KR20220066161A - 유체의 단백질 농도 측정 - Google Patents

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리플리겐 코포레이션
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Abstract

본 개시 내용은 기울기 분광법을 사용하여 제 1 농도를 결정하고, 선택적 흡착에 의해 발현된 단백질의 유체를 고갈시키고, 기울기 분광법을 사용하여 제 2 농도를 결정함으로써 사용자가 역가를 신속하게 결정하고 유지 단계를 제거할 수 있게 하는 시스템 및 방법을 제공한다. 또한, 본 개시 내용의 시스템 및 방법은 사용자가 생물 분석기 또는 HPLC의 사용을 필요치 않도록 만든다.

Description

유체의 단백질 농도 측정
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 10월 1일에 출원된 미국 임시출원특허 제62/909,004호에 우선권을 주장한다. 해당 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로서 본원에 명시적으로 포함된다는 것을 밝혀둔다.
본 개시 내용은 일반적으로 유체에서 발현된 단백질의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
제조 공정의 모니터링 및 제어는 모든 산업에서 중요하지만 생명공학(biotechnology) 공정의 경우에 특히 중요하다. 생명공학 공정은 단백질, 세포, 조직, 탄수화물 및 백신과 같은 다양한 제품을 생산하는 데 사용된다. 제조 공정의 모니터링은 현장 분석, 오프라인 모니터링 또는 온라인 모니터링에 의해 수행될 수 있다. 바이오제조 공정은 시간이 많이 소요되며 일반적으로 일괄(batch) 모드에서 수행된다. 전체 제조 공정은 물론, 각 개별 크로마토그래피(chromatography) 단계에 대한 연속 처리는 아직 상업적 공정에서 완성되지 않았다. 이는 부분적으로 프로세스의 각 단계에서 샘플을 채취한 다음 프로세스의 효율성을 보장하기 위해 분석을 수행해야 하기 때문이다. 이러한 샘플의 분석은 제조 공정의 각 단계 사이에 공정 매개변수의 조정을 가능하게 하는 정보를 제공할 수 있다.
현재, 바이오 제조 공정을 제어하는 데 필요한 많은 센서들은 UV 흡광도 센서(280nm)를 제외하고 사용 가능하고 정확하다. 매우 작은 경로 길이에서도 UV 센서는 공정 중에 포화 상태가 되어 공정 운영자에게 정보를 거의 또는 전혀 제공하지 않는다. 즉, UV 흡광도 추적(UV absorbance trace)에 의해 수행되는 공정 결정은 센서의 선형 영역에서만 수행될 수 있다.
이 문제를 피하기 위해 300nm와 같은 빛의 대리 파장을 사용할 수 있으며, 그리고 모든 경우에 280nm의 측정값이 더 큰 스케일로 필요하지 않도록 이 과정을 특성화하기 위해 분자의 공정 개발 단계에서 많은 노력을 기울인다. 그렇다고 해서 공정 중에 문제가 발생하지 않을 수 있다는 보장은 없으며, 실제로 A300 값이 반드시 A280 값을 나타내는 것은 아니다. 수백만 달러의 배치(batch) 비용으로 인해 불량 센서로 인한 배치 손실은 용납할 수 없는 위험이다. 공정 개발 중에 샘플은 프로세스의 각 단계에서 30개 이상의 지점에서 채취하여 무엇보다도 UV 흡광도를 분석해야 한다. 이 단계는 개발 프로세스의 각 단계에서 단일 분자에 대해 여러 번 반복되어야 한다.
정제 개발(Purification development)은 바이오 분자 개발의 총 연구개발 비용의 1-3%를 차지한다. 상위 12개 회사의 경우 약 7억 5천만 달러 내지 약 22억 달러에 이르는 개발 비용에 해당한다. 공정 개발 일정을 조금이라도 줄이는 것은 업계에 큰 가치가 될 것이다. 공정 전반에 걸쳐 280nm에서 단백질 농도를 직접 측정하면 샘플링 시간을 크게 단축할 수 있고 연속적인 공정 체계를 허용하며 공정의 모든 단계에서 잠재적으로 제품 순도를 나타낼 수 있다.
따라서, 정제, 변형 또는 희석 없이 화합물의 복합 혼합물에서 특정 물질의 존재를 간단하게 측정하는 방법이 필요하다.
분광 분석(Spectroscopic analysis)은 에너지와의 상호 작용(예: 흡수, 발광 또는 방출)에서 발생하는 전자기 스펙트럼으로부터 모든 상, 가스, 액체, 고체에서의 물질의 구성 및 특성이 결정되는 광범위한 분야이다. 분광학으로 알려진 분광화학 분석의 한 측면은 복사 에너지와 관심 물질의 상호 작용을 포함한다. 이러한 물질-방사선 상호작용을 연구하는 데 사용되는 특정 방법은 분광학의 많은 하위 분야를 정의한다. 특히 한 분야는 액체 물질의 광학 흡수 스펙트럼을 측정하는 흡수 분광학(absorption spectroscopy)으로 알려져 있다. 흡수 스펙트럼은 빛 파장의 함수로서의 빛 감쇠(흡광도로 인한)의 분포이다. 간단한 분광 광도계에서 연구할 샘플 물질을 큐벳 또는 샘플 셀이라고도 하는 투명한 용기에 넣는다. 알려진 파장 l, 즉 자외선, 적외선, 가시광선 등 및 강도 I의 전자기 복사(빛)는 큐벳의 한쪽에 입사한다. 방출되는 빛의 강도를 측정하는 디텍터는 큐벳의 반대쪽에 배치된다. 빛이 샘플을 통해 전파하는 길이는 거리는 d이다. 대부분의 표준 UV/가시광선 분광 광도계는 경로 길이가 1cm이고 일반적으로 50~2000pL의 샘플을 보유할 수 있는 표준 큐벳을 사용한다. 농도가 c인 단일 균질 물질로 구성된 샘플의 경우 샘플을 통해 투과된 빛은 비어의 법칙(Beer's Law)으로 알려진 "A=clε의"관계를 따르며, A는 흡광도(파장 I에서 샘플의 광학 밀도(OD, optical density)라고도 하며, OD는 입사광에 대한 투과광의 비율의 -log임)이고, ε는 흡광(absorptivity) 또는 소광(extinction) 계수이고(일반적으로 주어진 파장에서 일정함), c는 샘플의 농도이고 l은 샘플을 통과하는 빛의 경로 길이이다.
용액의 분광 측정(Spectroscopic measurements)은 다양한 분야에서 널리 사용된다. 종종 용액에 대한 관심의 화합물에 고도로 집중되어 있다. 예를 들어, 단백질, DNA 또는 RNA와 같은 특정 생물학적 샘플은 흡광도를 측정할 때 분광 광도계의 선형 범위를 벗어나는 농도로 분리되는 경우가 종종 존재한다. 따라서 장치의 선형 범위에 속하는 흡광도 값을 측정하려면 샘플을 희석해야 하는 경우가 많다. 샘플을 여러 번 희석해야 하는 경우가 많으며, 이는 희석 오류와 모든 다운스트림 어플리케이션에 대해 희석된 샘플을 제거하는 결과를 초래한다. 따라서 가능한 농도에 대한 지식 없이 기존 샘플을 채취하여 희석하지 않고 이러한 샘플의 흡수를 측정하는 것이 바람직하다.
다수의 샘플 큐벳을 사용하면 반복적인 샘플링 문제를 해결할 수 있지만 이 접근 방식은 여전히 여러 샘플 큐벳을 준비해야 하며 추가 사용에서 일부 샘플의 사용을 제외해야 한다. 또한 대부분의 분광 광도계에서 경로 길이 l은 고정되어 있다.
희석 문제에 대한 또 다른 접근법은 흡광도 측정을 할 때 경로 길이를 줄이는 것이다. 측정 경로 길이를 줄임으로써 샘플 부피를 줄일 수 있다. 경로 길이를 줄이면, 측정된 흡수율도 경로 길이 감소에 비례하여 감소한다. 예를 들어, 경로 길이를 표준 1cm에서 0.2mm로 줄이면 사실상 50배의 희석 효과를 얻을 수 있다. 따라서 시료를 통과하는 빛의 경로 길이를 줄이면 장치의 선형 범위 내에서 고농축 샘플의 흡광도를 측정할 수 있다. 표준 큐벳의 1cm2 치수를 유지하면서 내부 부피를 줄여 샘플을 통과하는 경로 길이를 줄이는 큐벳을 제조하는 여러 회사가 존재한다. 내부 부피를 줄임으로써 샘플이 덜 필요하며 대부분의 표준 분광 광도계의 선형 범위 내에서 보다 농축된 샘플을 측정할 수 있게된다. 이러한 저용량 큐벳을 사용하면 더 농축된 샘플을 측정할 수 있지만 이러한 큐벳 내의 경로 길이는 여전히 고정되어 있다. 샘플 농도가 분광 광도계의 선형 범위를 벗어나더라도 정확한 흡광도 판독을 수행하기 전에 샘플을 희석하거나 경로 길이가 훨씬 더 작은 큐벳이 필요할 수 있다.
