BR112013023211B1 - Anticorpo monoclonal, seu uso, composição, linhagem celular, método diagnóstico in vitro e kit - Google Patents

Abstract

ENSAIO DIAGNÓSTICO DE ANTICORPOS. A presente invenção refere-se a novos ensaios diagnósticos para o diagnóstico de amiloidose, em particular, doença de Alzheimer, e aspectos relacionados. Em particular, são proporcionados anticorpos monoclonais e um ensaio de anticorpos.

Description

[001] A presente invenção se refere a novos ensaios de diagnóstico para o diagnóstico de amiloidose, um grupo de doenças e alterações associadas com a proteína amiloide tais como, doença de Alzheimer e os aspectos relacionados. Em particular, um ensaio de anticorpos é proporcionado.

[002] Amiloidose não é uma única entidade de doença, mas em vez disso, um grupo diverso de processos de doença progressiva, caracterizada por depósitos nos tecidos extracelulares de uma proteína cerosa, semelhante a amido, chamada amiloide, a qual se acumula em um ou mais órgãos ou sistemas do corpo. À medida que os depósitos amiloides se acumulam, estes começam a interferir com a função normal do órgão ou sistema do corpo. Existem pelo menos 15 tipos diferentes de amiloidose. As principais formas são amiloidose primária, sem antecedentes conhecidos, amiloidose secundária após alguma outra condição, e amiloidose hereditária.

[003] A amiloidose secundária ocorre durante infecção crônica ou doença inflamatória, tal como a tuberculose, uma infecção bacteriana chamada febre mediterrânica familiar, infecções do osso (osteomielite), artrite reumatoide, inflamação do intestino delgado (ileíte granulomatosa), doença de Hodgkin e da lepra.

[004] Os depósitos de amiloide incluem componente amiloide P (pentagonal) (AP), uma glicoproteína relacionada com soro normal de P-amiloide (SAP), e glicosaminoglicanos sulfatados (GAG), carboidratos complexos de tecido conjuntivo. Fibrilas de proteína amiloide, que representam cerca de 90% do material amiloide, compreendem um dos vários tipos diferentes de proteínas. Essas proteínas são capazes de dobrar em fibrilas de folhas chamadas "beta- plissadas", uma configuração única de proteína que exibe sítios de ligação para o vermelho Congo, resultando nas propriedades da proteína amiloide de coloração única.

[005] Muitas doenças de envelhecimento são baseadas em, ou associadas às proteínas semelhante à amiloide e são caracterizadas, em parte, pela formação de depósitos extracelulares de amiloide ou de material semelhante a amiloide, que contribuem para a patogênese, bem como a progressão da doença. Essas doenças incluem, mas não são limitadas à desordens neurológicas tais como, comprometimento cognitivo leve (MCI), doença de Alzheimer (AD), tal como, por exemplo, doença esporádica de Alzheimer (TAS) ou formas de demência de Alzheimer familiar (FAD), como familiar Demência britânica (FBD) e familiar Dementia Dinamarquês (FDD), neurodegeneração em Síndrome de Down, demência com corpos de Lewy, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês), o complexo de demência de Guam Parkinson. Outras doenças que são baseadas em, ou associadas a proteínas tais como amiloide são paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla, doença de Creutzfeld Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada ao HIV, a ELA (esclerose lateral amiotrófica), Diabetes de Início no Adulto; amiloidose senil, tumores endócrinos, e outros, incluindo a degeneração macular.

[006] Embora patogênese dessas doenças possa ser diversa, seus depósitos característicos, muitas vezes contêm muitos constituintes moleculares compartilhados. Para um grau significativo, esse resultado pode ser atribuído à ativação local de vias pró- inflamatórias, levando, assim, à deposição simultânea de componentes do complemento ativados, reagentes de fase aguda, moduladores imunes, e de outros mediadores inflamatórios (McGeer e outros; Tohoku J. Exp. Med. 174 (3): 269-277 (1994)).

[007] Recentemente, acumulação de evidência demonstra o envolvimento de variantes peptídicos Aβ N terminal modificado em doença de Alzheimer. Visando exibição de biópsias uma presença de Aβ 1-40 e Aβ 1-42 não apenas no cérebro dos doentes de Alzheimer, mas também em placas senis de indivíduos não afetados. Entretanto, Aβ N3pE-40/Aβ N3pE-42 truncado de término e piroGlu modificado é quase exclusivamente enraizado no interior das placas de pacientes com doença de Alzheimer, tornando essa variante Aβ um marcador diagnóstico elegível e um alvo potencial para o desenvolvimento de drogas.

[008] No momento, vários fabricantes comerciais oferecem kits de ELISA, que permitem a detecção de Aβ 1-40/1-42 e Aβ N3pE-40/Aβ N3pE-42 na faixa de baixo picograma (pg).

[009] O cérebro dos pacientes com doença de Alzheimer (AD) é morfologicamente caracterizado pela presença de emaranhados neurofibrilares e por depósitos de peptídeos Aβ nas estruturas cerebrais neocorticais (Selkoe, D.J. & Schenk, doença de D. Alzheimer: compreensão molecular prediz terapêuticos à base de amiloide Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 545-584 (2003)). Peptídeos Aβ são liberados a partir da proteína precursora de amiloide (APP), após a clivagem sequencial por β e Y-secretase. Os resultados de clivagem de Y-secretase na geração de peptídeos Aβ 1-40 e Aβ 1-42, que diferem em seus términos C e exibem diferentes potências de agregação, formação e neurotoxicidade de fibrila (Shin, R.W. e outros, Beta- proteína amiloide (Abeta) 1-40, mas não Abeta 1-42 contribui para a formação experimental de fibrilas de amiloide de doença de Alzheimer em cérebro de rato J. Neurosci. 17, 8187-8193 (1997); Iwatsubo, T. e outros, Visualização de Abeta 42 (43) e Abeta 40 em placas senis, com anticorpos monoclonais específicos de Abeta-final: evidência de que uma espécie depositada inicialmente é Abeta 42 (43) Neuron. 13, 45-53 (1994); Iwatsubo T., Mann, D.M., Odaka, A., Suzuki, N. & Ihara, Y. proteína amiloide beta (Abeta) deposição: Abeta 42 (43) precede Abeta 40 na síndrome de Down. Ann. Neurol. 37, 294-299 (1995); Hardy, J.A. & Higgins, doença de Alzheimer GA: a hipótese de cascata amiloide. Science 256, 184-185 (1992); Roβner, S., Ueberham, U., Schliebs, R. Perez-Polo, J.R. & Bigl., V. A regulação de metabolismo de proteína precursora amiloide por meio de mecanismos colinérgicos e sinalização do receptor de neurotrofina. Prog. Neurobiol. 56, 541-569 (1998)).

[0010] A maioria dos peptídeos Aβ depositados em placas difusas é N-terminal truncado ou modificado. Estudos de Piccini e Saido demonstraram que a estrutura do núcleo das placas senis e de depósitos vasculares consistem de piroglutamato a 50% (piroGlu) peptídeos modificados (Piccini e outros, J. Biol. Chem. 7 de outubro de 2005; 280 (40): 34186-92; Saido e outros, Neuron. fevereiro de 1995, 14 (2): 457-66). Peptídeos PiroGlu modificados são mais fortemente citotóxicos do que outras espécies Aβ e estáveis contra as aminopeptidases (Russo e outros, J. Neurochem., setembro de 2002, 82 (6): 1480-9). Desse modo, as espécies Aβ piroGlu apresentam uma meia vida mais longa por meio da qual a acumulação dessas espécies e a formação de oligômeros neurotóxicos, bem como os agregados são benéficos (Saido, Neurobiol. Aging. 1998 Jan.-Fev., 19 (Suppl. 1): S69- 75). Devido à ciclização de glutamato para piroGlu, aminoácidos carregados serão perdidos o que reduz fortemente a solubilidade do peptídeo e provoca um aumento na tendência de agregação. Estudos in vitro têm mostrado que a oligomerização inicial de, por exemplo, Aβ3 (pE) é muito mais rápida em comparação com os peptídeos não modificados (Schilling e outros, Biochemistry. 17 de outubro de 2006; 45 (41): 12393-9).

[0011] Estudos conduzidos pelos requerentes mostraram que Aβ11(pE) tem uma maior potência de agregação e uma solubilidade muito menor do que Aβ3 (pE). O grupo de Naslund J. e outros; (Proc. Natl. Acad. Sci. Neurobiology, vol. 91 pp., 8378-8382) detectou por espectrometria de massa a variante truncada mais proeminente AβpE (11-42) em cérebros de AD esporádica. Até agora, o estudo de Naslund J., e outros, é um dos poucos estudos que examinaram a deposição de Aβ11 (pE), em placas.

[0012] Todos os fatos sugerem que Aβ piroGlu é um tipo de germe para a inicialização de formação de fibrila. Em um novo estudo (Piccini e outros, 2005, supra), voluntários com deposições de placa, mas sem patologia específica a AD poderiam ser distinguidos de pacientes com AD, devido à quantidade característica de espécies Aβ. Desse modo, a quantidade de peptídeos modificados piroGlu truncados de término N, foi significativamente maior no cérebro de pacientes com AD.

[0013] A formação pós-translacional de piroGlu na posição 3 ou 11 de peptídeo Aβ implica a ciclização de um resíduo de glutamato N- terminal. Glutaminilciclase (QC) desempenha um papel importante na geração de peptídeos piroGlu. QC é muito difundida no reino vegetal e animal e entre outros, está envolvida na maturação de hormônios peptídicos. Tanto a ciclização de glutamina por liberação de amônia e de glutamato por liberação de água para piroGlu é realizada por QC. Em contraste com a ciclização de glutamina, a ciclização de glutamato não ocorre espontaneamente. QC catalisa a reação secundária eficiente (indesejada) de glutamato para piroGlu. O resíduo piroGlu gerado protege a proteína contra a degradação proteolítica. Existem várias referências que mostram que QC desempenha um papel importante na geração de Aβ piroGlu: 1. Em vários estudos, foi demonstrado que QC catalisa a formação de resíduos piroGlu a partir de glutamato no término N de Aβ (Cynis e outros, Biochim. Biophys. Acta Out. 2006, 1764 (10): 16181625, Schilling e outros, FEBS. Lett. 09 de abril de 2004, 563 (1-3): 1916); 2. Ambos os peptídeos Aβ e QC são expressos em grandes quantidades no hipocampo e no córtex. Essas áreas do cérebro estão particularmente em risco em AD (Pohl e outros; Proc. Natl. Acad. Sci. EUA.15 de novembro de 1991, 88 (22): 10059-63, Selkoe, Physiol. Rev. abril 2001, 81 (2): 741 - 66); 3. A APP é clivada por β-secretase, durante o transporte para a membrana do plasma no qual o término N de Aβ com o resíduo de glutamato livre pode ser produzido (Greenfield e outros; Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 19 de janeiro de 1999; 96 (2):742-7)). Nas vesículas secretoras uma co-localização de APP processado e foi determinada a CQ. Assim, no meio ácido suave das vesículas uma modificação acelerada de resíduo de glutamato para piroglutamato pode ocorrer. 4. Também outra doença neurodegenerativa (dinamarquesa familiar (FDD) ou demência britânica (FBD)), estão relacionadas com peptídeos modificado piroGlu de término N, por exemplo, Bri2, mas, em contraste, não estão relacionadas com Aβ em termos da sua estrutura primária (Vidal R. e outros, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 97, 49204925).

[0014] Possivelmente, a formação catalisada por QC de Aβ piroGlu está envolvida no desenvolvimento e progressão de doenças neurodegenerativas. A formação de peptídeos de amiloide modificados de término N representa certamente um fator fundamental no processo de agregação de Aβ e poderia ser o início da doença. A supressão da formação de Aβ piroGlu por inibição de QC, pode representar uma abordagem terapêutica. Inibidores de QC seriam capazes de impedir a formação de Aβ piroGlu, reduzir a concentração de Aβ piroglutamato no cérebro e assim retardar a oligomerização de peptídeos Aβ. Schilling e outros mostraram que a expressão de QC foi induzida (up regulated) no córtex dos pacientes com AD e correlacionada com o aparecimento de peptídeo Aβ- modificado por piroGlu. Aplicação oral de um inibidor de QC resultou em nível reduzido de AβpE (3-42) piroglutamato modificado em dois modelos de ratos transgênicos diferentes de AD e um novo modelo de Drosophila (Schilling e outros, 2008 Biol. Chem. (389), 983991).

[0015] Demência de corpos de Lewy (LDB) é uma doença neurodegenerativa que pode ocorrer em pessoas com mais de 65 anos de idade e, normalmente, provoca sintomas de comprometimento cognitivo (pensamento) e mudanças de comportamento anormal. Os sintomas podem incluir comprometimento cognitivo, sinais neurológicos, distúrbios do sono e insuficiência autonômica. O comprometimento cognitivo é a característica de apresentação de LBD na maioria dos casos. Os pacientes têm episódios recorrentes de confusão que pioram progressivamente. A flutuação na capacidade cognitiva é freqüentemente associada com graus de mudança de atenção e alerta. Comprometimento cognitivo e flutuações de pensamento podem variar durante minutos, horas ou dias. Corpos de Lewy são formados a partir de proteínas de neurofilamentos fosforiladas e não-fosforiladas; contêm a proteína alfa-sinucleína sináptica, bem como a ubiquitina, que está envolvida na eliminação de proteínas danificadas ou anormais. Além de Corpos de Lewy, neuritas de Lewy, que são corpos de inclusão nos processos celulares das células nervosas, podem também estar presentes. Podem formar placas amiloides nos cérebros de pacientes que sofrem de DLB, no entanto, tendem a ser menos numerosas do que as observadas em pacientes com doença de Alzheimer. Emaranhados neurofibrilares, a outra marca micropatológica de AD, não é uma característica principal de LBD, mas são frequentemente presentes, além de placas amiloides.

[0016] A esclerose lateral amiotrófica (ALS) é caracterizada pela degeneração de neurônios motores superiores e inferiores. Em alguns pacientes com ALS, a demência ou afasia pode estar presente (ALS-D). A demência é mais comumente uma demência frontotemporal (DFT), e muitos desses casos apresentam inclusões tau-negativas positivas a ubiquitina em neurônios do giro denteado e as camadas superficiais dos lobos frontais e temporais.

[0017] Miosite por corpos de inclusão (IBM) é uma doença incapacitante normalmente encontrada em pessoas com mais de 50 anos de idade, em que as fibras musculares desenvolvem inflamação e começam a atrofiar-se - mas em que o cérebro é poupado e os pacientes retêm o seu pleno intelecto. Duas enzimas envolvidas na produção de proteína β amiloide foram verificadas ser aumentada dentro das células musculares de pacientes com esta doença muscular progressiva mais comum de pessoas mais velhas, em que β amiloide é também aumentada.

[0018] Outra doença que se baseia ou associa-se à acumulação e depósitos de proteína tal como amiloide é degeneração macular. Degeneração macular é uma doença oftalmológica comum que provoca a deterioração da mácula, que é a área central da retina (o tecido de papel fino na parte de trás do olho onde as células sensíveis à luz enviam sinais visuais para o cérebro). Visão nítida e clara, visão "em linha reta" é processada pela mácula. Danos à mácula resultam no desenvolvimento de pontos cegos e visão borrada ou distorcida. Degeneração macular relacionada à idade (AMD) é a principal causa de deficiência visual nos Estados Unidos e para pessoas com mais de 65 anos de idade é a principal causa de cegueira legal entre os caucasianos. Cerca de 1,8 milhões de americanos de 40 anos de idade e mais velhos têm AMD avançada, e outros 7,3 milhões de pessoas com AMD intermediária estão em risco substancial para a perda da visão. O governo estima que em 2020, haverá 2,9 milhões de pessoas com AMD avançada. Vítimas de AMD são muitas vezes surpreendidos e frustrados ao descobrir quão pouco se sabe sobre as causas e tratamento desta condição de cegueira.

[0019] Existem duas formas de degeneração macular: degeneração macular seca e degeneração macular úmida. A forma seca, em que as células da mácula lentamente começam a quebrar-se, é diagnosticada em 85 por cento dos casos de degeneração macular. Ambos os olhos são geralmente afetados pela AMD seca, embora um olho possa perder a visão, enquanto o outro olho permanece inalterado. Drusas, que são depósitos amarelos sob a retina, são os primeiros sinais comuns de AMD seca. O risco de desenvolver AMD seca avançada ou AMD úmida aumenta à medida que o número ou o tamanho das drusas aumentam. É possível que a AMD seca progrida e cause a perda de visão sem mudar para a forma úmida da doença; entretanto, também é possível para AMD seca de fase inicial mudar repentinamente para a forma úmida.

[0020] A forma úmida, embora apenas represente 15 por cento dos casos, resulta em 90 por cento da cegueira e é considerada AMD avançada (não há nenhuma fase inicial ou intermediária de AMD úmida). AMD úmida é sempre precedida pela forma seca da doença. Como a forma seca se agrava, algumas pessoas começam a apresentar vasos sanguíneos anormais que crescem atrás da mácula. Esses vasos são muito frágeis e poderão vazar fluido e sangue (aqui, degeneração macular "úmida"), provocando danos rápidos da mácula.

[0021] A forma seca de AMD, inicialmente, muitas vezes levam à visão ligeiramente turva. O centro de visão em particular pode, então, tornar-se turva e esta região cresce mais à medida que a doença progride. Nenhum sintoma pode ser notado se apenas um olho é afetado. Na AMD úmida, linhas retas podem aparecer, perda da visão central e ondulada pode ocorrer rapidamente.

[0022] Diagnóstico de degeneração macular envolve tipicamente um exame do olho dilatado, teste de acuidade visual, e uma visualização da parte posterior do olho usando um procedimento chamado fundoscopia para ajudar a diagnosticar a AMD, e - se é suspeita AMD exsudativa - angiofluoresceinografia também pode ser realizada. Se AMD seca atinge os estágios avançados, não há nenhum tratamento corrente, para evitar a perda de visão. Contudo, uma fórmula específica de dose elevada de antioxidantes e de zinco pode retardar ou prevenir AMD intermediária de progredir para a fase avançada. Macugen® (injeção de sódio pegaptanib), foto-coagulação a laser e terapia fotodinâmica pode controlar o crescimento anormal dos vasos sanguíneos e hemorragia na mácula, que é útil para algumas pessoas que apresentam AMD úmida, entretanto, a visão que já está perdida não será restaurada por essas técnicas. Se a visão já está perdida, existem ajudas de baixa visão, que podem ajudar a melhorar a qualidade de vida.

[0023] Um dos primeiros sinais de degeneração macular relacionada à idade (AMD) é a acumulação de depósitos extracelulares conhecidos como drusas entre a lâmina basal do epitélio pigmentado da retina (EPR) e membrana de Bruch (MB). Estudos recentes realizados por Anderson e outros confirmaram que drusas contêm beta amiloide.

(Experimental Eye Research 78 (2004) 243-256).

[0024] O objetivo da presente invenção é estabelecer uma técnica de detecção altamente sensível e concomitantemente robusta que permite a determinação quantitativa de variantes de Aβ, em particular, peptídeos AβpGlu (11-x), em amostras biológicas, por exemplo, amostras de líquido ou de soro, preferencialmente, amostras de soro. Este é um enorme desafio, levando em conta a baixa abundância de peptídeos Aβ no sangue. Tendo tal uma técnica de detecção disponível é, entretanto, um pré-requisito para o estudo de eficácia de inibidores de moléculas pequenas em programas de rastreio de fármacos.

[0025] A presente invenção proporciona novos métodos e composições que compreendem anticorpos altamente específicos e eficazes, incluindo anticorpos quiméricos e fragmentos destes, incluindo anticorpos e fragmentos destes parcial ou totalmente humanizados, tendo a capacidade de reconhecer e ligar-se especificamente a epítopos específicos a partir de uma faixa de antígenos de β-amiloide, em particular peptídeos AβpGlu (11-x), que podem ser apresentados ao anticorpo em uma forma monomérica, dimérica, trimérica, etc., ou uma forma polimérica, em forma de um agregado, fibras, filamentos ou na forma condensada de uma placa. Os anticorpos permitidos pelo ensinamento da presente invenção são particularmente úteis para o diagnóstico de amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados à formação de placas amiloides, incluindo, amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade, incluindo, mas não limitado a, distúrbios neurológicos tais como, doença de Alzheimer (AD), demência com corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo de demência de Guam Parkinson, bem como outras doenças que são baseadas em, ou associado às proteínas tal como amiloides, tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla, doença de Creutzfeld- Jacob, hemorragia hereditária cerebral com amiloidose tipo holandês, doença de Parkinson, demência relacionada ao HIV, a ELA (esclerose lateral amiotrófica), Diabetes de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil, tumores endócrinos, e outros, incluindo, degeneração macular, para citar apenas alguns.

Sumário da Invenção

[0026] A presente invenção se refere, em particular, a anticorpos ou seus variantes, que são caracterizados na medida em que se ligam a peptídeos AβpGlu(ll-x) com uma afinidade elevada. Alta afinidade significa no contexto da presente invenção uma afinidade de um valor KD de 10-7 M ou melhor, de preferência, um valor de KD de 10-8 M ou melhor, e ainda mais preferencialmente, um valor de KD de 10-9 M - 1012 M.

[0027] Em particular, o anticorpo é preferencialmente um anticorpo monoclonal e é selecionado a partir de Aβ 13-11-6, daqui por diante referido como clone 13.

[0028] O anticorpo de acordo com a presente invenção é especificamente útil em um método diagnóstico para detectar amiloidose, em particular, doença de Alzheimer.

