CN103459421A - 诊断性抗体测定 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的诊断测定以诊断淀粉状变性，特别是阿尔兹海默病，及涉及相关方面。本发明特别提供了单克隆抗体和抗体测定。

Description

诊断性抗体测定
本发明涉及新的诊断测定及相关方面，所述测定用于诊断淀粉状变性(amyloidosis)，这是一组与淀粉样蛋白相关的失调和异常，如阿尔兹海默病(Alzheimer's disease)。本发明特别提供了抗体测定。
淀粉状变性不是一个单一疾病，而是一组不同的进行性疾病，特征在于蜡样、淀粉样蛋白质(称作淀粉样蛋白)的胞外组织沉积，其在一或多个器官或身体系统中积聚。随着淀粉样沉积物的积聚，其开始干扰器官或身体系统的正常功能。有至少15种不同类型的淀粉状变性。主要形式是无已知先例(antecedent)的原发淀粉状变性，在一些其它病症之后发生的继发淀粉状变性，以及遗传性淀粉状变性。
继发淀粉状变性发生在慢性感染或炎症疾病期间，如肺结核，称作家族性地中海发热的细菌感染、骨感染(骨髓炎)、类风湿性关节炎、小肠炎症(肉芽肿性回肠炎)、霍奇金病和麻风病。
淀粉样沉积物包括淀粉样蛋白P(五角形)成分(AP)，其是与正常血清淀粉样蛋白P(SAP)相关的糖蛋白，及硫酸化粘多糖(GAG)，其是结缔组织的复杂碳水化合物。淀粉样蛋白质原纤维，其占淀粉样物质的大约90%，包含一些不同类型的蛋白质之一。这些蛋白质能折叠成所谓的“β-折叠”原纤维，这是一种独特的蛋白质构型，呈现出刚果红结合位点，导致所述淀粉样蛋白质的独特的染色性质。
许多老年性疾病基于淀粉样蛋白质或者与其相关，其特征部分在于导致发病以及疾病的进展的淀粉样蛋白或淀粉样蛋白样材料的胞外沉积。这些疾病包括但不限于神经失调如轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)或者家族性阿尔兹海默痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性，路易体痴呆(Lewy body dementia)，与淀粉状蛋白相关遗传性脑出血(荷兰型)；Guam Parkinson-Dementia综合征。基于淀粉样蛋白质或与其相关的其它疾病是进行性核上性麻痹，多发性硬化症；海绵状脑病，帕金森氏症，HIV-相关的痴呆，ALS(肌肉萎缩性侧索硬化症)，成人型糖尿病；老年性心脏淀粉状变性；内分泌性肿瘤等，包括黄斑变性。
尽管这些疾病的发病机制可以不同，但是其特征性沉积物通常含有许多共有的分子成分。在明显程度上，这可归因于促炎途径的局部激活，从而导致激活的补体成分、急性期反应物、免疫调节物及其它炎症中介物的同时沉积(McGeer et al.,Tohoku J Exp Med.174(3):269-277(1994))。
近年来，越来越多的迹象证实阿尔兹海默病中N-末端修饰的Aβ肽变体的参与作用。针对性的活组织检查显示Aβ1-40和Aβ1-42不仅存在于阿尔兹海默病患者的脑中，也存在于未受影响的个体的衰老斑中。然而，N-末端截短的和焦谷氨酸(pyroGlu)修饰的AβN3pE-40/AβN3pE-42几乎唯一存在于阿尔兹海默病患者的斑内，使得这种Aβ变体成为合适的诊断标记和药物开发的潜在目标。
目前，一些商业生产者提供了ELISA试剂盒，可以在较低的皮克(pg)范围检测Aβ1-40/1-42和AβN3pE-40/AβN3pE-42。
阿尔兹海默病(AD)患者的脑部的形态学特征是存在神经原纤维缠结及新皮质脑结构中Aβ肽的沉积(Selkoe,D.J.& Schenk,D.Alzheimer's disease:molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.43,545-584(2003))。Aβ肽在β-和γ-分泌酶相继裂解之后从淀粉样前体蛋白(APP)中释放。γ-分泌酶裂解导致Aβ1-40和Aβ1-42肽产生，它们在C-末端不同并呈现出不同的聚集、原纤维形成和神经毒性潜力(Shin,R.W.et al.Amyloid beta-protein(Abeta)1-40but not Abeta1-42contributes to the experimental formation of Alzheimer disease amyloid fibrilsin rat brain.J.Neurosci.17,8187-8193(1997)；Iwatsubo,T.et al.Visualizationof Abeta42(43)and Abeta40in senile plaques with end-specific Abetamonoclonals:evidence that an initially deposited species is Abeta42(43).Neuron13,45-53(1994)；Iwatsubo,T.,Mann,D.M.,Odaka,A.,Suzuki,N.&Ihara,Y.Amyloid beta protein(Abeta)deposition:Abeta42(43)precedes Abeta40in Down syndrome.Ann.Neurol.37,294-299(1995)；Hardy,J.A.& Higgins,G.A.Alzheimer's disease:the amyloid cascade hypothesis.Science256,184-185(1992)；Roβner,S.,Ueberham,U.,Schliebs,R.,Perez-Polo,J.R.&Bigl,V.The regulation of amyloid precursor protein metabolism by cholinergicmechanisms and neurotrophin receptor signaling.Prog.Neurobiol.56,541-569(1998)).
