CN110308226A - 一种发酵虫草菌粉生产全过程链质量控制快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种发酵虫草菌粉生产全过程链质量控制快速检测方法，其特征在于以中药指纹图谱技术为基础，将高效液相色谱法和近红外光谱相融合结合偏最小二乘回归法，建立发酵虫草菌粉生产过程核苷类成分定量分析模型。主要包括以下步骤：①利用高效液相色谱法测定核苷类成分标准含量；②利用中药指纹图谱分析过程核苷图谱的相似度；③采集核苷提取液近红外原始光谱；④光谱预处理；⑤定量模型的建立；⑥模型的验证。本发明具有快速、无损、检测结果准确的特点，可同时检测多种核苷类成分，快速判定各过程核苷类成分含量是否符合标准，最大可能保证发酵虫草菌粉产品中核苷类成分的质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物产品的检测方法，特别涉及发酵虫草菌粉产品生产全过程链质量控制快速检测方法，属于药物检测技术及近红外光谱分析检测领域。
背景技术
发酵虫草菌粉是药用菌株经液体深层发酵及加工制成，具有养肺阴，补肾阳的功效。研究证实发酵虫草菌粉类产品化学成分与冬虫夏草相似，主要有核苷类、甾醇类、多糖及氨基酸等主要成分，具有抗炎、抗氧化、促进免疫调节等药理作用，可作为冬虫夏草的可持续替代品。核苷类作为有效成分之一，在2015版中国药典中只有腺苷的含量测定及核苷类5个色谱峰的鉴别，单一指标成分难以表征发酵虫草菌粉核苷类成分质量属性的完整性，不能对发酵虫草菌粉核苷类成分质量进行有效控制。发酵过程中各核苷类成分含量是一个动态传递的过程，如何控制有效成分达到阈值仍是一个难题。仅从过程的一部分难以评价产品的质量，应从生产的多个环节入手，溯源管理产品质量。
查文献可知，指纹图谱较多应用于中药配方颗粒成品质量控制，在原辅料质量控制，中药生产过程质量控制方面的应用较少，并且指纹图谱虽然数据多但结果不直观，需结合更多的化学计量学方法进行数据处理。对于指纹图谱在发酵虫草菌粉核苷类成分的研究中也仅有对发酵过程中的腺苷、鸟苷、尿苷的监测，其研究结果表明不同过程样品含量差异较大，提示在发酵虫草菌粉生产初期就应进行质量检测。近红外也仅仅应用于监测中药提取过程或成品中某一种成分，尚未有研究报道近红外用于产品全过程链的监测，对于近红外在发酵虫草菌粉核苷类成分的研究，也仅有对发酵虫草菌粉成品中腺苷的研究，不能体现核苷类成分整体含量。
发明内容
本研究立足于中药指纹图谱，从全新视角控制产品质量。本发明整体流程示意图见图1。将中药指纹图谱与近红外光谱结合，基于发酵虫草菌粉生产的全过程链，系统监测多种核苷类成分尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷及总核苷，从而全面控制过程核苷类成分。此外，本研究基于高效液相融合近红外光谱结合偏最小二乘法，建立全过程各种核苷类成分定量分析模型可快速、准确预测核苷类成分含量，在生产过程中可以根据核苷类成分含量在全过程传递的规律，调控发酵过程中的温度、pH，转速等，确保各成分含量传递在阈值范围内，从而确定一个高效可控的发酵工艺，有利于企业大批量生产符合质量标准的发酵虫草菌粉产品。
为此，本发明提供一种发酵虫草菌粉生产全过程链质量控制快速检测方法，其中，所述发酵虫草菌粉生产全过程简要描述如下：菌种培养操作单元、菌种传代操作单元、发酵操作单元、滤过操作单元、干燥操作单元、粉碎操作单元、混合操作单元。
为对上述生产全过程中，每一个步骤获得的样品进行含量分析，首先需要获取尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、鸟苷及腺苷的标准曲线，标准曲线的建立方法如下：
分别精密称取尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、鸟苷及腺苷适量溶于10mL容量瓶中，配制成浓度分别为366.00μg/mL、1010.00μg/mL、324.00μg/mL、1217.00μg/mL、1474.00μg/mL的对照品溶液；分别各取1.5mL对照品溶液于10mL容量瓶中，定容至刻度，即得浓度分别为54.90μg/mL，151.50μg/mL，48.60μg/mL，182.55μg/mL，221.10μg/mL的混合对照品溶液。取混合对照品溶液稀释2倍、4倍、8倍、32倍、64倍、100倍、128倍，得到系列浓度混合对照品溶液，将混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，以浓度为横坐标，相应峰面积为纵坐标，建立5种核苷类成分标准曲线。
其中，所述高效液相色谱仪的色谱条件如下：
采用色谱柱ACE Excel 5SuperC 18，(250mm×4.6mm，5μm)，
