CN109668858A - 基于近红外光谱检测发酵过程生物量和组分浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于工业过程检测领域，涉及一种基于近红外光谱检测发酵过程生物量和组分浓度的方法。本发明是利用配有浸入式探头的近红外光谱分析仪，搭建生物发酵过程在线监测实验平台，从而实时原位测量生物发酵过程发酵液近红外光谱数据。首先对光谱数据和参考数据进行采集，其次对测量到的近红外光谱数据进行预处理操作，然后对数据划分校正集和验证集进行建立联合标定模型，并使用网格搜索和交叉验证的方法对模型参数进行选择，最后，通过外部实验验证建立模型的有效性，由此定量分析发酵过程生物量、底物浓度和产物浓度。本发明能够达到自动快速检测生物量、底物浓度和产物浓度，便于实际工业应用和推广。
Description
技术领域
本发明属于工业过程检测领域，涉及一种基于近红外光谱检测发酵过程生物量和组分浓度的方法，具体是基于近红外光谱分析技术实时测量发酵过程生物量、底物浓度和产物浓度的方法。
背景技术
发酵工程广泛用于生物质转化、食品、医药等生产行业。发酵过程的参数主要分为化学参数(如PH值、溶解氧浓度等)、物理参数(如发酵温度、搅拌转速等)和生物参数(基质浓度、生物质浓度和产物浓度等)。工程应用中主要通过调控这些参数对发酵过程进行控制和优化。目前仅对一些化学参数和物理参数可以实现在线测量，然而对于生物参数仍主要采用离线的测量技术，耗时较长，难以进行实时检测。
近红外光谱技术具有对不同物质组分的敏感性较好、非侵入检测等优点，近年来越来越多地用于发酵过程物质含量的检测，相对于离线检测的技术有较好的实时性。近红外的谱段范围为780nm～2500nm，可以反映分子中含氢基团(如C-H，N-H，O-H)振动的合频与倍频特征信息，有机分子一般都包含这些含氢基团，如蛋白质、糖和油脂等。发酵过程中的微生物、底物和产物普遍包含这些含氢集团，因此近红外光谱技术适合分析生物发酵过程中与含氢基团有直接或间接关系的成分。
目前，虽然近红外光谱技术开始应用于对发酵过程部分物质浓度的检测，但由于测量误差等影响，造成测量精度并不高，并且不能同时检测发酵过程生物量、底物浓度和产物浓度。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：针对生物发酵过程中生物量、底物浓度和产物浓度的同时测量问题，传统的方法是利用近红外光谱技术对不同组分分别建立检测模型，而对多组分建立联合标定模型进行检测有更好的准确性和便捷性。
为解决上述问题，本发明系统地提出如何对生物发酵过程生物量、底物浓度和产物浓度测量的技术方法，并以乙醇发酵过程为例解释说明。
本发明是利用配有浸入式探头的近红外光谱分析仪，搭建生物发酵过程在线监测实验平台，从而实时原位测量生物发酵过程发酵液近红外光谱数据，并传输给计算机，根据建立的联合标定模型对生物发酵过程的生物量、底物浓度和产物浓度进行预测。首先需要对光谱数据和参考数据进行采集，其次对测量的近红外光谱数据进行预处理操作，然后对数据划分建模集和验证集进行建立联合标定模型，并使用网格搜索和交叉验证的方法对模型参数进行选择，最后，通过外部实验验证建立模型的有效性，由此定量分析发酵过程生物量、底物浓度和产物浓度。本发明的流程如图1所示。
本发明的技术方案如下：
一种基于近红外光谱检测发酵过程生物量和组分浓度的方法，步骤如下：
(1)光谱数据和参考数据的采集
在发酵过程中，利用近红外光谱分析仪实时采集发酵液的近红外光谱数据，选用光学性质稳定的介质作为参考背景，每次采样检测的近红外光谱数据由仪器测量的表观光谱与参考背景的差谱得到，通过背景差减的方式去噪，以消除噪声引起的测量误差。
在对发酵液测量近红外光谱数据的同时，对发酵液进行取样，对发酵液样品进行离心或稀释的预处理操作，然后测量生物量、底物浓度和产物浓度作为参考数据。
(2)光谱数据的预处理