弥漫性斑中沉积的大多数Aβ肽是N-末端截短的或者修饰的。Piccini和Saido的研究显示出衰老斑和血管沉积物的核心结构由50%焦谷氨酸(pyroGlu)修饰的肽组成(Piccini et al.,J Biol Chem.2005Oct7;280(40):34186-92；Saido et al.,Neuron.1995Feb；14(2):457-66)。焦谷氨酸修饰的肽比其它Aβ种类具有更强的细胞毒性，并且对氨基肽酶是稳定的(Russo et al.,J Neurochem.2002Sep;82(6):1480-9)。因此，焦谷氨酸Aβ具有较长的半衰期，从而这些物质的累积及神经毒性寡聚体的形成和聚集是有益的(Saido,Neurobiol Aging.1998Jan-Feb;19(1Suppl):S69-75)。由于谷氨酸环化为焦谷氨酸，带电荷的氨基酸丧失，这样显著降低了肽的溶解性并且导致聚集倾向增加。体外研究表明与未修饰的肽相比，例如Aβ3(pE)的初始寡聚化更快速(Schilling et al.,Biochemistry.2006Oct17;45(41):12393-9)。
由本发明人进行的研究示出Aβ11(pE)与Aβ3(pE)相比具有较高的聚集潜力和更低的溶解性。
Figure BDA0000382775580000031
J.等研究小组(Proc.Natl.Acad.Sci.Neurobiology,Vol.91pp.8378-8382)通过质谱分析检测了散发性AD患者脑中大多数著名的截短的变体AβpE(11-42)。迄今为止，
Figure BDA0000382775580000032
J.等的研究是检验斑块中Aβ11(pE)沉积的几个研究之一。
所有事实均提示焦谷氨酸Aβ是起始原纤维形成的一种起源。在新近的研究中(Piccini et al.,2005,supra)，具有斑块沉积但无AD特异性病变的志愿者由于Aβ物种的特征性量而可以与AD患者区分开。从而N-末端截短的焦谷氨酸修饰的肽的量显著高于AD患者脑中的相应量。
在Aβ肽的位置3或11的焦谷氨酸翻译后形成意味着N-末端谷氨酸残基的环化。谷氨酰胺酰基环化酶(QC)在焦谷氨酸肽的产生中起重要作用。QC广泛分布于植物和动物界及其它事物中，参与肽激素的成熟。通过氨的释放而使谷氨酰胺环化及通过水的释放使谷氨酸环化为焦谷氨酸均是通过QC进行的。与谷氨酰胺环化相反，谷氨酸环化不是自发发生的。QC催化有效的(不希望的)从谷氨酸至焦谷氨酸的副反应。产生的焦谷氨酸残基保护蛋白质免于蛋白酶降解。有一些参考文献示出QC在焦谷氨酸Aβ的产生中起重要作用：
1.在一些研究中，示出QC在Aβ的N末端催化从谷氨酸形成焦谷氨酸残基(Cynis et al.,Biochim Biophys Acta.2006Oct;1764(10):1618-25,Schilling et al.,FEBS Lett.2004Apr9;563(1-3):191-6)；
2.Aβ肽和QC在海马和皮质中均大量表达。这些脑部区域在AD中特别危险(Pohl et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.1991Nov15;88(22):10059-63,Selkoe,Physiol Rev.2001Apr;81(2):741-66)；
3.APP在转运至质膜期间被β-分泌酶裂解，从而可以产生具有游离谷氨酸残基的Aβ的N末端(Greenfield et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.1999Jan19;96(2):742-7)。在分泌小泡中，确定了加工的APP和QC的共定位。因此在小泡的轻度酸性环境中，可以发生加速谷氨酸残基修饰为焦谷氨酸。
4.其它神经变性疾病(家族性丹麦型(FDD)或英国型痴呆(FBD))也与N-末端焦谷氨酸修饰的肽如Bri2相关，但是相反其与Aβ在一级结构方面不相关(Vidal R.et al.,1999Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97,4920-4925)。