紫外检测器进行检测，检测波长为260nm，
柱温30℃，
进样量为10μL，
以甲醇和水梯度洗脱，流速为1.0mL·min-1，分析时间为50min。
洗脱条件如下：
| 时间(分钟) | 水(％) | 甲醇(％) |
| 0 | 99 | 1 |
| 15 | 99 | 1 |
| 30 | 85 | 15 |
| 40 | 65 | 35 |
| 47 | 99 | 1 |
| 50 | 99 | 1 |
在建立了5种核苷类成分标准曲线后，即可对生产全过程中，每一个步骤获得的样品进行含量检测，为获得生产全过程核苷类成分定量模型，需要对多批次多个生产全过程中的每一个步骤的眼皮核苷类成分进行检测，以获得统一的数据，为此需要进行以下检测：
取多批次不同生产过程发酵虫草菌样品，每个样品重量为约1.00g，每个样品精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入超纯水40mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率45kHz)30min，放冷，再称定重量，用超纯水补足减少的重量，摇匀，离心(转速4000r/min，10min)，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，滤液即为供试品溶液。
将供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据标准曲线计算上述多批次不同生产过程发酵虫草菌样品中5种核苷类成分的含量，其中，所述高效液相色谱仪的色谱条件如下：
采用色谱柱ACE Excel 5SuperC 18，(250mm×4.6mm，5μm)，
紫外检测器进行检测，检测波长为260nm，
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进样量为10μL，
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采用中药指纹图谱相似度评价系统(2004A版)对上述多批次不同生产过程发酵虫草菌样品核苷类成分的相似性进行评价，如果均为合格品，即可进行近红外光谱模型的建立。
近红外快速检测发酵虫草菌粉生产全过程核苷类成分定量模型的建立方法，步骤如下：
⑦采集上述合格的多批次不同生产过程发酵虫草菌样品的近红外光谱：智能透射检测器附件，波数为4000-12500cm-1，扫描32次，分辨率为8cm-1，温度25℃，湿度40％，以log1/R形式显示光谱，每个样品扫描3次，取平均光谱。
⑧光谱预处理：采用TQ Analyst软件分析图谱。固定光程类型为恒定(Constant)，建立偏最小二乘法(PLS)、主成分回归法(PCR)结合原始光谱、一阶导数及二阶导数光谱定量模型。以校正模型、验证模型的均方差(RMSEC、RMSEV)和相关系数(Rc、Rv)为指标，筛选出最佳定量模型。
⑨校正集及验证集的划分：将上述多批次不同生产过程发酵虫草菌样品5种核苷类成分含量按照从大到小的顺序排列，确保校正集含量包含验证集含量，按照5:1的比例选取25个校正集，5个验证集。
⑩建模区间的选取：结合文献及软件推荐模型区间确定光谱分析波数区间为7317～6927.5cm-1、6738.5～6476.2cm-1、5859～5523.4cm-1、
4902.49～4817.64cm-1、4740.49～4107.91cm-1。
光谱异常样本的剔除：根据光谱的分布差异计算马氏距离鉴别异常值。
模型验证：选取验证集样品作为外部数据对模型进行验证，以校正模型、验证模型的均方差(RMSEC、RMSEV)和相关系数(Rc、Rv)为指标评价模型。将模型预测值与真实值进行独立样本t检验，评价所建模型的可靠性。
所述多批次不同生产过程发酵虫草菌样品，包括30批或30批以上的样品，如30批，50批，70批等。
在上述近红外快速检测发酵虫草菌粉生产全过程核苷类成分定量模型建立后，即可进行不同生产过程发酵虫草菌样品的快速检测了，检测方法如下：
供试品溶液的制备：取任何一个批次的实际生产过程中不同生产步骤的发酵虫草菌粉样品，每个样品1.00g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入超纯水40mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率45kHz)30min，放冷，再称定重量，用超纯水补足减少的重量，摇匀，离心(转速4000r/min，10min)，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，滤液即为供试品溶液。