生物反应器的结构差异(例如搅拌桨和挡板的尺寸和方向等)会改变培养基中的生理特性，从而影响光谱吸收特性。随着发酵过程的进行，生物量的增加不仅会影响发酵罐中各物质成分含量，还会影响罐中颜色、密度和粘度等物理特性，通气、搅拌速度、温度、PH等都会造成一定程度的光谱变化。为了消除环境条件变化对光谱测量带来的扰动，在使用化学计量学方法进行建模之前，需要对近红外光谱的数据进行预处理来消除无关信息和噪声。
将步骤(1)采集到的近红外光谱数据写成光谱数据矩阵，矩阵的行为测试样品的光谱，矩阵的列为是近红外光的某一波长下不同样品的吸收值，采用一阶导数的光谱预处理方法消除环境条件变化对光谱测量带来的扰动：
其中：xi,1st经过导数处理的光谱数据第i波数下的吸光度；xi表示光谱数据第i波数下的吸光度；xi+g表示光谱数据第i+g波数下的吸光度；g表示窗口宽度。
(3)建立联合标定模型
由于近红外光谱中包含的吸收峰为中红外光谱区基频吸收峰的倍频和组合频吸收峰，强度相对较弱，并且常为多种组分共同影响的重叠宽峰、肩峰等。在对物质含量预测前，需要建立定量分析校正模型，如果同时对生物量、底物浓度和产物浓度进行同时测量且提高预测精度，需要建立联合标定模型。根据同步采集的近红外光谱数据及生物量、底物浓度和产物浓度参考数据，多输出最小二乘支持向量机回归(MLS-SVR)作为最小二乘支持向量机回归的改进方法，可以有效的建立联合标定模型。
将步骤(2)中预处理后的近红外光谱数据可以按照一定比例分为建模集和验证集，并将参考数据的最大值和最小值归入建模集中，用于建立模型，以保证用于建立联合标定模型的参考数据范围大于验证集，从而确保以模型内插方式实现可靠的预测。
联合标定模型的输入为近红外光谱向量x∈Rp，Rp为p维向量空间，代表x为一个p维向量，多变量输出为生物参数y∈Rm，Rm为m维向量空间，代表y为一个m维向量；p为光谱变量个数，m为需要监测的生物参数的个数，生物参数包括生物量、底物浓度和产物浓度；设建模集为{(x1,y1),(x2,y2),...,(xn,yn)}，n为采集的光谱数据个数，即参考数据个数，令wi＝w0+vi，其中w0表示各个生物参数的共性信息，vi表示各个生物参数的特性信息，wi表示各个生物参数的共性和特性信息，相应的优化问题为：
其中E＝(e1,e2,...,em)，em为第m个生物参数的松弛因子，B＝(bT；...；bT)∈Rn×m，Rn×m代表B为一个n×m维的矩阵，b为常值偏差向量，V＝(v1,v2,...,vm)，γ和λ为惩罚参数，W＝(w0+v1,w0+v2,...,w0+vm)，为低维空间到高维空间的映射函数，trace表示矩阵的迹。
取式(2)对应的Lagrange函数：
其中表示拉格朗日函数。
由KKT(Karush-Kuhn-Tucher)条件建立线性方程组进行求解：
其中A＝(α1,α2,...,αm)∈Rm×n为拉格朗日乘子矩阵，αi表示拉格朗日乘子，表示式(2)所示拉格朗日函数，1n表示n维单位向量。记上述方程组的解为和b*，表示拉格朗日乘子。
根据优化目标的解，确定多输出的拟合函数y(x)：
其中表示x从低维空间到高维空间的映射，W*表示 表示拉格朗日乘子，k(x,xj)表示核函数，表示将矩阵复制1×m块。k(·,·)为核函数，选取为径向基核函数：
k(x,xj)＝exp(-p||x-xj||2) (6)
其中核函数参数p和惩罚参数γ、λ采用网格搜索、交叉验证方法确定。网格搜索寻优即让p、γ和λ遍历在一定范围内划分的等步长网格，网格中每一组p、γ和λ都是一组潜在解，遍历网格所有的参数进行交叉验证，计算交叉验证均方根误差RMSECV：
其中yi是第i个数据样本的测量值，是第i个数据样本的预测值，取最小的交叉验证均方根误差对应的参数作为模型参数。
为了评估联合标定模型对生物量、底物浓度和产物浓度数据的预测性能，采用预测集均方根误差RMSEP和范围误差比RPD作为评价指标，计算公式分别为：