Descrição das Figuras Figura 1: Triagem de anticorpo anti Aβ11(pE)

[0029] Analisaram-se 26 sobrenadantes celulares de hibridoma após a fusão celular e seleção de meio HAT. Os mAb foram testados contra diferentes peptídeos Aβ modificados contendo a sequência de EVHH parcialmente. O peptídeo marcado de cinza AβpE (11-23) (ver ponto 10) contém a sequência alvo com piroglutamato no término N (pEVHH). Cada membrana foi manchada com peptídeos 1-16. As células de hibridoma de membranas moldadas (n = 9) foram selecionadas para reclonagem. Apenas as células de membranas moldadas com uma linha sólida foram estáveis após reclonagem. Figura 2: Revestimento de chip CM5 com Aβ (pE11-30)

[0030] A superfície do chip sensor foi ativada com EDC/NHS a 10 μL/minuto por 8 minutos. A imobilização de ligante por acoplamento de amina foi realizada com: a) 10 ug/mL de Aβ (pE11-30) em KH2P04 10 mM, pH 6 e B) 50 ug/mL de Aβ (pE11-30) em acetato de sódio 10 mM , pH 5. Peptídeo foi injetado com 10 μl/minuto por 5 minutos (A) e 20 minutos (B). Em seguida, grupos reativos (ésteres livres) foram desativados com etanolamina 1 M, pH 8,5, 10 μL/minuto por 10 minutos. Peptídeos não imobilizados foram removidos por meio de injeção de HCl 0,1 M (3 x 10 μL) e, em seguida, o chip foi lavado durante a noite com tampão de processamento. Finalmente, o sinal foi de 1000 RU. A imobilização de ligante foi realizada em Biacore 3000. Figura 3: Medição de SPR de anticorpos anti Aβ11(pE)

[0031] Análise de sobrenadante de cultura celular de hibridoma de clone 13, por Biacore 3000. Utilização de chip CM5 com Aβ imobilizados (pE11-30), com 1000 RU (célula de fluxo 4). É ilustrado um diagrama (plot) em tempo real de ligação em Aβ (pE11-30) ao longo do tempo. Amostra diluição 1:100 em tampão de processamento e injeção com 30 μL/minuto durante 300 s e gravação de tempo de dissociação 300. O sinal de célula de fluxo não-revestida foi subtraído de sinais medidos em célula de fluxo 4 com Aβ imobilizado. Figura 4: Curva de anticorpo anti Aβ11 (pE)

[0032] Anticorpo purificado com concentrações de 0,04-10 ug/mL foi medido por SPR em Biacore 3000. A faixa linear da curva é de 0,040 μg/mL até 1,25 ug/mL de anticorpo. Diluição do anticorpo em tampão de processamento e injeção com 30 μL/minuto durante 300 s. Cada sinal de SPR foi selecionado a partir do final da fase de dissociação. O sinal a partir de células de fluxo não-revestidas foi subtraído dos sinais medidos em células de fluxo com Aβ imobilizado. Figura 5: Curva padrão de anticorpo anti Aβ11 (pE)

[0033] Anticorpo purificado com concentrações conhecidas foi medido por SPR em Biacore 3000. Faixa de concentração de 0,040 até 1,25 μg/mL de anticorpos. Equação de regressão linear: y = 3033,7x 50,099 (R2 = 0,991). Cada sinal de SPR foi selecionado a partir do final de fase de dissociação. O sinal a partir de células de fluxo não- revestidas foi subtraído dos sinais medidos em células de fluxo com Aβ imobilizado. Figura 6: Comparação de número celular e produção de concentração de anticorpo anti Aβ11 (pE)

[0034] Células do hibridoma de clone 13 (passagem celular 19) cultivadas em meio contendo soro e de meio sem soro (SFM de hibridomas), a 37°C e 5% de CO2, suplementado com L-glutamina 2 mM e β-mercaptoetanol 50 μM diretamente antes de uso. As células foram cultivadas por cerca de 10 dias em balões de agitação e regularmente foi retirada uma amostra para determinar o crescimento de células (A) e a concentração de anticorpo (B) por SPR. Figura 7: A taxa de crescimento específico μ dependente do tempo de cultivação

[0035] Células do hibridoma de clone 13 (passagem celular 19) cultivadas em meio contendo soro e meio sem soro (Hibridoma SFM) a 37°C e 5% de CO2, suplementado com L-glutamina 2 mM e β- mercaptoetanol 50 μM diretamente antes de utilização. Os dados são baseados na curva de crescimento do balão de agitação durante 10 dias. Figura 8: A concentração de anti Aβ11 (pE) foi plotada contra o integral de células viáveis

[0036] Células de hibridoma do clone 13 (passagem celular 19) cultivadas em meio contendo soro e meio sem soro (Hibridoma SFM) a 37°C e 5% de CO2, suplementado com L-glutamina 2 mM e β- mercaptoetanol 50 μM. Os dados são baseados na curva de crescimento em balões de agitação durante 10 dias. O integral de células viáveis foi obtido a partir do diagrama de número de células dependente do tempo, visto que os pontos de dados de 5, 24, 48, 72 horas foram integrados. As taxas de produtividade de anticorpos são obtidas a partir da inclinação das curvas (ver funções lineares). R2 = coeficiente de determinação. Figura 9: Cromatograma de purificação de anti Aβ11 (pE)

[0037] 1800 mL de sobrenadante de cultura celular de hibridoma (clone 13) com proteína G coluna HP (V = 5 mL) a AktaTMPurifier foram purificados. A coluna foi arrefecida a 4°C, equilibrada com 1 x tampão de ligação (20 mM de Na2 HPO4, pH 7,0). Centrifugação de sobrenadante de cultura celular a 38.400 x g, a 4°C, 30 minutos, misturados a 1:1 com 2 x tampão de ligação. Uso de bomba AktaTMPurifiers P-950. Aplicação de sobrenadante de cultura (arrefecido no gelo) com 1,5 mL/minuto. A) Cromatograma com absorbância a 280 nm e condutividade durante o processo de purificação. Lavar com gradiente 0-2 M de NaCl mais de 5 volumes de coluna, em seguida, lavar com 1 x tampão de ligação, novamente. Eluição com 0-2 M de gradiente de KSCN (pH 7,0) sobre 5 volumes de coluna com o fluxo inverso de 2,5 mL/min. B) Ampliação superior de gradiente 0-2 M de KSCN e a fração de eluição V = 20 mL. O volume indicado é o fluxo do sistema técnico, e não o volume real. Figura 10: Eletroferograma em gel de SDS de purificação de anticorpo anti Aβ11 (pE) (clone 13)

[0038] Padrão de peso molecular de proteína pré-marcado: 10 - 250 kDa, Fermentas. Frações de purificação analisadas: slot 1; 6: antes de purificação de proteínas G, slot 2; 7: por meio de fluxo, slot 3; 8: fração de lavagem, slot 4; 9: eluição com KSCN, 30 μg/mL de anticorpos foram aplicados, slot 5: tampão de amostra não redutor. Purificação de anticorpos foi realizada com proteína G coluna HP, e eluição com 0 - 2 M de KSCN, pH 7,0. Amostras reduzidas diluídas 1:3 em tampão de SDS (Roti®-Load 1, BioRad) com β-mercaptoetanol, incubadas 10 minutos, 95°C. As amostras não reduzidas diluídas 1:4 em tampão de amostra sem β-mercaptoetanol agitadas 30 minutos, a 30°C. Tempo de separação de SDS-PAGE (12%, 1 mm de gel SDS): 10 minutos a 100 V, 35 minutos a 200V. Gel corado com Coomassie Brilliant Blue-G250, descorado com ácido acético a 10%. Figura 11: Espectro de UV de anticorpo anti Aβ11(pE)

[0039] Uso de anticorpo purificado de coluna de proteína G a partir de sobrenadante de cultura celular de hibridoma (clone 13). Espectro medido entre 240 nm e 339 nm. Diluição de 1:20 em tampão de diálise (D-PBS, EDTA 2 mM, pH 7,13). A espessura de sonda foi de 1 cm e o espectro de UV entre 240 e 339 nm foi medido com o espectrômetro de UV-UV1. Figura 12: Espectro de UV de anticorpo anti Aβ11(pE)

[0040] Diluição de anticorpo: 1:10 em D-PBS, EDTA 2 mM, espectro de UV entre 240 nm e 339 nm foi medido com o espectrômetro de UV UV1 antes e após biotinilação. A espessura da sonda foi de 1 cm. Figura 13: Espectro de CD de anticorpo anti Aβ11(pE)

[0041] Espectro de anticorpo biotinilado e não biotinilado foi medido a 20°C com espectro-polarímetro Jasco J-710 entre 190 e 260 nm. A concentração do anticorpo foi de 0,13 mg/mL em 10 mM de NaH2PO4 (pH 7,1). Medição com 20 acumulações, integração de 1 s e 1 mm de espessura da sonda. Figura 14: Estabilidade térmica de anticorpo anti Aβ11 (pE)

[0042] O espectro de CD foi medido à temperatura de 20°C até 80°C com espectro-polarímetro Jasco J-710 entre 190 e 260 nm. As concentrações de anticorpos foram de 0,13 mg/mL em 10 mM de NaH2PO4 (pH 7,14). Medição em intervalos de 5°C, 10 acumulações com taxa de aquecimento de 30 K/h, integração de 1 s, e 1 mm de espessura da sonda. Temperatura equilibrada a 180 s antes de cada medição. Figura 15: Estabilidade térmica de anticorpo anti Aβ11(pE) biotinilado

[0043] O espectro de CD foi medido à temperatura de 20°C até 80°C com espectropolarímetro Jasco J-710 entre 190 e 260 nm. As concentrações de anticorpos foram de 0,13 mg/mL em 10 mM de NaH2PO4 (pH 7,14). Medição em intervalos de 5°C com taxa de aquecimento de 30 K/h, 10 acumulações, integração de 1 s, e 1 mm de espessura da temperatura de sonda, equilibrada a 180 s antes de cada medição. Figura 16: Curva de titulação ITC de Aβ(pE11-18)-PEG em anticorpo anti Aβ11(pE) (clone 13)

[0044] Uso de MicroCalorímetro ITC (MicroCal). O experimento consistiu de 30 injeções (1 x 2 μL e 29 x 10 μL) a 20°C, cada um de 81,78 μM de Aβ (pE11-18)-PEG em tampão ITC, pH 7,1, com intervalo de 4 minutos entre injeção subsequente (linha preta) . O traço superior ilustra o calor de diluição de Aβ (pE11-18)-PEG em tampão ITC. O traço inferior ilustra a injeção de Aβ (pE11-18)-PEG em célula de amostra (volume = 1,405 mL) contendo 5,13 μM de anticorpo em tampão ITC, pH 7,1. A linha vermelha é a linha de base. Figura 17: Curva de ligação ITC de Aβ(pE11-18)-PEG em anticorpo anti Aβ11(pE) (clone 13)

[0045] O anticorpo foi purificado com proteína G-Sepharose e eluído com gradiente KSCN (pH 7,0). O experimento consistiu de 30 injeções (1 x 2 μL e 29 x 10 μL) a 20°C, cada um de 81,78 μM de Aβ (pE11-18)-PEG em tampão ITC de pH 7,1, com intervalo de 4 minutos entre injeção subsequente. A célula da amostra (volume = 1,405 mL) contendo 5,13 μM de anticorpo em tampão ITC, pH 7,1. O calor de diluição de Aβ (pE11-18)-PEG em tampão ITC foi subtraído a partir de todas as injeções de ligante. Uso da MicroCalorímetro ITC (MicroCal). Parâmetros termodinâmicos de estequiometria de reação (N), constante de associação (K), entalpia de ligação (ΔH), bem como a entropia (ΔS), foi determinada com Origin 7.0. Figura 18: Curva de ligação ITC de Aβ (pE11-18)-PEG em anticorpo anti Aβ11(pE) (clone 13)

[0046] O anticorpo foi purificado com proteína G-Sepharose e eluído com solução de glicina-HCl 0,1 M (pH 2,7). O experimento consistiu de 30 injeções (1 x 2 μL e 29 x 10 μL) a 20°C, cada um de 686,31 μM de Aβ (pE11-18)-PEG em tampão ITC, pH 7,1 com um intervalo de 4 minutos entre injeções subsequentes. A célula da amostra (volume = 1,405 mL) contendo anticorpo de 32,85 μM em tampão ITC, pH 7,1. O calor de diluição de Aβ (pE11-18)-PEG em tampão ITC foi subtraído a partir de todas as injeções de ligante. Uso de MicroCalorímetro ITC (MicroCal). Parâmetros termodinâmicos de estequiometria de reação (N), constante de associação (K), entalpia de ligação (ΔH), bem como a entropia (ΔS), foi determinada com Origin 7.0. Figura 19: Curva de ligação ITC de Aβ(pE11-18)-PEG em anticorpo anti Aβ11(pE) biotinilado (clone 13)

[0047] O experimento consistiu de 30 injeções (1 x 2 μL e 29 x 10 μL) a 20°C, cada um de 101,8 μM de Aβ (pE11-18)-PEG em tampão ITC, pH 7,1 com um intervalo de 4 minutos entre injeções subsequentes. A célula da amostra (volume = 1,405 mL) contendo 5,12 μM de anticorpo biotinilado em tampão ITC, pH 7,1. O calor de diluição de Aβ (pE11-18)- PEG em tampão ITC foi subtraído a partir de todas as injeções de ligante. Uso de MicroCalorímetro ITC (MicroCal). Parâmetros termodinâmicos de estequiometria de reação (N), constante de associação (K), entalpia de ligação (ΔH), bem como a entropia (ΔS), foi determinada com Origin 7.0. Figura 20: Reatividade cruzada de anticorpo anti Aβ11(pE) e anti Aβ3(pE)

[0048] Determinação de reatividade cruzada de anticorpo anti Aβ11 (pE) (clone 13) para peptídeo AβpE(11-30) e AβpE(3-40) via SPR em Biacore 3000. O uso de chip CM5 com AβpE (11-30) imobilizado com aproximadamente 1000 RU e AβpE (3-40) com 1830 RU. Injeção de 1 ug/mL de anticorpos com 30 μL/minuto durante 300 s e registro de tempo de dissociação de 300 segundos, diluição em tampão de processamento. Os sinais medidos em célula de fluxo com Aβ imobilizado foram subtraídos com o sinal de célula de fluxo não- revestida. Figura 21: Curva-padrão de anticorpo anti Aβ11(pE) (clone 13) em ELISA auto-Ig

[0049] Imobilização de 200 ng/mL de Aβ(pE11-20)-biotina em microplacas revestidas com estreptavidina (2 horas, sob temperatura ambiente). Bloqueio com 200 μl de ELISA-Blocker (-T), 1 hora à temperatura ambiente e seguido por ciclo de lavagem (3 x 300 μL/poço tampão de lavagem). Padrão de anticorpo anti Aβ11(pE) (clone 13) foi diluído em ELISA-Blocker (+ T) na divisão de raiz de 3500 pg/mL, até 55 pg/mL e incubado 2 horas a 4°C. Um ciclo de lavagem seguiu e detecção com anticorpo policlonal de coelho anti-Ig de camundongo HRP 1 hora a 4°C. Após ciclo de lavagem, TMB/H2O2 foram adicionados, incubados 30 minutos à temperatura ambiente (escuro) e reação enzimática foi interrompida com 1 M de H2SO4. Absorção foi medida em 450/540 nm em TECAN Sunrise. Figura 22: ELISA direto de Aβ11(pE) (clone 13)

[0050] Peptídeo AβpE (11-30) com diferentes concentrações foi revestido durante a noite a 4°C e, em seguida, bloqueado com Bloqueador ELISA (-T), 2 horas sob temperatura ambiente. Anticorpo anti Aβ11 (pE) (clone 13) biotinilado foi pré-incubado com conjugado de estreptavidina-HRP 10 minutos à temperatura ambiente e diluído em Bloqueador ELISA (+ T) foram realizados. Adição de 1 ug/mL de anticorpo (clone 13). Ciclos de lavagem no intervalo incubações com 6 x 300 μL/poço de tampão TBS-T (exceto, após o revestimento de peptídeo). TMB/H2O2 foram adicionados, incubados 30 minutos à temperatura ambiente (escuro) e a reação enzimática foi interrompida com H2SO4 1 M. Absorção foi medida em 450/540 nm em TECAN Sunrise. Figura 23: ELISA direto de Aβ11(pE) (4GB)

[0051] Peptídeo AβpE (11-30) com diferentes concentrações foi revestido durante a noite a 4°C e, em seguida, bloqueado com Bloqueador ELISA (-T), 2 horas à temperatura ambiente. 4G8 biotinilado foi pré-incubado com conjugado de estreptavidina-HRP durante 10 minutos à temperatura ambiente e uma diluição de raiz dois em Bloqueador ELISA (+T) foram realizadas. Adição de 1 ug/mL de anticorpo 4G8. Ciclos de lavagem entre incubações com 6 x 300 μL/poço em tampão TBS-T (exceto, após o revestimento de peptídeo). TMB/H2O2 foram adicionados, incubados 30 minutos à temperatura ambiente (escuro) e a reação enzimática foi interrompida com H2SO4 1 M. Absorção foi medida em 450/540 nm em TECAN Sunrise. Figura 24: Coloração de beta amiloide de cérebro com AD humana

[0052] A imunocoloração foi realizada com anticorpo anti Aβ11 (pE) (clone 13). As seções do cérebro com AD foram embebidas em parafina. Os núcleos das células foram corados com hematoxilina. Cortes em série de hipocampo de caso AD 1; 3 e de córtex frontal de caso de AD 2 são gravados. Caso de AD 1 e 2 mostrou placas grandes, extracelulares, com deposição de Aβ11 (pE) (ver, quadrado estreito e de ampliação). Depósitos intracelulares de Aβ11 (pE) em caso de AD 2 (ver, quadrado inferior direito de ampliação) e depósitos de Aβ11 (pE), no caso de AD 3 (ver, estreito) foram mostrados. As ampliações nas imagens da esquerda e da direita são semelhantes. As imagens foram gentilmente cedidas pelo laboratório de C. Lemere (Havard Medical School, Boston). Figura 25: Coloração de beta amiloide de cérebro APP/PS1 de camundongos

[0053] Imunocoloração de formalina fixa, em seções do cérebro com AD embebidas em parafina com anticorpo anti Aβ11 (pE). Núcleos das células foram corados com hematoxilina. Cortes em série de hipocampo dos camundongos transgênicos. Cortes em série mostraram depósitos vasculares de Aβ11 (pE). A mancha marrom é mostrada nos vasos sanguíneos no cérebro. As imagens foram gentilmente cedidas pelo laboratório de C. Lemere (Havard Medical School, Boston). Figura 26: Nível de IgG e Ig em auto-Ig-ELISA de anti Aβ11(pE)

[0054] Plasma-EDTA de doença de Alzheimer (AD) e grupo de controle (13 AD; 30 controles) foi analisado em relação com imunoglobulinas totais e IgG em ELISA de autoanticorpos anti Aβ11(pE). Ilustrado é o desvio médio e padrão de controle e grupo com AD. Resultados de determinação duplicada, as amostras foram medidas na curva padrão. Figura 27: Nível de IgG2, IgG3, IgM e IgA em auto-Ig-ELISA de anti Aβ11(pE)

[0055] Plasma-EDTA de doença de Alzheimer (AD) e grupo de controle (13 AD, 30 controles) foi analisado em relação com IgG2, IgG3, IgM e IgA em ELISA de autoanticorpo anti Aβ11 (pE). Ilustrado é o desvio médio e padrão de controle e grupo com AD. Resultados de determinação duplicada, as amostras foram medidas na curva padrão.

Descrição detalhada da invenção Definições

[0056] O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e abrange especificamente anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos, e fragmentos de anticorpos desde que exibam a atividade biológica desejada. O anticorpo pode ser uma IgM, IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4), IgD, IgA ou IgE, por exemplo. Preferencialmente, contudo, o anticorpo não é um anticorpo IgM.

[0057] "Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, geralmente, a região de ligação com antígeno ou variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab', F (ab')2 e fragmentos Fv: diacorpos; moléculas de anticorpos de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

[0058] O termo "anticorpo monoclonal", tal como aqui utilizado se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos exceto, quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com preparações de "anticorpos policlonais", que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais podem frequentemente ser vantajosos na medida em que são sintetizados pela cultura de hibridoma, não contaminados por outras imunoglobulinas. O "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser considerado como exigindo produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais que devem ser utilizados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo primeiro método de hibridoma descrito por Kohler e outros, Nature, 256:495 (1975), ou podem ser preparados por métodos geralmente bem conhecidos de ADN recombinante. Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos de fagos, utilizando as técnicas descritas em Clackson e outros, Nature, 352:624-628 (1991) e Marks e outros, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.

[0059] Os anticorpos monoclonais neste relatório incluem especificamente anticorpos quiméricos (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da cadeia é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada.

[0060] As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos (tais como, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação a antígeno de anticorpos) que contêm uma sequência mínima derivada de uma imunoglobulina não- humana. Para a maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato ou coelho, apresentando a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região de estrutura Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem na CDR importada ou sequências de estrutura.

[0061] Essas modificações são feitas para adicionalmente aperfeiçoar e otimizar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente, todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado otimamente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones e outros, Nature, 321:522-525 (1986), Reichmann e outros; Nature. 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biel., 2:593-596 (1992). O anticorpo humanizado inclui um anticorpo Primatized™ em que a região de ligação ao antígeno do anticorpo é derivada de um anticorpo produzido por imunização de macacos Macaca com o antígeno de interesse.

[0062] Fragmentos de anticorpos "Fv de cadeia simples" ou "sFv" compreendem os fragmentos de anticorpo VH e VL, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipeptídeo Fv adicionalmente compreende um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite que o sFv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno. Para uma revisão de sFv ver Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994).

[0063] O termo "diacorpos" se refere a pequenos fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação ao antígeno, fragmentos estes que compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VD) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH - VD ). Utilizando um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação ao antígeno. Os diacorpos são descritos mais detalhadamente em Hollinger e outros, Proc. Natl. Acad. Sol. EUA, 90: 6444-6448 (1993).

[0064] Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que interfeririam com às utilizações de diagnóstico ou terapêutica do anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteicos ou não-proteicos. Em modalidades preferidas, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso de anticorpos, conforme determinado pelo método de Lowry, e mais preferencialmente, mais de 99% em peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácidos de término N ou interna por utilização de um sequenciador de copo rotativo, ou (3) até a homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando azul de Coomassie ou, de preferência, coloração prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ no interior de células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Geralmente, contudo, o anticorpo isolado será preparado através de pelo menos uma etapa de purificação.

[0065] Tal como aqui utilizado, as expressões "célula", "linhagem celular" e "cultura celular" são utilizadas intercambialmente e todas essas designações incluem a progênie. Desse modo, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula primária sujeita e cultura derivada desta sem levar em conta o número de transferências. É também entendido que toda a progênie pode não ser exatamente idêntica em conteúdo de ADN, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica quando selecionada da célula originalmente transformada está incluída. Onde designações distintas são pretendidas, estas serão evidentes a partir do contexto.

[0066] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína", conforme usados neste relatório são intercambiavelmente e são definidos significar uma biomolécula composta de aminoácidos ligados a uma ligação de peptídeos.

[0067] Os termos "um", "uma", e "o", "a", conforme usados neste relatório são definidos significar "um ou mais" e incluem o plural, a não ser que de outra maneira o contexto seja inapropriado.

[0068] A linguagem "doenças e distúrbios que são causados por, ou associadas às proteínas amiloide ou semelhante à amiloide" inclui, mas não se limita a, doenças e distúrbios causados pela presença ou atividade de proteínas semelhantes à amiloide em estado monomérico, fibrilas, ou polimérico , ou qualquer combinação dos três. Tais doenças e distúrbios incluem, mas não se limitam a, amiloidose, tumores endócrinos, e degeneração macular.

[0069] O termo "amiloidose" se refere a um grupo de doenças e distúrbios associados à formação de placas amiloides, incluindo, mas não se limitam as mesmas, amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade, tais como doenças, incluindo, mas não se limitam as mesmas, distúrbios neurológicos tais como doença de Alzheimer (AD), incluindo, doenças ou condições caracterizadas por uma perda de capacidade de memória cognitiva, tais como, por exemplo, insuficiência cognitiva moderada (MCI), doença esporádica de Alzheimer, demência com corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo de Demência de Guam Parkinson, formas familiares de doença de Alzheimer, como a demência familiar britânica (FBD) e demência dinamarquesa familiar (FDD), bem como outras doenças que são baseadas em, ou associadas às proteínas semelhantes à amiloide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada ao HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), miosite por corpos de inclusão (IBM), Diabetes de Início no Adulto e amiloidose cardíaca senil; e várias doenças oculares, incluindo, degeneração macular, neuropatia óptica relacionadas com drusas, e catarata devido à deposição de beta-amiloide.

[0070] "Beta-amiloide, Aβ ou/β-amiloide" é um termo reconhecido no estado da técnica e se refere a proteínas e peptídeos β amiloide, proteína precursora β amiloide (APP), bem como modificações, fragmentos e quaisquer equivalentes funcionais destes. Em particular, por β amiloide como aqui utilizado, entende-se qualquer fragmento produzido por clivagem proteolítica de APP, mas especialmente aqueles fragmentos que estão envolvidos em, ou associados com as patologias de amiloides, incluindo, mas não se limitam a, Aβ1-38, Aβ1-40, Aβ1-42. As sequências de aminoácidos desses peptídeos Aβ são como seguem: Aβ1-42 (ID SEQ NO. 1): Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys- Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly- Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala Aβ1-40 (ID SEQ NO. 2): Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys- Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly- Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val Aβ1-38 (ID SEQ NO. 3): Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys- Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly- Leu-Met-Val-Gly-Gly

[0071] "pGlu-Aβ" ou "Aβ N3pE" se refere a formas truncadas no término N de Aβ, que começam no resíduo de ácido glutâmico na posição 3 na sequência de aminoácidos de Aβ, e em que o referido resíduo de ácido glutâmico é ciclizado para formar um resíduo de ácido piroglutâmico. Em particular, por pGlu-Aβ como aqui utilizado são entendidos aqueles fragmentos que são envolvidos em, ou associados com as patologias amiloides, incluindo, mas não se limitam a, pGlu-Aβ3- 38, pGlU-Aβ3-40, p-GlU-Aβ3-42.