선행 기술은 또한 낮은 부피 샘플의 흡광도 값을 측정할 수 있는 분광 광도계 및 유동 셀을 설명한다. 이 장비들은 흡광도를 측정하기 위해 짧은 경로 길이를 활용하도록 설계되어 소량의 샘플만 필요하다. 미국 특허 제4,643,580호(Gross et al)는 작은 시험 용량을 수용하고 지지하기 위한 하우징이 있는 광도계 헤드(광도계 헤드)를 개시한다. 광섬유 송신기와 수신기는 하우징 내에 이격되어 있어 방울이 양 끝 사이에 매달릴 수 있다.
미국 특허 제4,910,402호(McMillan)는 주사기가 두 개의 고정된 섬유 사이의 틈으로 액체를 떨어뜨리고 LED 레이저로부터 IR 펄스가 방울을 통해 공급되는 장치를 개시한다. 출력 신호는 방울의 액체와 방사선의 상호 작용의 함수로로 분석된다.
미국 특허 제6,628,382호(Robertson)는 표면 장력에 의해 두 개의 대향 표면 사이에 방울이 유지되는 극도로 작은 액체 샘플에 대한 분광 광도 측정을 수행하는 장치를 개시한다. 두 표면은 광섬유에 의한 분광 광도 측정이 이루어질 수 있도록 샘플의 표면 장력을 유지하기 위해 서로에 대해 이동할 수 있다.
미국 특허 제6,747,740호(Leveille et al)는 0.1mm 미만으로 조정할 수 있는 측정 경로 길이를 갖는 광도 측정 플로우 셀(photometric measurement flow cell )을 개시한다. 플로우 셀에는 다양한 길이로 만들 수 있는 스템 부분을 포함하는 계단식 광학 요소를 포함한다. 측정 경로 길이는 특정 길이의 계단식 요소들 중 하나를 다른 길이의 다른 계단형 요소로 교체하여 조정할 수 있다.
미국 특허 제6,188,474호(Dussault et al)는 사용자가 두 개 이상의 구성 사이에서 샘플 셀 흐름 경로의 단면 형상을 변경할 수 있도록 하는 두 개의 조정 가능한 플레이트를 포함하는 분광학에 사용하기 위한 샘플 셀을 설명하다.
미국 특허 제6,091,490호(Stellman et al)는 긴 경로 길이 모세관 분광법(capillary spectroscopy)을 사용하여 소량 샘플의 분광 광도 측정을 위해 유리 모세관에 결합된 광섬유 피펫을 개시한다.
Molecular Devices Corporation이 출원한 일련의 특허들은, 미세정량(microtiter) 플레이트에서 여러 액체 샘플의 흡수 측정을 결정할 수 있는 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)를 개시한다. 미세정량 플레이트(microtiter plate)의 웰은 각각의 웰에 있는 샘플 용액의 양과 각각의 웰에 있는 용액의 메니스커스 곡률(curvature of the meniscus)에 따라 다른 광 경로 길이를 제공할 수 있다.
이들 장치들 중 일부는 고농축 저용량의 샘플의 측정을 위해 경로 길이를 변화시키는 기능을 제공하지만, 여기에 설명된 어플리케이션들은 주로 단일 경로 길이 및 단일 파장 측정에 관련된다. 몇몇 장치는 제한된 수의 경로 길이를 제공하고, 모두 0.2mm보다 큰 경로 길이로 제한된다. 더불어, 종래 기술의 장치 및 방법은 분광 광도계의 동적 범위를 확장하는 것을 제공하지 않으므로 장치의 흡광도 검출의 선형 범위 내에 떨어지도록 샘플의 농도를 조정할 필요가 없다. 종래 기술이 매우 고농축의 샘플 또는 저용량의 샘플의 농도를 결정하기 위해 더 짧은 경로 길이를 교시하는 한, 이러한 장비의 초점은 단일 경로 길이에서 단일 흡광도 판독값을 취하는 것이다. 이와 같은 종래 기술에서 참조는 정확한 농도 측정이 이루어질 수 있도록 경로 길이를 매우 정확하게 알아야 한다.
본 개시 내용은 소프트웨어 제어를 통해 실시간 측정에 응답하여 파라미터를 동적으로 조정하여 거의 모든 농도의 샘플을 원래의 샘플의 희석이나 농축 없이 측정될 수 있도록 기존의 분광 광도계의 동적 범위를 확장하는 가변 경로 길이 분광 광도계를 제공하는 장치 및 방법을 제공한다. 또한, 본 개시 내용의 특정 방법들은 샘플의 농도를 결정하기 위해 경로 길이를 알 필요가 없다. 본 개시의 이러한 목적 및 이점, 뿐만 아니라 추가적인 본 발명의 특징은 본 명세서에 제공된 설명으로부터 명백할 것이다.
유체를 처리하기 위해, 처리 단계 전후에 단백질의 농도를 결정하는 것이 바람직할 수 있다. 사용자가 이 결정 단계를 빠르고 효율적으로 수행하면 대기 시간이 길어져 생산 속도가 느려지는 것을 방지할 수 있다. HPLC와 같은 현재 방법에서는 컬럼 분리 단계(column separation step)와 분석자의 계산이 필요하며, 적절한 보정 곡선(calibration curve) 및 기타 샘플 정보와 같은 정보를 입력해야 한다. 유사하게, 생물 분석기(bioanalyzer)는 시간이 소모되는 효소 반응을 사용할 수 있다.
본 개시 내용은 사용자가 신속하게 역가(titer)를 결정하고 보류 단계를 제거할 수 있게 하는 시스템 및 방법을 제공하다. 또한, 본 개시 내용의 시스템 및 방법은 사용자가 이러한 측정을 위해 종종 요구되는 생체분석기 또는 HPLC의 사용을 제외할 수 있게 한다. 따라서 이전에는 3-10분이 걸렸던 프로세스를 이제 2-3분 만에 수행할 수 있게된다.
이들 시스템 및 방법은 샘플의 분광 측정을 위한 상호 작용적인 가변 경로 길이 장치 및 방법을 제공함으로써 선행 기술의 단점 및 결점을 극복한다. 본 개시 내용의 장치는 약 0.2μm 이상의 경로 길이를 제공함으로써 매우 농축된 샘플의 농도를 측정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 작은 경로 길이는 기존 분광 광도계로 측정할 수 없을 정도로 농축된 샘플의 측정도 허용한다. 더욱이, 본 개시 내용의 장치 및 방법은 2개 또는 3개의 상이한 경로 길이 구역에서 스펙트럼 스캔(spectrum scans)을 제공할 수 있다. 이를 통해 사용자는 한 번의 실행으로 샘플에서 최적의 흡광도 피크(absorbance peaks)를 결정할 수 있다. 이 방법의 장점은 여러 경로 길이와 여러 파장에서 흡광도 피크 데이터를 비교하여 농도 측정의 최적화에 대한 정보를 제공할 수 있다는 것이며, 이러한 값들은 샘플의 함량으로 인해 다를 수 있기 때문이다. 표준 고정 경로 길이 큐벳을 사용하는 장치는 이 모든 데이터를 동시에 표시할 수 없다. 가변 경로 길이 장치에는 프로브 팁, 샘플 용기, 프로브 팁 및 샘플 용기를 서로 상대적으로 이동시키는 메커니즘(예: 샘플 용기가 정지되어 있고 프로브가 이동하거나 프로브가 정지되어 있고 샘플 용기가 이동하거나 둘 다 움직일 수 있음), 광섬유, 디텍터, 경로 길이 제어 및 측정 파라미터에 적합한 소프트웨어를 포함할 수 있다.
본 개시 내용에는 샘플을 용기에 놓는 단계; 프로브가 용기의 바닥과 접촉하도록 용기에 대해 프로브를 이동시키는 단계; 프로브가 용액을 통해 미리선택된 경로 길이가 얻어지도록 미리 결정된 증분만큼 샘플을 통해 용기 바닥으로부터 이동하도록 용기에 대해 프로브를 이동시키는 단계; 미리 결정된 파장에서 흡광도 판독값을 얻는 단계; 상기 시료에 대하여 프로브를 이동시켜 측정하는 단계를 반복하는 단계; 흡광도 및 경로 길이로부터 회귀선의 기울기가 얻어지도록 회귀선을 생성하는 단계; 회귀선의 기울기를 시료의 흡광 계수로 나누어 시료의 농도를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 개시 내용은 또한 프로브에 작동 가능하게 연결된 광원을 포함하는 다중 경로 길이에서 샘플의 농도를 결정하기 위한 장치; 샘플을 담을 수 있는 샘플 용기; 샘플 용기가 프로브에 대해 이동되어 가변 경로 길이를 제공할 수 있도록 샘플 용기에 작동 가능하게 연결된 모터; 모터에 의해 샘플 용기에 대해 이동할 수 있는 전자기 방사선을 전달할 수 있는 프로브; 디텍터가 프로브로부터 방출되는 전자기 방사선에 실질적으로 수직하도록 배치된 전자기 방사선을 검출할 수 있는 디텍터; 및 설정된 경로 길이에서 디텍터에 의해 제공된 정보에 기초하여 샘플의 농도를 계산할 수 있는 소프트웨어를 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 기구 및 방법은 전자기 소스 및/또는 위에서 설명된 실시예 및 전자기 방사선 양상을 측정하기 위한 디텍터를 제공하는 데 사용될 수 있는 표준 분광 광도계(standard spectrophotometer )와 함께 사용될 수 있다.