可能的是QC-催化的焦谷氨酸Aβ形成参与神经变性疾病的发生和进展。N-末端修饰的淀粉样肽的形成无疑代表了在Aβ聚集过程中的一个基本因素，及可以是疾病发病因素。通过抑制QC而阻抑焦谷氨酸Aβ形成可以代表一种治疗方法。QC抑制剂能阻止焦谷氨酸Aβ形成，降低脑中焦谷氨酸Aβ浓度，因此延缓Aβ-肽的寡聚化。Schilling et al.示出QC表达在AD患者皮质中是被正调节的，及与焦谷氨酸-修饰的Aβ-肽的存在相关。在两个不同的AD转基因小鼠模型及在一个新的果蝇(Drosophila)模型中QC抑制剂的口服应用导致降低的焦谷氨酸修饰的AβpE(3-42)水平(Schilling et al.,2008Biol.Chem.(389),983-991)。
路易体痴呆(LBD)是一种神经变性疾病，可发生在65岁以上年龄的人，典型导致认知(思维)损伤和异常的行为改变。症状可包括认知损伤神经迹象，睡眠失调和自主神经衰竭。认知损伤在大多数案例中是LBD的当前特征。患者具有进行性恶化的复发的混乱的经历。认知能力的波动通常与注意力和警觉力(alertness)的转移程度相关。认知损伤和思维波动可以在几分钟、几小时或者几天内变化。路易体是从磷酸化和非磷酸化神经丝蛋白中形成的；其含有突触蛋白α-突触核蛋白以及遍在蛋白，其参与损害的或异常的蛋白质的除去。除了路易体之外，也可以存在是神经细胞的细胞过程(cell processes)中的包涵体的Lewy神经突。淀粉样斑块可以在DLB患者脑中形成，然而其与阿尔兹海默病患者中可见数目相比趋于较少。神经原纤维缠结，AD的其它微病理学(micropathological)特点，不是LBD的主要特征，但是除了淀粉样斑块之外也是经常存在的。
肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)特征在于上和下运动神经元的变性。在一些ALS患者中，可以存在痴呆和失语症(ALS-D)。痴呆是最常见的额颞区(FTD)，许多这样的病例在齿状回和额叶和颞叶的表层的神经元中具有遍在蛋白阳性的、tau-阴性的包涵体。
包涵体肌炎(IBM)是一种严重损害身体的疾病，通常见于50岁以上的人，其中肌纤维发生炎症并开始萎缩，但是脑部除外(spared)，患者保留其全部智力。发现参与淀粉样-β蛋白产生的两种酶在老年人中具有这种最常见的进行性肌病患者的肌细胞内部增加，其中淀粉样-β蛋白也增加。
基于或与淀粉样蛋白质的累积和沉积相关的另一疾病是黄斑变性。黄斑变性是一种常见的眼病，导致黄斑退化，黄斑是视网膜的中心区域(在眼后面的极薄组织，于此处光敏性细胞输送视觉信号至脑)。敏锐的、明亮的、“前向的(straight ahead)”视觉由黄斑加工。黄斑损害导致盲点产生及模糊或扭曲的视觉。年龄相关的黄斑变性(AMD)在美国是导致视觉损害的主要因素，对于白种人超过65岁的人是导致法定盲的因素。大约1.8百万的40岁及以上的美国人具有行进性AMD，另有7.3百万人具有中间状态AMD，处于视觉丧失的实际危险中。政府预计在2020年将有2.9百万人患有先进性AMD。AMD的受害者通常惊讶及失望地发现关于这种失明状况的原因和治疗知道的很少。
有两种形式的黄斑变性：干性黄斑变性和湿性黄斑变性。干性形式其中黄斑细胞缓慢开始损坏，在85%的黄斑变性病例中诊断。两眼通常均受干性AMD影响，但是一只眼可丧失视觉，而另一只眼保持不受影响。玻璃膜疣，是在视网膜下的黄色沉积物，是干性AMD的常见早期迹象。发生进行性干性AMD或湿性AMD的危险随着玻璃膜疣的数目或大小增加而增加。对于干性AMD可能的是进行性及导致视觉丧失，而不转变为湿性形式AMD；然而，也可能的是早期干性AMD突然转变为湿性形式。
湿性形式尽管仅占该病例的15%，但是导致90%的失明，被认为是进行性AMD(湿性AMD没有早期或中间阶段)。湿性AMD总是由该病的干性形式领先。随着干性形式恶化，一些人开始在黄斑后面具有异常的血管生长。这些血管非常脆弱，易渗液和出血(因此为“湿性”黄斑变性)，导致黄斑迅速损害。
