CN114585883A - 流体中蛋白质浓度的测定 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了系统和方法，其允许用户通过使用斜率光谱法测定第一浓度、通过选择性吸附消耗流体的表达蛋白、和使用斜率光谱法测定第二浓度来快速测定滴定度并去除保持步骤。此外，本公开的系统和方法允许用户放弃使用生物分析仪或HPLC。

Description

流体中蛋白质浓度的测定
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年10月1日提交的美国临时申请序列号No.62/909,004的优先权权益。该申请通过引用整体明确并入本文并用于所有目的。
技术领域
本公开总体上涉及一种测定流体中表达蛋白浓度的方法。
背景技术
制造过程的监测和控制在所有工业中都很重要，尤其是在生物技术过程的情况下。生物技术过程用于生产各种产品，例如蛋白质、细胞、组织、碳水化合物和疫苗。制造过程的监测可以通过原位分析、离线监测或在线监测来完成。生物制造过程是耗时的，通常以批处理模式进行。每个单独色谱步骤的连续处理还没有在商业过程中完成，更不用说整个制造过程。这在一定程度上是因为需要在过程的每个阶段采集样品，然后进行分析，以确保过程的效率。这些样品的分析将提供信息，使得能够在制造过程的每个步骤之间调整过程参数。
目前，除了UV吸收传感器(在280nm处)之外，控制生物制品制造过程所需的许多传感器都是可用且精确的。即使在非常小的路径长度下，UV传感器在过程期间也变得饱和，从而为过程操作员提供很少或不提供信息。这意味着通过UV吸收曲线做出的过程决策只能在传感器的线性区域进行。
为了避免这个问题，可以使用光的替代波长(例如300nm)，并且在所有情况下，在分子的过程开发阶段花费大量的努力来表征该过程，以使得在较大范围下280nm处的读数不是必要的。这不保证在过程期间不会出现问题，且事实上A300值不一定代表A280值。由于批量成本达数百万美元，由传感器故障而造成的批量损失是不可接受的风险。在过程开发过程中，需要在过程的每个阶段采集30+个点的样品，并对其进行UV吸收等分析。在开发过程的每个阶段，对于单个分子，该步骤需要重复多次。
纯化开发占生物分子开发总R&D成本的1-3％。对于排名前12位的公司来说，这相当于每种药物的开发成本约为7.5亿至22亿美元。减少过程开发时间，即使是很短的时间，对工业来说也是有很大价值的。在整个过程中，在280nm处直接测量蛋白质浓度可以显著减少采样时间，允许连续处理方案，并可能指示过程所有阶段期间的产品纯度。
因此，需要一种方法来简单地测定化合物的复杂混合物中特定物质的存在且无需纯化、改性或稀释。
光谱分析是一个广泛的领域，其中任何相(气体、液体、固体)的材料的组成和特性都由与能量相互作用(例如，吸收、发光或发射)产生的电磁波光谱来测定。光谱化学分析(称为光谱学)的一个方面，涉及辐射能与感兴趣的材料的相互作用。用于研究这样的物质-辐射相互作用的特定方法定义了光谱学的许多子领域。一个特别的领域被称为吸收光谱学，其中测量液体物质的光学吸收光谱。吸收光谱是作为光波长的函数的光衰减(由于吸收)的分布。在简单的分光光度计中，待研究的样品物质被放置在透明容器(也称为比色皿或样品池)中。已知波长λ，(即紫外线、红外线、可见光等)和强度I的电磁辐射(光)入射到比色皿的一侧。测量出射光强度的检测器放置在比色皿的另一侧。光穿过样品传播的长度是距离d。大多数标准UV/可见分光光度计使用标准比色皿，比色皿具有1cm的路径长度，且通常容纳50至2000μL样品。对于由具有浓度c的单个均质物质组成的样品，透过样品的光将遵循称为比尔定律的关系：A＝∈cl，其中A是吸光度(也称为样品在波长λ下的光密度(OD)，其中OD＝透射光与入射光之比的负对数)，∈是吸收率或消光系数(在给定波长下通常为常数)，c是样品浓度，且l是光通过样品的路径长度。
溶液的光谱测量广泛用于各个领域。通常溶液中感兴趣的化合物是高度浓缩的。例如，当测量吸光度时，某些生物样品(例如蛋白质、DNA或RNA)的分离浓度通常超出分光光度计的线性范围。因此，通常需要稀释样品来测量落入仪器线性范围内的吸光度。经常需要对样品进行多次稀释，这导致稀释误差以及用于任何下游应用的稀释的样品的移除。因此，需要在不知道可能浓度的情况下采集现有样品，并在不稀释的情况下测量这些样品的吸收。
多个样品比色皿可以解决重复采样的问题，但是，该方法仍然需要制备多个样品比色皿，并从进一步使用中移除一些样品。此外，在大多数分光光度计中，路径长度l是固定的。
解决稀释问题的另一种方法是在进行吸光度测量时减少路径长度。通过减少测量路径长度，可以减少样品体积。路径长度的减少也与路径长度的减少成比例地减少了测量的吸收。例如，路径长度从标准的1cm减少至0.2mm的路径长度提供了虚拟的50倍稀释。因此，如果穿过样品的光的路径长度减少，可以在仪器的线性范围内测量更高度浓缩样品的吸光度。有几家生产比色皿的公司，它们在保持标准比色皿1cm2尺寸的同时，通过减少内部体积来减少通过样品的路径长度。通过减少内部体积，需要更少的样品，并且可以在大多数标准分光光度计的线性范围内测量更浓缩的样品。虽然这些小体积比色皿使得能够测量更高浓缩的样品，但是这些比色皿内的路径长度仍然是固定的。如果样品浓度超出分光光度计的线性范围，可能仍需要稀释样品，或者可能需要另一个路径长度更短的比色皿，才能进行精确的吸光度读数。