본 발명은 광원, 경로 길이 및 경로 길이가 변경되는 디텍터를 갖는 플로우 스루 메커니즘(flow through mechanism)에서 스펙트럼을 검출함으로써 물질의 스펙트럼을 실시간으로 지속적으로 모니터링함으로써 시간 경과에 따른 용액 내 물질의 농도 변화를 측정하는 방법으로서, 스펙트럼의 다중 측정들(multiple measurements)이 상이한 경로 길이들에서 이루어진 다음 시간 경과에 따른 물질의 농도를 비교할 수 있다. 다른 공정 파라미터들과 함께 실시간으로 농도 신호를 가짐으로써 생체 분자 질량을 실시간으로 확인할 수 있다. 본 개시는 용액의 유입 및 유출을 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 위치에서 물질의 농도를 모니터링하는 것을 제공한다. 계면활성제, 생체분자, 단백질, 세포 및 바이러스 입자, 소분자, 펩티드 또는 복합 단백질을 포함하여 다양한 물질들을 모니터링할 수 있다.
본 개시는 물질의 스펙트럼을 실시간으로 지속적으로 모니터링하여 시간에 따른 용액 내 물질의 농도 변화를 결정하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 물질의 농도 변화는 침전, 여과, 전기영동, 크로마토그래피 분리, 화학 반응 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 국한되지 않는 하나 이상의 정제 공정을 거친 용액으로 인한 것이다. 크로마토그래피 분리는 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피일 수 있다.
본 개시 내용은 광원, 경로 길이 및 경로 길이가 변경되는 디텍터를 포함하는 플로우 스루 메커니즘에서 스펙트럼을 검출함으로써 개별 시점에서 물질의 자외선 스펙트럼을 실시간으로 모니터링하는 것을 포함하는 시간 경과에 따른 용액 내 물질의 농도 변화를 측정하는 방법에 관한 것으로서, 스펙트럼의 다중 측정이 불연속 시점에서 서로 다른 경로 길이에서 이루어지고 불연속 시점에서 물질의 농도를 비교하도록 할 수 있다. 본 발명은 광원, 경로 길이 및 경로 길이가 변경되는 디텍터를 포함하는 플로우 스루 메커니즘에서 물질의 자외선 스펙트럼을 검출하여 한외 여과막(ultrafiltration membrane)을 통과한 용액 내 물질의 농도를 실시간으로 지속적으로 모니터링하여 한외 여과에 사용되는 막의 수명을 결정하는 방법에 관한 것으로서, 스펙트럼의 다중 측정이 서로 다른 경로 길이에서 이루어지고 시간 경과에 따른 물질의 농도를 비교한다.
본 발명은 광원, 경로 길이 및 경로 길이가 변경되는 디텍터를 포함하는 플로우 스루 메커니즘에서 물질의 자외선 스펙트럼을 검출하여 수지를 통과한 용액 내 물질의 농도를 실시간으로 지속적으로 모니터링하여 크로마토그래피 수지의 결합 능력(binding capacity)을 결정하는 방법에 관한 것으로서, 스펙트럼의 다중 측정이 서로 다른 경로 길이에서 이루어지고 시간 경과에 따른 물질의 농도를 비교한다.
본 개시 내용은 자외선 스펙트럼이 생체 분자의 지문을 특징짓고 검출된 자외선 스펙트럼에 반응하여 적어도 하나의 제어 신호를 생성하는 바이오 제조 공정의 적어도 하나의 단계 동안 생체분자의 인시츄 및 실시간 자외선 스펙트럼을 검출함으로써 생체분자에 대한 바이오제조 공정을 제어하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 적어도 하나의 신호는 바이오제조 공정에서 제어 단계를 가능하게 한다.
본 개시 내용은 생체분자를 핑거프린팅하는 방법에 관한 것이고, 이에 의해 생체분자 스펙트럼은 생체분자 용액의 정체를 결정하기 위해 보정 곡선(calibration curve)과 비교될 수 있다.
본 개시 내용은 유체에서 발현된 단백질의 농도를 결정하기 위한 방법을 포함할 수 있다. 본 방법은 기울기 분광법을 사용하여 유체의 제 1 흡수 기울기 값을 측정하고, 상기 제 1 흡수 기울기 값을 알려진 단백질의 흡광 계수로 나누어 제 1 농도를 산출하는 단계를 포함할 수 있다. 유체는 발현된 단백질을 고갈시킬 수 있으며, 경사 분광법을 이용하여 측정된 고갈된 유체의 제 2 흡수 기울기 값을 상기 단백질의 알려진 흡광 계수로 나누어 제 2 농도를 산출할 수 있다. 제 1 및 제 2 농도에 기초하여, 선택적 흡착에 의해 제거된 물질의 양이 계산될 수 있다. 제거된 물질의 양을 계산하는 단계는, 제 1 농도에서 제 2 농도를 빼고 그 차이에 유체의 부피를 곱하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 유체의 제 1 및 제 2 기울기 값을 측정하는 단계는 동일한 파장에서 측정될 수 있다. 발현된 단백질의 농도 계산은 발현된 단백질의 알려진 흡광 계수를 사용할 수 있다. 선택적 흡착에 의해 발현된 단백질의 유체를 고갈시키는 단계는 고체 지지체에 고정화된 표적 단백질에 친화성 리간드(affinity ligand)를 사용하는 단계를 더 포함할 수 있다. 고정화된 표적 단백질은 단백질 A일 수 있다. 선택적 흡착에 의해 발현된 단백질의 유체를 고갈시키는 단계는, 수지, 멤브레인, 필터 플레이트 및 충전 컬럼 중 하나 이상을 사용하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 수지는 탈수될 수 있다. 유체를 고갈시키는 단계는, 제 1 측정치와 제 2 측정치 사이에 유체 체적을 증가시키는 단계를 포함하지 않을 수 있다. 유체를 고갈시키는 단계는 유체 부피를 설정된 양만큼 증가시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 단계들은 자동화될 수 있다. 유체는 측정 전에 여과될 수 있다. 유체는 측정 전에 성장 기간이 필요할 수 있다.
본 개시 내용은 유체에서 발현된 단백질의 고갈 수준(level of depletion)을 결정하기 위한 시스템을 포함할 수 있다. 이 시스템은 선택적 흡착에 의해 발현된 단백질의 유체를 고갈시키기 위한 고갈 모듈과, 유체의 유로에서 상기 고갈 모듈의 상류 및 하류에 위치된 제 1 및 제 2 유체 샘플링 모듈과, 상기 제 1 및 제 2 유체 샘플링 모듈로부터 유체를 전달받고, 다중의 경로 길이에서 상기 샘플링 모듈들로 부터의 유체의 흡광도를 측정하고, 그로부터 유체 농도를 결정하게되는 기울기 분광 장치를 포함하고, 상기 고갈은 상기 제 1 모듈로부터 유체에 발현된 단백질의 농도로부터 상기 제 2 모듈로부터 유체에 발현된 단백질의 농도를 빼고, 그 차이에 유체의 부피를 곱함으로써 측정된다. 고갈 모듈은 크로마토그래피 컬럼을 포함할 수 있다. 발현된 단백질의 유체를 고갈시키는 방법은 고정된 단백질 A, 수지, 막, 필터 플레이트, 및 충전 컬럼 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 수지는 탈수될 수 있다. 기울기 분광 장치는 기울기 분광기일 수 있다.
