发酵乳，所述定标集样品包括校正集样品和验证集样品，步骤(2)中采用交叉验证法对所述的乳酸菌数定标模型进行内部验证时，从定标集样品中取出85％的样品作为校正集样品进行建模，以剩下的15％样品作为验证集样品进行验证。
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