干性AMD最初通常导致轻微的视力模糊。特别是视觉中心然后可变的模糊，这个区域随着疾病进展而扩大。如果只是一只眼受影响可无症状。在湿性AMD中，直线可出现波纹，可以迅速发生中心视力丧失。
黄斑变性的诊断典型包括散瞳检查，视敏度检测，及使用称作眼底镜检查的程序观察眼后面，以帮助诊断AMD，以及如果怀疑是湿性AMD，也可以进行荧光素血管造影术。如果干性AMD达到进展阶段，目前还没有治疗方法可以阻止视力丧失。然而，特定的高剂量抗氧化剂和锌配制物可延缓或阻止中间AMD免于进展为晚期阶段。
Figure BDA0000382775580000061
(pegaptanibsodium注射液)、激光凝固和光动力学治疗可控制黄斑内异常血管生长和出血，这可有助于患有湿性AMD的一些人；然而，这些技术不能恢复已经丧失的视力。如果视力已经丧失，低视力辅助存在可帮助改善生存质量。
年龄相关的黄斑变性(AMD)的最早的迹象之一是视网膜色素上皮(RPE)的基底层与Bruch's膜(BM)之间的称作玻璃膜疣的胞外沉积物累积。由Anderson等进行的最近的研究证实玻璃膜疣含有淀粉样β-蛋白(Experimental Eye Research78(2004)243-256)。
本发明的目的是建立高敏性同时有力的检测技术，使得可以在生物样品如液体(liquor)或血清样品、优选血清样品中定量测定Aβ变体，特别是AβpGlu(11-x)肽。这是一个极大的挑战，考虑到血液中低丰度的Aβ肽。然而，可利用这种检测技术的先决条件是在药物筛选程序中研究小分子抑制剂的效力。
本发明提供了新的方法和组合物，所述组合物包含高特异性和高有效性的抗体，包括嵌合抗体及其片段，包括部分或完全人源化抗体及其片段，所述抗体具有特异性识别及结合一系列β-淀粉样抗原、特别是AβpGlu(11-x)肽的特定表位的能力，所述肽可以单体、二聚体、三聚体等或多聚体形式、以聚集体、纤维、细丝形式或者以斑块浓缩形式呈递给所述抗体。通过本发明教导可提供的抗体特别可用于诊断淀粉状变性，这是与淀粉样斑块形成相关的一组疾病或失调，包括继发淀粉状变性和年龄相关的淀粉状变性，包括但不限于神经失调如阿尔兹海默病(AD)，路易体痴呆(Lewy bodydementia)，唐氏综合征，遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆综合征(Guam Parkinson-Dementia complex)；以及基于或与淀粉样蛋白相关的其它疾病，如进行性核上性麻痹，多发性硬化症；Creutzfeld Jacob病，遗传性脑出血伴淀粉状变性荷兰型，帕金森氏症，HIV-相关的痴呆，ALS(肌萎缩性脊髓侧索硬化症)，成人型糖尿病；老年心脏淀粉状变性；内分泌性肿瘤，等等，包括黄斑变性，只是列举了一小部分。
发明概述
本发明特别涉及抗体或其变体，特征在于其以高亲和性结合AβpGlu(11-x)肽。所述高亲和性在本发明中是指亲和性KD值为10-7M或更好，优选10-8M或更好，更优选KD值为10-9M至10-12M。
特别地，所述抗体优选是单克隆抗体，选自Aβ13-11-6，在后文称作克隆13。
本发明的抗体可特别用于诊断方法中以检测淀粉状变性，特别是阿尔兹海默病。
附图描述
图1:抗Aβ11(pE)抗体的筛选
分析在细胞融合及HAT培养基选择之后的26个杂交瘤细胞上清。针对部分含有EVHH序列的不同的经修饰Aβ肽来测试mAb。灰色标记的肽AβpE(11-23)(见斑点10)含有在N末端具有焦谷氨酸的靶序列(pEVHH)。每个膜均用肽1-16点印。选择框起的膜(framed membranes)的杂交瘤细胞(n=9)用于再克隆。在再克隆后只有实线框内的膜的细胞是稳定的。
图2:用Aβ(pE11-30)包被CM5芯片