본 개시 내용은 또한 유체에서 크로마토그래피 컬럼에 대한 발현된 단백질의 결합을 평가하는 방법을 제공한다. 이 방법은, (a) 제 1 경로 길이에서 유체에 발현된 단백질의 제 1 흡광 스펙트럼을 취하는 단계와, (b) 상기 제 1 경로 길이를 증분만큼 변경하여 제 2 경로 길이를 제공하고, 설정된 파장에서 제 2 흡광 스펙트럼을 취하는 단계와, (c) 선택적 흡착에 의해 발현된 단백질의 유체를 고갈시키는 단계와, (d) 고갈된 유체에 대해 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 단계와, (e) 발현된 단백질의 고갈 전후에 유체에 대한 회귀 기울기를 획득하기 위해 주어진 파장에서 흡광도 값으로부터 회귀선을 생성하는 단계와, (f) 고갈되지 않은 유체 기울기에서 고갈된 유체의 기울기를 빼는 단계와, (g) 단계 (f)에서 계산된 양을 고갈 전 유체의 기울기로 나누어 발현된 단백질의 고갈의 백분율을 계산하는 단계를 포함할 수 있다. 발현된 단백질의 농도의 계산은, 발현된 단백질의 알려진 흡광 계수를 사용할 수 있다. 선택적 흡착에 의해 발현된 단백질의 유체를 고갈시키는 단계는, 고체 지지체에 고정된 표적 단백질에 친화성 리간드를 사용하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 표적 단백질은 고정화된 단백질 A일 수 있다. 선택적 흡착에 의해 발현된 단백질의 유체를 고갈시키는 단계는, 수지, 멤브레인, 필터 플레이트 및 충전 컬럼 중 하나 이상의 사용을 더 포함한다. 수지는 탈수될 수 있다. 상기 단계들은 자동화될 수 있다. 유체는 측정 전에 여과될 수 있다. 유체는 측정 전에 성장 기간이 필요할 수 있다.
도 1은 가변 경로 길이 장비 소프트웨어 셋업의 하나의 가능한 실시예의 흐름도이다.
도 2는 가변 경로 길이 장비 소프트웨어의 데이터 획득의 흐름도이다.
도 3a는 본 발명의 장치의 일 실시예의 개략도이다.
도 3b는 프로브 팁 어셈블리의 일 실시예의 개략도이다.
도 4는 본 발명의 장치에서 샘플 용기 역할을 할 수 있는 관통형 장비의 개략도이다. 상세 설명
본 개시 내용의 시스템 및 방법은 일반적으로 기울기 분광법을 사용하여 유체에서 발현된 단백질을 측정하는 데 필요한 시간을 줄이기 위해 해결된다. 기울기 분광법(Slope spectroscopy)은 다양한 경로 길이(pathlengths)에 걸쳐 흡광도를 측정하여 용액의 농도를 측정하는 방법이다.
통상의 기술자는 유체에서 발현된 단백질의 측정을 위한 기울기 분광법의 사용이 기존의 산업 표준 공정에서 몇몇 벗어나는 부분을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 또한 유체를 처리하는 데 필요한 시간을 크게 줄일 수 있다.
본 개시 내용은 바이오프로세스(bioprocesses), 보다 구체적으로 처리 단계(processing step)의 입력물 및 출력물의 농도를 측정하는 방법을 설명한다. 이러한 방법은 처리 단계 전후에 시스템에서 샘플을 추출할 수 있다.
본 개시 내용의 방법 및 시스템에 의해 수집된 정보는 바이오프로세스에서 취해진 조치를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이오프로세스는 발현된 단백질의 계산된 농도로 인해 지연되거나 가속화될 수 있다. 또한 상기 정보는 바이오프로세싱의 결함이나 오류를 암시할 수 있으며 결과적으로 수정 조치가 취해질 수 있다. 유체에 단백질이 없는지 확인되면 프로세스가 완료되어 버퍼 사용을 최소화하고 시간을 절약할 수 있다.
사용자는 이러한 방법을 통해 수집된 정보와 예상 침투 출력량(expected output volumes of permeate)에 대한 지식을 결합하여 발현된 단백질이 유체로부터 고갈(depletion)되는 시기를 결정할 수 있다. 또한 사용자는 고정된 단백질 A로 단클론 항체(monoclonal antibodies)를 고갈시켜 측정할 수 있다.
설명되는 방법을 사용하여 수지의 결합 능력(binding capacity)을 평가할 수 있다. 이를 통해 수지의 효율성을 결정하고, 필터의 거름 특성(sieving property)을 평가하거나, 필터에 얼마나 많은 물질이 남아 있는지 파악하여 막힘을 발생시키는 데 사용할 수 있다.
용기에 대해 프로브를 이동시키는 것(단계) 또는 "시료에 대해 프로브를 이동시키는 것(단계)"은 프로브에 대해 용기 또는 샘플이 이동됨을 의미한다. 여기에는 프로브가 움직이고 용기 또는 샘플이 정지되어 있고, 용기 또는 샘플이 움직이고 프로브가 정지되어 있고, 샘플 또는 용기가 움직이고 프로브가 움직이는 상황 모두 포함된다.
"흡광도 판독값을 취하는 것(단계)" 는 용어는 임의의 흡광도 판독값(들)이 장치 또는 기구에 의해 측정됨을 의미한다. 이것은 흡광도 판독값이 단일 파장 및/또는 단일 경로 길이에서 수행되거나 판독값이 여러 파장들 및/또는 다중 경로 길이들에서 수행되는(예: 스캔) 상황을 포함한다.
용어 "샘플(들)"은 화합물, 혼합물, 표면, 용액, 에멀젼(emulsions), 현탁액, 세포 배양물, 발효 배양물, 세포, 조직, 분비물 또는 추출물 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
"모터"라는 용어는 샘플을 통해 가변 경로 길이를 제공하도록 제어될 수 있는 모든 장치를 의미할 수 있다.
"선택적 흡착(selective adsorption)"이라는 용어는 유체로부터 생성물을 고갈시키기 위한 친화도 기반(affinity-based) 방법을 지칭한다. 선택적 흡착은 예를 들어 친화성-결합제, 예를 들어 펩티드 리간드(peptide ligand), 항체 또는 그의 기능적 단편, 독소, 압타머(aptamer), 약리학적 작용제(pharmacological agonist) 또는 길항제(antagonist), 또는 기타 적합한 시약에 의해 매개될 수 있다. 친화성 결합제는 어떤 경우에는 수지 또는 입자와 같은 고체 지지체에 결합되고; 다른 경우에, 친화성 결합제는 결합되지 않으며, 이 경우 고갈은 예를 들어 친화성 결합제 상의 작용기의 반응을 통한 기질에 대한 결합된 친화성 결합제의 공유 결합 및/또는 항체와 같은 제 2 결합제의 사용에 의해 달성될 수 있다. 다른 적합한 친화성 결합제 및 고갈 방법은 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
경사 분광법(Slope Spectroscopy)
본 개시는 관심 파라미터들의 다중 측정을 위한 가변 경로 길이의 사용을 허용하는 접근법을 채용함으로써 용액의 분광 광도 특성(spectrophotometric characteristics)을 결정하기 위한 장치 및 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 용액 중 화합물의 농도를 측정할 때 본 개시 내용은 다양한 경로 길이에서 용액의 흡광도(absorbance)를 측정하기 위한 방법 및 장치를 제공하다. 다양한 경로 길이에서의 흡광도 값은 용액에서 화합물의 농도를 계산하는 데 사용할 수 있다. 본 개시 내용의 장치 및 방법은 샘플의 단일 또는 다중 희석에 의존하지 않고 고농축 샘플의 농도를 결정하는 데 특히 유용하다. 이러한 속성은 본 발명의 장치가 달성할 수 있는 짧은 경로 길이로 인해 가능하다. 본 발명의 장치는 약 0.2μm 이상의 경로 길이를 제공함으로써 매우 농축된 샘플의 농도를 측정하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 기구는 약 0.5 μm 내지 약 15 cm 또는 약 1 μm 내지 약 50 mm의 경로 길이를 제공할 수 있다. 본 장치 및 방법은 또한 더 긴 경로 길이를 제공함으로써 극도로 희석된 용액의 농도 측정을 제공할 수 있다. 본질적으로 본 발명의 장치 및 방법은 용액의 흡광도 값을 측정하기 위한 광범위한 경로 길이를 허용함으로써 표준 분광 광도계의 동적 범위를 확장한다. 이 넓은 동적 범위를 통해 사용자는 샘플을 변화(희석 또는 농축)하지 않고도 샘플의 농도를 측정할 수 있다. 본 개시의 방법 및 장치의 실시 예는 특정 시료 또는 시료 세트의 흡광도, 소멸 계수 또는 농도를 결정하기 위한 것이지만, 본 개시의 장치 및 방법은 산란, 발광, 광발광(photoluminescence), 광발광 분극(polarization), 시간-분해(time-resolved) 광발광, 광발광 수명(life times) 또는 화학발광(chemiluminescence) 등과 같은 다른 모드에서도 사용될 수 있다. 본 개시의 장치 및 방법은 주어진 시간에 하나 이상의 샘플의 광학 값을 결정하는 데 사용될 수 있다. 본 개시 내용은 큐벳(cuvettes) 또는 임의의 샘플 홀더와 같은 단일 샘플 형식뿐만 아니라 미세정량(microtiter) 플레이트 및 다중 큐벳 또는 다중 샘플 배열과 같은 다중 샘플 형식의 사용을 고려할 수 있다.