随后对上述供试品溶液进行近红外光谱的采集：智能透射检测器附件，波数为4000-12500cm-1，扫描32次，分辨率为8cm-1，温度25℃，湿度40％，以log1/R形式显示光谱，每个样品扫描3次，取平均光谱。
将光谱数据带入上述建立好的定量模型，根据光谱数据即可快速准确的得出不同生产过程发酵虫草菌样品5种核苷类成分的含量，根据该含量即可判断生产过程中发酵虫草菌样品是否合格。
优选的，本发明利用近红外快速检测发酵虫草菌粉生产全过程核苷类成分定量模型的建立，由下述步骤组成：
(1)发酵虫草菌粉过程核苷类成分标准含量的测定
①对照品溶液的制备：分别精密称取尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、鸟苷及腺苷适量溶于10mL容量瓶中，配制成浓度分别为366.00μg/mL、1010.00μg/mL、324.00μg/mL、1217.00μg/mL、1474.00μg/mL的对照品溶液；分别各取1.5mL对照品溶液于10mL容量瓶中，定容至刻度，即得浓度分别为54.90μg/mL，151.50μg/mL，48.60μg/mL，182.55μg/mL，221.10μg/mL的混合对照品溶液。取混合对照品溶液稀释2倍、4倍、8倍、32倍、64倍、100倍、128倍，得到系列浓度混合对照品溶液。
②供试品溶液的制备：取30批不同过程发酵虫草菌粉约1.00g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入超纯水40mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率45kHz)30min，放冷，再称定重量，用超纯水补足减少的重量，摇匀，离心(转速4000r/min，10min)，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，滤液即为供试品溶液。
③建立标准曲线：核苷的色谱分析采用色谱柱ACE Excel 5SuperC 18，(250mm×4.6mm，5μm)，紫外检测器进行检测，检测波长为260nm，柱温30℃，进样量为10μL，以甲醇和水梯度洗脱，流速为1.0mL·min-1，分析时间为50min。洗脱条件表1：
表1流动相梯度洗脱条件
| 时间(分钟) | 水(％) | 甲醇(％) |
| 0 | 99 | 1 |
| 15 | 99 | 1 |
| 30 | 85 | 15 |
| 40 | 65 | 35 |
| 47 | 99 | 1 |
| 50 | 99 | 1 |
在(1)③色谱条件下分析(1)①系列浓度混合对照品溶液，得到各浓度下5种核苷类成分色谱峰峰面积，以浓度为横坐标，相应峰面积为纵坐标，建立5种核苷类成分标准曲线。
④色谱分析：将(1)②制备的供试品溶液按照(1)③色谱条件进行测定，将得到的5种核苷类成分峰面积代入标准曲线中计算即得核苷类成分的含量。
(2)相似度分析
将(1)④得到的不同批次、不同过程核苷类成分液相色谱导入中药指纹图谱相似度评价系统(2004A版)分析不同批次、不同过程核苷类成分的相似性。
(3)近红外定量模型的建立
①过程核苷提取液原始光谱的采集：智能透射检测器附件，波数为4000-12500cm-1，扫描32次，分辨率为8cm-1，温度25℃，湿度40％，以log1/R形式显示光谱，每个样品扫描3次，取平均光谱。
②光谱预处理：采用TQ Analyst软件分析图谱。固定光程类型为恒定(Constant)，建立偏最小二乘法(PLS)、主成分回归法(PCR)结合原始光谱、一阶导数及二阶导数光谱定量模型。以校正模型、验证模型的均方差(RMSEC、RMSEV)和相关系数(Rc、Rv)为指标，筛选出最佳定量模型。
③校正集及验证集的划分：将(1)④测出的不同批次、不同过程5种核苷类成分含量按照从大到小的顺序排列，确保校正集含量包含验证集含量，按照5:1的比例选取25个校正集，5个验证集。
④建模区间的选取：结合文献及软件推荐模型区间确定光谱分析波数区间为7317～6927.5cm-1、6738.5～6476.2cm-1、5859～5523.4cm-1、4902.49～4817.64cm-1、4740.49～4107.91cm-1。
⑤光谱异常样本的剔除：根据光谱的分布差异计算马氏距离鉴别异常值。
⑥模型验证：选取验证集样品作为外部数据对模型进行验证，以校正模型、验证模型的均方差(RMSEC、RMSEV)和相关系数(Rc、Rv)为指标评价模型。将模型预测值与真实值进行独立样本t检验，评价所建模型的可靠性。
附图说明：
图1本发明流程示意图
图2 5种核苷类成分标准曲线图
图3发酵虫草菌粉指纹图谱
图4过程核苷提取液原始光谱图
图5发酵虫草菌粉总核苷各种光谱预处理结果图