现有技术还描述了能够测量小体积样品的吸光度值的分光光度计和流动池。这些装置被设计为利用短路径长度测量吸光度，因此只需要少量样品。授予Gross等人的美国专利No.4,643,580公开了一种光度计头，其中具有用于接收和支撑小测试体积的外壳。光纤发射器和接收器在外壳内隔开，以便液滴可以悬浮在两端之间。
授予McMillan的美国专利No.4,910,402公开了一种装置，其中注射器将液体滴入两根固定光纤之间的间隙，来自LED激光器的IR脉冲通过液滴输入。输出信号被分析为辐射与液滴液体的相互作用的函数。
授予Robertson的美国专利No.6,628,382描述了一种用于对极小的液体样品进行分光光度测量的装置，其中液滴通过表面张力保持在两个相对的表面之间。这两个表面可以彼此相对移动，以保持样品中的表面张力，以使得可以通过光纤进行分光光度测量。
授予Leveille等人的美国专利No.6,747,740描述了一种光度测量流动池，该流动池具有可以被向下调整至小于0.1mm的测量路径长度。该流动池含有阶梯式光学元件，该元件包括可以制成各种长度的杆部分。测量路径长度可以通过将一个特定长度的阶梯式元件替换为另一个不同长度的阶梯式元件来调节。
授予Dussault等人的美国专利No.6,188,474描述了一种用于光谱学的样品池，该样品池包括两个可调节板，这两个可调节板使得用户能够在两种或更多种配置之间改变样品池流动路径的横截面几何形状。
授予Stellman等人的美国专利No.6,091,490描述了一种耦合到玻璃毛细管的光纤移液管，用于利用长路径长度毛细管光谱学进行小体积样品的分光光度测量。
转让给Molecular Devices Corporation的一系列专利描述了一种能够测定微量滴定板中多种液体样品的吸收测量值的酶标仪。基于每个孔中样品溶液的量和每个孔中溶液弯月面的曲率，微量滴定板的每个孔可以提供不同的光路长度。
虽然这些仪器中的一些为高浓度低体积样品的测量提供了改变路径长度的能力，但是其中描述的应用主要涉及单路径长度和单波长测量。一些仪器提供有限数量的路径长度，并且所有仪器都被限制为路径长度大于0.2mm。此外，现有技术的装置和方法没有提供扩大分光光度计的动态范围，因此没有必要将样品的浓度调整至落在仪器的吸光度检测的线性范围内。就现有技术教导较短的路径长度来测定非常浓缩的样品或低体积样品的浓度而言，这些装置的重点是在单个路径长度上获取单个吸光度读数。因此，现有技术参考文献要求非常精确地知道路径长度，以便能够进行精确的浓度测量。
本公开提供了提供可变路径长度分光光度计的装置和方法，该分光光度计通过软件控制响应于实时测量动态地调整参数，以扩大常规分光光度计的动态范围，以使得几乎任何浓度的样品都可以在不稀释或不浓缩原始样品的情况下进行测量。此外，本公开的某些方法不要求已知路径长度来测定样品的浓度。从本文提供的公开内容的描述中，本公开的这一目的和优点以及其他目的和优点以及另外的发明特征将变得显而易见。
为了处理流体，可能希望在处理步骤之前和之后测定蛋白质的浓度。快速且有效的测定步骤有助于用户避免长时间的等待、减慢生产。当前的方法，例如HPLC，需要柱分离步骤和分析员的计算，以及输入信息(例如合适的校准曲线和其他样品信息)。类似地，生物分析仪可能会使用耗时的酶促反应。
发明内容
本公开提供了允许用户快速测定滴定度并去除保持步骤的系统和方法。此外，本公开的系统和方法允许用户放弃使用生物分析仪或HPLC(其通常是这些测量所需要的)。因此，之前需要3-10分钟的过程现在可以在2-3分钟内完成。
这些系统和方法通过提供用于样品光谱测量的交互式可变路径长度装置和方法，克服了现有技术的缺点和不足。通过提供约0.2μm及以上的路径长度，本公开的仪器可用于测量非常浓缩的样品的浓度。这样小的路径长度允许测量太浓缩而不能用常规分光光度计测量的样品。此外，本公开的仪器和方法可以在两个或三个不同的路径长度区域中提供光谱扫描。这使用户能够在单次运行中测定样品中的最佳吸光度峰。该方法的好处是，它可以通过比较多个路径长度和多个波长下的吸光度峰数据来提供关于优化浓度测量的信息，因为这些值可能会因样品中的含量而不同。使用标准固定路径长度比色皿的仪器不能同时显示所有这些数据。可变路径长度仪器可以包括探针头、样品容器、用于使探针头和样品容器相对于彼此移动(例如，样品容器静止而探针移动，或者探针静止而样品容器移动，或者两者都能够移动)的机构、传输光纤、检测器和用于路径长度控制和测量参数的合适软件。
本公开包括测定样品浓度的方法，该方法包括将样品放置在容器中；相对于容器移动探针，以使得探针与容器的底部接触；相对于容器移动探针，以使得探针以预定增量从容器底部移动通过样品，从而获得穿过溶液的预选路径长度；在预定波长下获取吸光度读数；重复相对于样品移动探针并进行测量的步骤；由吸光度和路径长度生成回归直线，从而获得回归直线的斜率；通过将回归直线的斜率除以样品的消光系数来测定样品的浓度。