본 발명의 가변 경로 길이 장치는 프로브 팁, 샘플 용기, 모터, 전달 광섬유, 디텍터, 단방향 슬라이딩 메커니즘 및 경로 길이 제어와 파라미터들의 측정을 위한 적절한 소프트웨어를 포함할 수 있다.
프로브 팁(Probe Tip)
본 개시 내용에서 프로브 팁은 샘플에 광을 전달하는 광 전달 장비이다. 프로브 팁은 샘플을 통해 빛의 통과를 허용하기 위해 하나 이상의 전자기 소스(electromagnetic sources)와 인터페이스하는 광섬유 케이블과 같은 단일 광 전달 장비일 수 있다. 대안적으로, 프로브 팁은 광 전달 장비, 하우징, 종단 단부(end terminations) 및 기타 광학 부품 및 코팅을 구비하는 프로브 팁 어셈블리에 수용될 수 있다. 광 전달 장비는 용융 실리카, 유리, 플라스틱 또는 전자기 소스와 디텍터의 파장 범위에 적합한 투과성 물질일 수 있다. 광 전달 장비는 단일 섬유 또는 다중 섬유로 구성될 수 있으며 이러한 섬유는 장치의 활용에 따라 다른 직경을 가질 수 있다. 섬유는 거의 임의의 직경을 가질 수 있지만 대부분의 실시 양태에서 섬유 직경은 약 0.005mm 내지 약 20.0mm 범위에 있을 수 있다. 일 실시예에서, 광 전달 장비는 약 0.1mm 내지 약 1.0mm의 직경을 갖는 단일 광섬유이다. 프로브 팁은 선택적으로 하우징을 사용하여 광 전달 장비를 포함할 수 있다. 이 하우징은 주로 광 전달 장비를 차폐하는 데 사용되며 금속, 플라스틱, 세라믹 또는 사용에 적합한 기타 재료로 만들어 질 수 있다. 프로브 팁은 커넥터, 페룰(ferrules) 또는 기계적 상호 연결을 용이하게 하는 모든 것과 같은 종단 단부(end terminations)를 선택적으로 포함할 수 있다. 종단은 장치의 사용과 호환되는 모든 방식으로 연마, 절단, 형성 또는 조작될 수 있다. 본 개시 내용의 장치는 렌즈 또는 필터와 같은 추가 광학 구성요소를 구비하는 프로브 팁을 포함한다. 프로브 팁에는 필터, pH 표시기, 촉매 또는 씰링 메커니즘 역할을 하기 위해 섬유 팁 단부에 코팅이 포함될 수 있다. 프로브 팁은 기구 및/또는 프로브 어셈블리 장비의 영구적인 부분일 수 있거나 대안적으로 프로브 팁은 프로브 팁 어셈블리로부터 제거될 수 있도록 분리 가능할 수 있다. 장치의 영구적인 부품으로서 프로브 팁은 광 전달 장비의 필수적인 부분이다. 일 실시 예에서 프로브 팁은 광원에 한쪽 단부가 부착되고 다른 쪽 단부는 샘플에 담그어진 단일 광섬유이다. 대안적으로, 프로브 팁은 분리 가능할 수 있고 이러한 실시 예에서 프로브 팁은 다양한 메커니즘을 통해 광 전달 장비로부터 분리될 수 있다. 일 실시예에서, 프로브 팁은 사용 후에 프로브 팁이 제거되고 다른 프로브 팁으로 교체될 수 있도록 Touhey Borst 어댑터를 통해 광 전달 장비에 부착된다. 분리 가능한 프로브 팁은 샘플을 관통하고 광 전달 어셈블리에 부착하기에 충분한 길이를 가질 수 있다. 분리 가능한 프로브 팁의 실시 예에서 프로브 팁의 길이는 길이가 약 20mm 이상일 수 있다. 용도에 따라 프로브 팁은 제거 후 그냥 버려질 수 있다. 일회용 프로브 팁은 프로브 팁 세척과 관련된 문제를 방지하고 한 샘플에서 다른 샘플로의 오염 가능성을 방지할 수 있다. 본 개시 내용의 장치는 단일 광 전달 장비와 연관될 수 있는 다중 프로브 팁을 포함할 수 있다. 대안적으로 다수의 광 전달 장비들이 각각의 프로브 팁들과 연관될 수 있다.
경로 길이는 프로브 팁의 끝과 액체를 수용하는 샘플 용기의 내부 표면 사이의 거리이며, 내부 표면은 프로브 팁에 실질적으로 수직인 용기의 표면이다. 경로 길이를 정의하고 액체와 접촉하는 프로브 팁의 끝 표면은 디텍터에 인접한 샘플 용기의 내부 표면과 실질적으로 평행하다. 일 실시 예에서, 프로브 팁은 샘플을 보유하는 샘플 용기 위에 위치되고 프로브 팁을 나가는 빛이 샘플 용기를 통해 디텍터(또는 검출 광 가이드)로 통과하도록 정렬된다. 프로브 팁은 장치 범위 내에서의 파장을 전송할 수 있다.
광원(Light Source)
전자기 방사선 소스(electromagnetic radiation source)는 넓은 스펙트럼 범위 또는 좁은 대역에 걸쳐 미리 결정된 방식으로 광을 제공한다. 광원은 아크 램프, 백열 램프, 형광 램프, 전계 발광 장치, 레이저, 레이저 다이오드, 발광 다이오드 또는 기타 광원을 포함할 수 있다. 일 실시 예에서, 방사선 소스는 제논 아크 램프(Xenon arc lamp) 또는 텅스텐 램프이다. 본 발명의 일 실시 예에서, 광원은 광 가이드(light guide)를 통해 프로브 팁에 결합된다. 또는, 광원은 프로브 팁에 직접 장착될 수 있는 발광 다이오드일 수 있다.
샘플 용기(Sample Vessel)
용기(vessel)는 액체를 수용할 수 있어야 하고 빛이 액체를 통과하여 검출 광 가이드(detection light guide) 또는 디텍터(detector)로 통과할 수 있어야 하다. 또한 용기에는 프로브 팁이 광을 전달하여 액체를 통과할 수 있도록 하는 구멍이 있다. 이 용기는 일반적으로 약 200-1100 nm의 장치 범위 내에서 파장을 전송할 수 있어야 한다. 자외선 어플리케이션의 경우 석영 용기(quartz vessel)가 필요할 수 있지만 종종 시클로 올레핀 중합체(COP, cyclo olefin polymer), 시클로 올레핀 공중합체(COC, cyclo olefin copolymer), 폴리스티렌(PS, polystyrene) 또는 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA, polymethyl methacrylate)로 만들어진 플라스틱 용기로 형성되어도 무방하다. 본 개시 내용과 함께 사용되는 샘플 용기는 분석에 사용할 수 있는 샘플의 양과 용도에 따라 다양한 크기와 모양을 가질 수 있다. 본 개시 내용의 샘플 용기는 흡광도 값을 취할 수 있는 모든 것이 될 수 있다. 이러한 용기는 큐벳 또는 미세정량 플레이트와 같은 고정된 샘플 용기 또는 플로우-스루 장비(flow-through device)에서와 같이 이동하는 샘플을 포함한다(도 4). 샘플 크기는 고정된 샘플에서 0.1pL에서 수 리터 사이일 수 있다. 용기의 형상은 디텍터를 향하는 면이 실질적으로 평평하고 디텍터의 면과 실질적으로 평행하다. 디텍터는 샘플을 통해 들어오는 전자기 복사선의 역반사 때문에 노이즈를 줄이기 위해 용기에 대해 약간의 각도를 갖도록 위치할 수 있다. 샘플 용기에는 미세정량 플레이트(microtiter plate)와 같이 여러 개의 웰(well)이 있을 수 있다. 샘플 용기는 광학 물질이나 화학 물질 또는 항체와 같은 생화학 물질로 코팅될 수 있다. 샘플 용기는 선택적으로 장치에 의해 가열되거나 냉각될 수 있으며 멸균 또는 비멸균일 수 있는 씰링된 영역에 보관될 수 있다. 샘플은 스테이지에 의해 지지되는 샘플 홀더에 보관될 수 있다. 샘플에는 화합물, 혼합물, 표면, 용액, 에멀젼, 현탁액, 세포 배양, 발효 배양, 세포, 조직, 분비물, 추출물 등이 포함될 수 있다. 샘플 분석에는 광활성 분석물의 존재, 농도 또는 물리적 특성 측정이 포함될 수 있다. 샘플은 단일의 웰, 큐벳 또는 샘플 홀더의 내용물을 참조하거나 미세정량 플레이트 내의 여러 샘플을 참조할 수 있다. 일부 실시예에서 스테이지는 장치 외부에 있을 수 있다.