图6发酵虫草菌粉总核苷定量模型实际值与计算值关系值散点图
具体实施方式：
(1)发酵虫草菌粉过程核苷类成分标准含量的测定
①对照品溶液的制备：分别精密称取尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、鸟苷及腺苷适量溶于10mL容量瓶中，配制成浓度分别为366.00μg/mL、1010.00μg/mL、324.00μg/mL、1217.00μg/mL、1474.00μg/mL的对照品溶液；分别各取1.5mL对照品溶液于10mL容量瓶中，定容至刻度，即得浓度分别为54.90μg/mL，151.50μg/mL，48.60μg/mL，182.55μg/mL，221.10μg/mL的混合对照品溶液。取混合对照品溶液稀释2倍、4倍、8倍、32倍、64倍、100倍、128倍，得到系列浓度混合对照品溶液。
②供试品溶液的制备：取30批不同过程发酵虫草菌粉约1.00g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入超纯水40mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率45kHz)30min，放冷，再称定重量，用超纯水补足减少的重量，摇匀，离心(转速4000r/min，10min)，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，滤液即为供试品溶液。
③建立标准曲线：核苷的色谱分析采用色谱柱ACE Excel 5SuperC 18，(250mm×4.6mm，5μm)，紫外检测器进行检测，检测波长为260nm，柱温30℃，进样量为10μL，以甲醇和水梯度洗脱，流速为1.0mL·min-1，分析时间为50min。洗脱条件见表1：
表1流动相梯度洗脱条件
| 时间(分钟) | 水(％) | 甲醇(％) |
| 0 | 99 | 1 |
| 15 | 99 | 1 |
| 30 | 85 | 15 |
| 40 | 65 | 35 |
| 47 | 99 | 1 |
| 50 | 99 | 1 |
在(1)③色谱条件下分析(1)①系列浓度混合对照品溶液，得到各浓度下5种核苷类成分色谱峰峰面积，以浓度为横坐标，相应峰面积为纵坐标，建立5种核苷类成分标准曲线，得到的各成分标准曲线图见图2。
④色谱分析：将(1)②制备的供试品溶液按照(1)③色谱条件进行测定，将得到的5种核苷类成分峰面积代入标准曲线中计算即得核苷类成分的含量。
(2)相似度分析
将(1)④得到的不同批次、不同过程核苷类成分液相色谱图导入中药指纹图谱相似度评价系统(2004A版)分析不同批次、不同过程核苷类成分的相似度，发酵虫草菌粉指纹图谱见图3。
(3)近红外定量模型的建立
①过程核苷提取液原始光谱的采集：智能透射检测器附件，波数为4000-12500cm-1，扫描32次，分辨率为8cm-1，温度25℃，湿度40％，以log1/R形式显示光谱，每个样品扫描3次，取平均光谱，即得核苷提取液原始光谱图见图4。
②光谱预处理：采用TQ Analyst软件分析图谱。固定光程类型为恒定(Constant)，建立偏最小二乘法(PLS)、主成分回归法(PCR)结合原始光谱、一阶导数及二阶导数光谱定量模型。以校正模型、验证模型的均方差(RMSEC、RMSEV)和相关系数(Rc、Rv)为指标，筛选出最佳定量模型。发酵虫草菌粉总核苷各种预处理方式结果见图5。
③校正集及验证集的划分：将(1)④测出的不同批次、不同过程5种核苷类成分含量按照从大到小的顺序排列，确保校正集含量包含验证集含量，按照5:1的比例选取25个校正集，5个验证集。
④建模区间的选取：结合文献及软件推荐模型区间确定光谱分析波数区间为7317～6927.5cm-1、6738.5～6476.2cm-1、5859～5523.4cm-1、4902.49～4817.64cm-1、4740.49～4107.91cm-1。
⑤光谱异常样本的剔除：根据光谱的分布差异计算马氏距离鉴别异常值。
⑥模型验证：选取验证集样品作为外部数据对模型进行验证，以校正模型、验证模型的均方差(RMSEC、RMSEV)和相关系数(Rc、Rv)为指标评价模型。将模型预测值与真实值进行独立样本t检验，评价所建模型的可靠性。30批发酵虫草菌粉总核苷实际值与模型计算值散点图见图6，实际值与模型计算值的比较见表2。
表2菌种混合总核苷真实值与模型计算值的比较
Claims (10)
1.一种发酵虫草菌粉生产全过程链质量控制快速检测方法，其特征在于，所述检测方法，步骤如下：