[0072] As sequências das formas truncadas de término N de Aβ, Aβ3-38, Aβ3-40, Aβ3-42, são como seguem: Aβ3-42 (ID SEQ NO. 4): Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val- Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu- Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala Aβ3-40 (ID SEQ NO. 5): Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val- Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu- Met-Val-Gly-Gly-Val-Val Aβ3-38 (ID SEQ NO. 6): Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val- Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu- Met-Val-Gly-Gly

[0073] "AβpGlu(11)", "Aβ(pE11)" ou "Aβ11(pE)" se refere a formas truncadas de término N de Aβ, que começam no resíduo de ácido glutâmico na posição 11 na sequência de aminoácidos de Aβ, e em que o referido resíduo de ácido glutâmico é ciclizado para formar um resíduo de ácido piroglutâmico. Em particular, por AβpGlu(11-x) como aqui utilizado, são entendidos esses fragmentos que são envolvidos em, ou associados com as patologias de amiloides, incluindo, mas não se limitam a, pGlu-Aβ11-38, pGlu-Aβ11-40, pGlu-Aβ11-42, são como seguem: Aβ11-42 (ID SEQ NO. 7): Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser- Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala Aβ11-40 (ID SEQ NO. 8): Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser- Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val Aβ11-38 (ID SEQ NO. 9): Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser- Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly

[0074] Em particular, a presente invenção se refere aos itens seguintes: 1. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que se liga a peptídeos AβpGlu(11) ou variantes destes, de preferência, com alta afinidade. 2. Anticorpo, de acordo com o item 1, em que a alta afinidade significa um valor de constante de dissociação (KD) de 10-7 M, ou melhor. 3. Anticorpo, de acordo com o item 1 ou 2, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal. 4. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que a parte variável da cadeia leve do anticorpo apresenta uma sequência de nucleotídeos de ID SEQ NO: 51, ou uma sequência de aminoácidos de ID SEQ NO: 52. 5. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que a parte variável da cadeia pesada do anticorpo apresenta uma sequência de nucleotídeos de ID SEQ NO: 53, ou uma sequência de aminoácidos de ID SEQ NO: 54. 6. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que a parte variável da cadeia leve do anticorpo apresenta a sequência de nucleotídeos de ID SEQ NO: 51, ou a sequência de aminoácidos de ID SEQ NO: 52, e em que a parte variável da cadeia pesada desse anticorpo apresenta a sequência de nucleotídeos de ID SEQ NO: 53, ou a sequência de aminoácidos de ID SEQ NO: 54. 7. Anticorpo de acordo com qualquer dos itens precedentes, em que o anticorpo é Aβ 13-11-6 (Depósito N°. DSM ACC 3100) ou uma variante funcional deste. 8. Anticorpo, de acordo com o item 7, em que o anticorpo é Aβ 13-11-6 (Depósito N°. DSM ACC 3100). 9. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que o anticorpo é um anticorpo humanizado ou quimérico, ou um fragmento de anticorpo o qual retém a maior afinidade. 10. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes para utilização na detecção de peptídeos AβpGlu(ll) ou variantes destes. 11. Anticorpo, de acordo com o item 10, em que as variantes são selecionadas do grupo seguinte: variantes, pGlu-Aβ11-38 pGlu-Aβ11-40 pGlu-Aβ11-42, e pGlu-Aβ11-x

[0075] em que x é um número inteiro entre 18 e 42, mais preferencialmente, 30 e 42. 12. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, o qual é humano. 13. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, o qual é um diacorpo ou um anticorpo de cadeia única que retém a alta afinidade. 14. Anticorpo, de acordo com qualquer dos itens precedentes, que se liga ao epítopo ligado pelos anticorpos definidos no item 11. 15. Anticorpo, de acordo com qualquer dos itens precedentes, o qual apresenta as regiões determinantes de complementaridade dos anticorpos, como definido no item 11. 16. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que a parte variável da cadeia leve do anticorpo apresenta uma ou mais, tais como, uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade que são as mesmas como uma ou mais, tais como, uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade do anticorpo que apresenta uma parte variável de uma cadeia leve, que apresenta uma sequência de nucleotídeos de ID SEQ NO: 51, ou uma sequência de aminoácidos de ID SEQ NO: 52. 17. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que a parte variável da cadeia leve do anticorpo apresenta uma ou mais, tais como, uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade que são as mesmas ou mais, tais como, uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade do anticorpo que apresenta uma parte variável de uma cadeia pesada que apresenta uma sequência de nucleotídeos de ID SEQ NO: 53, ou uma sequência de aminoácidos de ID SEQ NO: 54. 18. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, o qual é rotulado. 19. Anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, o qual é imobilizado em uma fase sólida. 20. Anticorpo obtenível da linhagem celular de hibridoma DSM ACC 3100. 21. Composição compreendendo o anticorpo, conforme definido em qualquer um dos itens precedentes. 22. Composição, de acordo com o item 21, para o tratamento, prevenção ou retardo de amiloidose. 23. Composição, de acordo com o item 21 ou 22, na qual a amiloidose é uma doença neurodegenerativa selecionada do grupo que consiste de comprometimento cognitivo leve, doença de Alzheimer e neurodegeneração em Síndrome de Down. 24. Composição, de acordo com o item 21 ou 22, na qual a amiloidose é doença de Alzheimer esporádica ou uma demência de Alzheimer familiar. 25. Composição, de acordo com o item 24, na qual a demência familiar de Alzheimer é Demência Britânica Familiar ou Demência Dinamarquesa Familiar. 26. Linhagem celular de hibridoma DSM ACC 3100. 27. Uso do anticorpo, como definido em qualquer um dos itens 1 a 20, ou a composição conforme definida em qualquer um dos itens 21 a 25 em um método diagnóstico ou terapêutico. 28. Uso, de acordo com o item 27, para a diagnose de uma doença ou condição associada à amiloide. 29. Uso, de acordo com o item 28, no qual a amiloidose é uma doença neurodegenerativa selecionada do grupo que consiste de comprometimento cognitivo leve, doença de Alzheimer e neurodegeneração em Síndrome de Down. 30. Uso, de acordo com o item 28, no qual a amiloidose é doença de Alzheimer esporádica ou uma demência de Alzheimer Familiar. 31. Uso, de acordo com o item 28, no qual a demência de Alzheimer Familiar é demência britânica familiar ou demência dinamarquesa familiar. 32. Método de diagnóstico in vitro para o diagnóstico de uma doença ou condição associada com amiloide, em particular, doença de Alzheimer, método este compreendendo as seguintes etapas:

[0076] contato de um anticorpo, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 20, com uma amostra de um indivíduo suspeito de estar sofrendo da doença ou condição, e

[0077] detecção da ligação do anticorpo a uma proteína AβpGlu(11), a partir da amostra. 33. Kit diagnóstico, compreendendo o anticorpo conforme definido em qualquer um dos itens 1 a 20, e instruções de uso, e - opcionalmente - (a) adicionalmente substância(s) biologicamente ativa(s). 34. Kit diagnóstico de item 33, no qual a substância biológica adicional é um inibidor de glutaminilciclase. 35. Oligonucleotídeo selecionado do grupo que consiste em ID SEQ Nos.: 26 a 50.

[0078] Os anticorpos da invenção podem ser úteis para o diagnóstico de amiloidose.

[0079] Os anticorpos da invenção podem ser utilizados como agentes de purificação por afinidade. Nesse processo, os anticorpos são imobilizados em uma fase sólida, tal como uma resina Sephadex ou papel de filtro, utilizando métodos bem conhecidos no estado da técnica. O anticorpo imobilizado é colocado em contato com uma amostra contendo o peptídeo AβpGlu (11) que deve ser purificado, e consequentemente, o suporte é lavado com um solvente adequado que removerá substancialmente todo o material na amostra, exceto o peptídeo AβpGlu(11), que é ligado ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, tal como tampão de glicina, pH 5,0, que liberará o peptídeo AβpGlu(11) a partir do anticorpo.

[0080] Anticorpos de peptídeo anti-AβpGlu(11) podem também ser úteis em ensaios de diagnóstico para peptídeo AβpGlu(11), por exemplo, detectando sua ocorrência em células específicas, tecidos ou soro. Desse modo, os anticorpos podem ser utilizados no diagnóstico de amiloidose, em particular, de uma doença neurodegenerativa selecionada do grupo que consiste de comprometimento cognitivo leve (MCI), doença de Alzheimer (AD), tal como, por exemplo, doença esporádica de Alzheimer (SAD) ou Demências de Alzheimer Familiares (FAD), tais como demência britânica familiar (FBD) e Demência dinamarquesa familiar (FBD) e neurodegeneração em Síndrome de Down, de preferência, doença de Alzheimer.

[0081] Para aplicações de diagnóstico, o anticorpo tipicamente, será rotulado com uma porção detectável. Numerosos rótulos são disponíveis, os quais podem ser geralmente agrupados nas seguintes categorias: (a) Radioisótopos, tais como, 35S, 14C, 125I, 3H e 131I. O anticorpo pode ser marcado com o radioisótopo utilizando as técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Gütigen e outros, Ed., Wiley-Interscience. Nova Iorque, Nova Iorque. Pubs. (1991), por exemplo, e radioatividade pode ser medida utilizando contagem de cintilações. (b) marcadores fluorescentes tais como quelatos de terra rara (quelatos de európio) ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansila, Lissamina, ficoeritrina e Vermelho Texas são disponíveis. Os marcadores fluorescentes podem ser conjugados ao anticorpo utilizando as técnicas descritas in Current Protocols in Immunology, supra, por exemplo. Fluorescência pode ser quantificada utilizando um fluorímetro. (c) Vários marcadores de enzima-substrato são disponíveis. A enzima geralmente catalisa uma alteração química do substrato cromogênico que pode ser medida utilizando várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma mudança de cor em um substrato, que pode ser medida espectro-fotometricamente. Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou quimioluminescência do substrato. Técnicas para quantificar uma mudança na fluorescência são acima descritas. O substrato quimioluminescente torna-se eletronicamente excitado por uma reação química e pode então emitir luz que pode ser medida (usando um quimioluminômetro, por exemplo) ou doa energia a um aceitador fluorescente. Exemplos de marcadores enzimáticos incluem luciferases (por exemplo, luciferase de pirilampo e luciferase bacteriana; Patente dos E.U.A No. 4.737.456), luciferina, 2, 3-diidroftalazinodionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase, tais como, peroxidase de rábano (HRPO), fosfatase alcalina, O-galactosidase, glicoamilase, lisozima, sacarídeo-oxidases (por exemplo, glicose-oxidase, galactose-oxidase e glicose-6-fosfato desidrogenase), oxidases heterocíclicas (tais como, uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase, e similares. Técnicas para enzimas de conjugação a anticorpos são descritas em O'Sullivan e outros, Métodos para a preparação de conjugados de enzima-anticorpo para uso em Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym (ed. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, Nova Iorque, 73: 147-166 (1981).

[0082] Exemplos de combinações de enzima-substrato incluem, por exemplo: (i) Peroxidase de rábano silvestre (HRPO) com peroxidase de hidrogênio como um substrato, em que a peroxidase de hidrogênio oxida um precursor de corante (por exemplo, ortofenileno-diamina (OPD) ou 3,3',5,5'-tetrametil-benzidina, cloridreto (TMB)); (ii) Fosfatase alcalina (AP) com para-nitrofenil fosfato como substrato cromogênico; e (iii) β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substrato cromogênico (por exemplo, p-nitrofenil-β-D-galactosidase) ou o substrato fluorogênico 4-metilumbeliferil-β-D-galactosidase.

[0083] Numerosas outras combinações de enzima-substrato são disponíveis daqueles versados no estado da técnica.

[0084] Algumas vezes, o marcador é indiretamente conjugado com o anticorpo. Aquele versado no estado da técnica estará ciente de várias técnicas para atingir esse objetivo. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado com biotina e qualquer das três amplas categorias de marcadores mencionados acima pode ser conjugada com avidina, ou vice-versa. A biotina liga-se seletivamente à avidina e assim, o marcador pode ser conjugado com o anticorpo nessa maneira indireta. Alternativamente, para alcançar conjugação indireta do marcador com o anticorpo, o anticorpo é conjugado com um pequeno hapteno (por exemplo, digoxina) e um dos diferentes tipos de marcadores mencionados acima é conjugado com um anticorpo anti-hapteno (por exemplo, anticorpo anti-digoxina). Desse modo, a conjugação indireta do marcador com o anticorpo pode ser alcançada.

[0085] O anticorpo AβpGlu(11) não necessita de ser marcado, e a presença deste, pode ser detectada usando um anticorpo marcado que se liga ao anticorpo AβpGlu(11).

[0086] Os anticorpos da presente invenção podem ser empregados em qualquer método de ensaio conhecido, tais como, ensaios de ligação competitiva, ensaios intercalados diretos e indiretos e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press. Inc.,1987).

[0087] Os ensaios de ligação competitiva contam com a capacidade de um padrão marcado competir com o analito da amostra de teste para ligação com uma quantidade limitada de anticorpo. A quantidade de peptídeo AβpGlu(11) na amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade de padrão que se torna ligada aos anticorpos. Para facilitar determinação da quantidade de padrão que se torna ligada, os anticorpos geralmente são insolubizados antes ou após a competição, de modo que o padrão e analito que são ligados aos anticorpos possam ser convenientemente separados do padrão e do analito que permanecem não ligados.

[0088] Ensaios intercalados envolvem a utilização de dois anticorpos, cada um capaz de se ligar a uma porção imunogênica diferente, ou epítopo, da proteína a ser detectada. Em um ensaio intercalado, o analito da amostra de teste é ligado por um primeiro anticorpo que é imobilizado em um suporte sólido, e, por conseguinte um segundo anticorpo liga-se ao analito, formando assim um complexo de três partes insolúvel. O segundo anticorpo pode ele próprio ser marcado com uma porção detectável (ensaios intercalados diretos) ou pode ser medido utilizando um anticorpo antiimunoglobulina que é marcado com uma porção detectável (ensaio intercalado indireto). Por exemplo, um tipo preferível de ensaio intercalado é um ensaio ELISA, caso em que a porção detectável é uma enzima.

[0089] Para imuno-histoquímica, a amostra de tecido pode ser fresca ou congelada ou pode ser embebida em parafina e fixada com um conservante tal como formalina, por exemplo.

Kits Diagnósticos

[0090] Por uma questão de conveniência, o anticorpo da presente invenção pode ser proporcionado em um kit, ou seja, uma combinação embalada de reagentes em quantidades predeterminadas com instruções para executar o ensaio de diagnóstico. Quando o anticorpo for marcado com uma enzima, o kit incluirá substratos e cofatores requeridos pela enzima (por exemplo, um precursor de substrato que proporciona o cromóforo ou fluoróforo detectável). Além disso, outros aditivos podem ser incluídos tais como estabilizantes, tampões (por exemplo, um tampão de bloqueio ou tampão de lise) e semelhantes. As quantidades relativas dos vários reagentes podem ser amplamente variadas para proporcionar concentrações em solução dos reagentes que otimizam substancialmente a sensibilidade do ensaio. Particularmente, os reagentes podem ser proporcionados como pós- secos, usualmente liofilizados, incluindo excipientes que em dissolução proporcionarão uma solução reagente apresentando a concentração apropriada.

[0091] O kit diagnóstico de acordo com a invenção pode conter uma substância adicional biologicamente ativa, como descrita abaixo. Especialmente preferidos para o uso no kit diagnóstico são inibidores de glutaminil ciclase.

[0092] O kit diagnóstico da invenção é especialmente útil para a detecção e diagnóstico de doenças e condições associadas a amiloides, em particular, doenças neurodegenerativas selecionadas do grupo que consiste em comprometimento cognitivo leve (MCI), doença de Alzheimer (AD), tal como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD) ou Demências de Alzheimer Familiar (FAD) tal como Demência britânica familiar (FBD) e Demência dinamarquesa Familiar (FBD), neurodegeneração em Síndrome de Down, preferencialmente, doença de Alzheimer.

[0093] A presente invenção se refere em particular a anticorpos que são caracterizados pelo fato de que se ligam a peptídeos AβpGlu(11) com uma alta afinidade. A presente invenção também se refere a anticorpos que são caracterizados pelo fato de que se ligam a peptídeos AβpGlu(11) ou variantes destes, com uma alta afinidade. Essa alta afinidade significa no contexto da presente invenção uma afinidade de um valor KD de 10-7 M ou superior, de preferência, um valor de KD de 108 M ou superior, e ainda mais preferencialmente, um valor de KD de 109 M - 10—12 M. Desse modo, os anticorpos da invenção se ligam a peptídeos AβpGlu(11) com uma afinidade maior que os anticorpos anteriormente conhecidos.

[0094] Em particular, o anticorpo é preferencialmente, um anticorpo monoclonal e é Aβ 13-11-6 (DSM ACC 3100).

[0095] O anticorpo de acordo com a presente invenção é especialmente útil em um método de diagnóstico para detectar a amiloidose, em particular, uma doença neurodegenerativa selecionada do grupo que consiste de comprometimento cognitivo leve (MCI), doença de Alzheimer (AD), tal como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD) ou demências de Alzheimer Familiar (FAD), tal como Demência Britânica Familiar (FBD) e Demência Dinamarquesa Familiar (FDD), neurodegeneração em Síndrome de Down, preferencialmente, doença de Alzheimer.

[0096] De acordo com uma modalidade preferida, o anticorpo pode ser humanizado ou é um anticorpo quimérico ou é um anticorpo humano.

[0097] Adicionalmente, o anticorpo conforme selecionado do grupo acima mencionado pode também ser uma variante funcional desse grupo.

[0098] No contexto da presente invenção, uma variante de um peptídeo AβpGlu(11) é em particular pGlu-Aβ11-38, pGlu-Aβ11-40, pGlu-Aβ11-42.

[0099] Variantes adicionais de peptídeos AβpGlu(11) são todas as variantes pGlu-Aβ11-x, que foram mostradas acumular-se no cérebro como uma consequência de doença de Alzheimer ou doença de Alzheimer precedente. X é definido como um número inteiro entre 18 e 42, por exemplo, no pGlu-Aβ11-42 acima, "42" seria o número inteiro para "x".

[00100] No contexto da presente invenção, uma "variante funcional" do anticorpo inventivo é um anticorpo que mantém as capacidades de ligação, em particular, capacidades de ligação com alta afinidade a um peptídeo pGlu-Aβ11-x ou variante funcional do mesmo. A provisão de tais variantes funcionais é conhecida no estado da técnica e abrange as possibilidades acima mencionadas, que foram indicadas sob a definição de anticorpos e fragmentos destes.

[00101] Em uma modalidade preferida, o anticorpo é um fragmento de anticorpo, conforme definido acima.

[00102] Em uma modalidade adicional preferida, o anticorpo inventivo é um anticorpo que se liga ao epítopo que é ligado pelos anticorpos conforme definidos acima, em particular, anticorpo 13-11-6.

[00103] Em uma modalidade adicional preferida, o anticorpo da invenção é um anticorpo que apresenta as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) dos anticorpos acima definidos. Preferencialmente, o anticorpo pode ser marcado; possíveis rótulos são aqueles conforme mencionados acima e todos aqueles conhecidos daquele versado no estado da técnica de usos diagnósticos de anticorpos, em particular.

[00104] Preferencialmente, o anticorpo é imobilizado em uma fase sólida.

[00105] A presente invenção também se refere a um anticorpo que é obtenível de linhagem celular de hibridoma 13-11-6 (DSM ACC 3100).

[00106] A presente invenção também se refere a uma composição que compreende o anticorpo conforme definido acima. Em particular, a composição é uma composição para um uso diagnóstico, especialmente, para o diagnóstico de uma doença neurodegenerativa selecionada do grupo que consiste em comprometimento cognitivo leve (MCI), doença de Alzheimer (AD), tal como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD) ou demências de Alzheimer familiar (FAD), tal como, demência britânica familiar (FBD) e demência dinamarquesa familiar (FDD), neurodegeneração em Síndrome de Down; preferencialmente, doença de Alzheimer; em particular, através de detecção de peptídeo AβpGlu(11) ou variantes deste, em uma amostra biológica.

[00107] Em outra modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção e como descrito neste relatório anteriormente, ou um fragmento do mesmo, exibe uma afinidade de ligação a um oligômero de AβpGlu(11), fibra, fibrila ou filamento que é pelo menos 2 vezes, particularmente, pelo menos 4 vezes, particularmente, pelo menos 10 vezes, particularmente, pelo menos 15 vezes, mais particularmente, pelo menos 20 vezes, mas especialmente, pelo menos 25 vezes maior que a afinidade de ligação a um monômero de AβpGlu(11).

[00108] Em ainda outra modalidade, um anticorpo, ou um fragmento deste; ou um anticorpo quimérico ou um fragmento deste, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento deste, é proporcionado conforme descrito neste relatório anteriormente, cujo anticorpo liga-se substancialmente, a Aβ agregado, incluindo placas de Aβ, no mamífero, particularmente, o cérebro humano, mas, preferencialmente, não mostra qualquer reatividade cruzada significativa com proteína precursora amiloide (APP).

[00109] Em outro aspecto da invenção, o anticorpo ou um fragmento deste, ou o anticorpo quimérico ou um fragmento deste; ou um anticorpo humanizado ou um fragmento deste, é proporcionado conforme descrito neste relatório anteriormente, cujo anticorpo liga-se substancialmente a, amiloide polimérico solúvel, particularmente, β amiloide (Aβ), incluindo, monômeros Aβ, no mamífero, particularmente, o cérebro humano, mas, preferencialmente, não mostra qualquer reatividade cruzada significativa com proteína precursora amiloide (APP).

[00110] A presente invenção se refere também a formas humanizadas dos anticorpos conforme definidos acima, a composições compreendendo os anticorpos humanizados e o uso dessas composições para o tratamento de amiloidose, especialmente, para o tratamento de doença neurodegenerativa em um mamífero, em particular, em um humano. Essa doença neurodegenerativa é, em particular, selecionada do grupo que consiste de comprometimento cognitivo leve (MCI), doença de Alzheimer (AD), tal como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD) ou demências de Alzheimer Familiar (FAD), tal como, demência britânica familiar (FBD) e demência dinamarquesa familiar (FDD), neurodegeneração em Síndrome de Down. Preferencialmente, a doença neurodegenerativa é doença de Alzheimer.

[00111] A presente invenção também se refere à linhagem celular de hibridoma 13-11-6.

[00112] A presente invenção também se refere ao uso do anticorpo ou a composição compreendendo o anticorpo, ambos conforme definidos acima, para uso em um método diagnóstico in vitro. Em particular, esse método diagnóstico se refere a, diagnóstico de uma doença neurodegenerativa selecionada do grupo que consiste de comprometimento cognitivo leve (MCI), doença de Alzheimer (AD), tal como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD) ou demências de Alzheimer Familiar (FAD), tal como, demência britânica familiar (FBD) e demência dinamarquesa familiar (FDD), neurodegeneração em Síndrome de Down; preferencialmente, doença de Alzheimer; especialmente, por meio de detecção de um peptídeo AβpGlu(11) ou variantes deste, em uma amostra biológica.

[00113] Preferencialmente, a amostra é uma amostra de soro.

[00114] De acordo com outra modalidade preferida, a amostra é um líquido ou fluido cerebrospinal (CSF).

[00115] Em uma modalidade particularmente preferida, a presente invenção se refere ao método seguinte:

[00116] Método diagnóstico in vitro ou in situ para o diagnóstico de uma doença ou condição associada com amiloide, preferencialmente, doença de Alzheimer, método este que compreende as seguintes etapas:

[00117] contatar um anticorpo de acordo com a invenção, com uma amostra, de preferência, selecionada de um soro, licor ou amostra CSF, mais preferencialmente, uma amostra de soro; ou uma parte do corpo ou área do corpo específica de um indivíduo suspeito de sofrer da condição ou doença, e

[00118] detectar ligação do anticorpo a um peptídeo AβpGlu(11), a partir da amostra.