本公开还包括用于在多个路径长度下测定样品浓度的仪器，该仪器包括：光源，其可操作地连接到探针；样品容器，其可以容纳样品；马达，其可操作地连接到样品容器，以使得样品容器可以相对于探针移动，以提供可变的路径长度；探针，其可以携带电磁辐射，可以通过马达相对于样品容器移动；检测器，其能够检测电磁辐射，被设置成使得检测器基本上垂直于从探针发出的电磁辐射；以及软件，其可以基于检测器在预定路径长度上提供的信息计算样品浓度。
本公开的仪器和方法可以与标准分光光度计结合使用，该分光光度计可以用于提供电磁源和/或用于测量电磁辐射的检测器。以上描述的方面和实施方案。
本公开可涉及通过在流通机构中检测光谱来连续实时监测物质的光谱来测定溶液中物质浓度随时间的变化的方法，该流通机构具有光源、路径长度和检测器，在流通机构中改变路径长度，以使得在不同的路径长度下进行光谱的多次测量，然后比较物质随时间的浓度。通过实时获得浓度信号以及其他过程参数，可以实时测定生物分子质量。本公开提供了在多于一个位置处(包括但不限于在溶液的入口和出口处)监测物质的浓度。可以监测各种物质，包括但不限于表面活性剂、生物分子、蛋白质、细胞和病毒颗粒、小分子、肽或结合蛋白。
本公开可涉及通过连续实时监测物质的光谱来测定溶液中物质浓度随时间的变化的方法，其中物质浓度的变化是由于溶液进行了一个或多个纯化过程，包括但不限于沉淀、过滤、电泳、色谱分离、化学反应及其组合。色谱分离可以是阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、凝胶过滤色谱、疏水相互作用色谱和亲和色谱。
本公开可涉及测定溶液中物质浓度随时间变化的方法，包括通过在流通机构中检测光谱来实时监测物质在离散时间点的紫外光谱，该流通机构包括光源、路径长度和检测器，在流通机构中改变路径长度，以使得在离散时间点在不同的路径长度下进行光谱的多次测量，并比较物质在离散时间点的浓度。本公开涉及通过在流通机构中检测物质的紫外光谱来连续实时监测通过超滤膜的溶液中物质的浓度，来测定超滤中使用的膜的寿命的方法，该流通机构包括光源、路径长度和检测器，在流通机构中改变路径长度，以使得在不同的路径长度下进行光谱的多次测量，并比较物质随时间的浓度。
本公开可涉及通过在流通机构中检测物质的紫外光谱来连续实时监测通过树脂的溶液中物质的浓度，来测定色谱树脂的结合能力的方法，该流通机构包括光源、路径长度和检测器，在流通机构中改变路径长度，以使得在不同的路径长度下进行光谱的多次测量，并比较物质随时间的浓度。
本公开涉及通过在生物制造过程的至少一个阶段过程中原位且实时检测生物分子的紫外光谱来控制生物分子的生物制造过程的方法，其中紫外光谱表征生物分子的指纹，并响应于检测到的紫外光谱产生至少一个控制信号，其中至少一个信号在生物制造过程中启用控制步骤。
本公开涉及对生物分子进行指纹识别的方法，由此可以将生物分子光谱与校准曲线进行比较，以测定生物分子溶液的身份。
本公开可以包括测定流体中的表达蛋白浓度的方法。该方法可以包括使用斜率光谱法测量流体的第一吸收斜率值，并将所述第一吸收斜率值除以蛋白质的已知消光系数，以得到第一浓度。可以消耗流体的表达蛋白(例如，通过选择性吸附、沉淀、过滤等)，并使用斜率光谱法测量所述消耗的流体的第二吸收斜率值，将所述第二吸收斜率值除以所述蛋白质的已知消光系数以得到第二浓度。基于第一浓度和第二浓度，可以计算通过选择性吸附去除的材料的量。计算去除的材料的量可以包括从第一浓度中减去第二浓度，并将差乘以流体的体积。此外，测量流体的第一斜率值和第二斜率值可以在相同的波长下测量。表达蛋白的浓度的计算可以使用表达蛋白的已知消光系数。通过选择性吸附来消耗流体的表达蛋白可以进一步包括使用已经固定在固体支撑物上的靶蛋白的亲和配体。固定的靶蛋白可以是蛋白质A。通过选择性吸附来消耗流体的表达蛋白可以进一步包括使用以下中的一种或多种：树脂、膜、过滤板或填充柱。树脂可以是脱水的。消耗流体的步骤可以不包括在第一次测量和第二次测量之间增加流体体积。消耗流体的步骤可以包括将流体体积增加预定量。该步骤可以是自动化的。在测量前，流体可以被过滤。在测量前，流体可能需要生长期。
本公开可以包括用于测定流体中表达蛋白的消耗水平的系统。该系统可以包括通过选择性吸附来消耗流体的表达蛋白的消耗模块；第一流体采样模块和第二流体采样模块，其位于流体的流动路径中的消耗模块的上游和下游；以及斜率光谱装置，其被配置为接收来自第一流体采样模块和第二流体采样模块的流体，并在多个路径长度下测量来自采样模块的流体的吸光度，并由此测定流体浓度，其中通过从来自第一模块的流体中的表达蛋白的浓度中减去来自第二模块的流体中的表达蛋白的浓度，并将二者之间的差乘以流体的体积，来测定消耗。消耗模块可以包括色谱柱。消耗流体的表达蛋白的方法可以包括以下中的一种或多种：固定的蛋白质A、树脂、膜、过滤板或填充柱。树脂可以是脱水的。斜率光谱装置可以是斜率分光计。