供试品溶液的制备：取任何一个批次的实际生产过程中不同生产步骤的发酵虫草菌粉样品，每个样品1.00g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入超纯水40mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率45kHz)30min，放冷，再称定重量，用超纯水补足减少的重量，摇匀，离心(转速4000r/min，10min)，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，滤液即为供试品溶液；
对供试品溶液进行近红外光谱的采集：智能透射检测器附件，波数为4000-12500cm-1，扫描32次，分辨率为8cm-1，温度25℃，湿度40％，以log1/R形式显示光谱，每个样品扫描3次，取平均光谱；
将光谱数据带入建立好近红外光谱定量模型，根据近红外光谱定量模型即可快速准确的读出不同生产过程发酵虫草菌样品5种核苷类成分的含量，并判断样品是否合格。
2.发酵虫草菌粉生产全过程近红外光谱定量模型的建立方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：
取多批次不同生产过程发酵虫草菌样品，每个样品重量为约1.00g，每个样品精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入超纯水40mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率45kHz)30min，放冷，再称定重量，用超纯水补足减少的重量，摇匀，离心(转速4000r/min，10min)，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，滤液即为供试品溶液。
将供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据标准曲线计算上述多批次不同生产过程发酵虫草菌样品中5种核苷类成分的含量，其中，所述高效液相色谱仪的色谱条件如下：
采用色谱柱ACE Excel5 SuperC 18，(250mm×4.6mm，5μm)，
紫外检测器进行检测，检测波长为260nm，
柱温30℃，
进样量为10μL，
以甲醇和水梯度洗脱，流速为1.0mL·min-1，分析时间为50min。
洗脱条件如下：
采用中药指纹图谱相似度评价系统(2004A版)对上述多批次不同生产过程发酵虫草菌样品核苷类成分的相似性进行评价，如果均为合格品，即可进行近红外光谱模型的建立。
近红外快速检测发酵虫草菌粉生产全过程核苷类成分定量模型的建立方法，步骤如下：
①采集上述多批次不同生产过程发酵虫草菌样品的近红外光谱：智能透射检测器附件，波数为4000-12500cm-1，扫描32次，分辨率为8cm-1，温度25℃，湿度40％，以log1/R形式显示光谱，每个样品扫描3次，取平均光谱。
②光谱预处理：采用TQ Analyst软件分析图谱。固定光程类型为恒定(Constant)，建立偏最小二乘法(PLS)、主成分回归法(PCR)结合原始光谱、一阶导数及二阶导数光谱定量模型。以校正模型、验证模型的均方差(RMSEC、RMSEV)和相关系数(Rc、Rv)为指标，筛选出最佳定量模型。
③校正集及验证集的划分：将上述多批次不同生产过程发酵虫草菌样品5种核苷类成分含量按照从大到小的顺序排列，确保校正集含量包含验证集含量，按照5:1的比例选取25个校正集，5个验证集。
④建模区间的选取：结合文献及软件推荐模型区间确定光谱分析波数区间为7317～6927.5cm-1、6738.5～6476.2cm-1、5859～5523.4cm-1、4902.49～4817.64cm-1、4740.49～4107.91cm-1。
⑤光谱异常样本的剔除：根据光谱的分布差异计算马氏距离鉴别异常值。
⑥模型验证：选取验证集样品作为外部数据对模型进行验证，以校正模型、验证模型的均方差(RMSEC、RMSEV)和相关系数(Rc、Rv)为指标评价模型。将模型预测值与真实值进行独立样本t检验，评价所建模型的可靠性。
3.根据权利要求2所述的发酵虫草菌粉生产全过程近红外光谱定量模型的建立方法，其特征在于，其中，所述多批次不同生产过程发酵虫草菌样品，包括30批或30批以上的样品。
4.根据权利要求2所述的发酵虫草菌粉生产全过程近红外光谱定量模型的建立方法，其特征在于，其中，所述多批次不同生产过程发酵虫草菌样品，不同过程包括以下操作单元：菌种培养操作单元、菌种传代操作单元、发酵操作单元、滤过操作单元、干燥操作单元、粉碎操作单元、混合操作单元。
5.利用近红外快速检测发酵虫草菌粉生产全过程核苷类成分，将高效液相色谱法-指纹图谱和近红外光谱相融合结合偏最小二乘回归法，建立发酵虫草菌粉生产过程核苷类成分定量分析模型，可同时快速测定发酵过程中多种核苷类成分含量，具体模型建立过程如下：
(1)发酵虫草菌粉过程核苷类成分标准含量的测定