[00119] Mais particularmente, a invenção se refere a um método de diagnóstico de uma doença ou condição associada à amiloide, preferencialmente, doença de Alzheimer, método este que compreende detectar a ligação imunoespecífica de um anticorpo ou um fragmento ativo do mesmo, a um peptídeo AβpGlu(11), em uma amostra ou in situ, o qual inclui as etapas de: (a) levar a amostra, ou uma parte do corpo ou área do corpo específica suspeita de conter a proteína amiloide em contato com um anticorpo, particularmente, um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, ou um anticorpo quimérico ou fragmento deste, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento deste, de acordo com a invenção e como descrito neste relatório anteriormente, e/ou uma parte funcional do mesmo, anticorpo este que se liga a um peptídeo AβpGlu(11); (b) permitir o anticorpo e/ou uma parte funcional do mesmo, ligar-se ao peptídeo AβpGlu(11) de modo a formar um complexo imunológico; (c) detectar a formação do complexo imunológico; e (d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de peptídeo AβpGlu(11) na amostra ou parte ou área do corpo específica.

[00120] Também compreendido é um método para determinar o grau de carga da placa amiloidogênica em um tecido e/ou fluidos corporais, método este que compreende: (a) obter uma amostra representativa do tecido e/ou fluidos corporais sob investigação; (b) testar a amostra em relação à presença de proteína amiloide com um anticorpo, particularmente, um anticorpo monoclonal, de acordo com a invenção, ou um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, de acordo com a invenção, e conforme descrito neste relatório anteriormente, e/ou uma parte funcional do mesmo; (c) determinar a quantidade de anticorpo ligado à proteína; e (d) calcular a carga de placa no tecido e/ou fluidos corporais.

[00121] Em particular, a invenção se refere a um método de determinação do grau de carga da placa amiloidogênica em um tecido e/ou fluidos corporais, em que a formação do complexo imunológico na etapa c) é determinada de modo que a presença ou ausência do complexo imunológico correlaciona-se com a presença ou ausência de proteína amiloide, em particular, peptídeos AβpGlu(11).

[00122] Em ainda outra modalidade, a invenção se refere a uma composição compreendendo o anticorpo de acordo com a invenção, ou um anticorpo quimérico ou um fragmento deste; ou um anticorpo humanizado ou um fragmento deste, de acordo com a invenção e como descrito neste relatório anteriormente, incluindo, qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou qualquer derivado ou partes funcionais deste, em uma quantidade terapeuticamente eficaz, em particular, uma composição que é uma composição farmacêutica, opcionalmente, além disso, compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00123] Em outra modalidade da invenção, a composição compreende o anticorpo em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Além disso, compreendida pela invenção é uma mistura que compreende um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, de acordo com a invenção, ou um anticorpo quimérico ou um fragmento deste, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento deste, de acordo com a invenção, e como descrito neste relatório anteriormente, incluindo, qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou quaisquer partes derivadas ou funcionais dos mesmos; em uma quantidade terapeuticamente eficaz e, opcionalmente, uma substância adicional biologicamente ativa e/ou um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um diluente e/ou um excipiente.

[00124] Em particular, a invenção se refere a uma mistura, em que a substância adicional biologicamente ativa é um composto utilizado na medicação de amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados com a proteína amiloide ou semelhante à amiloide, tal como a proteína AβpGlu(11) envolvida nas doenças neurodegenerativas selecionadas do grupo que consiste de comprometimento cognitivo leve (MCI), doença de Alzheimer (AD), tal como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (TAS) ou demências de Alzheimer familiar (FAD), tal como, demência Britânica familiar (FBD) e demência dinamarquesa familiar (FDD ), neurodegeneração em Síndrome de Down; preferencialmente, doença de Alzheimer.

[00125] Em outra modalidade da invenção, a outra substância biologicamente ativa; ou composto pode também ser um agente terapêutico que pode ser usada no tratamento de amiloidose causada por AβpGlu(11) ou pode ser usada na medicação de outros distúrbios neurológicos.

[00126] A outra substância biologicamente ativa ou composto pode exercer seu efeito biológico pelo mesmo ou similar mecanismo como o anticorpo, de acordo com a invenção, ou por um mecanismo de ação correlacionado, ou por uma multiplicidade de mecanismos de ação relacionados e/ou não relacionados.

[00127] Geralmente, o outro composto biologicamente ativo pode incluir intensificadores de transmissão de nêutrons, drogas psicoterapêuticas, inibidores da acetilcolinesterase, bloqueadores dos canais de cálcio, aminas biogênicas, tranquilizantes benzodiazepínicos, síntese de acetilcolina, intensificadores de armazenamento ou liberação, agonistas dos receptores pós-sinápticos de acetilcolina, inibidores de monoamina oxidase-A ou B, antagonistas dos receptores de N-metil-D-aspartato glutamato, drogas não esteroidais antiinflamatórias, antioxidantes, e antagonistas dos receptores serotonérgicos.

[00128] Mais particularmente, a invenção se refere a uma mistura compreendendo pelo menos um composto selecionado do grupo que consiste em compostos eficazes contra estresse oxidativo, compostos antiapoptóticos, quelantes metálicos, inibidores de reparação do ADN tais como pirenzepina e metabólitos, ácido 3-amino-1- propanossulfônico (3 APS), 1, 3-propanodissulfonato (1,3 PDS) ativadores de α-secretase, inibidores de β- e Y-secretase, proteínas tau, neurotransmissores, quebradores (breakers) de 3 folhas, atrativos para compensação de beta amiloide/componentes celulares de depleção, inibidores de beta-amiloide truncada de término N, incluindo, 3-42 beta amiloide piroglutamato, tais como inibidores de glutaminil ciclase, moléculas antiinflamatórias, ou inibidores de colinoesterase (ChEIs), tais como tacrina, rivastigmina, donepezila, e/ou galantamina, agonistas de M1 e outros fármacos, incluindo qualquer amiloide ou fármacos modificadores de tau e suplementos nutritivos, e suplementos nutritivos, juntamente com um anticorpo de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um diluente e/ou um excipiente.

[00129] A invenção adicionalmente se refere a uma mistura, em que o composto é um inibidor de colinoesterase (ChEIs), particularmente, uma mistura, em que o composto é aquele selecionado do grupo que consiste de tacrina, rivastigmina, donepezila, galantamina, niacina e memantina.

[00130] Em uma modalidade adicional, as misturas de acordo com a invenção podem compreender niacina ou memantina juntamente com um anticorpo de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um diluente e/ou um excipiente.

[00131] Em uma modalidade adicional, as misturas de acordo com a invenção podem compreender um inibidor de glutaminil ciclase juntamente com um anticorpo de acordo com a invenção e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um diluente e/ou um excipiente.

[00132] Inibidores preferidos de glutaminil ciclase são descritos no WO 2005/075436, em particular, exemplos 1-141, conforme mostrados em pp. 31-40. A síntese de exemplos 1-141 é mostrada em pp. 40-48 do WO 2005/075436. A descrição do WO 2005/075436 em relação aos exemplos 1-141, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada neste relatório como referência.

[00133] Inibidores adicionais preferidos de glutaminil ciclase são descritos no WO 2008/055945, em particular, exemplos 1-473 conforme mostrados em pp. 46-155. A síntese de exemplos 1-473 é mostrada em pp. 156-192 do WO 2008/055945. A descrição do WO 2008/055945 em relação aos exemplos 1-473, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada neste relatório como referência.

[00134] Inibidores adicionais preferidos de glutaminil ciclase são descritos no WO 2008/055947, em particular, exemplos 1-345, conforme mostrados em pp. 53-118. A síntese de exemplos 1-345 é mostrada em pp. 119-133 do WO 2008/055947. A descrição do WO 2008/055947 em relação aos exemplos 1-345, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada neste relatório como referência.

[00135] Inibidores adicionais preferidos de glutaminil ciclase são descritos no WO 2008/055950, em particular, exemplos 1-212, conforme mostrados em pp. 57-120. A síntese de exemplos 1-212 é mostrada em pp. 121-128 do WO 2008/055950. A descrição do WO 2008/055950 em relação aos exemplos 1-212, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada neste relatório como referência.

[00136] Inibidores adicionais preferidos de glutaminil ciclase são descritos no WO 2008/065141, em particular, exemplos 1-25, conforme mostrados em pp. 56-59. A síntese de exemplos 1-25 é mostrada em pp. 60-67 do WO 2008/065141. A descrição do WO 2008/065141 em relação aos exemplos 1-25, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada neste relatório como referência.

[00137] Inibidores adicionais preferidos de glutaminil ciclase são descritos no WO 2008/110523, em particular, exemplos 1-27, conforme mostrados em pp. 55-59. A síntese de exemplos 1-27 é mostrada em pp. 59-71 do WO 2008/110523. A descrição do WO 2008/110523 em relação aos exemplos 1-27, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada neste relatório como referência.

[00138] Inibidores adicionais preferidos de glutaminil ciclase são descritos no WO 2008/128981, em particular, exemplos 1-18, conforme mostrados em pp. 62-65. A síntese de exemplos 1-18 é mostrada em pp. 65-74 do WO 2008/128981. A descrição do WO 2008/128981 em relação aos exemplos 1-18, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada neste relatório como referência.

[00139] Inibidores adicionais preferidos de glutaminil ciclase são descritos no WO 2008/128982, em particular, exemplos 1-44, conforme mostrados em pp. 61-67. A síntese de exemplos 1-44 é mostrada em pp. 68-83 do WO 2008/128982. A descrição do WO 2008/128982 em relação aos exemplos 1-44, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada neste relatório como referência.

[00140] Inibidores adicionais preferidos de glutaminil ciclase são descritos no WO 2008/128983, em particular, exemplos 1-30, conforme mostrados em pp. 64-68. A síntese de exemplos 1-30 é mostrada em pp. 68-80 do WO 2008/128983. A descrição do WO 2008/128983 em relação aos exemplos 1-30, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada neste relatório como referência.

[00141] Inibidores adicionais preferidos de glutaminil ciclase são descritos no WO 2008/128984, em particular, exemplos 1-36, conforme mostrados em pp. 63-69. A síntese de exemplos 1-36 é mostrada em pp. 69-81 do WO 2008/128984. A descrição do WO 2008/128984 em relação aos exemplos 1-36, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada neste relatório como referência.

[00142] Inibidores adicionais preferidos de glutaminil ciclase são descritos no WO 2008/128985, em particular, exemplos 1-71, conforme mostrados em pp. 66-76. A síntese de exemplos 1-71 é mostrada em pp. 76-98 do WO 2008/128985. A descrição do WO 2008/128985 em relação aos exemplos 1-71, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada neste relatório como referência.

[00143] Inibidores adicionais preferidos de glutaminil ciclase são descritos no WO 2008/128986, em particular, exemplos 1-7, conforme mostrados em pp. 65-66. A síntese de exemplos 1-7 é mostrada em pp. 66-73 do WO 2008/128986. A descrição do WO 2008/128986 em relação aos exemplos 1-7, sua síntese e seu uso como inibidores de glutaminil ciclase é incorporada neste relatório como referência.

[00144] Em ainda outra modalidade da invenção, são proporcionadas misturas que compreendem "antipsicóticos atípicos", tais como, por exemplo, clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazol ou olanzapina para o tratamento de sintomas psicóticos positivos e negativos, incluindo alucinações, delírios, distúrbios do pensamento (manifestados por incoerência marcada, descarrilamento, tangencialidade), e comportamento bizarro ou desorganizado, bem como anedonia, afeto enfraquecido, apatia, e reclusão social e, juntamente com um anticorpo, especialmente, um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas particularmente, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento deste; de acordo com a invenção e como descrito neste relatório e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um diluente e/ou um excipiente.

[00145] Em uma modalidade específica da invenção, as composições e misturas de acordo com a invenção, e como descritas neste relatório anteriormente, compreendem o anticorpo e a substância biologicamente ativa, respectivamente, em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

[00146] Outros compostos que podem ser adequadamente usados nas misturas em combinação com o anticorpo, de acordo com a presente invenção, são descritos no WO 2008/065141 (ver, especialmente, páginas 37/38), incluindo, inibidores de PEP (pp. 43/44), LiCl, inibidores de dipeptidilaminopeptidases, de preferência, inibidores de enzimas semelhantes a DP IV ou DP IV (ver, páginas 48/49); acetilcolinesterase (ACE) (ver p. 47), intensificadores de PIMT, inibidores de beta secretases (ver p. 41), inibidores de gama secretases (ver, páginas 41/42), inibidores de endopeptidase neutra, inibidores de fosfodiesterase-4 (PDE-4) (ver, páginas 42/43), inibidores de TNFalfa, antagonistas de receptores muscarínicos M1 (ver, p. 46), antagonistas de receptor de NMDA (ver, páginas 47/48), inibidores de receptor Sigma-1, antagonistas de histamina H3 (ver, p. 43), agentes imunomoduladores, agentes imunossupressores ou um agente selecionado do grupo que consiste em antegren (natalizumab), Neurelan (Fampridine-SR), campath (alemtuzumab), IR 208, NBI 5788/MSP 771 (tiplimotida), paclitaxel, Anergix.MS (AG 284), SH636, Diferina (CD 271, adapaleno), BAY 361677 (interleucina-4), inibidores de matriz-metaloproteinase (por exemplo, BB 76163), interferon-tau (trofoblastina) e SAIK-MS; anticorpos de beta-amiloide (ver, p. 44), inibidores de protease cisteína (ver, p. 44.), antagonistas de MCP-1 (ver, pp. 44/45), inibidores de deposição de proteína amiloide (ver, p. 42) e inibidores de síntese de beta amiloide (ver, p. 42.), cujo documento é aqui incorporado como referência.

[00147] Em outra modalidade, a invenção se refere a uma mistura que compreende o anticorpo, particularmente, um anticorpo monoclonal, de acordo com a invenção, ou um anticorpo quimérico ou um fragmento deste, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento deste, de acordo com a invenção, e como descrito neste relatório anteriormente; e/ou a substância biologicamente ativa em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

[00148] A invenção, além disso, se refere ao uso de um anticorpo, em particular, um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas, particularmente, um anticorpo quimérico ou fragmento deste, ou um anticorpo humanizado ou fragmento deste, de acordo com a invenção, e como aqui descrito anteriormente e/ou uma parte funcional deste, e/ou uma composição farmacêutica, ou uma mistura que compreende o anticorpo, para a preparação de um medicamento para tratar ou aliviar os efeitos de amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados à formação de placas amiloides, incluindo, a amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade, tais como, doenças, incluindo, mas não se limita a, distúrbios neurológicos, tais como, Doença de Alzheimer (AD), demência com corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês), o complexo de demência de Guam Parkinson, bem como, outras doenças que são baseadas em, ou associadas às proteínas semelhantes a amiloides, tais como, paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla, doença de Creutzfeld Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada ao HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), Diabetes de Início em Adulto; amiloidose senil; tumores endócrinos, e outros, incluindo, degeneração macular.

[00149] Também, compreendido pela presente invenção é um método para a preparação de um anticorpo, particularmente, um anticorpo monoclonal, de acordo com a invenção, mas, particularmente, um anticorpo quimérico ou um fragmento deste, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento deste, de acordo com a invenção e como descrito neste relatório anteriormente e/ou uma parte funcional deste; e/ou uma composição farmacêutica, ou uma mistura compreendendo o anticorpo e/ou uma parte funcional deste, particularmente, em uma quantidade terapeuticamente eficaz, para uso em um método de prevenção, tratamento ou alívio dos efeitos de amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados à formação de placas amiloides, incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade tais como, doenças, incluindo, mas não se limita a doenças neurodegenerativas, tais como, comprometimento cognitivo leve (MCI), doença de Alzheimer (AD), tal como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD) ou demências de Alzheimer familiar (FAD), tal como Demência britânica familiar (FBD) e Demência dinamarquesa Familiar (FDD), neurodegeneração em Síndrome de Down, demência com corpos de Lewy, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês), o complexo de demência de Guam Parkinson; bem como, outras doenças que se baseiam em, ou associadas às proteínas semelhantes a amiloides, tais como, paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla, doença de Creutzfeld Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada ao HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), Diabetes de Início em Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo, degeneração macular, compreendendo a formulação de um anticorpo, particularmente, um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas, particularmente, um anticorpo quimérico ou um fragmento deste, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento deste, de acordo com a invenção, em uma forma farmaceuticamente aceitável.

[00150] Adicionalmente, compreendido pela presente invenção é um método para prevenção, tratamento ou alívio dos efeitos de amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados à formação de placas amiloides, incluindo, amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade, tais como, doenças, incluindo, mas não se limita a, distúrbios neurológicos, tais como, comprometimento cognitivo leve (MCI), doença de Alzheimer (AD), tal como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD) ou demências de Alzheimer familiar (FAD), tal como Demência britânica familiar (FBD) e Demência dinamarquesa Familiar (FDD), neurodegeneração em Síndrome de Down, demência com corpos de Lewy, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês), o complexo de demência de Guam Parkinson, bem como, outras doenças que se baseiam em, ou associadas às proteínas semelhantes a amiloides, tais como, paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla, doença de Creutzfeld Jacob, doença de Parkinson, demência relacionada com HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), Diabetes de Início em Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo, degeneração macular, por meio de administração de um anticorpo e/ou uma parte funcional deste, mas, particularmente, um anticorpo humanizado e/ou uma parte funcional deste, ou uma composição ou mistura que compreende tal anticorpo e/ou uma parte funcional deste, a um animal ou um ser humano afetado por tal distúrbio, compreendendo administrar o anticorpo em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

[00151] É também um objetivo da invenção proporcionar um método para o tratamento de amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados à formação de placas amiloides, incluindo, mas não se limitam a; doenças neurodegenerativas, tais como, comprometimento cognitivo leve (MCI), doenças de Alzheimer (AD), tal como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD) ou Demências de Alzheimer Familiar (FAD), tal como, Demência Britânica Familiar (FBD) e Demência Dinamarquesa Familiar (FDD), neurodegeneração em Síndrome de Down; particularmente, uma doença ou condição caracterizada por uma perda de capacidade da memória cognitiva, por meio de administração a um animal, particularmente, um mamífero ou ser humano, um anticorpo, particularmente, uma composição farmacêutica, de acordo com a invenção, e como descrita neste relatório.

[00152] Em uma modalidade específica, a invenção proporciona um método para reter ou aumentar a capacidade de memória cognitiva, mas, particularmente, para restaurar a capacidade de memória cognitiva de um animal, particularmente, um mamífero ou um ser humano, que sofre de perda de memória, por meio de administração a um animal, particularmente, um mamífero ou um ser humano, um anticorpo, em particular, uma composição farmacêutica, de acordo com a invenção, e como descrita neste relatório anteriormente.

[00153] É um objetivo adicional da invenção, proporcionar uma composição terapêutica e um método de produção de tal composição, bem como, um método para o tratamento de amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados à formação de placas amiloides, incluindo, amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade, incluindo, mas não se limita a, doenças neurodegenerativas, tais como, comprometimento cognitivo leve (MCI), doença de Alzheimer (AD), tal como, por exemplo, doença de Alzheimer esporádica (SAD) ou demências de Alzheimer Familiar (FAD), tal como, Demência Britânica Familiar (FBD) e Demência Dinamarquesa Familiar (FDD), neurodegeneração em Síndrome de Down; particularmente, uma doença ou condição caracterizada por uma perda de capacidade da memória cognitiva, usando um anticorpo, de acordo com a invenção, e como descrito neste relatório anteriormente.

[00154] Em particular, a invenção se refere ao tratamento de um animal, particularmente, um mamífero, ou um ser humano, que sofre de uma condição associada a, amiloide, caracterizada pelo fato de que uma perda de capacidade da memória cognitiva que leva à retenção de capacidade da memória cognitiva.

EXEMPLOS 1. Material e Métodos 1.1 Técnicas de cultura celular 1.1.1 Células de hibridoma e triagem de anticorpos

[00155] Células de hibridoma murino que produzem anticorpos monoclonais (mAb) contra espécies Aβ foram fornecidas a partir de BioGenes GmbH (Berlin). Camundongos BALB/c foram imunizados com antígeno químico sintetizado Aβ(pE11-14) que foi ligado no resíduo de cisteína de término C com proteína hemocianina do caramujo Megathura crenulata (keyhole limpet hemocyanin) (KLH). A proteína KLH é potentemente imunogênica e foi aplicada como proteína veículo de vacina.

[00156] A fusão celular foi realizada com células de baço dos camundongos imunizados e a linhagem celular do mieloma murino SP2/0-Agl4. Após a fusão celular, as células de hibridoma foram selecionadas com meio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT). Portanto, o meio de HAT permite seleção de células do hibridoma, que herdam o gene de hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (HGPRT) a partir de células B e de propriedades tumorigênicas de células do mieloma. Posteriormente, os sobrenadantes de hibridoma foram pesquisados quanto à presença de mAb específico contra Aβ (pE11-14). Os mAb foram examinados quanto à sua capacidade de se ligarem a diferentes peptídeos Aβ modificados. Portanto peptídeos Aβ foram marcados em uma membrana de hidróxi-celulose, incubados com mAb a partir de sobrenadantes de cultura celular e foram detectados por anticorpos marcados. As células de hibridoma, que produzem o mAb específico contra o peptídeo Aβ11 (pE) modificado de término N e mostraram nenhuma reação cruzada significativa com outros peptídeos Aβ modificados (ver, Tabela 1) foram selecionados para reclonagem. Através de técnicas de diluição limitadas, as células de hibridoma foram clonadas para obter um clone isolado.

[00157] O clone de hibridoma seguinte era estável após reclonagem e fornecido de BioGenes:

[00158] pEVHH-59025 13-11-6 (clone 13).

[00159] O presente estudo pretendido a cultivar com sucesso as células de hibridoma para a produção de mAb em sobrenadante de cultura celular. A concentração de mAb no sobrenadante de cultura celular do clone deve ser determinada por ressonância plasmônica de superfície, Surface Plasmon Resonance (SPR). Um objetivo adicional foi a otimização de cultivo, por meio do que a adaptação de células de hibridoma a partir de soro contendo meio livre de soro deve ser realizada para simplificar a purificação de mAb. Além disso, o mAb deve ser purificado, caracterizado biofisicamente e aplicado em ensaio, ou utilizado para imunocoloração.

Tabela 1: Sequência de aminoácidos de peptídeos Aβ11(pE) e Aβ modificado.

[00160] O peptídeo marcado de cinza AβpE(11-23) contém a sequência alvo com piroglutamato no término N

1.1.2 Cultivo de células de hibridoma

[00161] As células de hibridoma foram cultivadas em frascos de cultura celular a 37oC e em uma atmosfera umidificada de CO2 a 5%. O cultivo de meio D-MEM (com L-glutamina, piruvato de sódio, 4,5 g/l de glicose, Invitrogen), foi suplementado com FBS a 15% e MEM-NEA a 1% (aminoácidos não essenciais, Invitrogen). Imediatamente, antes de utilização de meio de cultura de uma solução estoque de β- mercaptoetanol 50 mM e uma solução fresca de estoque descongelada de L-glutamina 200 mM foram utilizadas com uma concentração final de, pelo menos, β-mercaptoetanol 50 μM e L-glutamina 2 mM. A subcultura de células foi realizada rotineiramente dependente da densidade celular duas vezes por semana. A densidade das células deve ser entre 1 x 106 e 2 x 106 células vivas/mL. Em relação à passagem de células de hibridoma, as células aderentes parciais foram descoladas do fundo do frasco através de pipetagem de suspensão celular cuidadosamente ascendente e descendente, transferidas para tubos Falcon e centrifugadas a 300 x g durante 5 minutos. Posteriormente, o sobrenadante de cultura celular contendo mAb foi aspirado, em seguida, coletado em um reservatório e armazenado a 4°C. Para medição de SPR, uma amostra (100 μL) foi tomada a partir do sobrenadante de cultura celular. Após ressuspensão de pélete celular com meio de cultura fresco a densidade celular foi determinada utilizando Contador de células Casy® (Scharfe System GmbH, Reutlingen). Portanto, a suspensão celular foi diluída 10 vezes em Casy® ton (solução salina fisiológica) e, em seguida, 100 μL de diluição de células foram transferidos para 9.900 μL de Casy®ton. O dispositivo determinou a quantidade de células vivas e mortas, bem como a quantidade total de células por mL na amostra por exclusão de corrente elétrica. Células vitais com as membranas celulares intactas excluem a corrente elétrica, visto que as células mortas com as membranas celulares defeituosas são eletricamente condutivas. Em seguida, as células foram semeadas com uma densidade, dependente do crescimento celular, entre 1 x 105 e 5 x 105 células vivas/mL em frasco T (25 cm2 - 175 cm2, de acordo com exigência).