모터(Motor)
모터는 팁 프로브를 용기 안팎으로 구동한다. 모터는 프로브 팁을 정밀한 단계로 구동하여 샘플을 통과하는 경로 길이(path length)를 변경한다. 경로 길이의 변경은 장치 구성에 따라 0mm 이상일 수 있다. 모터는 샘플 내에서 프로브의 움직임을 허용하여 프로브 팁을 미리 결정된 정확한 경로 길이에 배치시키도록 한다. 본 발명의 기구와 함께 사용될 수 있는 모터는 스테퍼 모터, 서보, 압전, 전기 및 자기 모터 또는 샘플을 통해 가변 경로 길이를 제공하도록 제어될 수 있는 임의의 장비들을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 기구의 실시 예에서 모터는 프로브 팁이 샘플 용기에 대해 이동하도록 샘플 용기가 놓이는 스테이지를 구동한다. 이 구성에서 스테이지와 프로브는 0.2μm에서 1cm 범위의 증분으로 서로에 대해 이동할 수 있다. 일 실시예에서 증분 범위는 약 1μm에서 약 50μm 사이일 수 있다. 프로브에 대한 스테이지의 상대적 움직임은 0.2μm 이하의 분해능으로 정확할 수 있다. 본 발명의 장치의 일 실시예에서, 프로브와 스테이지의 상대적인 운동의 분해능은 약 0.5μm 내지 약 0.01μm 사이일 수 있다.
단방향 슬라이딩 메커니즘(Unidirectional Sliding Mechanism)
단방향 슬라이딩 메커니즘은 다른 모든 경로 길이들을 참조할 수 있는 대략적인 제로 벤치마크(zero benchmark )로서의 "제로(0) 경로 길이(zero path length)" 위치를 설정하기 위해 프로브 팁의 끝과 샘플 용기의 "바닥"(프로브 팁에 수직) 사이의 물리적 접촉을 허용하도록 설계된 시스템이다. 본 개시 내용의 실시예에서 단방향 슬라이딩 메커니즘은 프로브 팁이 샘플 용기 표면과 물리적으로 접촉하도록 하여 프로브 팁이 "제로 경로 길이" 위치에 있도록 보장한다. 샘플 용기나 프로브 팁에 손상을 주지 않고 물리적 접촉이 이루어져야 한다. 일 실시예에서 위치는 일단 물리적 접촉이 달성되면 프로브 팁의 샘플 용기 중 하나의 선형 변위를 일 방향으로 허용/요구함으로써 달성된다. 이것은 저울에서 용기 기능을 사용하는 것과 같은 방식으로 제로 경로 길이 위치가 설정된 방향으로의 변위를 허용하다. 프로브 팁과 용기 표면이 분리됨에 따라 움직임이 제한되어 백래시 또는 반동을 줄이거나 제거할 수있다. 이러한 기능이 가능한 장비를 단방향 슬라이딩 메커니즘이라고 지칭할 수 있다. 단방향 슬라이딩 메커니즘의 다양한 실시예가 존재할 수 있다.
일 실시예에서, 단방향 슬라이딩 메커니즘은 나사산이 있는 두 개의 플라스틱 구성요소에 의해 수용되는 중앙에 구멍이 있는 실리콘 고무 또는 유사하게 호환되는 개스킷 재료를 포함하는 Touhy Borst 어댑터(TBA, Touhy Borst Adapter)라고 하는 모델링된 플라스틱 연결 장치로 구성되며, 이들을 나사로 조일 경우 내부 개스킷을 압축하여, 내부 구멍의 직경을 줄여 구멍 내부의 모든 주위에 씰(seal)을 형성한다. 씰링(sealing) 및 압축의 양은 TBA의 두 나사산 구성요소 사이의 나사 결합 길이를 변경하여 제어할 수 있다. 일 실시예에서, 프로브 팁은 TBA 개스킷의 구멍을 통해 삽입되고 TBA는 프로브 팁 주위의 TBA 개스킷을 압축하도록 조여진다. 프로브 팁과 TBA 개스킷 사이의 마찰력이 프로브 팁의 무게를 초과하도록 나사산이 조정되어, 수직으로 잡았을 때 프로브 팁이 TBA에서 떨어지지는 않되, 프로브 팁이 개스킷 내부로 슬라이딩할 수 없을 정도로 꽉 조이지는 않는다. 이 마찰 상호작용(frictional interaction)으로 인해 경로 길이가 0인 위치를 설정할 수 있는 단방향 슬라이딩 변위가 발생하게 된다.
이를 달성할 수 있는 다른 수단들 및 메커니즘들이 존재할 수 있다. 일 실시예에서 구멍, 선형 슬릿 또는 두 개의 블록 사이에 둘러싸인 두 개의 직교 슬릿(two orthogonal slits)이 있는 얇은 멤브레인(thin membrane)은 프로브 팁이 블록에 삽입될 수 있고 멤브레인이 일 방향으로의 변위를 허용하는 마찰력을 생성하도록 프로브 팁보다 약간 큰 구멍을 포함할 수 있다.
다른 실시 예에서 프로브 팁 또는 샘플 용기를 위한 커플링 메커니즘은 한 방향으로 힘이 가해질 때 프로브 팁 또는 샘플 용기를 해제하고, 힘이 풀릴 때는 스프링이 장착된 압축 링과 유사하게 더 단단히 움켜쥐는 스프링 장착된(spring loaded) 테이퍼진 슬라이딩 커플링(tapered sliding coupling)을 포함할 수 있다.
다른 실시예에서 샘플 용기의 프로브 팁을 위한 결합 메커니즘은 톱니 슬라이드를 일 방향으로 변위될 때 제자리에 잠기고, 반대 방향으로 움직이거나 언로딩을 허용하는 해제 버튼을 필요로 하는 스프링 장착 래칫 메커니즘(spring loaded ratchet mechanism)을 포함할 수 있다.
단방향 슬라이딩 메커니즘의 각각의 실시 예에서 제로 경로 길이 위치는 수동적으로 설정되며, 이는 사용자가 물리적 접촉 조건을 달성하기 위해 시스템의 모션을 구동하는 것 외에는 장치와 상호 작용할 필요가 없다는 것을 의미한다. 사용자의 개입이 필요한 다른 실시예들이 존재하며, 이는 본 개시 내용의 장치의 긴 경로 길이 및 플로우 버전(long path length and flow versions 에 사용될 수 있다. 일 실시 예에서, 프로브 팁 결합 메커니즘은 슬라이딩 커플링을 구비할 수 있다. 물리적 접촉이 이루어지고 변위가 발생한 후 사용자는 엄지 나사, 고정 나사, 수집 조임, 기계적 클램프, 자기 클램프 또는 프로브 팁, 프로브 팁 커플링 메커니즘, 샘플 또는 샘플 용기 장비의 위치를 잠글 수 있는 기타 수단들을 사용하여 변위를 설정할 수 있다.
디텍터(Detector)
디텍터는 검출된 광으로부터 에너지를 장치에 의해 처리될 수 있는 신호로 변환할 수 있는 임의의 메커니즘을 포함할 수 있다. 적합한 디텍터에는 광전자 증배관(photomultiplier tube), 광다이오드, 애벌랜치(avalanche) 광다이오드, 전하 결합 소자(CCD, charge-coupled devices), 및 강화 CCD 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 디텍터, 광원 및 분석 모드에 따라 이러한 디텍터는 개별(discrete), 아날로그, 포인트(analog, point) 또는 이미징 모드에서의 사용을 포함하여 다양한 검출 모드로 사용될 수 있다. 디텍터는 흡광도, 광발광 및 산란을 측정하는 데 사용할 수 있다. 본 개시 내용의 장치는 일 실시 예에서 단일 디텍터가 사용되지만 하나 이상의 디텍터를 사용할 수도 있다. 일 실시예에서 광전자 증배관(photomultiplier tube)이 디텍터로 사용된다. 본 개시 내용의 장치의 디텍터는, 전자기 방사선을 샘플을 통과하여 디텍터로 전달할 수 있는 광 전달 장치에 디텍터를 작동 가능하게 연결함으로써 원격으로 위치될 수 있는 장치에 통합될 수 있다. 광 전달 장비는 용융 실리카, 유리, 플라스틱 또는 전자기 소스 및 디텍터의 파장 범위에 적합한 투과성 물질일 수 있다. 광 전달 장비는 단일 섬유 또는 다중 섬유로 구성될 수 있으며 이러한 섬유는 장치의 활용에 따라 다른 직경을 가질 수 있다. 섬유는 거의 임의의 직경을 가질 수 있지만 대부분의 실시 양태에서 섬유 직경은 약 0.005mm 내지 약 20.0mm 범위의 크기를 가질 수 있다.