其中yi是第i个数据样本的测量值，是第i个数据样本的预测值，是待预测数据样本均值，n为采集的光谱数据个数。其中SD为建模集样本分布标准差，反映样本分布范围，RMSEP用于评价预测值和参考值的偏差，偏差越小说明模型预测准确性越高。通过外部实验验证模型的有效性，如果满足RPD>5的定量标准，模型可应用于可以接受的质量预测；如果RPD>10，则模型可以应用于实时过程控制和优化。
(4)在线监测生物量、底物浓度和产物浓度
近红外光谱分析仪与监控计算机连接，在发酵过程中近红外光谱分析仪实时采集发酵液在不同波长下的吸光度值(即近红外光谱)，并传输到监控计算机中，利用步骤(3)中的联合标定模型实现对生物量、底物浓度和产物浓度实时检测及显示结果。
本发明的有益效果：本发明能实时检测生物发酵过程中生物量、底物浓度和产物浓度；考虑发酵过程中主要组分之间的关联性，通过建立一个联合标定模型同时检测多种物质浓度，相对于对各组分分别建立一个独立标定模型有更好的简便性和准确性。该方法可操作性强，对经验技术要求较低，能够达到自动快速检测生物量、底物浓度和产物浓度，便于实际工业应用和推广。
附图说明
图1是本发明的建模流程图；
图2是本发明的基于近红外光谱的乙醇发酵过程实验平台；
图3是乙醇发酵过程近红外光谱图。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例为对批次乙醇发酵过程的生物量、葡萄糖浓度和乙醇浓度的在线检测。建立的乙醇发酵过程在线监测实验平台如图2所示。发酵罐容量为2.5L，罐中的温度、PH值、搅拌桨转速等由发酵控制设备进行控制。利用铂金温度计PT100测量发酵罐中温度，通过加热装置及循环冷却水进行控温。通过NaOH溶液调节发酵液酸碱度，由PH计实时检测发酵罐内PH值；通过电动搅拌桨对发酵罐中溶液进行均匀搅拌；采用傅里叶近红外光谱分析仪以及配套的浸入式漫反射探头采集近红外光谱，再将数据传输至监控计算机。本实施例所用的菌种为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae 4126)菌种。发酵实验前需要对种子进行培养和活化，然后接种到发酵培养基中。
采用本发明的具体实施如下：
第一步：光谱数据和参考数据的采集
近红外光谱分析仪采集的近红外光谱数据为表观光谱信息，样品的表观光谱中包含真实光谱信息和噪声。由于每次实验的仪器和实验条件可能存在着不同，会在测量近红外光谱数据产生较多噪声。为了消除工况产生的噪声，选用光学性质稳定的空气作为参考背景，每次采样检测的近红外光谱数据由仪器测量的表观光谱与测量的空气的近红外光谱的差谱得到。
采用傅里叶近红外光谱分析仪以及配套的浸入式漫反射探头采集近红外光谱，光谱采集设置：测量波数范围为4000cm-1-12000cm-1，仪器分辨率为16cm-1，光谱扫描次数为64次，检测器增益为237.84，采集近红外光谱以空气为参考背景。采用离线检测方法检测参考数据，其中，采用液相色谱仪测量发酵液葡萄糖浓度，采用气相色谱仪测量发酵液的乙醇浓度，采用酶标仪测量发酵液的生物量(采用OD表示)。
第二步：光谱数据的预处理
通常采集到的近红外光谱数据可以写成光谱数据矩阵，矩阵中的每一行都是一条测试样品的光谱，矩阵的每一列都是近红外光的某一波长下不同样品的吸收值。图3示例给出了对其中一个批次乙醇发酵过程采集的近红外光谱吸光度数据，图中最明显的变化为基线漂移，造成基线漂移是由于发酵过程的物理特性变化(例如气泡)使光源散射。为了消除环境条件变化对光谱测量带来的扰动，采用了一阶导数的光谱预处理方法：
其中：xi,1st经过导数处理的光谱数据第i波数下的吸光度；xi表示光谱数据第i波数下的吸光度；xi+g表示光谱数据第i+g波数下的吸光度；g表示窗口宽度。利用经过一阶导数的光谱数据建立定量标定模型，用于消除基线和背景漂移对光谱造成的影响，增强光谱的差异，从而可以提高检测精度。
第三步：建立联合标定模型
实施例中按照3:1的比例分为建模集和验证集，将离线检测参考数据的最大值和最小值归入建模集中，用于建立模型，以保证用于建立光谱标定模型的参考数据范围大于验证集，从而确保以模型内插方式实现可靠的预测。