1.1.3 Criopreservação de células de hibridoma

[00162] Células de hibridoma em fase logarítmica de crescimento e com viabilidade acima de 85% foram criopreservadas. Congelamento de células deve ser realizado o mais cedo possível com o baixo número de passagens. As células de hibridoma foram centrifugadas a 300 x g durante 5 minutos e ressuspensas sob uma concentração de 7 x 106 células vivas/mL em 45% de meio de cultura (D-MEM, 1% de MEM- NEA, FBS a 15%), 45% de soro fetal bovino (FBS) inativado por calor e sulfóxido de dimetila a 10% (DMSO). A suspensão celular foi rapidamente transferida em alíquotas de 1 mL para criofrascos. Os criofrascos foram colocados no interior do recipiente de congelamento cheio com álcool isopropílico de QUALIFREEZE para garantir uma taxa de arrefecimento lenta de 1°C por minuto. O recipiente de congelamento foi armazenado por um período máximo de 48 horas a -80°C. Posteriormente, os criofrascos foram transferidos para nitrogênio líquido a -196°C.

1.1.4 Descongelamento de células de hibridoma

[00163] As células de hibridoma armazenadas em nitrogênio líquido foram descongeladas rapidamente em um banho de água a 37°C até que pequenos pedaços de gelo foram deixados no interior. Os meios de congelamento usados continham DMSO que apresenta um efeito tóxico da célula sob temperaturas superiores a 4°C. Portanto, o meio de cultura celular deve ser arrefecido a 4°C. A suspensão celular foi transferida em tubos Falcon e diluída gota a gota, com 5 mL de meio de cultura a 4°C. As células foram imediatamente centrifugadas a 300 x g durante 5 minutos e o sobrenadante com o agente anticongelante tóxico celular DMSO foi aspirado. O pélete de células foi ressuspenso em meio de cultura celular aquecido a 37°C e semeado em um frasco T de 25 cm2 com uma densidade celular de 5 - 7 x 105 células vivas por mL.

1.1.5 Triagem de contaminação

[00164] Células de hibridoma foram examinadas a cada dois meses para contaminação por micoplasma. Portanto, o Kit de detecção MycoAlert® Mycoplasma de Lonza foi usado para testar o sobrenadante de cultura celular. O ensaio é um teste bioquímico seletivo que explora a atividade de certas enzimas do micoplasma. Os micoplasmas viáveis são lisados e as enzimas reagem com o substrato MycoAlertTM catalisando a conversão de ADP em ATP. O aumento de nível de ATP pode ser detectado usando uma reação de bioluminescência porque a intensidade da luz emitida correlaciona-se com a concentração de ATP.

[00165] Portanto, uma amostra de sobrenadante de cultura celular foi centrifugado a 200 x g durante 5 minutos, em seguida 100 μL de sobrenadante de hibridoma foram misturados com 100 μL de Reagente MycoAlert™ em uma placa de 96 poços e incubados 5 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi medida com o luminômetro GeniosPro (Tecan) e, em seguida, 100 μL de substrato MycoAlert™ foram adicionados, incubados por 10 minutos à temperatura ambiente e a luminescência foi medida novamente. Quando a razão de segunda medição de luminescência, primeiro é menor que 1, as células não são contaminadas.

1.1.6 Cultivo de célula de hibridoma em frasco de agitação

[00166] Células de hibridoma crescem em cultura de suspensão estacionária (por exemplo, frasco T) e, em cultura de suspensão agitada (por exemplo, frasco de agitação). Para a produção de anticorpos as células de hibridoma foram cultivadas por cerca de sete dias em frascos de agitação paralelos para cultivo estacionário em frascos T. As células foram semeadas com uma densidade entre 3 x 105 e 5 x 105 células/mL em frasco de agitação. Os meios de cultura celular (D-MEM, MEM-NEA a 1%, FBS a 15%, ou FBS de IgG ultra-baixa) foram suplementados com gentamicina a 0,5%, β-mercaptoetanol 50 μM e L-glutamina 2 mM. Para facilitar uma troca gasosa ótima apenas cerca de 30% de volume total do frasco de agitação foram preenchidos com meios. A cultura de suspensão em frascos de agitação foi incubada a 37°C, CO2 a 5% e girada a 80 rpm. Após incubação de sete dias a suspensão celular foi transferida com pipeta para tubos Falcon e centrifugada a 500 x g durante 10 minutos. Posteriormente, o sobrenadante de cultura celular contendo os anticorpos foi coletado em um reservatório e armazenado a 4°C. Para medição de SPR, tomou-se uma amostra de sobrenadante de cultura celular. O pélete celular foi descartado.

1.1.7 Adaptação de células de hibridoma a meios livres de soro

[00167] A aplicação de meios livres de soro simplifica a purificação do mAb produzido em contraste com meio suplementado com soro. Meios livres de soro são livres de BSA e imunoglobulinas bovina (por exemplo, IgG), facilitando purificação de mAb. As células devem ser adaptadas a partir de meio contendo soro (D-MEM, FBS a 15%, MEM- NEA a 1%) para condições livres de soro por meio de redução gradual da concentração sérica para garantir uma alta vitalidade celular e taxa de produção de anticorpos. Portanto, as células devem ser em fase logarítmica de crescimento moderado com viabilidade superior a 90% antes de adaptação. Em seguida, diferentes meios livres de soro e meios livres de proteína foram testados (ver Tabela 2). Tabela 2: Meios livres de soro e meios livres de proteína testados de cultivo de células de hibridoma

[00168] Todos os meios testados foram suplementados com gentamicina a 0,5%. Imediatamente, antes de uso de meio de cultura, β-mercaptoetanol 50 μM e L-glutamina 2 mM foram adicionados. Paralelos à adaptação de meios livres de soro, também meios de cultura (D-MEM, MEM-NEA a 1%) com 15% de FBS de IgG ultrabaixa (Invitrogen) contendo menos de 5 μg/mL de IgG foram testados. Devido à presença de FBS, as células foram adaptadas diretamente ao meio de cultura. Portanto, as células foram subcultivadas com uma densidade de semeadura de 4 x 105 de células vivas/mL em meio de cultura com 15% de FBS de IgG ultrabaixa. A subcultura adicional de células foi realizada rotineiramente dependente da densidade celular, duas vezes por semana.

[00169] As células de hibridoma foram cultivadas em frasco T de 175 cm2 a 37oC e em uma atmosfera umidificada de CO2 a 5%.

1.1.8 Preparação de curvas de crescimento

[00170] Curvas de crescimento durante sete dias foram criadas para análise a longo prazo de crescimento de células de hibridoma em meios livres de soro e meios contendo soro. As células de hibridoma foram cultivadas em frascos de agitação. Portanto, um frasco de agitação de 125 mL foi inoculado com um volume de processamento de 30 mL de suspensão celular a 37°C, CO2 a 5%, e foi agitado a 80 rpm. Regularmente, uma amostra de 300 μL foi obtida a partir do frasco de agitação para a determinação de número de células e concentração de anticorpos no sobrenadante de cultura celular. Para a otimização de meios, meios contendo soro com FBS a 15% ou FBS a 15% de IgG ultra- baixa (Invitrogen) e livres de soro, bem como meios livres de proteína das empresas PAA e GIBCO foram testados.

1.2 Purificação de anticorpos 1.2.1 Cromatografia de afinidade

[00171] O mAb enriquecido no sobrenadante de cultura celular de hibridoma foi purificado utilizando cromatografia de afinidade. Portanto, foi usada uma coluna HiTrap de Proteína G HP (5 mL), com proteína G recombinante acoplada a 6% de material de suporte dextrano reticulado (GE Healthcare, Uppsala). Proteína G, uma proteína de superfície celular de bactérias Streptococci de grupo G, é um receptor de Fc do tipo III, que se liga à região Fc de IgG de mamíferos por um mecanismo não-imunológico. O receptor Fc também apresenta uma região de ligação de albumina. Mas o sítio de ligação da albumina é geneticamente suprimido a partir de forma recombinante de proteína G, evitando desse modo, reações cruzadas indesejáveis com albumina e assim a purificação de anticorpos a partir de sobrenadante de cultura celular contendo FBS é possível. Contudo, a proteína G liga-se além de IgG de camundongo também IgG bovina. Por essa razão, o cultivo de células de hibridoma FBS-IgG ultra-baixa (Invitrogen) contendo menos de 5 μg/mL de IgG foi usado e também meios livres de soro e livres de proteína foram testados para o cultivo de hibridoma.

[00172] A cromatografia de afinidade foi realizada no purificador Akta™ (GE Healthcare). No início, a coluna foi lavada com água bidestilada desgaseificada para remover o conservante de etanol. A coluna inteira foi arrefecida a 4°C. Em seguida, a coluna de proteína G foi equilibrada com 1 x tampão de ligação (Na2HPO4 20 mM, pH 7,0) para assegurar que o pH ótimo 7 e força iônica adequada para a ligação de anticorpo. O sobrenadante de cultura celular foi centrifugado a 38.400 x g (Avanti J-30I, BECKMAN COULTER) a 4°C e 30 minutos para remover os fragmentos celulares restantes. Para a cromatografia, o sobrenadante de cultura celular foi misturado a 1:1 com tampão de ligação 2 x (Na2HPO4 40 mM, pH 7,0). A aplicação da sonda na coluna foi realizada com a bomba de aplicação da amostra de Purificadores Akta™ P-950 com um fluxo de 1,5 mL/minuto, durante a noite, por meio do que o sobrenadante foi arrefecido com gelo. Desse modo, a pressão total máxima permitida não deve exceder a 0,3 MPa porque a pressão excessiva pode destruir o leito de gel do material de suporte. Após isso, o excesso e componentes inespecíficos foram lavados da coluna com tampão de ligação, seguido por um gradiente de NaCl de 0 a 2 M sobre 5 volumes de coluna. Posteriormente, a coluna foi lavada novamente com 1 x tampão de ligação. Dois métodos diferentes foram testados para eluir os anticorpos a partir da coluna. A proteína foi eluída em fluxo inverso de 2,5 mL/minuto, e a fração foi coletada com o aumento de absorção em 280 nm. O primeiro método de eluição foi realizado com solução de glicina-HCl 0,1 M (pH 2,7) por mudança de pH. Devido à alteração de pH, as imunoglobulinas ligadas foram liberadas da proteína G e foram então coletadas. Após eluição, o pH na fração de eluição foi imediatamente neutralizado por meio de titulação com Tris-HCl 1 M, pH 9,0. A coluna foi lavada com 1 x tampão de ligação para equilibrar a coluna a pH 7,0. O segundo método, foi realizado com um gradiente de tiocianato de potássio (KSCN) de 0 a 2 M sobre 5 volumes de coluna, por meio do que o pH se mantém constante em 7,0. As interações entre o anticorpo e a proteína G foram afrouxadas por meio de KSCN. Após eluição, a coluna foi enxaguada 1 x com tampão de ligação.

[00173] Posteriormente, a solução de anticorpos foi imediatamente dialisada para trocar o tampão.

1.2.2 SDS-Poliacrilamidogeleletroforese (SDS-PAGE)

[00174] O SDS-Poliacrilamidogeleletroforese é usado para separar proteínas de acordo com seu peso molecular no campo elétrico. Com o detergente SDS (dodecilsulfato de sódio), as cargas intrínsecas de polipeptídeos foram sobrepostas através da acumulação de SDS no polipeptídeo (aproximadamente, 1 molécula por 1,6 aminoácido). Desse modo, a mobilidade eletroforética depende amplamente do peso molecular da proteína. Para a redução das proteínas, as sondas foram diluídas com tampão de amostra de SDS (Roti®-Load 1, BioRad), na proporção 1:3 (v/v) e incubadas por 10 minutos a 95°C. O tampão de amostra SDS contém β-mercaptoetanol que reduz ligações de dissulfeto de proteínas e causar a separação de cadeias pesadas e leves de anticorpos. Amostras que não deverão ser reduzidas foram diluídas com tampão de amostra (Tris-HCl 250 mM, pH 8,0; 5% (p/v) de SDS, 50% (v/v) de glicerina, 0,005% (p/v) de azul de bromofenol), não contendo nenhum β-mercaptoetanol. O tampão foi diluído na proporção de 1:4 (v/v) com a amostra. Antes de aplicação da amostra a um gel de poliacrilamida, as sondas foram agitadas ligeiramente a 30°C por 30 minutos. No presente processamento, frações de cromatografia de afinidade (ver, capítulo 1.2.1) foram analisadas em SDS-PAGE para análise de teste da presença e pureza dos anticorpos a serem analisados. A separação de proteínas foi realizada em 12% de gel de poliacrilamida (ver composição, Tabela 3). A eletroforese foi realizada em uma câmara de corte vertical, preenchida com 1 x tampão de processamento (30,3 g/l de Tris, 10 g/l de SDS, 144 g/l de glicina) e iniciada com 100 V por 10 minutos e, em seguida, aumentada para uma voltagem constante de 200. Além das sondas, uma escada (ladder) de proteínas pré-coradas (10 - 250 kDa, Fermentas) foi aplicada como referência de peso molecular.

[00175] As proteínas foram coradas com Azul Brilhante de Coomassie G250, durante 30 minutos. Após isso, o gel foi descorado com ácido acético a 10% durante várias horas. Tabela 3: Composição de gel de empilhamento e separação por SDS- PAGE

1.2.3 Diálise e concentração elevada de proteínas

[00176] A diálise foi utilizada para a transformação de solução de anticorpos em tampão de armazenamento (D-PBS com EDTA 2 mM (pH 7,13)), utilizando as propriedades semipermeáveis de membrana da diálise. Após purificação de anticorpos com cromatografia de afinidade, as frações de eluição contendo anticorpos foram dialisadas. No início, o tubo de diálise foi embebido em água destilada para se alcançar a semipermeabilidade, flexibilidade do tubo e para remover os agentes de preservação. O tubo de diálise com um limiar de corte de 6 - 8 kDa foi preenchido com a solução de anticorpos e suspenso em tampão de armazenamento. Após isso, a solução de anticorpo foi dialisada durante a noite a 4°C, sob agitação constante contra o volume de amostra 100 vezes maior. Posteriormente, a concentração foi determinada com espectroscopia UV/VIS. A solução de anticorpo foi subconcentrada a pelo menos 2 mg/mL, utilizando tubos de 20 mL VIVASPIN CONCENTRADOR" da empresa VIVASCIENCE com limiar de corte de 5 kDa. A solução de anticorpos foi centrifugada a 4°C e 3.500 x g em um Swing-Out-Rotor de Sigma. Finalmente, o anticorpo foi dialisado contra D-PBS com EDTA 2 mM (pH 7,13). 1.2.3.1 Biotinilação de anticorpos

[00177] A biotinilação do anti Aβ11(pE) (clone 13) de mAb de camundongo foi necessária para a aplicação em ELISA de Aβ11(pE), como anticorpo para detectar especificamente peptídeos Aβ(pEII-x) em amostras biológicas. Para a detecção um polímero de estreptavidina-peroxidase foi adicionado ao anticorpo biotinilado, por meio do que uma forte interação não covalente entre a estreptavidina e biotina foi formada.

[00178] A biotinilação foi realizada com anticorpo concentrado (ver seção 1.2.3). No primeiro, o mAb purificado e concentrado foi dialisado contra tampão de biotinilação (NaH2PO4100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2) a 4°C durante a noite. Em seguida, a concentração de proteína foi determinada via espectro de UV (ver seção 1.3.1). O agente de biotinilação (NHS-PEO4-Biotina) foi dissolvido em água destilada para preparar uma solução 20 mM. A reação foi realizada em uma razão molar de anticorpo: biotina de 1:6 e incubada a 4°C por 4 horas. A reação entre anticorpo e biotina ativada foi interrompida com a adição de tampão Tris 1 M, pH 9,0 com excesso de 50 vezes referido à quantidade da mistura reacional e em seguida incubada a 4°C durante 1 hora. A solução de anticorpo-biotina foi dialisada duas vezes contra tampão de diálise (D-PBS, EDTA 2 mM) a 4°C por dois dias, e a concentração de proteína foi determinada via espectro de UV (ver seção 1.3.1). Para a estimativa de nível de biotina incorporada 100 μL de solução HABA-Avidina foram adicionados a 800 μL de tampão de diálise, incubados na cuveta de medição durante 10 minutos e, em seguida, A500 com Espectrômetro de UV-UV1 foi medido. Em seguida, essa solução de 100 μL de anticorpo-biotina foi adicionada à solução na cuvete, misturada e a absorção de A500 foi medida novamente quando o valor mantém-se constante por pelo menos 15 segundos. A biotina forma um complexo com avidina, resultando na redução de absorção em 500 nm. Calculou-se então o nível de incorporação de biotina (moles de biotina por mol de proteína).

1.3 Métodos para caracterização biofísica de anticorpos 1.3.1 Espectroscopia de UV/VIS

[00179] Após a purificação de anticorpo anti Aβ11(pE), o espectro de UV/VIS foi determinado. Para a determinação da concentração de proteína, a absorção em 280 nm e também o espectro de UV entre 240 nm e 339 nm foi medido com o espectrômetro de UV-UV1 de Thermo Scientific. A concentração de proteína foi determinada pela absorção de A280 e o coeficiente de extinção. Um coeficiente de extinção de ε = 1,5 foi assumido para o anticorpo anti Aβ11(pE). 1.3.2 Determinação de estabilidade de proteína termodinâmica via Espectroscopia de CD

[00180] O anticorpo anti Aβ11(pE) purificado foi dialisado contra NaH2PO4 10 mM (pH 7,14). A concentração foi determinada por espectroscopia de UV/VIS (ver seção 1.3.1). Para espectroscopia de CD o anticorpo foi diluído para uma concentração de 0,13 mg/mL e preenchido em uma cuvete de vidro de quartzo (d = 0,1 cm). O espectro de CD foi medido com o Espectro-Polarímetro Jasco J-710 (Jasco GmbH, Groβ-Umstadt) entre 190 e 260 nm. Os espectros sob temperatura de 20°C foram medidos com 20 acumulações. Em seguida, a temperatura foi aumentada de 20°C até 80°C, por meio do que a elipticidade foi medida sob intervalo de 5°C com 10 acumulações. A taxa de aquecimento foi de 30 K/hora, e a temperatura foi equilibrada em 180 segundos antes de cada medição. 1.3.3 Ressonância Plasmônica de Superfície 1.3.3.1 Imobilização de ligante em chip CM5

[00181] O peptídeo sintetizado Aβ(pE11-30), armazenado em hexafluorisopropanol (HFIP) a -80oC, foi descongelado sob temperatura ambiente. O tubo contendo o peptídeo foi deixado aberto sob uma coifa durante a noite para evaporar o solvente HFIP. Com acetato de sódio 10 mM, pH 5 o peptídeo foi diluído a uma concentração sob 1 mg/mL.

[00182] O chip CM5 usado apresenta uma matriz de dextrano carboxilado. Para acoplamento do peptídeo Aβ(pE11-30), foi utilizado o método de acoplamento de amina. Foi necessário ativar a superfície do chip sensor antes de acoplamento do peptídeo. Portanto, os reagentes de ativação 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil)-carbodiimida (EDC) 0,4 M e N-hidroxissuccinimida (NHS) 0,1 M foram misturados sob uma proporção 1:1 e injetados com 10 μL/minuto durante 8 minutos em chip CM5. Em seguida, o acoplamento de peptídeo seguiu. Primeiramente, 10 μg/mL de peptídeo Aβ(pE11-30) em di-hidrogeno-ortofosfato de potássio 10 mM, pH 6 foram injetados com uma vazão de 10 μL/minuto durante 5 minutos. Devido à elevação de sinal baixo, o peptídeo foi novamente aplicado com uma concentração superior diluído em uma solução com pH 5. 50 μg/mL de peptídeo Aβ(pE11-30) em acetato de sódio 10 mM, pH 5 foram injetados com uma vazão de 10 μL/minuto durante 20 minutos. Um pH ácido moderado foi escolhido para o acoplamento proporcionar uma pré-concentração do peptídeo (carga líquida positiva) na superfície do sensor (carga líquida negativa de grupo carboxílico) por atração eletrostática. A ligação covalente do peptídeo foi formada pela reação dos dois aminoácidos lisina (na posição de peptídeos 16 e 28) com o grupo carboxila ativado na superfície do chip. Grupos éster reativos em excesso foram desativados com etanolamina 1 M, pH 8,5 com uma vazão de 10 μL/minuto durante 10 minutos. Peptídeos não imobilizados foram removidos por meio de injeção de HCl 0,1 M (3 x 10 μL) e, subsequentemente, o chip foi lavado durante a noite com tampão de processamento. No término, o sinal foi de aproximadamente 1000 unidades de resposta (UR), por meio do que a superfície do chip foi saturada com o peptídeo. Portanto, o chip revestido foi utilizado para determinação de teor do anticorpo anti Aβ11(pE) fora de sobrenadante de cultura celular. 1.3.3.2 Quantificação de anticorpos anti Aβ11(pE)

[00183] Para a medição de concentração de anticorpo anti Aβ11(pE), utilizou-se um chip CM5, o qual foi revestido com Aβ (pE11-30). A superfície do chip foi saturada com o peptídeo e o sinal foi de aproximadamente 1000 unidades de resposta (UR) (ver seção 1.3.3.1). O mAb contendo em sobrenadante de cultura celular foram apropriadamente diluídos em tampão de processamento (tampão de EDTA HEPES (HBS-EP), Biacore) para análise de anticorpo. Em primeiro lugar, as células de fluxo de chip sensor foram lavadas com tampão de processamento. Posteriormente, a solução de anticorpo com anti Aβ11(pE) foi injetada com uma vazão de 30 μL/minuto durante 300 segundos para caracterizar a associação do anticorpo no antígeno. Uma célula de fluxo não modificada foi utilizada como referência, a qual apenas deve mostrar as interações não específicas do anticorpo com a matriz. Posteriormente, o tampão de processamento foi outra vez injetado automaticamente por uma válvula de transição (switch-over) para induzir a dissociação do anticorpo. Finalmente, o chip foi regenerado por meio de injeção de HCl 0,1 M (10 μL), por meio do que o anticorpo remanescente foi removido da superfície do sensor. A avaliação da ligação foi realizada com o programa BIAevaluation (Biacore, Freiburg).

[00184] Para a quantificação de concentração de anticorpo em amostras de sobrenadante de cultura celular, mediu-se a curva padrão com concentrações conhecidas determinadas por espectroscopia de UV/VIS do mAb purificado e dialisado a partir de clone 13 de hibridoma. O mAb foi purificado como descrito na seção 1.2.1. Em relação à concentração padrão mais elevada, 10 μg/mL de mAb foram aplicados e diluídos em tampão de processamento até a concentração mais baixa de 0,04 μg/mL, por realização de uma divisão de raiz dois. 1.3.3.3 Determinação de reatividade cruzada por SPR

[00185] A reatividade cruzada de anticorpo anti Aβ11(pE) (clone 13) para peptídeos piroglutamato Aβ3(pE), Aβ11(pE), CCL2 (conhecido como MCP-1), CCL8 (conhecido como MCP-2), gastrina volumosa, gonadoliberina, neurortensina, orexina A, fibronectina, colágeno 1 e TRH (hormônio de liberação de tirotropina) foi testada via SPR. Portanto, foram utilizados chips CM5 com uma alta concentração de peptídeos piroglutamato imobilizados. Anticorpo clone 13 foi diluído em tampão de processamento e injetado com 1 μg/mL, uma vazão de 30 μl/minuto durante 300 segundos.