본 개시 내용의 기구의 일 실시예는 프로브 팁이 "상부"에 있고 디텍터가 "하부"에 있도록 배향된 시스템의 광학계를 갖는다(도 3a). 이 수직 배향(vertical orientation )에서 샘플 용기는 디텍터 위에 있으며 프로브 팁은 위아래로 움직일 수 있으며 프로브 팁에서 나오는 광이 샘플 용기 내의 샘플을 통해 이동하고 아래의 디텍터에 충돌하도록 샘플 용기 안팎으로 이동할 수 있다. 플로우 셀(flow-cell) 시스템과 같이, 디텍터 및 프로브 팁이 실질적으로 수평 배향(horizontal orientation, 도 4)일 수 있고 샘플이 디텍터와 프로브 사이에서 유동하는 다른 배향이 가능하다. 절대 공간 방향 또는 프로브와 디텍터에 관계없이 프로브 팁과 디텍터의 표면은 서로에 대해 실질적으로 수직이어야 한다.
소프트웨어(Software)
제어 소프트웨어는 파장, 경로 길이, 데이터 수집 모드(파장/경로 길이 모두에 대해), 운동(kinetics), 트리거/타겟, 스펙트럼의 다양한 영역에 대해 다양한 동적 범위/분해능을 제공하기 위한 개별 경로 길이/파장 밴드, abs/경로 길이 곡선, 회귀 알고리즘 및 기울기 결정, 기울기 값에서 농도 측정, 흡광 계수 측정, 기준선(base line) 보정 또는 산란 보정 등과 같은 다양한 기준에 따라 장비 동작을 조정할 수 있다. 도 1은 본 개시의 소프트웨어 방식의 실시 예의 흐름도이다. 소프트웨어는 스캐닝 또는 이산 파장 판독 옵션, 신호 평균화 시간, 파장 간격, 스캐닝 또는 개별 경로 길이 판독 옵션, 기준선 보정, 산란 보정, 실시간 파장 단면과 같은 데이터 처리 옵션, 임계값 옵션(예: 파장, 경로 길이, 흡광도, 기울기, 절편, 결정 계수 등), 운동/연속 측정 옵션을 제공하도록 구성된다. 도 2a 및 2b는 가변 경로 길이 장치 소프트웨어의 데이터 수집의 일 실시예의 흐름도이다. 도 2는 데이터 수집 프로그램에 통합될 수 있는 실시간 데이터 수집의 데이터 수집의 일 실시예의 흐름도이다.
도 3a는 본 개시 내용의 장치의 일 실시예의 개략도이다. 모터(1)는 샘플 용기(3)가 있는 스테이지(4)를 구동한다. 파이버 팁 프로브(2, fiber tip probe)는 스테이지가 위아래로 이동함에 따라 샘플 용기까지의 프로브 거리가 각각 증가하거나 감소되도록, 모터에 대해 고정된다. 스테이지 아래에는 프로브 팁이 샘플을 통과한 후 전자기 방사선을 수신하는 디텍터(5, detector)가 있다. 도 3b는 프로브 팁 어셈블리의 일 실시예의 개략도이다.
도 4는 본 개시 내용의 장치에서 샘플 용기 역할을 할 수 있는 플로우-스루 장비(flow-through device)의 개략도이다. 플로우-스루 장비는 플로우 셀(flow cell) 장비 안팎으로 샘플 용액의 흐름을 허용하는 플로우 셀 바디(8)를 포함하다. 플로우 셀 바디(8)는 일반적으로 200-1100 nm의 전자기 소스 범위에서 전자기 복사선에 투과되는 적어도 하나의 윈도우(7)를 구비한다. 윈도우는 다양한 재료로 형성 될수 있지만 자외선 응용 분야의 경우 석영, 사이클로 올레핀 폴리머(COP), 사이클로 올레핀 코폴리머(COC), 폴리스티렌(PS) 또는 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA)의 재질이 요구될 수 있다. 윈도우는 전자기 복사선이 윈도우를 통과하여 디텍터(5)에 부딪힐 수 있는 한 다양한 크기와 모양을 가질 수 있다. 플로우 셀 바디에는 프로브 팁이 통과할 수 있는 포트를 더 포함할 수 있다. 이 포트는 프로브 팁이 플로우-스루 장비에서 샘플 용액의 누출없이 포트를 통과할 수 있도록 다이나믹 씰(9, dynamic seal)로 밀봉되어 있다. 이러한 씰(seals)은 유타주 웨스트 솔트레이크시티에 있는 Parker Hannifin Corporation EPS Division에서 입수할 수 있는 FlexiSeal Rod 및 Piston Seals을 포함할 수 있다. 도면 상에는 샘플 용액이 유입 포트로 유입되어 유출 포트를 빠져나가는 단일 경로가 존재한다. 대안적인 실시예들은 다중 경로와 다중 유입 포트 및 유출 포트를 포함할 수 있다. 도 4의 플로우 셀 장비의 실시예에서, 프로브 팁은 샘플 용액의 흐름에 실질적으로 수직하게 이동하고, 디텍터에 대해 실질적으로 수직하다.
본 개시 내용의 방법의 일 실시 예에서, 경로 길이 거리가 무엇인지 정확하게 알지 못하는 상태에서 다수의 흡광도 측정이 다수의 경로 길이들에서 이루어질 수 있다. 종래의 기술들은 샘플 농도의 정확한 측정이 이루어질 수 있도록 흡광도 판독에서 경로 길이를 정확하게 결정하는 방법을 가르치는 방법들이 대부분이다. 본 개시 내용의 이 실시 양태에서, 서로 다른 경로 길이들에서 이루어지는 다중 흡광도 측정은, 흡광도 및 경로 길이 정보로부터 회귀선(regression line)을 계산하는 장치의 능력에 기초하여 농도의 정확한 계산을 가능하게 한다. 그런 다음 회귀선의 기울기를 사용하여 샘플의 농도를 계산할 수 있다. 회귀선을 계산하는 데 사용되는 소프트웨어가 제시된 데이터 세트에서 가장 정확한 선을 선택하도록 프로그래밍될 수 있다는 사실 때문에, 각 경로 길이를 정확하게 알 필요는 없다. 이러한 방법에서 수집된 데이터 포인트의 수는 경로 길이 또는 흡광도 판독값의 변화를 "완화"하는 경향이 있어 R2 값이 매우 높은 회귀선을 얻을 수 있다. 본 개시 내용의 방법에서 적어도 0.99999의 R2 값이 달성되었다. 분명히 R2 값이 높을수록 기울기가 더 정확하여 샘플 농도를 매우 정확하게 결정할 수 있다. 0과 0.99999 사이의 임의의 R2 값은 본 개시 내용의 장치 및 방법에서 달성 가능하지만, 본 개시 내용의 방법의 일부 실시 양태에서 R2 값은 0.95000을 초과하고 일부 실시양태에서 R2는 0.99500을 초과할 수 있다. 본 개시 내용의 실시양태에서, R2 값은 약 0.95000 내지 약 0.99999일 수 있다. 다른 실시양태에서 약 0.99500 내지 약 0.99999 및 약 0.99990 내지 약 0.99999 사이의 R2 값을 포함할 수 있다. R2가 선형 회귀에 대한 적합도의 척도인 반면, 적합도를 측정하는 임의의 다른 수학적 표현이 본 개시 내용의 방법에서 이용될 수 있다.
본 개시 내용의 장치 및 방법은 사용자가 흡광도와 같은 미리 결정된 파라미터를 선택함으로써 데이터 수집을 최적화할 수 있게 한다. 예를 들어 사용자는 1.0의 흡광도를 정의하고 장치가 샘플의 흡광도가 1.0인 다른 파라미터들(예: 파장 또는 경로 길이)를 검색하도록 할 수 있다. 이 기능을 통해 사용자는 여러 번 희석하거나 장치의 파라미터들을 수동으로 계속 변경할 필요 없이 실험의 파라미터들을 정의할 수 있다. 본 발명의 소프트웨어는 또한 사용자가 예상 R2 값을 정의할 수 있게 하여 결과에 대한 정확도 수준이 데이터 획득 이전에 정의될 수 있도록 한다.
본 개시 내용의 장치 및 방법은 흡광도, 경로 길이 및 파장의 측정을 포함하는 3차원 데이터 세트를 포함하는 다양한 데이터 세트의 수집을 허용한다. 소프트웨어를 사용하면 이러한 데이터 세트의 3차원 그래프를 생성할 수 있다. 또한, 본 개시 내용의 장치 및 방법은 실시간 데이터의 수집을 제공한다.
본 개시 내용의 장치 및 방법은 서로 다른 파장에서 특정 샘플의 흡광 계수의 계산을 가능하게 한다. 흡수율(absorptivity)이라고도 하는 흡광 계수(extinction coefficient)는 주어진 파장에서의 농도 단위 경로 길이(unit path length) 당 용액의 흡광도이다. 주어진 샘플에 대한 흡광 계수가 제 1 파장(ε1)에서 얻어지면 제 2 파장(ε2)에서 흡광 계수를 계산할 수 있다. 이것은 제 1 파장(A/l)에서 흡광도/경로 길이 대 제 2 파장(A/l)2에서 흡광도/경로 길이의 비율을 측정하고 이 비율을 흡광 계수의 비율과 동일시하여 수행된다: (A/l)l/(A/l)2=ε1/ε2.