本公开还提供了评估流体中表达蛋白与色谱柱的结合的方法。该方法可以包括：(a)在第一路径长度下获取流体中表达蛋白的第一吸收光谱，(b)以增量改变第一路径长度以提供第二路径长度，并在预定波长处获取第二吸收光谱读数，(c)消耗流体的表达蛋白(例如，通过选择性吸附)，(d)对消耗的流体重复(a)和(b)，(e)由给定波长处的吸光度值生成回归直线，从而获得在表达蛋白消耗之前和之后的流体的回归斜率，(f)从未消耗的流体斜率中减去消耗的流体斜率，以及(g)计算表达蛋白的浓度。表达蛋白的浓度的计算可以使用表达蛋白的已知消光系数。通过选择性吸附来消耗流体的表达蛋白进一步包括使用已经固定在固体支撑物上的靶蛋白的亲和配体。靶蛋白可以是固定的蛋白质A。通过选择性吸附来消耗流体的表达蛋白可以进一步包括使用以下中的一种或多种：树脂、膜、过滤板或填充柱。树脂可以是脱水的。该步骤可以是自动化的。在测量前，流体可以被过滤。在测量前，流体可能需要生长期。
附图说明
图1是可变路径长度装置软件设置的一个可能实施方案的流程图。
图2是可变路径长度仪器软件的数据采集的流程图。
图3A是本发明仪器的一个实施方案的示意图。
图3B是探针头组件的一个实施方案的示意图。
图4是可用作本发明仪器中的样品容器的流通装置的示意图。
具体实施方式
综述
本公开的系统和方法总体上致力于通过使用斜率光谱法来减少测定流体中的表达蛋白所需的时间。斜率光谱法是一种通过测量不同路径长度上的吸光度来测定溶液浓度的方法。
本领域技术人员将理解，使用斜率光谱法测定流体中的表达蛋白涉及与现有的工业标准过程的一些不同。此外，它将大大地减少处理流体所需的时间。
本公开描述了测量生物过程(更具体地是处理步骤)的输入浓度和输出浓度的方法。这些方法可以在处理步骤之前和之后从系统中抽取样品。
由本公开的方法和系统收集的信息可以用于确定生物过程中采取的行动。例如，由于计算的表达蛋白的浓度，生物过程可以被延迟或加速。此外，该信息可以提示生物过程中的故障或错误，导致采取补救措施。确定流体中不存在蛋白质可以触发该过程的完成，最小化缓冲液的使用并节省时间。
用户可以将通过这些方法收集的信息与渗透液的预期输出体积的知识相结合，以测定表达蛋白何时已经从流体中耗尽。此外，用户可以通过用固定的蛋白质A的消耗来测量单克隆抗体。
所述方法可用于评估树脂的结合能力。它们可以进一步用于测定树脂的效率，评估过滤器的筛分性能，或者测定有多少材料停留在过滤器上而不是通过过滤器，从而导致堵塞。
术语“相对于容器移动探针”或“相对于样品移动探针”是指容器或样品相对于探针是移动的。这包括探针移动且容器或样品静止、容器或样品移动且探针静止以及样品或容器移动且探针移动的情况。
术语“获取吸光度读数”是指任何吸光度读数均是由装置或仪器测量的。这包括在单个波长和/或单个路径长度下获取吸光度读数，或者在多个波长(例如在扫描中)和/或多个路径长度下获取读数的情况。
术语“样品”可以包括但不限于化合物、混合物、表面、溶液、乳液、悬浮液、细胞培养物、发酵培养物、细胞、组织、分泌物和提取物。
术语“马达”是可以被控制以提供可变的通过样品的路径长度的任何装置。
术语“选择性吸附”是指从流体中消耗产物的基于亲和的方法。选择性吸附可以由例如亲和结合剂(例如肽配体、抗体或抗体的功能片段)、毒素、适体、药理学激动剂或药理学拮抗剂或其他合适试剂介导。在一些情况下，亲和结合剂结合到固体支撑物(如树脂或颗粒)上；在其他情况下，亲和结合剂是未结合的，在这种情况下，可以通过例如经由亲和结合剂上官能团的反应将结合的亲和结合剂共价连接到底物上，和/或通过使用第二种结合剂(例如抗体)来实现消耗。其他合适的亲和结合剂和消耗方法对本领域技术人员来说将是是显而易见的。
斜率光谱法
本公开涉及通过采用允许使用可变路径长度来多次测定感兴趣的参数的方法来测定溶液的分光光度特性的装置和方法。例如，在测定溶液中化合物的浓度时，本公开提供了用于测定溶液在不同路径长度下的吸光度的方法和装置。不同路径长度下的吸光度值然后可用于计算溶液中化合物的浓度。本公开的装置和方法对于测定高浓缩的样品的浓度特别有用，不需要借助于对样品进行一次或多次稀释。由于本公开的装置可以实现的小路径长度，该属性是可能的。通过提供约0.2μm及更长的路径长度，本公开的仪器可用于测量非常浓缩的样品的浓度。本公开的仪器可以提供约0.5μm至约15cm或约1μm至约50mm之间的路径长度。该装置和方法还通过提供更大的路径长度来提供极稀溶液浓度的测量。本质上，本公开的装置和方法通过允许宽范围的路径长度测量溶液的吸光度值，来扩大标准分光光度计的动态范围。这种宽动态范围使用户能够在不改变(稀释或浓缩)样品的情况下测定样品的浓度。虽然本公开的方法和装置的实施方案用于测定特定样品或样品组的吸光度、消光系数或浓度，但是本公开的装置和方法也可以用于不同的模式，例如散射、发光、光致发光、光致发光偏振、时间分辨光致发光、光致发光寿命和化学发光以及其他模式。本公开的装置和方法可用于在给定时间测定一个或多个样品的光学值。本公开考虑使用单个样品形式(例如比色皿或任何样品容器)以及多个样品形式(例如微量滴定板和多个比色皿或多个样品排列)。
本公开的可变路径长度装置可以包括探针头、样品容器、马达、传输光纤、检测器、单向滑动机构和用于路径长度控制和测量参数的合适的软件。
探针头