1.3.4 Calorimetria Isotérmica de Titulação (CIT) 1.3.4.1 Determinação de parâmetros termodinâmicos

[00186] Com CIT, determinam-se os parâmetros termodinâmicos da ligação de anticorpo anti Aβ11(pE) de clone 13 em antígeno Aβ11 (pE). Para o experimento de CIT, o peptídeo Aβ (pE11-18)-PEG foi utilizado porque o grupo de PEG hidrófilo confere propriedades hidrófilas e assim foi possível dissolver o peptídeo diretamente em tampão de CIT. Experimentos anteriores com Aβ (pE11-20), pode apenas ser realizados com 1 - 2% de DMSO, devido à forte hidrofobicidade do peptídeo ser necessário para dissolvê-lo com DMSO, o que podia apresentar um efeito sobre as propriedades de ligação da CIT. Primeiramente, o anticorpo foi dialisado contra tampão de CIT (NaCl 150 mM, Na2HPO4 25 mM, KH2PO4 25 mM, EDTA 1 mM, pH = 7,1) durante a noite a 4°C. O peptídeo liofilizado, armazenado sob -20°C, foi dissolvido em tampão idêntico a CIT, pH = 7,1, que foi utilizado para a diálise do anticorpo. Tanto anticorpo quanto o antígeno deve ser em soluções idênticas, de outra maneira grandes calores de diluição mascararão a observação desejada. Antes do experimento CIT, a concentração de anticorpo foi determinada por espectroscopia de UV/VIS (ver seção 1.3.1). A princípio, o anticorpo com, por exemplo, 5,13 μM (ver, Tabela 4) foi adicionado na célula de amostra e a célula de referência foi preenchida com água destilada. Em seguida o antígeno foi injetado na célula de amostra com, por exemplo, 81,78 μM (ver, Tabela 4). O antígeno deve ser geralmente, em excesso duplo para o anticorpo, tendo em mente que um anticorpo apresenta dois sítios de ligação, o antígeno estava na célula, pelo menos, em excesso quatro vezes para o anticorpo. As 30 injeções (1 x 2 μL e 29 x 10 μL) foram produzidas com um intervalo de 4 minutos entre as injeções subsequentes. A medição de calor de reação foi realizada a 20°C. Além disso, o calor de reação foi determinado, o qual apenas foi gerado por diluição do antígeno através da titulação para tampão CIT (pH = 7,1). Portanto, o antígeno foi injetado na célula de amostra preenchida com tampão de CIT. O calor de reação que foi gerado durante a titulação do antígeno para o anticorpo foi corrigido em cerca desse valor. A análise dos dados brutos e a determinação da constante de associação (KA), estequiometria de reação (n), entalpia de ligação (ΔH) e entropia (ΔS) foi realizada com o software Origin de MicroCal.

[00187] Com CIT, os parâmetros de ligação de anticorpo anti Aβ11(pE) eluído a partir de coluna de proteína G com gradiente de KSCN (pH 7,0), com glicina-HCl 0,1 M (pH 2,7) e também o anticorpo biotinilado foram analisados. Na Tabela 4, as concentrações de antígeno e anticorpo usados são listadas. Tabela 4: Concentrações de peptídeo Aβ(pE11-18)-PEG e anticorpo anti Aβ11(pE) em CIT

[00188] Concentrações usadas do anticorpo eluído com gradiente de KSCN (pH 7,0) e glicina-HCl 0,1 M (pH 2,7) a partir de coluna de proteína G, respectivamente, e do anticorpo anti Aβ11(pE) biotinilado. A interação de peptídeo Aβ(pE11-18)-PEG e os três anticorpos foram analisados em CIT.

[00189] O anticorpo anti Aβ11(pE) eluído por glicina foi aplicado em uma concentração maior que o anticorpo eluído por KSCN devido à presunção de que o anticorpo foi parcialmente inativado por eluição ácida.

1.4 Aplicação de anticorpos anti Aβ11(pE) monoclonais 1.4.1 Estudo PBD-0316

[00190] Amostras de plasma e soro de pacientes com AD (n = 13) e 30 controles saudáveis foram analisadas no presente estudo. As 43 amostras analisadas procedem do estudo inicial e foram recrutadas através de um CRO (GALMED GmbH). As amostras originadas de pacientes com um diagnóstico clínico de AD e de grupos de controle. Em um exame de pré-estudo as funções neuropsicológicas de todos os participantes do estudo foram testadas por vários testes psicométricos (DemTect, Teste Mini-Mental-State, Teste do relógio (clock-drawing). A escala DemTect é um teste rápido para detecção de demência compreendendo cinco subtestes curtos (repetição de lista de 10 palavras, transcodificação de números, tarefa de fluência de palavra semântica, teste dos dígitos inversos, recordação tardia de lista de palavras (Kessler e outros, 2000, Psycho 26 343 - 347). O Exame de Estado Mini-Mental (MMSE) ou teste de Folstein é um teste de questionário breve de 30 pontos, que é utilizado para avaliar a cognição. É comumente usado na medicina para triagem de demência. No intervalo de tempo de aproximadamente 10 minutos, estas amostras de várias funções, incluindo aritmética, memória e orientação. O teste inclui perguntas e problemas simples em um número de áreas: o tempo e local do teste, listas de repetição de palavras, aritmética, uso da linguagem e compreensão e habilidades motoras básicas repetir.

[00191] Classificação dos relógios (clock-drawing test) foi baseada em uma modificação da escala usada por Shulmann e outros, 1986. Todos os círculos foram pré-desenhados e a instrução para os participantes foi a "definir o tempo de 10 após 11".

[00192] Após exame de pré-estudo, o estudo iniciou 2 semanas posteriores com retirada de sangue de todos os participantes, definiu como ponto de tempo zero. Todas as amostras de sangue para a determinação de biomarcadores de AD foram coletadas em tubos de polipropileno (Sarstedt Monovette) contendo EDTA potássio de plasma de EDTA e branco para soro. Todas as amostras foram coletadas por punção venosa ou por retirada repetida de uma cânula residente inserida em veia do antebraço e centrifugadas com 1.550 g (3.000 rpm) durante 10 minutos a 4°C para proporcionar plasma. As amostras foram centrifugadas dentro de uma hora após a retirada de sangue. Plasma ou soro de cada amostra separada foi pipetado fora, preenchido em um criotubo de polipropileno de 5 mL e armazenado congelado a -80°C. Após 3; sangue de 6 e 12 meses foi novamente retirado de todos os participantes e manipulados conforme descrito acima.

1.4.2 ELISA de auto-Ig 1.4.2.1 Desempenho e estabelecimento de auto-Ig-ELISA

[00193] Testes ELISA de auto-Ig foram realizados e estabelecidos para a análise de auto-imunoglobulinas em amostras de plasma de pacientes com doença de Alzheimer (AD), e controles saudáveis. Especialmente auto-imunoglobulinas contra o término pE-N de peptídeos Aβ e peptídeos Bri2 devem ser testadas. O auto-Ig-ELISA é construído de acordo com o princípio do ELISA tipo sanduíche direto. Portanto, microplacas revestidas com estreptavidina (Thermo Scientific) foram usadas para a imobilização de peptídeos Aβ (pE3-12); Aβ (pE11- 20) e Bri2 (1-23), que são biotiniladas no término C. A princípio, a placa de estreptavidina foi lavada três vezes com 300 μL de tampão de lavagem (Tris 25 mM, NaCl 150 mM, Tween a 0,05%, BSA a 0,1%) para limpar a placa e remover agentes conservantes. Posteriormente, 100 μL de solução de peptídeo com 200 ng/mL foram adicionados e incubados sob temperatura ambiente (TA) por 2 horas. As microplacas (MTP) foram mascaradas com uma folha de cobertura para evitar a evaporação durante o tempo de incubação. As MTPs foram bloqueadas com 200 μL/poço de ELISA-Blocker sem Tween 20 (ELISA-Blocker (-T)) e incubadas por 1 hora a temperatura ambiente. Após isso, peptídeos não ligados foram removidos por lavagem três vezes com tampão de lavagem de 300 μL. As amostras de plasma de EDTA foram diluídas apropriadamente em ELISA-Blocker + Tween 20 (ELISA-Blocker (+ T)). Para a curva de calibração, os mAb foram diluídos em ELISA-Blocker (+ T) ou o tampão de lavagem por meio de realização de uma divisão de raiz dois. As amostras padrão e de plasma-EDTA diluídas foram transferidas para MTP com 100 μL por poço. Dependendo da quantidade de determinação, as amostras e os calibradores foram pipetados em diversos poços. Após um período de incubação de 2 horas a 4°C, um novo ciclo de lavagem, seguido (três vezes com tampão de lavagem 300 μL/poço). Ig's anticamundongo de coelho policlonal conjugado com peroxidase de rábano (HRP) foram usadas para a detecção do calibrador. Ig's, IgG, IgG2, IgG3 anti-humana policlonais. IgM ou IgA conjugada com HRP foram usadas como solução de enzima- conjugada para a detecção de auto-imunoglobulinas fora de EDTA- plasma. As soluções de conjugado de enzima foram diluídas com ELISA-Blocker (+ T) a uma concentração de 1 μg/mL. Em cada poço, 100 μL de solução de conjugado de enzima foram pipetados e incubados por 1 hora a 4°C. Seguiu-se um ciclo de lavagem (tampão de lavagem três vezes com 300 μL/poço). A solução de substrato de peroxidase Sure Blue (empresa KLP) contendo tetrametilbenzidina (TMB, cromogênio) e peróxido de hidrogênio (substrato) foi adicionada com 100 μL/poço. O HRP catalisa a decomposição de duas moléculas de peróxido de hidrogênio a água e oxigênio, por meio do que dois elétrons dos grupos amino do TMB cromogênico são transferidos no substrato. A liberação de elétrons de TMB (oxidação) leva a um cátion radical que é estabilizado através de dimerização e exibe a cor azul típica. Assim, a cor do cromogênio é alterada de incolor para azul por meio da transferência de elétrons. A intensidade da cor da solução é proporcional à concentração de analito. Após a incubação de 30 minutos à temperatura ambiente a reação enzimática foi interrompida com solução de H2SO4 1 M por meio de inativação da peroxidase e a dimerização de TMB é abolida. Após a desproporção, formou-se o cátion bivalente de cor amarela intensa. A absorção foi medida sob um comprimento de onda de 450 nm corrigido por absorvência a 540 nm. A absorção sob 450 nm e 540 nm foi medida com o leitor de placas de

TECAN-Sunrise.

[00194] Os testes ELISA de anti Aβ3(pE), anti Aβ11(pE) e anti Bri2 (1-23) foram completamente estabelecidos de acordo com os protocolos descritos (ver, Tabela 5). Para o estabelecimento do ELISA, utilizou-se o protocolo padrão do fabricante (Thermo Fisher Scientific) como um modelo. Após a otimização de diferentes parâmetros tais como, a concentração de antígeno imobilizado, anticorpo de detecção e tempos e temperaturas de incubação, bem como ciclos de lavagem, foram preparados os protocolos seguintes. Tabela 5: Desempenho de auto-Ig por ELISA

[00195] Após o estabelecimento de ELISA de auto-Ig, amostras de plasma de pacientes com AD e controles saudáveis foram testadas. Portanto, 13 amostras de plasma de pacientes com AD e 30 controles saudáveis, foram analisadas. As amostras de plasma originadas de pacientes com um diagnóstico clínico de AD/MCI e de grupos de controle saudáveis. As 43 amostras de plasma provêm do estudo PBD- 0316 realizado em cooperação com Companhia de Pesquisa Médica Galmed. Foram utilizadas amostras de plasma coletadas após 6 meses (T0+6). Para as amostras de plasma, inibidor de protease e EDTA foram adicionados para impedir degradação de proteína e conservar as amostras. Portanto, para 1 mL de plasma, adicionou-se 25 μl de solução de inibidor de protease. Para a solução de inibidor de protease, um comprimido de inibidor de protease Complete Mini foram resolvidos em 1 mL de PBS. Em seguida, as amostras foram em alíquotas e armazenadas a -80°C para garantir uma qualidade constante de plasma analisado.

1.4.3 Estabelecimento de Aβ (pE11-x) por ELISA

[00196] ELISA de Aβ (pE11-x) deve ser estabelecido para a análise de peptídeos Aβ (pE11-x) no cérebro de, por exemplo, modelos camundongos. A detecção de peptídeos piroGlu Aβ no plasma ou CSF não é possível devido à alta tendência de agregação, a passagem de oligômeros através da barreira cerebral sanguínea é prejudicada.

[00197] O ELISA Aβ11 (pE) foi construído de acordo com o princípio de ELISA tipo sanduíche e como modelo, o protocolo clássico de Aβ3 (pE) ELISA foi aplicado. Anticorpo monoclonal anti-Aβ (17-24) de camundongo comercialmente disponível (clone 4G8, Covance) foi utilizado como anticorpo de captura adsorvido à superfície da microplaca. O anticorpo monoclonal biotinilado anti- Aβ11 (pE) ligado a Aβ (pE11-x) capturado foram detectados por adição de conjugado de estreptavidina-HRP (SA-HRP). O estabelecimento foi realizado com peptídeo Aβ (pE11-30) e peptídeo Aβ (pE11-40) sintetizados. O peptídeo Aβ armazenado em hexafluorisopropanol (HFIP) a -80°C foi descongelado à temperatura ambiente. O tubo com o peptídeo foi deixado aberto sob uma capela de laboratório (fume hood) para evaporar o solvente HFIP. Os peptídeos foram dissolvidos em NaOH 100 mM, incubados por 10 minutos à temperatura ambiente e foram diluídos em tampão EIA, que contém Tween a 0,05% e BSA a 1%. O ELISA de Aβ (pE11-x) foi realizado de acordo com o protocolo descrito na Tabela 6. Tabela 6: Desempenho de ELISA de Aβ (pE11-x) tipo sanduíche

[00198] Além do ELISA tipo sanduíche, foi realizado um teste ELISA direto com antígeno adsorvido Aβ (pE11-30) em microplaca para testar diretamente o anticorpo monoclonal anti Aβ (17-24)-biotina (clone 4G8) e o anticorpo monoclonal anti Aβ11 (pE)-biotina (clone 13). Os anticorpos biotinilados foram detectados por adição de conjugado de estreptavidina-HRP (SA-HRP). O protocolo de ELISA direto estabelecido foi mostrado na Tabela 7. Tabela 7: Desempenho de ELISA de Aβ (pE11-x) direto

1.4.4. Imuno-histoquímica

[00199] As imagens de imuno-histoquímica (IHC) foram gentilmente cedidas de Qiaoqiao Shi (Lab. de C. Lemere) de Harvard Medical School em Boston.

[00200] Com IHC, os antígenos de Aβ (pE11-x) e Aβ (pE3-x) foram localizados em cortes de tecido cerebral. Portanto, utilizou-se o anticorpo anti Aβ11 (pE) (clone 13) para detecção dos peptídeos Aβ piroGlu.

[00201] Para as seções de tecido cerebral humano de IHC do hipocampo e do córtex frontal de pacientes com AD e, além disso, foram utilizadas seções de tecido cerebral de hipocampo de camundongos transgênicos APP/PS1. Camundongos APP/PS1, atualmente são utilizados por diversos laboratórios para estudos sobre os mecanismos de deposição de amiloide. O modelo camundongo expressa a mutação sueca de proteína precursora de amiloide (APP), mostra um aumento dos níveis cerebrais de Aβ seguido por desenvolvimento de placas neuríticas. Coexpressão do mutante presenilina 1 (PS1) aumenta a geração de Aβ (1-42). As seções de tecido foram embebidas em parafina e corte em série. As seções foram coradas com hematoxilina para núcleo coloridos de células e, em seguida, imunocoradas com anticorpo anti- Aβ11(pE). As preparações de seção de tecido e coloração foram realizadas de acordo com metodologia padrão.

1.5 Sequenciamento de regiões variáveis de anticorpos Cultivo de células de hibridoma:

[00202] Células de hibridoma foram cultivadas em D-MEM (+ L- Glutamina, + Piruvato de Na, 4,5 g/l de glicose, Gibco) com a adição de FBS a 15%, MEM-NEA a 1% (aminoácidos não essenciais, Gibco), 50 μg/mL de gentamicina (Gibco) e β-mercaptoetanol 50 μM a 37°C e CO2 a 5%. Subcultivo ocorreu após 3-4 dias, dependendo da densidade celular. As células foram semeadas em uma concentração de 0,5 x 106 células/mL, divisão ocorreu em uma densidade celular de 2-5 x 106 células/mL.

Síntese de cDNA e Transcrição Reversa:

[00203] RNA total foi isolado de 2 x 106 células, de acordo com o manual do Kit de isolamento NucleospinRNA (Macherey-Nagel). 100 ng de ARN foram aplicados para síntese de cDNA utilizando iniciador Oligo (dT)15 (Promega) e Transcriptase Reversa SuperScript III (Invitrogen).

Amplificação por RCP de Regiões Variáveis de Cadeia Pesada e Leve:

[00204] A região variável de cadeia pesada foi amplificada a partir do modelo de cDNA usando DNA Polimerase de Alta Fidelidade PhusionTM (NEW ENGLAND BioLabs) com o iniciador MHCG1 em combinação com iniciadores MHV1 a MHV12. Para amplificação da região variável de cadeia leve, utilizou-se a combinação de iniciador MKC com os iniciadores MKV1 a MKV11 (ver, Tabela 8).

Clonagem de produtos de RCP em pJET1.2:

[00205] Regiões variáveis de cadeia pesada e leve, amplificados por RCP, foram clonadas em vetor pJET1.2/blunt de acordo com o protocolo de Kit de Clonagem de RCP CloneJETTM (Fermentas). Sequenciamento foi realizado pelo uso de iniciadores de sequenciamento pJET1.2. Tabela 8: Sequências de iniciador de amplificação de RCP de regiões variáveis de cadeia pesada e leve

2. Resultados 2.1 Triagem de anticorpo

[00206] Após a fusão celular e seleção de células de hibridoma com meio HAT, as células de hidridoma (que se originam de diversas diferentes células individuais) foram selecionadas para identificar células de mAb secretoras específicas ao antígeno alvo Aβ11 (pE). O mAb foram examinados quanto à sua capacidade de se ligarem a diferentes peptídeos Aβ modificados. Desse modo, possíveis reações cruzadas do mAb com outros peptídeos Aβ modificados foram determinadas. Os peptídeos Aβ com as diferentes sequências que foram manchadas sob uma membrana de hidróxi-celulose são mostrados na Figura 1. A triagem foi realizada com 26 sobrenadantes de células de hibridoma testados versus 16 peptídeos diferentes Aβ.

[00207] Figura 1 mostra 26 membranas (rotuladas como P1-P53), que foram manchadas com 16 peptídeos, ilustrados acima das membranas. A análise de triagem indicou que mAb de células de hibridoma de membranas emolduradas (P7, P10, P11, P12, P13, P15, P22, P24, P27) mostrou um sinal médio a forte contra o peptídeo Aβ (pE11-23) modificado no término N ( pEVHHQKLVFFAED) (ID SEQ NO: 19) com o epítopo alvo Aβ11 (pE). Além disso, estes não indicaram reações cruzadas significativas com outros peptídeos Aβ modificados. O mAb testado em membranas moldadas também não se ligaram ao glutamato não cíclico de término N na posição 11 (ver, ponto 9), e não foram detectados sinais de ligação em pontos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 13, sem a sequência completa de Aβ pEVHH em término N. Além disso, nenhum sinal de ligação no piroglutamato de término N na posição 3 (ver, ponto 6) foi detectado nas membranas emolduradas. Em resumo, pode-se dizer que os mAb a partir de células de hibridoma testado em imagens de membranas moldadas eram específicos ao peptídeo Aβ11 (pE) de término N e não mostraram reações cruzadas significativas com outras sequências de peptídeo Aβ(1-42). Por essa razão, os 9 clones de hibridoma descritos foram selecionados para reclonagem. Cinco clones de hibridoma, que são marcados na Figura 1, com uma linhagem sólida foram estáveis após reclonagem e selecionados para reclonagem adicional. Usando a técnica de diluição limitada, as células de hibridoma selecionadas foram clonadas para obter um clone isolado. No presente trabalho, um desses cinco clones de hibridoma selecionados, denominado clone 13 foi cultivado (ver a seção 2.2 seguinte) e concentração de anticorpo no sobrenadante de cultura celular foi determinada.

[00208] Células de hibridoma testadas em membrana P4, P5, P16, P25, não foram selecionadas para reclonagem porque o mAb mostrou sinal fraco ou nenhum sinal contra o antígeno alvo Aβ11 (pE) e também contra os diferentes peptídeos Aβ. Além disso, as células de hibridoma de membrana P1, P17, P26, P29, P31, P32, P35, P36, P38, P42, P47, P49 e P53, não foram selecionadas para reclonagem porque o mAb mostrou um forte sinal no antígeno alvo Aβ (pE11 -14), bem como outros peptídeos Aβ manchados e assim estes não indicaram nenhuma seletividade contra o antígeno Aβ (pE11-14).

2.2 Cultivo de células de hibridoma e otimização de meios de cultura celular

[00209] Foram realizados testes preliminares com células de hibridoma que produzem anticorpos anti-Aβ. Durante os testes, as condições ótimas de cultivo para células de hibridoma que produzem anticorpos contra Aβ3 (pE) foram determinadas. Foi demonstrado que as células de hibridoma cultivadas com o meio DMEM suplementado com FBS a 15%, MEM-NEAA a 1%, L-glutamina 2 mM e β- mercaptoetanol 50 μM apresentam uma alta proliferação, bem como, alta taxa de produção de anticorpos. Portanto, no presente estudo, o clone de hibridoma escolhido (clone 13) foi cultivado de acordo com as condições otimizadas.

[00210] Foi demonstrado que o clone de hibridoma pode ser cultivado com sucesso. Dentro de 4 a 6 passagens após descongelação de células de hibridoma o número de células pode ser aumentado em 12 vezes ou 20 vezes. As células formaram parcialmente agregados de células em suspensão, e também células aderentes podem ser observadas. Células vitais mostraram uma forma celular redonda e eram maiores em comparação com as células não vitais. As células foram testadas regularmente por contaminação de micoplasma com Kit de detecção MycoAlert®. Todas as células de hibridoma testadas eram livres de micoplasma. Durante o tempo de cultivo de células de hibridoma, a concentração de anticorpos anti-Aβ11 (pE) em sobrenadante de cultura celular foi medida por SPR (ver, seção 2.2.1). Um objetivo adicional do presente estudo foi a adaptação de células de hibridoma a partir de condições contendo soro a condições livres de soro para simplificar a purificação do mAb produzido. Isso foi realizado por etapas. O meio ótimo livre de soro foi identificado por preparação de curvas de crescimento após adaptação de meios durante dez dias. Desse modo, a taxa de crescimento celular e produção de anticorpos foi medida durante o tempo de cultivo.

2.2.1 Determinação de concentração de anticorpos em sobrenadante de cultura celular

[00211] A concentração de anticorpos anti-Aβ11 (pE) fora de sobrenadante da cultura celular foi determinada com o princípio de ressonância plasmônica de superfície (SPR) no Biacore 3000. Portanto, o peptídeo Aβ (pE11-30) foi imobilizado na superfície do sensor de um chip CM5 (ver, seção de método 1.3.3.1). Na Figura 2, a imobilização de Aβ (pE11-30) é mostrada em um diagrama de tempo real ao longo do tempo. A princípio, o acoplamento foi realizado com 10 μg/mL de Aβ (pE11-30). O sinal elevou-se (ver Figura 2, marcado A) durante o acoplamento de peptídeo.

[00212] Devido ao baixo sinal, o peptídeo foi novamente aplicado com uma concentração mais elevada de 50 μg/mL (ver Figura 2, marcado B). Em resumo, uma elevada concentração de peptídeo foi imobilizada na superfície do chip. Para a determinação de teor do anticorpo a partir do sobrenadante de cultura celular uma elevada concentração de peptídeo imobilizado foi necessária. Desse modo, a detecção de concentrações mesmo baixa de anticorpos é possível, e também a faixa linear da curva padrão é mais elevada do que com concentrações mais baixas de peptídeos imobilizados. A sobrecarga do chip não foi adequada para estudos de ligação e a determinação de taxas de ligação, como taxa de dissociação Kd e taxa de associação Ka . Devido à alta concentração de antígeno, múltiplas interações de ligação do anticorpo são possíveis (efeito de avidez), que leva a taxas de ligação incorretas e a uma taxa fora artificialmente baixa.