一般发酵过程生物量、底物浓度和产物浓度存在相互关联性，因此采用MLS-SVR方法建立联合标定模型。联合标定模型的输入为近红外光谱向量x∈Rp，Rp为p维向量空间，代表x为一个p维向量，多变量输出为生物参数y∈Rm，Rm为m维向量空间，代表y为一个m维向量，p为光谱变量个数，m为需要监测的生物参数的个数，生物参数包括生物量、底物浓度和产物浓度；设建模集为{(x1,y1),(x2,y2),...,(xn,yn)}，n为采集的光谱数据个数，即参考数据个数，令wi＝w0+vi，其中w0表示各个生物参数的共性信息，vi表示各个生物参数的特性信息，wi表示各个生物参数的共性和特性信息，相应的优化问题为：
其中E＝(e1,e2,...,em)，em为第m个生物参数的松弛因子，B＝(bT；...；bT)∈Rn×m，Rn×m代表B为一个n×m维的矩阵，b为常值偏差向量，V＝(v1,v2,...,vm)，γ和λ为惩罚参数，W＝(w0+v1,w0+v2,...,w0+vm)，为低维空间到高维空间的映射函数，trace表示矩阵的迹。
取式(11)对应的Lagrange函数：
其中表示拉格朗日函数。
由KKT(Karush-Kuhn-Tucher)条件建立线性方程组进行求解：
其中A＝(α1,α2,...,αm)∈Rm×n为拉格朗日乘子矩阵，αi表示拉格朗日乘子，1n表示n维单位向量。记上述方程组的解为和b*，表示拉格朗日乘子。
根据优化目标的解，确定多输出的拟合函数y(x)：
其中表示x从低维空间到高维空间的映射，W*表示 表示拉格朗日乘子，k(x,xj)表示核函数，表示将矩阵复制1×m块。k(·,·)为核函数，选取为径向基核函数：
k(x,xj)＝exp(-p||x-xj||2) (15)
其中核函数参数p和惩罚参数γ、λ采用网格搜索、交叉验证方法确定。网格搜索寻优即让p、γ和λ遍历在一定范围内划分的等步长网格，网格中每一组p、γ和λ都是一组潜在解，遍历网格所有的参数进行交叉验证，计算交叉验证均方根误差RMSECV：
其中yi是第i个数据样本的测量值，是第i个数据样本的预测值，取最小的交叉验证均方根误差对应的参数作为模型参数。
为了评估联合标定模型对生物量、底物浓度和产物浓度数据的预测性能，采用预测集均方根误差RMSEP和范围误差比RPD作为评价指标，计算公式分别为：
其中yi是第i个数据样本的测量值，是第i个数据样本的预测值，是待预测数据样本均值，n为采集的光谱数据个数。其中SD为建模集样本分布标准差，反映样本分布范围，RMSEP用于评价预测值和参考值的偏差，偏差越小说明模型预测准确性越高。通过外部实验验证模型的有效性，如果满足RPD>5的定量标准，模型可应用于可以接受的质量预测；如果RPD>10，则模型可以应用于实时过程控制和优化。
第四步：测量生物量、葡萄糖浓度和乙醇浓度
根据MLS-SVR建立的联合标定模型，对生物量、底物浓度和产物浓度实时检测及显示结果。基于近红外光谱技术建立的在线监测联合标定模型可以对葡萄糖浓度、生物量和乙醇浓度进行实时监测，定时1min给出一次测量结果，然而离线检测方法需要取样，并且使用多个仪器对三种生物参数分别进行测量，耗时约30min～1h。
Claims (1)
1.基于近红外光谱检测发酵过程生物量和组分浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤，
第一步：光谱数据和参考数据的采集
采用傅里叶近红外光谱分析仪以及配套的浸入式漫反射探头采集近红外光谱，光谱采集设置：测量波数范围为4000cm-1-12000cm-1，仪器分辨率为16cm-1，光谱扫描次数为64次，检测器增益为237.84，采集近红外光谱以空气为参考背景；采用离线检测方法检测参考数据，其中，采用液相色谱仪测量发酵液葡萄糖浓度，采用气相色谱仪测量发酵液的乙醇浓度，采用酶标仪测量发酵液的生物量；
第二步：光谱数据的预处理