在本公开中，探针头是将光传输至样品的光传输装置。探针头可以是单个光传输装置，例如与一个或多个电磁源接口的光纤电缆，以允许光穿过样品。可选地，探针头可以容纳在探针头组件中，该探针头组件可以包括光传输装置、外壳、末端终端以及其他光学部件和涂层。光传输装置可以是熔融石英、玻璃、塑料或任何适用于电磁源和检测器波长范围的可透射材料。光传输装置可以由单根纤维或多根纤维组成，并且这些纤维可以根据仪器的用途具有不同的直径。纤维可以具有几乎任何直径，但在大多数实施方案中，纤维直径在约0.005mm至约20.0mm的范围内。在一个实施方案中，光传输装置是具有约0.1mm至约1.0mm的直径的单根光纤。探针头可选地利用外壳来容纳光传输装置。该外壳主要用于屏蔽光传输装置，并且可以由金属、塑料、陶瓷或与其用途相容的任何其他材料制成。探针头可以可选地包括末端终端，例如连接器、套圈或有助于机械互连的任何东西。终端可以被抛光、切割、成型或以与设备用途相容的任何方式操作。本公开的仪器包括带有附加光学部件(例如透镜或滤光器)的探针头。探针头可以包括光纤尖端末端上的涂层，以用作过滤器、pH指示剂、催化剂或密封机构。探针头可以是仪器和/或探针组件装置的永久部分，或者可替换地，探针头可以是可拆卸的，以使得它可以从探针头组件移除。作为仪器的永久部分，探针头是光传输装置的组成部分。在一个实施方案中，探针头是单根光纤，其一端连接到光源，且另一端浸入样品中。可选地，探针头可以是可拆卸的，并且在这样的实施方案中，探针头可以通过多种机构与光传输装置分离。在一个实施方案中，探针头通过Touhey Borst适配器连接到光传输装置，以使得在使用之后，探针头可以被移除并用另一个探针头替换。可拆卸探针头的长度足以穿透样品并连接到光传输组件上。在可拆卸探针头的实施方案中，探针头的长度为至少约20mm。根据它的用途，探针头在移除后可以简单地扔掉。一次性探针头避免了与清洁探针头相关的问题，并避免了从一个样品到另一个样品的潜在污染。本公开的仪器包括可以与单个光传输装置相关联的多个探针头。可选地，多个光传输装置可以与每个探针头相关联。
路径长度是探针头的末端和容纳液体的样品容器的内表面之间的距离，内表面是基本上垂直于探针头的容器表面。既限定了路径长度又与液体接触的探针头的端面基本上平行于邻近检测器的样品容器的内表面。在一个实施方案中，探针头位于容纳样品的样品容器上方并对齐，以使得离开探针头的光将穿过样品容器到达检测器(或检测光导)上。探针头能够传输仪器范围内的波长。
光源
电磁辐射源以预定的方式提供宽光谱范围或窄波段的光。光源可以包括弧光灯、白炽灯、荧光灯、电致发光器件、激光器、激光二极管和发光二极管以及其他光源。在一个实施方案中，辐射源是氙弧灯或钨丝灯。在本公开的实施方案中，光源通过光导耦合到探针头。可选地，光源可以是发光二极管，该发光二极管可以直接安装在探针头上。
样品容器
该容器必须能够容纳液体并允许光穿过它到达检测光导或检测器上。该容器还将具有开口，以允许探针头传送光，以穿透液体。该容器应该能够传输仪器范围内，通常地约200-1100nm的波长。对于紫外线应用，可能需要石英容器，但通常由环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚苯乙烯(PS)或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制成的塑料容器就足够了。根据应用和可用于分析的样品量，本公开使用的样品容器可以具有不同的尺寸和形状。本公开的样品容器可以是允许获取吸光度值的任何东西。这样的容器包括静止的样品容器(例如比色皿或微量滴定板)或如在流通装置(图4)中的移动的样品。静止的样品中的样品尺寸可以为0.1μL至数升之间。容器的形状是面向检测器的一侧基本上是平的，并且基本上平行于检测器的表面。检测器可以位于与容器成微小角度处，以减少由于穿过样品的电磁辐射的背反射的噪声。样品容器可以具有多个孔，例如在微量滴定板中。样品容器可以涂覆有光学材料或化学物质或生化物质(例如抗体)。样品容器可以任选地通过仪器加热或冷却，并且可以保持在可以是无菌或非无菌的密封区域中。样品可以被保持在由平台支撑的样品架中。样品可以包括化合物、混合物、表面、溶液、乳液、悬浮液、细胞培养物、发酵培养物、细胞、组织、分泌物、提取物等。样品的分析可以包括测量这样的组合物中光敏分析物的存在、浓度或物理特性。样品可以指单个孔或比色皿或样品架的内容物，或者可以指微量滴定板内的多个样品。在一些实施方案中，平台可以在仪器外部。
马达
马达驱动探针头进出容器。马达以精确的步进驱动探针头，以改变通过样品的路径长度。根据装置配置，路径长度变化可以从0mm到更大。马达允许探针在样品内移动，以将探针头放置在精确的预定的路径长度上。可以与本公开的仪器一起使用的马达包括步进马达、伺服马达、压电马达、电马达和磁马达或者可以被控制以提供通过样品的可变路径长度的任何装置。在本公开的仪器的实施方案中，马达驱动样品容器放置在其上的平台，使得探针头相对于样品容器移动。在该配置中，平台和探针以0.2μm至1cm范围的增量相对于彼此移动。在一个实施方案中，增量范围在约1μm至约50μm之间。平台与探针的相对运动精确至0.2μm或更小的分辨率。在本公开的仪器的实施方案中，探针和平台的相对运动的分辨率在约0.5μm至约0.01μm之间。