[00213] A partir de cada passagem celular do clone de hibridoma cultivado, os sobrenadantes de cultura celular foram testados em relação a anticorpos anti Aβ11 (pE) em BiacoreTM 3000. Os resultados do clone de hibridoma 13 são mostrados na Figura 3. O clone 13 foi o único clone que produziu anticorpos anti Aβ11 (pE). Uma curva com um alto sinal de medição (RU) do anticorpo a partir de hibridoma de clone 13 foi determinada, a qual leva à conclusão de que o anticorpo anti Aβ11 (pE) foi produzido com um alto rendimento. Em contraste com os clones 15, 22 e 24, nenhum sinal específico de medição (RU) foi obtido durante o período total de cultivo. Por essa razão, apenas as células de hibridoma de clone 13 foram adicionalmente cultivadas e utilizadas para todos os experimentos explicados no presente estudo.

[00214] Para a quantificação de concentração de anticorpos no sobrenadante de cultura celular, mediu-se uma curva padrão com concentrações conhecidas de anticorpo anti Aβ11 (pE) purificado a partir de clone 13 (ver, seção 1.2). Os sinais de medição (RU) por Biacore 3000 foram comparados com as concentrações de anticorpos. A curva padrão é mostrada na Figura 4.

[00215] O padrão mostra um curso linear entre concentrações de anticorpos de 0,040 μg/mL e 1,25 μg/mL (ver Figura 5). Acima da concentração de 1,25 μg/mL, a inclinação da curva declinou. Devido à elevada concentração de anticorpos, impedimentos estéricos durante a ligação de anticorpo ao antígeno podem ocorrer. A equação de regressão linear: y = 3033,7x + 50,099 (r2 = 0,991) foi utilizada para cálculo de concentrações de anticorpos a partir de sobrenadante de cultura celular. As amostras adicionais medidas de sobrenadante de cultura celular foram diluídas de modo que a medição estava dentro da faixa linear de curva padrão.

2.2.2 Adaptação de células de hibridoma a condições livres de soro

[00216] As células de hibridoma (clone 13) foram adaptadas a partir de meios contendo soro (SCM) para diferentes meios livres de soro (SFM) e livres de proteína, para simplificar a purificação por afinidade da proteína G do mAb de anti Aβ11 (pE) de murino a partir de sobrenadante de cultura celular . Proteína G liga-se especificamente e com alta afinidade moléculas de imunoglobulina G de murino. A IgG bovina contida em FBS também é fortemente ligada a partir de Proteína G e reações cruzadas indesejáveis são possíveis. Portanto, meios livres de soro ou meios livres de proteína devem ser usados para o cultivo de células de hibridoma para excluir que a IgG bovina está contida na fração de eluição de anticorpo purificado.

[00217] A adaptação de meios para os diferentes meios SFM (Hibridoma expresso, Hibridoma Expresso Plus, Hibridoma SFM) e meio livre de proteína (Meio de hibridoma CD) foi realizada em frascos T e após cada passagem, o número de células e a concentração de anticorpos foram determinados. Na Tabela 9, o crescimento celular e produção de anticorpos após a adaptação de meios são mostrados. Tabela 9: Crescimento celular e produção de anticorpos após adaptação a SFM e meio livre de proteína

[00218] As células de hibridoma (clone 13) foram adaptadas seqüencialmente em frascos T (37oC, CO2 a 5%). Após o processo de adaptação, as células foram cultivadas 2 passagens e os resultados de crescimento celular e produção de anticorpos anti Aβ11 (pE) (via SPR) foram determinados. Proliferação de células +..., nenhuma proliferação de células -... e produção de anticorpos, respectivamente.

[00219] Os resultados na Tabela 9 mostram que apenas células de hibridoma SFM proliferaram e também produziram anticorpos com um rendimento elevado. Assim, apenas a adaptação de células a hibridoma SFM foram bem sucedidas. Para a comparação de células cultivadas em SCM (DMEM, FBS a 15%, NEAA a 1% e DMEM, FBS a 15% de baixa IgG, NEAA a 1%) e em Hibridoma SFM, uma curva de crescimento durante 10 dias foi determinada. Portanto, as células foram cultivadas em frascos de agitação e regularmente, uma amostra foi obtida para a determinação de número de células e concentração de anticorpos no sobrenadante de cultura celular (ver Figura 6).

[00220] Os resultados demonstraram que as células cultivadas em hibridoma SFM mostraram um aumento significativo, mais de duas vezes maior comparado com as células em SCM. A fase exponencial de células em hibridoma SFM iniciou-se em 24 horas, visto que células em SCM iniciaram após 48 horas. Assim, o hibridoma SFM iniciou um crescimento exponencial anterior com uma fase de atraso mais curta em comparação com as células de hibridoma SCM. Similarmente, células cultivadas em SFM e SCM atingiram o número mais elevado de células após 72 horas. É notável que as células cultivadas em SFM mostraram uma fase extinguível dentro de 72 horas e 144 horas, que não foi observada em curvas de crescimento de células cultivadas por SCM. Além da medição de número de células, mediu-se a concentração de anticorpos anti Aβ11 (pE). As células cultivadas em SFM mostraram um rendimento de anticorpos significativamente maior do que em SCM. Geralmente, a concentração de anticorpos aumentou com o número de células crescente na fase exponencial, mas as células cultivadas em SCM pararam a produção de anticorpos com o início de fase estacionária em 72 horas. Contudo, a produção de anticorpos de células cultivadas por SFM aumenta ligeiramente independente do número de células reduzido após 72 horas.

[00221] Para determinar parâmetros específicos para a análise de curvas de crescimento, a taxa de crescimento específico μ e a taxa de produção qp foram calculadas. Esses dados devem servir para melhor interpretação de crescimento e produção de anticorpos. Na Figura 7, a taxa específica de crescimento foi marcada contra o tempo de cultivo.

[00222] No início de cultivo, determinou-se uma elevada taxa de crescimento específico que diminuiu fortemente após a fase de crescimento exponencial em 72 horas. A taxa específica de crescimento μ foi positiva até somente antes de 96 horas, indicando que as células tinham crescido. A fase de declínio das células foi caracterizada por uma taxa de crescimento negativo porque fontes de energia foram consumidas após 96 horas. Foi notável que as células em hibridoma SFM mostraram uma forte diminuição de taxa de crescimento após 72 horas devido à concentração celular muito alta.

[00223] Além disso, o integral de concentração viável de células durante o tempo de cultura chamado integrante de densidade celular viável (IVCD) foi calculado. O IVCD implica como muitas células, por incorporação de tempo, contribuem para a produção de anticorpos durante o tempo de cultivo. O integral foi determinado a partir das curvas ilustradas na Figura 6 (A). Os pontos medidos de números de células vivas em tempo de cultivo 5 horas, 24 horas, 48 horas e 72 horas foram ajustados pela função exponencial f(t)= a.ec.t, por meio do que A e C são constantes e T o tempo. Posteriormente, a função exponencial foi integrada. As IVCD foram calculadas para cada ponto de tempo em 5 horas, 24 horas, 48 horas e 72 horas. Para a determinação das taxas de produção de anticorpos qp as concentrações de anticorpos foram plotadas contra a IVCD (ver Figura 8) e a partir da inclinação dessas curvas qp foi obtido. (Renard e outros, Biotechnol. Lett. 1988, 10, 91-96; Ozturk e outros, J. Biotechnol. 1990, 16, 259-278).

[00224] Na Figura 8, apenas os pontos de dados em 5, 24, 48, 72 horas, foram incluídos, porque as taxas de produção de anticorpos foram fortemente reduzidas na fase de declínio e a linha reta não pode correlacionar os pontos de dados de declínio e as fases exponenciais. A taxa específica de produção de anticorpos foi em fase exponencial significativamente maior que em fase estacionária. Esses dados indicam que a taxa de produção de anticorpos foi dependente do crescimento para a linhagem celular de hibridoma utilizando nesse estudo. Em contraste Ozturk S. descreveu que a taxa específica de produção de anticorpo foi constante tanto em fase exponencial de crescimento e de declínio e assim a produção de anticorpos de células de hibridoma de camundongo não foi associada a crescimento (Ozturk S. e outros; supra).

[00225] Na Tabela 10, as taxas de produção de anticorpos específicos obtidos são mostradas. Tabela 10: Taxa de produção específica qp de células de hibridoma cultivadas com SCM e SFM em frasco de agitação

[00226] As células cultivadas em Hibridoma SFM mostraram a taxa mais alta de produção de anticorpos com 0,5121 pg/(células . h). Desse modo, o qp de hibridoma SFM foi aproximadamente duas vezes maior comparado com células cultivadas em SCM, possivelmente, devido à proliferação de células duas vezes maior em SFM.

[00227] As células de hibridoma cultivadas em SCM foram subcultivadas diversas passagens e a partir da passagem de número 18, a concentração de anticorpo foi reduzida continuamente (dados não mostrados). A produção de anticorpos de células com o número de passagem 27 foi totalmente interrompida, mas as células mostraram um crescimento normal de células independente de produção reduzida de anticorpos, que também foi reconhecida por células de hibridoma produtoras de anticorpos anti Aβ3 (pE). Já na literatura, foi descrito que as células de hibridoma são muitas vezes instáveis e podem interromper a produção de anticorpos. Determinou-se que as células de hibridoma estão, frequentemente, presentes como uma mistura de células produtoras e não produtoras de anticorpos (Heath e outros; J. Biotechnol. 1990, Vol.15, S.71-89). As células de hibridoma que produzem anticorpos não podem faltar integridade genética relativa às sequências de cadeias pesadas e leves. As células não produtoras mostram uma taxa maior de proliferação do que células produtoras e podem dominar a cultura de hibridoma após algumas passagens (Kromenaker e outros, Biotechnol. Prog. 1994, Vol.10, S.299-307). Em contraste, as células cultivadas em Hibridoma SFM ainda mostraram uma taxa elevada de produção de anticorpos além da passagem 27. Isso sugere que as células cultivadas em SFM mostraram crescimento contínuo de células, bem como a produção de anticorpos independente do número de passagem de células. O cultivo de células em SFM até maior número de passagem foi efetuado uma vez. Para fazer uma declaração clara, o experimento deve ser repetido uma segunda vez.

[00228] Resumindo, as células cultivadas em Hibridoma SFM mostraram um excelente crescimento de células com uma taxa máxima de crescimento e exibem o rendimento de produção de anticorpos significativo mais alto com uma alta taxa de produção específica, durante o tempo total de cultivo, em comparação com as células cultivadas em SCM. As células de hibridoma usadas exigem apenas uma adaptação sequencial menor de SCM para Hibridoma SFM. Com o uso de hibridoma SFM o custo de cultivo de hibridoma pode ser reduzido em 18%, comparado com o uso alternativo de DMEM com FBS de IgG baixa. Adicionalmente, a purificação de mAb a partir de sobrenadante de cultura celular foi simplificada, devido à ausência de IgG bovina contendo soro e outros componentes do soro, tal como proteases.

[00229] As curvas de crescimento de todos os meios testados mostraram uma forte diminuição após fase de crescimento exponencial em 72 horas, devido ao consumo completo de L-glutamina. Miller e outros descreveram que o número máximo de células é enriquecido quando L-glutamina foi consumido porque o fator de limitação de crescimento celular é L-glutamina que é principalmente usada como fonte de energia e facilita o crescimento celular e produção de anticorpos (Miller e outros, 1989, Biotech. Bioeng. Vol. 32, S.947-965). Devido a esses fatos, o SCM e também SFM foram suplementados com L-glutamina 2 mM. Mas o crescimento celular e produção de anticorpos foi significativamente mais elevado para células de hibridoma SFM do que em SCM.

[00230] O hibridoma SFM é um meio com teor de proteína muito baixo (20 μg/mL) otimizado para o cultivo de células de hibridoma. O meio contém L-glutamina, elementos de traços, minerais, e uma baixa quantidade (20 μg/mL) de proteínas definidas (insulina e transferrina). Essas substâncias no SFM foram decisivas para a alta proliferação celular e rendimento de anticorpos não foi examinado, mas no seguinte pode ser especulado. Existem diversas possibilidades para aumentar a eficiência de anticorpos de células de hibridoma. Na literatura descreve- se que a adição de uma mistura de lipídios contendo colesterol, fosfolípidos e ácidos graxos aumentaram a produção de anticorpos de células de hibridoma, porque a organização de lipídios e fluidez de membrana plasmática apresenta uma influência na função das células (Savonniere e outros, Biotechnol. 18 de julho de 1996; 48 (1-2): 16173)). Também, fatores de crescimento poderiam aumentar a taxa de produção de anticorpos, por exemplo, fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de fibroblastos (FGF), interleucina-2 (IL-2), IL-6 (fator estimulante de célula B), transferrina, insulina e etanolamina (Murakami e outros; Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, fevereiro de 1982; 79 (4): 1158-1162; Dandulakis e outros; Biotechnol. Prog., setembro- outubro de 1995; 11 (5): 518-24).

2.3 Purificação de anticorpos

[00231] O anticorpo anti Aβ11 (pE) de clone 13 deve ser purificada para homogeneidade fora de sobrenadante de cultura celular para ser usado no teste de ELISA e experimentos adicionais. O anticorpo foi purificado com coluna Sepharose de proteína G (ver, seção 1.2.1). O anticorpo ligado foi eluído de acordo com dois métodos diferentes. A princípio, solução ácida de glicina-HCl 0,1 M (pH 2,7) foi utilizada e a fração eluída foi imediatamente neutralizada através de titulação com Tris-HCl 1 M, pH 9,0. Durante o processo de neutralização o anticorpo foi fortemente precipitado devido a uma alteração possível na estrutura do anticorpo durante a eluição ácida.

[00232] Por essa razão, um método de eluição de pH neutro foi realizado com um gradiente de tiocianato de potássio. Devido a KSCN foram afrouxadas as interações entre o anticorpo e proteína G. Com essa técnica, o anticorpo foi eluído e nenhuma precipitação do anticorpo ocorreu. Na Figura 9, o cromatograma do processo de purificação é mostrado.

[00233] Com o aumento do gradiente de KSCN, o anticorpo foi eluído. O pico de eluição foi quase simétrico como uma função de Gauss, que indicou uma eluição homogênea com uma espécie de anticorpo. A eluição foi induzida pelo íon caotrópico SCN- que suprime as interações de proteína-proteína. Uma concentração demasiado elevada de KSCN poderia desnaturar as proteínas e, portanto, realizou- se a eluição de anticorpo em um gradiente seguido por diálise imediata.

[00234] Após a cromatografia de afinidade, um SDS-PAGE foi realizado para examinar o teor de anticorpos nas diferentes frações de coluna de purificação de proteína G (ver Figura 10). Desse modo, a pureza da fração de eluição com anticorpo anti Aβ11 (pE) pode ser determinada. Amostras de sobrenadante de cultura celular não purificado, fluxo através de fração, fração de lavagem e fração de eluição de coluna de proteína G foram analisadas.

[00235] O gel de SDS mostra que, durante a purificação de proteína G o anticorpo de ligação específico foi separado a partir de proteínas de ligação não específicas. No sobrenadante de cultura celular não purificado (slot 1; 6) e fluxo através de (2; 7), a banda de BSA (soroalbumina bovino) com aprox. 66 kDa foi claramente identificada, entretanto, a fração de eluição (slot 4; 9) não continha BSA. Durante o ciclo de lavagem uma pequena parte dos anticorpos ligados foi lavada fora da coluna (slot 3). A fração de eluição no slot 4 mostra que apenas o anticorpo de ligação específico foi eluído. Em SDS-PAGE, o anticorpo foi separado na cadeia pesada, com aprox. 50 kDa e a cadeia leve, com aprox. 25 kDa (ver, slot 4) com base nas condições redutoras. Para mostrar que o anticorpo total, com ligações bissulfureto intactas, a fração de eluição foi aplicada sob condições não redutoras (ver, slot 9). O anticorpo foi identificado com uma banda a aprox. 150 kDa. Além disso, foi demonstrado que nenhum BSA foi mantido de volta na coluna e assim removido do anticorpo purificado na fração de eluição. Proteína G liga-se a IgG de camundongo, mas também de IgG bovina que está contendo em FBS. Para reduzir as impurezas com IgG bovina, FBS de IgG ultrabaixa (Invitrogen), contendo menos de 5 μg/mL de IgG foi usada. Com esse método de purificação, o anticorpo foi purificado até homogeneidade e separado a partir de todas as outras proteínas contidas no sobrenadante de cultura celular. Após diálise, a concentração de anticorpo foi determinada via espectrometria de UV e SPR.

[00236] Durante a purificação de anticorpo anti Aβ11 (pE), o anticorpo com uma coluna de proteína G Sepharose a partir de amostras de sobrenadante da cultura celular antes de aplicação na coluna de proteína G, a partir do fluxo por meio de, fração de lavagem e fração de eluição foram tomadas. Isso foi seguido por medição via SPR. Para a quantificação de anticorpos anti Aβ11 (pE) por SPR foi utilizada a curva-padrão que é ilustrada na Figura 10. Determinou-se que, antes da purificação aprox. 14,8 μg/mL de anticorpo foram contidos no sobrenadante de cultura celular, o que é equivalente a uma quantidade total de 26,7 mg de anticorpo em 1.800 mL de sobrenadante. O fluxo continha 0,8 μg/mL de anticorpo (2,4 mg no total) e a fração de lavagem de 8,7 μg/mL (0,2 mg no total) de anticorpo. Uma concentração de 1,07 mg/mL, o qual foi de 21 mg de anticorpo na fração de eluição foi determinada via SPR. Subsequentemente, o rendimento da cromatografia de afinidade foi de 80%. Após a purificação, concentração e diálise do anticorpo, realizou-se a medição do espectro de UV (ver Figura 11).

[00237] A partir do espectro de UV, a concentração do anticorpo com 4,09 mg/mL, após a purificação foi determinada. Portanto, aproximadamente 21 mg de anticorpo fora de 1.800 mL de sobrenadante de cultura celular foram purificados. Assim, a concentração de anticorpo determinada por método de UV/VIS, concordou com os resultados de SPR. O anticorpo foi então filtrado por esterilização, aliquotado e armazenado para análise adicional a 4°C.

[00238] O resultado apresentado de purificação de anticorpo foi realizado com sobrenadante de cultura celular de células com passagens elevadas (passagem 17 - 22), por meio do que uma taxa reduzida de produção de anticorpo acima de 18 passagens foi observada (ver, seção 2.2.2). Contudo, a concentração de anticorpos no sobrenadante de cultura celular de células com número de passagens inferior quantificou a aproximadamente 30 μg/mL.

[00239] Consequentemente, rendimento de purificação de anticorpos de células com número inferior de passagens seria duas vezes maior com aproximadamente 42 mg do que com as passagens de células superiores usadas.

2.3.1 Biotinilação de anticorpo anti Aβ11 (pE)

[00240] O anticorpo anti Aβ11 (pE) foi biotinilado para a aplicação como anticorpo de detecção no ELISA de Aβ (pE11-x). A solução de biotina-anticorpo foi dialisada para remover a biotina não-conjugada. Uma concentração de 1,88 mg/mL de anticorpo biotinilado (MW 150.000) foi determinada via espectro de UV e em seguida o nível de biotinilação foi determinado com ensaio HABA.

[00241] O resultado foi que aproximadamente 2 moléculas de biotina foram acopladas em um anticorpo. Na Figura 12, é mostrado o espectro de UV/VIS do anticorpo antes e após a biotinilação. Os dois espectros mostraram o mesmo curso da curva, indicando que não ocorreu agregação durante o processo de biotinilação. Assim, a biotinilação foi bem sucedida e o anticorpo pode ser usado em combinação com o polímero de estreptavidina-HRP como anticorpo de detecção.

2.4 Caracterização de anticorpos anti Aβ11 (pE) 2.4.1 Seqüenciamento de regiões variáveis de anticorpos

[00242] As sequências seguintes foram identificadas: 2.4.1.1 Clone 13-11-6 (Clone 13) Aβ Clone 13 parte variável de sequência de nucleotídeo de cadeia leve (ID SEQ NO: 51) atggagtcacatacccaggttcttatattgctgctgctatgggtatctggtacctgtggggaca ttgtgatgtcacagtctccatcctccctggctgtgtcagcaggagagaaggtcactatgagctg caaatccagtcagagtctgttctacagtagaacccgaaagaactacttggcttggtaccaacag aaaccagggcagtctcctaaattgctgatctactgggcatccactagggaatctggggtccctg atcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtgtgcaggctga agacctggcagtttattactgcaagcaatcttacaatctgtggtcgttcggtggaggcaccaag ctggaaatcaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagt Aβ Clone 13 parte variável de sequência de proteína de cadeia leve (ID SEQ NO: 52) MESHTQVLILLLLWVSGTCGDIV MSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLFYSRTRKNYLAWYQQ KPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAV YYCKQSYNLWSFGGGTK LEIKRADAAPTVS I FPPS Aβ Clone 13 parte variável de sequência de nucleotídeo de cadeia pesada (ID SEQ NO: 53) atgggatggagctgtatcatgttctttttggtagcaacagctacagatgtccactcccaggtcc aactgcagcagcctgggactgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggc ttctggcttcaccttcaccagctactggatgcactgggtgagacagaggcctggacaaggcctt gagtggattggagagattaatcctagtaacggtcgtactaactataatgagaagttcaagagca aggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactcagcagcctgacatc tgaggactctgaggtctattactgtgcgagaggggatcttgcctgggactggtctgcttactgg ggccaagggactctggtcactgtctctgcagccaaaacgacacccccatctgtctatccactg Aβ Clone 13 parte variável de sequência de proteína de cadeia pesada (ID SEQ NO: 54) MGWSCIMXFLVATATDVHSQVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGF TFTSYWMHWVRQRPGQGL EWIGEINPSNGRTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSE VYYCARGDLAWDWSAYW GQGTLVTVSAAKTTPPSVYPL

2.4.2 Determinação de estrutura secundária

[00243] A estrutura secundária de anticorpo anti Aβ11 (pE) biotinilado e não biotinilado foi investigada por espectroscopia de CD. Possíveis modificações de estrutura secundária devido ao processo de biotinilação podem ser analisadas. A medição de CD foi realizada com 130 μg/mL de anticorpo (biotinilado e não biotinilado) dissolvido em fosfato de sódio 10 mM, pH 7,1. Na Figura 13, o espectro extremo de UV-CD dos anticorpos a 20°C é mostrado. Os espectros do anticorpo biotinilado e não biotinilado foram quase idênticos e ambos os anticorpos mostraram um mínimo em 218 nm e um máximo a 200 nm, o que é típico para as proteínas em folhas β. Os resultados indicaram que a biotinilação não teve nenhuma influência sobre a estrutura secundária. Os mesmos espectros de CD indicam estrutura secundária idêntica e assim nenhuma influência sobre propriedades de ligação, entretanto, isso não implica propriedades de ligação em ITC ou em ELISA. 2.4.3 Temperatura de transição de anticorpos Aβ11 (pE)

[00244] Dicroísmo circular pode ser utilizado para observar como estrutura secundária se altera com as condições ambientais. A estabilidade térmica da proteína é avaliada usando CD seguindo alterações no espectro com o aumento da temperatura. Na Figura 14 e Figura 15, são mostrados os espectros de anticorpo anti Aβ11(pE) biotinilado e não biotinilado, sob temperaturas de 20°C até 80°C. A partir de uma temperatura de 60°C o curso de espectros foi alterado. O máximo em aproximadamente 201 nm, o sinal típico de proteínas em folhas β, diminuiu sob uma temperatura de 60°C, e resultou em 80°C, no mínimo. Os resultados indicaram que o anticorpo biotinilado, bem como o anticorpo não biotinilado começaram a desnaturar a 60°C (Tm«65°C). Assim, a estabilidade de temperatura do anticorpo foi fornecida a 60°C. Os resultados foram na faixa normal de IgG's e de acordo com outros estudos, por exemplo, S. Frey determinaram uma temperatura de fusão de IgG monoclonal com 63°C (S. Frey e outros, 2008, Biol. Chem., vol. 389 , pp. 37-45). Ambos os anticorpos mostraram, na faixa de 20°C até 60°C espectros idênticos em CD, com um mínimo de aproximadamente 218 nm e um máximo de 201 nm, indicando que a biotinilação não teve nenhuma influência sobre a estabilidade da proteína. 2.4.4 Propriedades de ligação de anticorpo Aβ11(pE)

[00245] Para caracterizar a ligação de anticorpo anti Aβ11 (pE) no peptídeo Aβ (pE11-18)-PEG o método de calorimetria isotérmica de titulação (CIT) foi utilizado (ver, seção 1.3.4). O anticorpo que foi eluído a partir de coluna de proteína G com gradiente de KSCN (pH 7,0) e glicina-HCl 0,1 M (pH 2,7) foi analisado. Com CIT, a estequiometria da reação (N), constante de associação (KA), entalpia de ligação (ΔH), bem como a entropia (ΔS) foram determinadas. O peptídeo foi titulado a anticorpo anti Aβ11(pE) no Microcalorímetro CIT como descrito na seção 1.3.4.2. A curva de titulação exibe o calor por segundo, como uma função de tempo (ver, Figura 16). Os parceiros de reação interagem, e calor é liberado ou absorvido na proporção direta com a quantidade de eventos de ligação. Cada injeção de antígeno leva às alterações de temperatura. Para compensar a diferença de temperatura entre a amostra e célula de referência, a adição ou remoção de calor para a célula de amostra ocorre e serve como sinal de medição.