通常采集到的近红外光谱数据可以写成光谱数据矩阵，矩阵中的每一行都是一条测试样品的光谱，矩阵的每一列都是近红外光的某一波长下不同样品的吸收值；为了消除环境条件变化对光谱测量带来的扰动，采用了一阶导数的光谱预处理方法：
其中：xi,1st经过导数处理的光谱数据第i波数下的吸光度；xi表示光谱数据第i波数下的吸光度；xi+g表示光谱数据第i+g波数下的吸光度；g表示窗口宽度；利用经过一阶导数的光谱数据建立定量标定模型，用于消除基线和背景漂移对光谱造成的影响，增强光谱的差异，从而可以提高检测精度；
第三步：建立联合标定模型
建模集和验证集，将离线检测参考数据的最大值和最小值归入建模集中，用于建立模型，以保证用于建立光谱标定模型的参考数据范围大于验证集，从而确保以模型内插方式实现可靠的预测；采用MLS-SVR方法建立联合标定模型；联合标定模型的输入为近红外光谱向量x，多变量输出为生物参数y，其中，x∈Rp、y∈Rm，p为光谱变量个数，m为需要监测的生物参数的个数，生物参数包括生物量、底物浓度和产物浓度；设建模集为{(x1,y1),(x2,y2),...,(xn,yn)}，n为采集的光谱数据个数，即参考数据个数；令wi＝w0+vi，其中w0表示各个生物参数的共性信息，vi表示各个生物参数的个性信息，wi表示各个生物参数的共性和特性信息，相应的优化问题为：
其中E＝(e1,e2,...,em)，em为待优化的第m个生物参数的松弛因子，B＝(bT；...；bT)∈Rn×m，b为常值偏差向量，V＝(v1,v2,...,vm)，γ和λ为惩罚参数，为低维空间到高维空间的映射函数，W＝(w0+v1,w0+v2,...,w0+vm)，trace表示矩阵的迹；
取式(2)对应的Lagrange函数：
其中表示拉格朗日函数；
由KKT(Karush-Kuhn-Tucher)条件建立线性方程组进行求解：
其中A＝(α1,α2,...,αm)∈Rm×n为拉格朗日乘子矩阵，αi表示拉格朗日乘子，L表示式(2)所示拉格朗日函数，1n表示n维单位向量；记上述方程组的解为和b*，表示拉格朗日乘子；
根据wi的优化目标的解，确定多输出的拟合函数y(x)：
其中表示x从低维空间到高维空间的映射，W*表示 表示拉格朗日乘子，k(x,xj)表示核函数，repmat表示将矩阵复制1×m块；
k(·,·)为核函数，选取为径向基核函数：
k(x,xj)＝exp(-p||x-xj||2) (6)
其中核函数参数p和惩罚参数γ、λ采用网格搜索、交叉验证方法确定；网格搜索寻优即让p、γ和λ遍历在一定范围内划分的等步长网格，网格中每一组p、γ和λ都是一组潜在解，遍历网格所有的参数进行交叉验证，计算交叉验证均方根误差RMSECV：
其中yi是第i个数据样本的测量值，是第i个数据样本的预测值，取最小的交叉验证均方根误差对应的参数作为模型参数；
为了评估联合标定模型对生物量、底物浓度和产物浓度数据的预测性能，采用预测集均方根误差RMSEP、相关系数R2和范围误差比RPD作为评价指标，计算公式分别为：
其中yi是第i个数据样本的测量值，是第i个数据样本的预测值，是待预测数据样本均值，n为采集的光谱数据个数；其中SD为建模集样本分布标准差，反映样本分布范围，RMSEP用于评价预测值和参考值的偏差，偏差越小说明模型预测准确性越高；通过外部实验验证模型的有效性，如果满足RPD>5的定量标准，模型可应用于接受的质量预测；如果RPD>10，则模型应用于实时过程控制和优化；
第四步：测量生物量、葡萄糖浓度和乙醇浓度
根据MLS-SVR建立的联合标定模型，对生物量、底物浓度和产物浓度实时检测及显示结果；基于近红外光谱技术建立的在线监测联合标定模型对葡萄糖浓度、生物量和乙醇浓度进行实时监测，定时1min给出一次测量结果，然而离线检测方法需要取样，并且使用多个仪器对三种生物参数分别进行测量，耗时约30min～1h。
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