본 개시 내용의 장치 및 방법은 또한 샘플의 다중의 성분을 식별하는 파장이 분리될 수 있는 한 사용자가 복잡한 혼합물의 성분들을 동시에 측정할 수 있게 한다. 예를 들어, 종래의 분광 광도계는 단일 실험에서 두개의 성분 A(고도로 농축되고 300nm에서 주로 흡수되는)와, B(600nm에서 흡수되는 희박한)가 있는 샘플의 농도를 결정할 수 없었다. 기존의 분광 광도계에서는 성분 B로 인한 흡광도를 측정하면 A의 농도가 디텍터에 잠길 정도로 높기 때문에 A의 흡광도를 측정할 수 없었다. 성분 A를 결정하기 위해 기존의 샘플을 희석해야 하며, 이 경우 성분 B가 농도를 측정할 수 있는 충분한 신호를 생성하지 못할 수 있다. 종래의 분광 광도계에서는 성분 A와 B의 농도를 동시에 측정할 수 없다. 본 개시 내용에서 경로 길이는 성분 A 및 B의 농도가 함께 결정될 수 있도록 변경될 수 있다. 명백하게, 샘플 내 성분을 고유하게 식별하는 피크들이 있는 한, 본 개시 내용의 방법은 매우 복잡한 샘플의 성분 농도를 측정할 수 있다. 또한 장치는 실시간으로 데이터를 생성할 수 있기 때문에 샘플 내 구성 요소의 상호 작용을 모니터링하여 운동 데이터(kinetic data) 또는 시간 경과가 필요한 모든 데이터를 생성할 수 있다.
통상의 기술자는 예를 들어, 습식 크로마토그래피 매체(wetted chromatography medium)를 사용하여 많은 흡착 방법이 시스템에 유체를 추가하는 것을 포함할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 추가적인 유체는 최종 사용자가 관심 제품의 희석으로 인한 감소로 인해, 관심 물질 또는 제품의 고갈로 인해, 기울기 또는 절대 흡광도의 감소를 구별할 수 없는 한, 본 개시의 방법에 따른 두 번째 흡착 방법의 해석을 복잡하게 할 수 있다. 이는 특정 구현예에서 발현된 단백질의 유체를 고갈시키는 단계 동안 시스템에 추가될 수 있는 임의의 체적의 유체를 감소 또는 제거함으로써 해결된다. 유체를 고갈시키는 단계는 제 1 측정치(first measurement) 및 제 2 측정치(second measurement) 사이에 유체 부피를 증가시키는 것을 포함하지 않을 수 있다. 탈수된 수지(dehydrated resin )가 사용될 수 있다. 이 탈수된 수지는 단백질 A를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 유체를 고갈시키는 단계는 유체 부피를 미리 결정된 양만큼 증가시키는 단계를 포함할 수 있다.

Claims (26)

  1. 유체에서 발현된 단백질의 농도를 측정하는 방법에 있어서,
    기울기 분광법을 사용하여 유체의 제 1 흡수 기울기 값을 측정하고, 상기 제 1 흡수 기울기 값을 알려진 단백질의 흡광 계수로 나누어 제 1 농도를 산출하는 단계;
    선택적 흡착에 의해 발현된 단백질의 유체를 고갈시키는 단계;
    기울기 분광법을 사용하여 고갈된 유체의 제 2 흡수 기울기 값을 측정하고, 상기 제 2 흡수 기울기 값을 알려진 단백질의 흡광 계수로 나누어 제 2 농도를 산출하는 단계; 및
    상기 제 1 농도 및 상기 제 2 농도에 기초하여, 상기 선택적 흡착에 의해 제거된 물질의 양을 계산하는 단계;를 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 제거된 물질의 양을 계산하는 단계는, 상기 제 1 농도에서 상기 제 2 농도를 빼고 그 차이에 상기 유체의 부피를 곱하는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 유체의 제 1 기울기 값과 상기 제 2 기울기 값을 측정하는 단계는 동일한 파장에서 측정되는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    발현된 단백질의 농도의 계산은 상기 발현된 단백질의 알려진 흡광 계수를 사용하는 방법
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 선택적 흡착에 의해 발현된 단백질의 유체를 고갈시키는 단계는, 고체 지지체 상에 고정화된 표적 단백질에 친화성 리간드를 사용하는 단계를 더 포함하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 표적 단백질은 고정화된 단백질 A인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 선택적 흡착에 의해 발현된 단백질의 유체를 고갈시키는 단계는, 수지, 멤브레인, 필터 플레이트 및 충전 컬럼 중 하나 이상을 사용하는 단계를 더 포함하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 수지는 탈수되는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 유체를 고갈시키는 단계는, 제 1 측정치와 제 2 측정치 사이에 유체 체적을 증가시키는 단계를 포함하지 않는 방법.
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 유체를 고갈시키는 단계는, 유체 부피를 설정된 양만큼 증가시키는 단계를 포함하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 단계들은 자동화되는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    유체가 측정 전에 필터링되는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 유체는 측정 전에 성장 기간을 필요로 하는 방법.
  14. 유체에서 발현된 단백질의 고갈 수준을 결정하기 위한 시스템에 있어서,
    선택적 흡착에 의해 발현된 단백질의 유체를 고갈시키기 위한 고갈 모듈;
    유체의 유로에서 상기 고갈 모듈의 상류 및 하류에 위치된 제 1 및 제 2 유체 샘플링 모듈; 및
    상기 제 1 및 제 2 유체 샘플링 모듈로부터 유체를 전달받고, 다중의 경로 길이에서 상기 샘플링 모듈들로 부터의 유체의 흡광도를 측정하고, 그로부터 유체 농도를 결정하게 되는 기울기 분광 장치;를 포함하고,
    상기 고갈은 상기 제 1 모듈로부터 유체에 발현된 단백질의 농도로부터 상기 제 2 모듈로부터 유체에 발현된 단백질의 농도를 빼고, 그 차이에 유체의 부피를 곱함으로써 측정되는 시스템.
  15. 제 12 항에 있어서,
    상기 고갈 모듈은 크로마토그래피 컬럼을 포함하는 시스템.
  16. 제 12 항에 있어서,
    발현된 단백질의 유체를 고갈시키는 방법은, 고정된 단백질 A, 수지, 막, 필터 플레이트, 및 충전 컬럼 중 하나 이상을 포함하는 시스템.
  17. 제 12 항에 있어서,
    기울기 분광 장치는, 기울기 분광기인 시스템.
  18. 유체 내 크로마토그래피 컬럼에 대한 발현된 단백질의 결합을 평가하는 방법에 있어서,
    (a) 제 1 경로 길이에서 유체에 발현된 단백질의 제 1 흡광 스펙트럼을 취하는 단계;
    (b) 상기 제 1 경로 길이를 증분만큼 변경하여 제 2 경로 길이를 제공하고, 설정된 파장에서 제 2 흡광 스펙트럼을 취하는 단계;
    (c) 선택적 흡착에 의해 발현된 단백질의 유체를 고갈시키는 단계;
    (d) 고갈된 유체에 대해 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 단계;
    (e) 발현된 단백질의 고갈 전후에 유체에 대한 회귀 기울기를 획득하기 위해 주어진 파장에서 흡광도 값으로부터 회귀선을 생성하는 단계;
    (f) 고갈되지 않은 유체 기울기에서 고갈된 유체의 기울기를 빼는 단계; 및
    (g) 단계 (f)에서 계산된 양을 고갈 전 유체의 기울기로 나누어 발현된 단백질의 고갈의 백분율을 계산하는 단계를 포함하는, 방법
  19. 제 16 항에 있어서,
    발현된 단백질의 농도의 계산은, 발현된 단백질의 알려진 흡광 계수를 사용하는 방법.
  20. 제 16 항에 있어서,
    선택적 흡착에 의해 발현된 단백질의 유체를 고갈시키는 단계는, 고체 지지체에 고정된 표적 단백질에 친화성 리간드를 사용하는 단계를 더 포함하는 방법.
  21. 제 18 항에 있어서,
    상기 표적 단백질은 고정화된 단백질 A인 방법.
  22. 제 16 항에 있어서,
    선택적 흡착에 의해 발현된 단백질의 유체를 고갈시키는 단계는, 수지, 멤브레인, 필터 플레이트 및 충전 컬럼 중 하나 이상의 사용을 더 포함하는 방법.
  23. 제 20 항에 있어서,
    상기 수지는 탈수되는 방법.
  24. 제 16 항에 있어서,
    상기 단계들이 자동화되는 방법.
  25. 제 16 항에 있어서,
    유체는 측정 전에 필터링되는 방법.
  26. 제 16 항에 있어서,
    유체는 측정 전에 성장 기간을 필요로 하는 방법.
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