单向滑动机构
单向滑动机构是一种系统，其设计成允许探针头的端部和样品容器的“底部”(垂直于探针头)之间的物理接触，以便建立一个“零路径长度”位置，该位置是一个近似的零基准，所有其他路径长度都可以从该零基准参考。在本公开的一个实施方案中，单向滑动机构确保探针头与样品容器表面物理接触，从而保证探针头处于“零路径长度”位置。应在不对样品容器或探针头造成损坏的情况下实现物理接触。在一个实施方案中，一旦实现物理接触，通过允许/要求探针头的任一样品容器在一个方向上的线性位移来实现所述位置。这允许在设置零路径长度位置的方向上移动，与在秤上使用去皮功能非常相似。当探针头和容器表面分离时，该运动被限制以减少或消除反冲或回弹(recoil)。具有这些特征的装置被称为单向滑动机构。单向滑动机构有许多实施方案。
在一个实施方案中，单向滑动机构包括称为Touhy Borst适配器(TBA)的模拟塑料耦合装置，该耦合装置含有中心具有孔的硅橡胶垫圈材料或类似的柔性垫圈材料，该垫圈材料由两个螺纹塑料部件容纳，这两个螺纹塑料部件在拧在一起时压缩内部垫圈，从而减小内部孔的直径，在孔内的任何东西周围产生密封。密封和压缩的量可以通过改变TBA的两个螺纹部件之间的螺纹接合长度来控制。在一个实施方案中，探针头通过TBA垫圈中的孔插入，然后拧紧TBA以压缩探针头周围的TBA垫圈。调节螺纹，使得探针头和TBA垫圈之间的摩擦力超过探针头的重量，从而当垂直保持时，不允许探针头从TBA中掉出，但不能太紧以至于探针头不能在垫圈内滑动。该摩擦相互作用导致单向滑动位移，从而允许建立零路径长度位置。
有通过其可以实现这一点的其他方法和机构。在一个实施方案中，封闭在两个块之间的具有孔、线性狭缝或两个正交狭缝的薄膜含有稍大于探针头的孔，以使得探针头可以插入块中，并且膜产生允许在一个方向上位移的摩擦力。
在另一个实施方案中，用于探针头或样品容器的耦合机构可以包括弹簧加载的锥形滑动联轴器，当在一个方向上施加力时，该弹簧加载的锥形滑动联轴器释放探针头或样品容器，但当力被释放时，该弹簧加载的锥形滑动联轴器夹得更紧，类似于弹簧加载的压缩环。
在另一个实施方案中，用于样品容器的探针头的耦合机构可以包括弹簧加载的棘轮机构，当在一个方向上移动时，该弹簧加载的棘轮机构移动锁定在适当位置的带齿的滑块，但将需要释放按钮以允许卸载或以相反方向运动。
在单向滑动机构的每个实施方案中，零路径长度位置是被动设置的，这意味着除了驱动系统的运动以实现物理接触条件外，用户不需要与装置交互。存在需要用户干预的其他实施方案，其可用于本公开的仪器的长路径长度和流动型式。在一个实施方案中，探针头耦合机构具有滑动联轴器。在实现物理接触并发生位移后，用户将通过翼形螺钉、定位螺钉、紧固夹具(tightening a collect)、机械夹具、磁性夹具或锁定探针头、探针头耦合机构、样品容器或样品容器保持装置的位置的其他装置来设置位移。
检测器
检测器包括能够将来自检测到的光的能量转换成可由装置处理的信号的任何机构。合适的检测器包括光电倍增管、光电二极管、雪崩光电二极管、电荷耦合器件(CCD)和增强CCD等。根据检测器、光源和检验模式，这样的检测器可以用于多种检测模式，包括但不限于离散、模拟、点或成像模式。检测器可用于测量吸光度、光致发光和散射。本公开的装置可以使用一个或多个检测器，尽管在一个实施方案中使用了单个检测器。在一个实施方案中，光电倍增管用作检测器。本公开的仪器的检测器可以集成到仪器中，或者可以通过将检测器可操作地连接至光传输装置来远程定位，该光传输装置可以将电磁辐射穿过样品传输至检测器。光传输装置可以是熔融石英、玻璃、塑料或任何适用于电磁源和检测器波长范围的可透射材料。光传输装置可以由单根纤维或多根纤维组成，并且这些纤维可以根据仪器的用途具有不同的直径。纤维可以具有几乎任何直径，但是在大多数实施方案中，纤维直径在约0.005mm至约20.0mm的范围内。
本公开的仪器的一个实施方案具有系统定向的光学部件，以使得探针头在“顶部”，且检测器在“底部”(图3A)。在该垂直方向上，样品容器在检测器上方，且探针头可以上下移动，进出样品容器，以使得来自探针头的光穿过样品容器内的样品，并打在下方的检测器上。其他的方向是可能的，例如在流动池系统中，其中检测器和探针头可以处于基本水平的方向(图4)，并且样品在检测器和探针之间流动。不管探针和检测器的绝对空间方向，探针头和检测器的表面应该基本上相互垂直。
软件
控制软件将基于各种标准(例如但不限于波长、路径长度、数据采集模式(对于波长/路径长度两者)、动力学、触发/目标、离散路径长度/波段)来调节装置行为以提供不同光谱区域的不同动态范围/分辨率、创建abs/路径长度曲线的横截面图、回归算法和斜率确定、从斜率值确定浓度、消光系数确定、基线校正和散射校正。图1是本公开的软件方案的实施方案的流程图。该软件被配置为提供扫描选项或离散波长读取选项、信号平均时间、波长间隔、扫描选项或离散路径长度读取选项、数据处理选项(例如基线校正、散射校正、实时波长横截面)、阈值选项(例如波长、路径长度、吸光度、斜率、截距、决定系数等)、动力学/连续测量选项。图2A和2B是可变路径长度仪器软件的数据采集的一个实施方案的流程图。图2是可以集成到数据采集程序中的实时数据收集的数据采集的一个实施方案的流程图。