①对照品溶液的制备：分别精密称取尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、鸟苷及腺苷适量溶于10mL容量瓶中，配制成浓度分别为366.00μg/mL、1010.00μg/mL、324.00μg/mL、1217.00μg/mL、1474.00μg/mL的对照品溶液；分别各取1.5mL对照品溶液于10mL容量瓶中，定容至刻度，即得浓度分别为54.90μg/mL，151.50μg/mL，48.60μg/mL，182.55μg/mL，221.10μg/mL的混合对照品溶液。取混合对照品溶液稀释2倍、4倍、8倍、32倍、64倍、100倍、128倍，得到系列浓度混合对照品溶液。
②供试品溶液的制备：取30批不同过程发酵虫草菌粉约1.00g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入超纯水40mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率45kHz)30min，放冷，再称定重量，用超纯水补足减少的重量，摇匀，离心(转速4000r/min，10min)，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，滤液即为供试品溶液。
③建立标准曲线：核苷的色谱分析采用色谱柱ACE Excel 5 SuperC 18，(250mm×4.6mm，5μm)，紫外检测器进行检测，检测波长为260nm，柱温30℃，进样量为10μL，以甲醇和水梯度洗脱，流速为1.0mL·min-1，分析时间为50min。洗脱条件见表1：
表1流动相梯度洗脱条件
在1(1)③色谱条件下分析1(1)①系列浓度混合对照品溶液，得到各浓度下5种核苷类成分色谱峰峰面积，以浓度为横坐标，相应峰面积为纵坐标，建立5种核苷类成分标准曲线。
④色谱分析：将1(1)②制备的供试品溶液按照1(1)③色谱条件进行测定，将得到的5种核苷类成分峰面积代入标准曲线中计算即得核苷类成分的含量。
(2)相似度分析
将1(1)④得到的不同批次、不同过程核苷类成分液相色谱图导入中药指纹图谱相似度评价系统(2004A版)分析不同批次、不同过程核苷类成分的相似度。
(3)近红外定量模型的建立
①过程核苷提取液原始光谱的采集：智能透射检测器附件，波数为4000-12500cm-1，扫描32次，分辨率为8cm-1，温度25℃，湿度40％，以log1/R形式显示光谱，每个样品扫描3次，取平均光谱。
②光谱预处理：采用TQ Analyst软件分析图谱。固定光程类型为恒定(Constant)，建立偏最小二乘法(PLS)、主成分回归法(PCR)结合原始光谱、一阶导数及二阶导数光谱定量模型。以校正模型、验证模型的均方差(RMSEC、RMSEV)和相关系数(Rc、Rv)为指标，筛选出最佳定量模型。
③校正集及验证集的划分：将1(1)④测出的不同批次、不同过程5种核苷类成分含量按照从大到小的顺序排列，确保校正集含量包含验证集含量，按照5:1的比例选取25个校正集，5个验证集。
④建模区间的选取：结合文献及软件推荐模型区间确定光谱分析波数区间为7317～6927.5cm-1、6738.5～6476.2cm-1、5859～5523.4cm-1、4902.49～4817.64cm-1、4740.49～4107.91cm-1。
⑤光谱异常样本的剔除：根据光谱的分布差异计算马氏距离鉴别异常值。
⑥模型验证：选取验证集样品作为外部数据对模型进行验证，以校正模型、验证模型的均方差(RMSEC、RMSEV)和相关系数(Rc、Rv)为指标评价模型。将模型预测值与真实值进行独立样本t检验，评价所建模型的可靠性。
6.按权利要求1(1)测定发酵虫草菌粉全过程核苷类成分含量，其特征在于核苷类成分指尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷组成的含量。
7.按权利要求1(2)分析核苷类成分相似度，其特征在于全过程、不同批次核苷提取液液相色谱的导入。
8.按权利要求1(3)②预处理核苷提取液原始光谱，其特征在于对比分析偏最小二乘法、主成分回归结合一阶导数、二阶导数处理原始光谱，选取偏最小二乘法结合一阶导数处理核苷提取液原始光谱。
9.按权利要求1(3)③选取校正集与验证集，其特征在于校正集与验证集比例为5:1。
10.按按权利要求1(3)④选取建模区间，其特征在于波数区间为7317～6927.5cm-1、6738.5～6476.2cm-1、5859～5523.4cm-1、4902.49～4817.64cm-1、4740.49～4107.91cm-1。
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