[00246] A princípio, o calor da diluição de Aβ (pE11-18)-PEG em tampão de CIT foi determinado (ver Figura 16, traço superior). O traço superior mostra um sinal constante e baixo (sinal de fundo), em comparação com o sinal de medição. Posteriormente, o peptídeo Aβ (pE11-18)-PEG foi titulado a anticorpo anti Aβ11(pE) na célula de amostra (ver Figura 16, traço inferior). A liberação total de calor após cada injeção foi determinada por integração da área entre cada pico e entre cada linha de base. Em seguida, o calor de diluição (ver Figura 16, traço superior) foi subtraído da liberação total de calor de cada injeção. A Figura 17 mostra a curva de ligação obtida de anticorpo anti Aβ11(pE) (eluído com gradiente de KSCN) com Aβ (pE11-18)-PEG, por meio do que a liberação total de calor em cada injeção é representada contra a razão molar de anticorpo e peptídeo. A partir da curva de ligação as constantes de parâmetros termodinâmicos foram determinadas com o programa Origin 7.0.

[00247] Na Tabela 11, os parâmetros determinados N, KA, KD, ΔH, e ΔS, bem como a energia de Gibbs ΔG para a ligação de anticorpo anti Aβ11 (pE) em peptídeo Aβ(pE11-18)-PEG são mostrados. Nota-se que KD = 1/KA e ΔG = ΔH - T ΔS. Tabela 11: Parâmetros termodinâmicos de ligação de peptídeo Aβ (pE11-18)-PEG em anticorpo anti Aβ11 (pE)

[00248] O anticorpo foi eluído a partir de coluna de proteína G com gradiente de KSCN (pH 7,0) e glicina-HCl 0,1 M (pH 2,7), respectivamente. Os parâmetros foram determinados por MicroCalorímetro CIT a 20oC.

[00249] A princípio, foram discutidos os resultados de anticorpo anti Aβ11 (pE), eluído com gradiente KSCN (pH 7,0). A estequiometria da ligação de antígeno e anticorpo foi de 1,88. Assim, a estequiometria foi quase 2, o que significa quase todos os anticorpos foram ativos e interagiram com duas moléculas de peptídeo Aβ (pE11-18)-PEG. A razão para a variação de estequiometria foi as determinações de concentração imprecisa devido aos coeficientes de absorção de anticorpos desconhecidos. A estequiometria com significativamente menos do que dois indicaria que uma parte de moléculas de anticorpo é inativa, o que é no caso para anticorpo ácido eluído.

[00250] A constante de dissociação do anticorpo foi de 78,74 nM. Por exemplo, anticorpo anti-hMCP1 N1pE (1-x) (dados não mostrados) mostrou uma constante de dissociação 3 vezes maior do que anticorpo anti Aβ11 (pE). Isso significa que a força de ligação de anti Aβ11 (pE) foi maior que de anticorpo anti-hMCP1 N1pE (1-x). Entretanto, o anticorpo anti-hMCP1 N1pE (1-x), foi utilizado com sucesso em MCP1 ELISA, o que sugere que o anticorpo anti Aβ11 (pE) deve também apresentar boas propriedades de ligação em ELISA. A constante de dissociação determinada de anticorpo anti Aβ11 (pE) variou no meio de resultados de CIT descritos na literatura. Por exemplo, a interação de D-PAM (Mimético de Proteína) com IgG de anticorpos monoclonais mostrou uma KD na faixa de 10-5 M-1 (D'Agostino B. e outros, J. Immunol. Methods, 20 de abril de 2008; 333 (1 -2): 126-38) e a KD da interação entre Aβ (1-40) solúvel monomérico e os anticorpos monoclonais de camundongo foram na faixa de 10-7 a 10-8 M-1 (Brockhaus e outros, J. Phys. Chem. B. 8 de fevereiro de 2007, 111 (5): 1238-1243). A KD de anticorpo anti Aβ11 (pE) quantificou 7,8 • 10-8 M-1 e foi comparável com os dados descritos na literatura.

[00251] Em geral, as interações de anticorpos e antígenos são na maioria das vezes entálpicas impulsionadas por ligações de hidrogênio (interação específica) e muitas vezes a variação de entropia é negativa (ΔS < 0), devido à perda de graus de conformação. Mas, a partir da ligação de Aβ (pE11-18)-PEG em anticorpo anti Aβ11(pE) resultou em um ganho moderado de entropia de ΔS = 4,33 (cal • mol-1 • K-1), uma entalpia negativa com ΔH = -8,259 kcal/mol e uma baixa energia de Gibbs com ΔG = - 9,53 kcal/mol. Assim, a interação foi impulsão entálpica moderada (ΔH < 0), devido à formação de ligações de hidrogênio e também impulsão entrópica moderada (ΔS > 0), o que é incomum para interações de anticorpos e antígenos. A ligação foi caracterizada por interações hidrofóbicas devido a forte epítopo hidrofóbico Aβ11 (pE), as moléculas de água foram deslocadas, o que resultou em ganho de graus de liberdade de conformação e assim, em um ganho de entropia moderado (Ohtaka e outros, 2002, Protein Sci. 11, 1908-1916). Em contraste, a maioria das ligações de antígenos e anticorpos é direcionada por uma entalpia negativa e entropia desfavorável perdida, por exemplo, anticorpo MCP1 N1pE (1-x).

[00252] Os resultados de CIT acima descritos foram realizados com anticorpo purificado com a proteína G sepharose e eluído com gradiente KSCN (ver, seção 2.3). Além disso, a eluição de anticorpo foi testada com uma solução ácida de glicina-HCl 0,1 M (pH 2,7), seguido por neutralização imediata com Tris-HCl 1 M, o anticorpo foi precipitado. Antes de determinação da concentração, a proteína precipitada foi removida por centrifugação e não ocorre dentro do experimento de CIT. Os parâmetros de ligação deste anticorpo ácido eluído também foram caracterizados por CIT. A Figura 18 mostra a curva de ligação obtida de anticorpo anti Aβ11 (pE) (eluído com glicina-HCl) com Aβ (pE11-18)- PEG, por meio do que a liberação total de calor em cada injeção é representada em função da razão molar de anticorpo e peptídeo.

[00253] Os resultados de anticorpo anti Aβ11(pE) eluído com glicina- HCl mostraram uma constante de dissociação KD = 105,26 nm, uma entalpia negativa com ΔH = -7,99 kcal/mol e um ganho de entropia de 4,64 (cal • mol-1 • K-1). Os parâmetros energéticos do anticorpo ácido e eluído por KSCN foram quase os mesmos, mas em contraste com o valor de estequiometria de anticorpo ácido eluído foi de apenas 1,01 e assim, significativamente, menor que dois. Isso significa aproximadamente a metade dos anticorpos foi inativada devido à eluição ácida. Em conclusão, a eluição de anticorpo foi realizada adicionalmente, com gradiente KSCN em vez de glicina-HCl ácido.

[00254] Adicionalmente, o anticorpo anti Aβ11(pE) biotinilado (ver, seção 1.2.3.1) foi também examinado em CIT. Na tabela 12, parâmetros de ligação termodinâmica determinados, são mostrados.

Tabela 12: Parâmetros de ligação termodinâmica de peptídeo Aβ(pE11- 18)-PEG em anticorpo anti Aβ11(pE) biotinilado

[00255] O anticorpo foi biotinilado, por meio do qual as moléculas de biotina foram acopladas em um anticorpo. Os parâmetros foram determinados por MicroCalorímetro de CIT a 20oC.

[00256] Na Figura 19, a curva de ligação obtida de anticorpo anti Aβ11(pE) biotinilado e Aβ(pE11-18)-PEG são mostrados.

[00257] Os resultados de anticorpo anti Aβ11 (pE) biotinilado mostram quase o mesmo valor de entalpia e entropia, mas uma constante de dissociação ligeiramente maior (KD = 125 nM) do que o anticorpo não biotinilado. Isso significa que a força de ligação de anticorpo anti Aβ11 (pE) biotinilado foi ligeiramente menor que a de anticorpo não biotinilado. Também, a estequiometria com 1,66 estava sob a estequiometria de anticorpo não biotinilado que possivelmente mostrou que a parte inferior de moléculas de anticorpos é inativa. Concluindo, determinou-se uma ligeira perda de atividade de anticorpos, possivelmente, pelo processo de biotinilação.

2.4.5 Determinação de reatividade cruzada

[00258] A reatividade cruzada de anticorpo anti Aβ11 (pE) (clone 13) para peptídeos piroglutamato CCL2 (conhecido como MCP-1), CCL8 (conhecido como MCP-2), gastrina volumosa, gonadoliberina, neurotensina, orexina A, fibronectina, colágeno 1 e TRH (hormônio de liberação de tirotropina), foi testada via SPR (dados não mostrados). O anticorpo testado não mostrou nenhuma reatividade cruzada com os diversos peptídeos piroglutamato. Adicionalmente, a reatividade cruzada de anticorpo clone 13 para AβpE (3-40) e AβpE (11-30), foi testada em SPR, por meio da qual o anticorpo deve ser comparado quanto à sua reatividade. Na Figura 20, um diagrama de tempo real de clone 13 para AβpE (11-30) e AβpE (3-40) ao longo do tempo é ilustrado.

[00259] Os resultados de SPR indicam que o clone 13 mostrou uma fraca reatividade cruzada com AβpE (3-40), mas com quatro grandezas inferiores a AβpE(11-30). Os resultados da CIT (ver, seção 2.4.3) mostraram que a ligação entre Aβ11pE e clone 13 foi impulsão entrópica moderada devido às interações hidrofóbicas. Isso significa que, em geral, o clone 13 pode inespecificamente interagir com peptídeos hidrofóbicos, por exemplo, Aβ3 (pE), o que foi confirmado pelos resultados de SPR acima mostrados. Resumindo, o anticorpo anti Aβ11 (pE) mostrou uma alta afinidade (ver resultados de CIT) e uma boa especificidade.

2.5 Aplicação de anticorpo anti Aβ11(pE) em ELISA tipo sanduíche 2.5.1 Estabelecimento de auto-Ig-ELISA

[00260] Para a análise de auto-imunoglobulinas em amostras de plasma de pacientes com AD e controles saudáveis, o ELISA de autoanticorpos anti Aβ11 (pE), anti Aβ3 (pE) e anti Bri-2 (pE1) foram estabelecidos (ver, Tabela 5). Os testes ELISA foram desenvolvidos para a análise das diferentes classes de IgG, IgM, IgA de anticorpos, subclasses (IgG2, IgG3) e Ig's totais de imunoglobulina. No início do processo de otimização, sinais de fundo demasiado elevados foram medidos, por meio dos quais após imobilização do peptídeo (200 ng/mL), nenhum bloqueio foi realizado. Portanto, ELISA-Blocker (-T) e PBS/FBS a 10%/Tween a 0,05% foram testados para bloqueio, bem como, para diluição de amostras e conjugados. ELISA-Blocker (-T) mostrou o menor sinal de fundo e a maior relação sinal-para-ruído em todos os auto-Ig-ELISA's.

[00261] Além disso, estabeleceu-se um padrão para a quantificação de amostras em auto-Ig-ELISA de anti Aβ11 (pE). Portanto, o mAb purificado e dialisado (clone 13) (ver, capítulo 2.2) foi testado como padrão. O mAb é direcionado contra o término N de Aβ (pE11-x) e pertence à classe de IgG de camundongo. Na Figura 21, a curva-padrão do mAb clone 13 é mostrada. Para a detecção do anticorpo padrão (clone 13), Ig's de coelho anticamundongo (HRP) e em contraste, de amostras de plasma humano foi utilizada Ig's, IgG, IgG2, IgG3, IgM ou IgA anti-humana. Um padrão de cada classe e subclasse de autoanticorpos não foi disponível, mas a comparação de nível de autoanticorpos em pacientes com AD e grupos de controle dentro de cada classe/subclasse de anticorpos foi possível, porque as amostras foram testadas e quantificadas sob condições idênticas. Contudo, a comparação de concentrações de autoanticorpos entre as classes/subclasses, bem como, entre O auto-Ig-ELISA não foi admissível devido à quantificação com o padrão de classe IgG.

[00262] O LOQ do ELISA de autoanticorpo Aβ11(pE) foi de 55 pg/mL com S/N de 1,65 e o LOQ de ELISA de autoanticorpo Aβ3(pE) foi de 48,8 pg/mL com razão de S/N de 1,88. Resumindo, o mAb de hibridoma clone 13 foi adequando como padrão e foi adicionalmente usado no auto-Ig-ELISA de anti-Aβ11(pE).

2.5.2 Desenvolvimento de ELISA do Aβ(pE11-x)

[00263] O desempenho do ELISA de Aβ11(pE) de acordo com o teste ELISA tipo sanduíche com o anticorpo de captura 4G8 e anticorpo de detecção anti Aβ11 (pE) biotinilado mostrou sinais fracos ou inconsistentes (resultados não mostrados). A detecção de peptídeo Aβ (pE11-30), bem como de Aβ (pE11-40) mostrou apenas sinais fracos. Ambos os peptídeos Aβ são muito hidrofóbicos e para evitar a adesão de peptídeos na parede do vaso durante o armazenamento, foram preparadas as soluções de peptídeos (HFIP foi evaporado e solvido alcalino), imediatamente, antes de utilização no teste ELISA, mas também não foi detectado nenhum sinal. Possíveis problemas poderiam ser causados por impedimento estérico entre o anticorpo de captura 4G8 com epítopo de Aβ (17-24) e o anticorpo de detecção com epítopo Aβ (pE11-15). Para testar diretamente a reatividade de anticorpos de 4G8 e anticorpo anti Aβ11 (pE) um teste ELISA direto com peptídeo Aβ adsorvido foi realizado. Imediatamente, antes de uso, o HFIP foi evaporado e, em seguida, o peptídeo Aβ foi dissolvido em NaOH (10 minutos à temperatura ambiente). O peptídeo forte hidrofóbico Aβ (pE11-30) deve ser imediatamente diluído em PBS diretamente na microplaca para garantir que o peptídeo durante a diluição não aderiu ao frasco de polipropileno. Nas Figuras 22 e 23, o sinal de ELISA por uso de anticorpo biotinilado anti Aβ11(pE) e anticorpo 4G8 é mostrado. O anticorpo anti Aβ11 (pE) mostrou um forte sinal de ELISA em uma concentração de Aβ (pE11-30) dependente da maneira e detectou peptídeos Aβ na faixa de nanogramas. Concluindo, o anticorpo biotinilado anti Aβ11 (pE) reconheceu o peptídeo e foi adequado para a aplicação como anticorpo de detecção.

[00264] Em contraste, o anticorpo biotinilado 4G8 mostrou apenas um fraco sinal de ELISA em uma concentração de Aβ(pE11-30) dependente da maneira.

[00265] Em comparação com o clone 13, o sinal de 4G8 foi cinco vezes menor, sob as mesmas condições. Normalmente, o 4G8 comercialmente disponível mostra uma boa propriedade de ligação a proteínas Aβ (Schupf e outros; Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 16 de setembro de 2008; 105 (37): 14052-7). Contudo, no caso de Aβ (pE11- 30), 4G8 mostrou apenas sinais de ligação fracos. O anticorpo 4G8 foi gerado por imunização com peptídeo sintético correspondente aos primeiros 24 aminoácidos do peptídeo Aβ e reconhece exclusivamente a sequência de 17-24 de peptídeo Aβ (Kim e outros 1988). Portanto, 4G8 reconheceu outras estruturas do que o peptídeo Aβ (pE11-30). Em seguida, a razão de detecção de sinal baixo era a estrutura de peptídeo utilizado. A partir desses resultados pode-se concluir que o anticorpo 4G8 não foi adequado como anticorpo de captura em ELISA de Aβ11 (pE), o que explica que apenas sinais baixos ou inconsistentes foram detectados. Em futuro próximo, as placas pré-revestidas com mAB de IgG de camundongo Aβ (35-40) anti-humano da empresa IBL devem ser testadas como anticorpo de captura, por meio do qual o peptídeo padrão Aβ (pE11-40) deve ser usado. 2.5.3 Imunocoloração com anticorpo Aβ11 (pE)

[00266] A imunocoloração de seções do cérebro de pacientes com AD e camundongos transgênicos APP/PS1 foi realizada com anticorpo Aβ11(pE) (clone 13). As imagens de IHC de casos 1 a 3 de AD humana são mostradas na Figura 24.

[00267] As seções de coloração de caso 1, 2 e 3 de AD indicam que Aβ11(pE) foi depositado extracelular, por meio do que na região do núcleo da placa de caso 1 de AD principalmente, Aβ11(pE) foi corado. Concluindo, Aβ11(pE) pode ser corado na região do núcleo, bem como, na região periférica de placas. Além disso, depósitos intracelulares foram claramente visíveis em caso 3 de AD. A amplificação (quadrado direito de fundo) em caso 3 de AD mostrou que deposições de Aβ11(pE) foram coradas diretamente além do núcleo celular, visível como forma semicircular. Notável foi que maior coloração intracelular de Aβ11(pE) foi detectada do que em Aβ3(pE).

[00268] Os resultados indicam que o anticorpo monoclonal clone 13 especificamente reconhece tanto depósitos intracelular quanto extracelulares de Aβ11(pE).

[00269] Além das seções de cérebro humano também seções de cérebro de camundongo transgênico APP/PS1 foram examinadas para deposições de Aβ11(pE) (ver, Figura 25).

[00270] As imagens de IHC de cérebro de camundongos mostram depósitos vasculares de peptídeos Aβ11(pE). Além da coloração marrom claramente visível junto aos vasos sanguíneos no cérebro de camundongos, também depósitos intracelulares de Aβ11(pE) eram visíveis. Em contraste, nas seções de cérebro humano, os depósitos vasculares não foram observados.

[00271] Resumindo, os resultados mostram que depósitos de Aβ11(pE) podem ser detectados intraneuronal, extraneuronalmente, e também vascularmente. O clone 13, mostrou uma excelente reatividade contra os peptídeos piroGlu e pode ser utilizado para a imunocoloração. Até agora, nenhuma fonte é conhecida, o que mostrou que a deposição de Aβ11 (pE) ocorre intracelular e intercelularmente em cérebros de AD humano. A deposição de peptídeos Aβ como placas é uma das mais proeminentes características patológicas de doença de Alzheimer e considera-se estar intimamente relacionada com a patogênese de demência em AD. A composição de placas não é completamente compreendida até agora.

2.6Níveis de autoanticorpo em pacientes com AD e controles saudáveis

[00272] No presente estudo, estudou-se o nível de autoanticorpos das classes e subclasses de IgG, IgM, IgA, Ig's imunoglobulinas totais, IgG2 e IgG3 direcionadas contra o epítopo Aβ(pE11-x). O objetivo foi encontrar um biomarcador potencial de diagnóstico de AD, por meio do qual uma possível correlação entre os perfis de auto-anticorpos Aβ de pacientes com AD foi analisada. Portanto, amostras de plasma que se origina de pacientes com um diagnóstico clínico de AD e de grupo de controle saudáveis foram estudadas. As 13 amostras de plasma de pacientes com AD e 30 controles saudáveis foram obtidas a partir do estudo PBD-0316 (T0 + 6 meses). Para essa análise, os testes de auto- Ig-ELISA que foram estabelecidos no presente estudo (ver, seção 1.4.2.1) foram utilizados. Os resultados são apresentados nas Figuras 26 e 27.

[00273] Na Figura 26 e Figura 27, a concentração de auto-anticorpos anti Aβ11(pE) de Ig's (imunoglobulinas totais), IgG, IgG2, IgG3, IgM e IgA é mostrada. O nível médio de todas as classes e subclasses de anticorpos anti Aβ11 (pE) analisados, exceto IgG2, foi aumentado em pacientes com AD em comparação com o grupo controle. Os resultados de autoanticorpos anti Aβ11 (pE), não mostraram nenhuma diferença significativa entre AD e controles saudáveis e uma grande flutuação de nível de autoanticorpos em controles de plasma e pacientes com AD.

3. Depósitos

[00274] Os anticorpos monoclonais que reconhecem especificamente Aβ N11pE-x, foram gerados. Atualmente, os anticorpos monoclonais correspondentes que expressam linhagem de células de hibridoma 13-11-6 foram depositados de acordo com com o Tratado de Budapeste e é disponível no Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) em Braunschweig, DE, com uma data de depósito de 14 de dezembro de 2010, e com o respectivo número de depósito

(clone 13-11-6): DSM ACC 3100

[00275] Especificidade desse anticorpo para suas respectivas sequências-alvo foi confirmada. Em relação a Aβ N11pE-x, clones de anticorpos de alta afinidade que podem ser identificados fornecem fortes sinais, em um teste de ELISA estabelecido com um limite de detecção esperado na faixa de pg baixo.

Claims (13)

1. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que se liga a peptídeos Aβ iniciados com o aminoácido 11 e apresentando um piroglutamato no N-terminal (AβpGlu(11)) com alta afinidade, em que a referida alta afinidade significa um valor de constante de dissociação (KD) de 10-7 M, ou melhor, em que a parte variável da cadeia leve do referido anticorpo apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52; e em que a parte variável da cadeia pesada do referido anticorpo apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54.

2. Anticorpo, de acordo com precedentes reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é Aβ 13-11-6, o qual é produzido pela linhagem celular de hibridoma No. de depósito DSM ACC 3100.

3. Anticorpo, de acordo com precedentes reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo humanizado ou quimérico, ou um fragmento de anticorpos que retém a alta afinidade.

4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que é humano.

5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que é um diacorpo ou um anticorpo de cadeia simples que retém a alta afinidade.

6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é marcado.

7. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que se encontra imobilizado numa fase sólida.

8. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Uso do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é para detecção de peptídeos AβpGlu(11) em tecidos cerebrais.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as variantes são selecionadas a partir do seguinte grupo: variantes pGlu-Aβ11-38 pGlu-Aβ11-40 pGlu-Aβ11-42, e pGlu-Aβ11-x, em que x é um número inteiro entre 18 e 42, mais preferencialmente, 30 e 42.

11. Linhagem celular de hibridoma, , caracterizada pelo fato de que é DSM ACC 3100.

12. Método diagnóstico in vitro para o diagnóstico de uma doença ou condição associada com amiloide, em que a referida doença ou condição associada a amiloide é uma doença neurodegenerativa selecionada a partir do grupo que consiste em deficiência cognitiva leve, doença de Alzheimer, demência familiar de Alzheimer e neurodegeneração na Síndrome de Down,, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: contatar um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, com uma amostra de tecido cerebral de um indivíduo suspeito de estar sofrendo com essa doença ou condição, e, detectar ligação do anticorpo com uma proteína AβpGlu(11), a partir da amostra.

13. Kit diagnóstico, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e instruções para uso, e - opcionalmente - (a) substâncias adicionais biologicamente ativas, em que a substância biológica adicional é um inibidor de glutaminil ciclase.

Images