图3A是本公开的仪器的一个实施方案的示意图。马达(1)驱动样品容器(3)所在的平台(4)。纤维探针头(2)相对于马达固定，以使得随着平台上下移动，探针到样品容器的距离分别地增加或减少。平台下方是检测器(5)，一旦探针头穿过样品，检测器(5)就接收来自探针头的电磁辐射。图3B是探针头组件的一个实施方案的示意图。
图4是可用作本公开的仪器中的样品容器的流通装置的示意图。流通装置包括允许样品溶液流入和流出流动池装置的流动池主体(8)。流动池主体(8)具有至少一个窗口(7)，该窗口(7)对通常地200-1100nm的电磁源范围内的电磁辐射是透明的。窗口可以由各种材料制成，但是对于紫外线应用，可能需要石英、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚苯乙烯(PS)或聚甲基丙烯酸甲酯PMMA。该窗口可以具有不同的尺寸和形状，只要电磁辐射可以穿过该窗口并照射检测器(5)。流动池主体还包括探针头可以穿过的端口。该端口用动态密封件(9)密封，以使得探针头可以穿过该端口，而样品溶液不从流通装置中泄漏。这样的密封件包括可从犹他州西盐湖城的Parker Hannifin公司EPS部门获得的FlexiSeal Rod和Piston Seals。在该图中，有一条用于样品溶液流入入口端口并流出出口端口的单个路径。另外的实施方案可以包括多个路径和多个入口端口和出口端口。在图4的流动池装置的实施方案中，探针头基本上垂直于样品溶液的流动并基本上垂直于检测器移动。
在本公开的方法的一个实施方案中，可以在没有精确地知道路径长度距离是多少的情况下，在多个路径长度下进行多个吸光度测量。现有技术充满了教导如何精确地测定吸光度读数中的路径长度的方法，以便可以精确地测定样品的浓度。在本公开的该实施方案中，在不同路径长度下进行的多个吸光度测量使得能够基于仪器由吸光度和路径长度信息计算回归直线的能力精确地计算浓度。回归直线的斜率可以用来计算样品的浓度。由于用于计算回归直线的软件可以被编程为从提供的数据集中选择最精确的直线，因此不需要精确地知道每个路径长度。在这些方法中获取的数据点的数量倾向于“消除”路径长度或吸光度读数中的任何干扰，以使得可以获得具有非常高的R2值的回归直线。在本公开的方法中，已经实现了至少0.99999的R2值。显然，R2值越高，斜率越精确，这导致样品浓度的高度精确的测定。0至0.99999之间的任何R2值在本公开的仪器和方法中都是可实现的，然而在本公开的方法的一些实施方案中，R2值超过0.95000，且在一些实施方案中，R2将超过0.99500。在本公开的实施方案中，R2值在约0.95000和约0.99999之间。其他的实施方案包括在约0.99500和约0.99999之间以及约0.99990和约0.99999之间的R2值。虽然R2是线性回归的拟合优度的度量，但是在本公开的方法中可以使用度量拟合优度的任何其他数学表达式。
本公开的仪器和方法允许用户通过选择预定的参数(例如吸光度)来优化数据收集。例如，用户可以定义吸光度为1.0，并使仪器搜索在其下样品吸光度为1.0的其他参数(例如波长或路径长度)。该功能使用户能够定义实验参数，而不必进行多次稀释或不断地手动更改仪器参数。本公开的软件还允许用户定义预期的R2值，以便可以在数据采集之前定义结果的精确水平。
本公开的仪器和方法允许收集各种数据集，包括三维数据集，该三维数据集包括吸光度、路径长度和波长的测量。该软件使用户能够生成这些数据集的三维图形。此外，本公开的仪器和方法提供了实时数据的收集。
本公开的仪器和方法使得能够计算特定样品在不同波长下的消光系数。消光系数，也称为吸收率，是在给定波长下每单位路径长度和浓度下溶液的吸光度。如果已知给定样品在第一波长处的消光系数(∈1)，则可以计算第二波长处的消光系数(∈2)。这是通过测量第一波长处的吸光度/路径长度(A/l)1与第二波长处的吸光度/路径长度(A/l)2的比率，并将该比率等于消光系数的比率来实现的：(A/l)1/(A/l)2＝∈1/∈2。
只要可以分离识别样品中的多种组分的波长，本公开的仪器和方法还使得用户能够同时测量复杂混合物中的组分。例如，常规的分光光度计不能在单个实验中不能测定有两种组分的样品的浓度，其中A高度浓缩并主要在300nm处吸收，而B相当稀并在600nm处吸收。在常规的分光光度计中，归因于组分B的吸光度测量将妨碍组分A的吸光度测量，因为A的浓度高到足以淹没检测器。将需要稀释原始样品来测定组分A，这样做时，组分B将不会产生足够的信号以允许测量它的浓度。在常规的分光光度计中，组分A和组分B的浓度不可以同时测量。在本公开中，可以改变路径长度，以便可以一起测定组分A和组分B的浓度。显然，只要存在唯一识别样品中组分的峰，本公开的方法就可以测量非常复杂的样品的组分的浓度。此外，因为该仪器能够实时产生数据，所以可以监测样品中组分的相互作用，以产生动力学数据或需要时间过程的任何数据。
本领域技术人员可以理解，许多吸附方法可以包括向系统中添加流体，例如通过使用润湿的色谱介质。附加流体可能使根据本公开方法的第二吸附方法的解释复杂化，因为最终用户可能不能区分由于感兴趣的物质或产品的消耗而导致的斜率或绝对吸光度的降低与由于感兴趣的产品的稀释而导致的降低。在某些实施方案中，这是通过减少或消除在消耗流体的表达蛋白的流体消耗的步骤过程中可以加入到系统中的任何体积的流体来解决的。消耗流体的步骤可以不包括在第一次测量和第二次测量之间增加流体体积。可以使用脱水树脂。该脱水树脂可以包括蛋白质A。在其他实施方案中，消耗流体的步骤可以包括将流体体积增加预定量。

Claims (26)

1.一种测定流体中表达蛋白的浓度的方法，其包括：
使用斜率光谱法测量流体的第一吸收斜率值，并将所述第一吸收斜率值除以蛋白质的已知消光系数，以得到第一浓度；
通过选择性吸附来消耗流体的表达蛋白；
使用斜率光谱法测量消耗的流体的第二吸收斜率值，并将所述第二吸收斜率值除以蛋白质的已知消光系数，以得到第二浓度；以及
基于所述第一浓度和第二浓度，计算通过选择性吸附去除的材料的量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中计算去除的材料的量的步骤包括从第一浓度中减去第二浓度，并将差乘以流体的体积。
3.根据权利要求1所述的方法，其中测量流体的第一斜率值和第二斜率值在相同的波长下测量。
4.根据权利要求1所述的方法，其中使用表达蛋白的已知消光系数计算表达蛋白的浓度。
5.根据权利要求1所述的方法，其中通过选择性吸附来消耗流体的表达蛋白进一步包括使用已经固定在固体支撑物上的靶蛋白的亲和配体。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述靶蛋白是固定的蛋白质A。
7.根据权利要求1所述的方法，其中通过选择性吸附来消耗流体的表达蛋白进一步包括使用以下中的一种或多种：树脂、膜、过滤板或填充柱。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述树脂是脱水的。
9.根据权利要求7所述的方法，其中消耗流体的步骤不包括在第一次测量和第二次测量之间增加流体体积。
10.根据权利要求7所述的方法，其中消耗流体的步骤包括将流体体积增加预定量。
11.根据权利要求1所述的方法，其中步骤是自动化的。
12.根据权利要求1所述的方法，其中在测量之前过滤流体。
13.根据权利要求1所述的方法，其中在测量之前流体需要生长期。
14.一种用于测定流体中表达蛋白的消耗水平的系统，其包括：
消耗模块，其通过选择性吸附来消耗流体的表达蛋白；
第一流体采样模块和第二流体采样模块，其位于流体的流动路径中的所述消耗模块的上游和下游；以及
斜率光谱装置，其被配置为接收来自所述第一流体采样模块和第二流体采样模块的流体，并在多个路径长度下测量来自采样模块的流体的吸光度，并由此测定流体浓度，
其中通过从来自第一模块的流体中的表达蛋白的浓度中减去来自第二模块的流体中的表达蛋白的浓度，并将二者之间的差乘以流体的体积，来测定消耗。
15.根据权利要求12所述的系统，其中所述消耗模块包括色谱柱。
16.根据权利要求14所述的系统，其中消耗流体的表达蛋白的方法包括以下中的一种或多种：固定的蛋白质A、树脂、膜、过滤板或填充柱。
17.根据权利要求14所述的系统，其中所述斜率光谱装置是斜率分光计。
18.一种评估流体中表达蛋白与色谱柱的结合的方法，其包括以下步骤：
(a)在第一路径长度下获取流体中表达蛋白的第一吸收光谱；
(b)以增量改变第一路径长度以提供第二路径长度，并在预定波长处获取第二吸收光谱读数；
(c)通过选择性吸附消耗流体的表达蛋白；
(d)对消耗的流体重复(a)和(b)；
(e)由给定波长处的吸光度值生成回归直线，从而获得在表达蛋白消耗之前和之后的流体的回归斜率；
(f)从未消耗的流体斜率中减去消耗的流体斜率；以及
(g)通过将(f)中计算的量除以消耗前流体的斜率来计算表达蛋白的消耗的百分比。
19.根据权利要求18所述的方法，其中使用表达蛋白的已知消光系数计算表达蛋白的浓度。
20.根据权利要求18所述的方法，其中通过选择性吸附来消耗流体的表达蛋白进一步包括使用已经固定在固体支撑物上的靶蛋白的亲和配体。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述靶蛋白是固定的蛋白质A。
22.根据权利要求18所述的方法，其中通过选择性吸附来消耗流体的表达蛋白进一步包括使用以下中的一种或多种：树脂、膜、过滤板或填充柱。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述树脂是脱水的。
24.根据权利要求18所述的方法，其中步骤是自动化的。
25.根据权利要求18所述的方法，其中在测量之前过滤流体。
26.根据权利要求18所述的方法，其中在测量之前流体需要生长期。
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