传感器芯片表面用EDC/NHS以10μl/分钟激活8分钟。使用如下材料进行通过胺偶联的配体固定化：A)10μg/ml Aβ(pE11-30)于10mM KH2PO4，pH6中；B)50μg/ml Aβ(pE11-30)于10mM乙酸钠，pH5中。以10μl/分钟速度注射肽5分钟(A)和20分钟(B)。然后，将反应基团(游离酯)用1M乙醇胺pH8.5以10μl/分钟速度失活10分钟。未固定化的肽通过注射0.1MHCl(3×10μl)除去，然后将芯片用运行缓冲液漂洗过夜。最终，信号为1000RU。配体固定化在Biacore3000进行。
图3:抗Aβ11(pE)抗体的SPR测量
通过Biacore3000分析来自克隆13的杂交瘤细胞培养上清。使用具有固定化的Aβ(pE11-30)的CM5芯片，信号为1000RU(流动池4)。示出的是Aβ(pE11-30)随着时间的实时结合图。样品在运行缓冲液中以1:100稀释，使用30μl/分钟速度在300秒内期间注射，记录300秒解离时间。来自未包被的流动池的信号从在具有固定化Aβ的流动池4中测量的信号中减去。
图4:抗Aβ11(pE)抗体的曲线
在Biacore3000通过SPR测量浓度为0.04-10μg/ml的纯化的抗体。曲线的线性范围是从0.040μg/ml直至1.25μg/ml抗体。抗体在运行缓冲液中稀释，以30μl/分钟速度在300秒期间注射。从解离期末选择SPR信号。来自未包被的流动池的信号从在具有Aβ的流动池测量的信号中减去。
图5：抗Aβ11(pE)抗体的标准曲线
在Biacore3000通过SPR测量已知浓度的纯化抗体。抗体的浓度范围是从0.040直至1.25μg/ml抗体。线性回归等式：y=3033.7x+50.099(R2=0.991)。每个SPR信号从解离期末选择。来自未包被的流动池的信号从在具有固定化Aβ的流动池测量的信号中减去。
图6：细胞数和产生抗Aβ11(pE)抗体浓度的对比
在含有血清的培养基和无血清培养基(杂交瘤SFM)中于37℃和5%CO2条件下培养的克隆13的杂交瘤细胞(细胞传代19代)，在使用前直接补加2mM L-谷氨酰胺和50μMβ-巯基乙醇。将细胞在摇瓶中培养大约10天，定期取样以通过SPR确定细胞生长(A)和抗体浓度(B)。
图7：依赖于培养时间的比生长速率μ
在含有血清的培养基中和无血清培养基(杂交瘤SFM)中于37℃和5%CO2条件下培养的克隆13的杂交瘤细胞(细胞传代19代)，在使用前直接补加2mM L-谷氨酰胺和50μMβ-巯基乙醇。数据基于在摇瓶中培养10天的生长曲线。
图8：抗Aβ11(pE)的浓度针对存活细胞的积分(integral)绘图
将克隆13的杂交瘤细胞(细胞传代19代)在含有血清的培养基中和无血清培养基(杂交瘤SFM)中在37℃和5%CO2条件下培养，培养基中补加了2mM L-谷氨酰胺和50μMβ-巯基乙醇。数据基于在摇瓶中生长10天的生长曲线。存活细胞的积分得自依赖于时间的细胞数图，从而在5、24、48、72小时的数据点被积分(integrated)。抗体生产率得自曲线斜率(见线性函数)。R2=确定系数(coefficient of determination)。
图9：抗Aβ11(pE)纯化的层析图
在
Figure BDA0000382775580000091
上使用蛋白G HP柱(V=5ml)纯化1800ml杂交瘤(克隆13)细胞培养上清。将该柱在4℃冷却，用1×结合缓冲液(20mMNa2HPO4，pH7.0)平衡。将细胞上清在4℃以38400×g离心30分钟，与2×结合缓冲液以1:1比率混合。使用
Figure BDA0000382775580000092
P-950泵。以1.5ml/分钟应用培养上清(冰冷却的)。A)在纯化期间在280nm光吸收和传导率的层析图。用5个柱体积的0-2M NaCl-梯度洗涤，然后用1×结合缓冲液载体洗涤。用5个柱体积的0-2M KSCN-梯度(pH7.0)洗脱，反向流速为2.5ml/分钟。B)0-2M KSCN-梯度的较高的放大率和洗脱级分V=20ml。所示体积是技术系统流程，非实际体积。
图10：抗Aβ11(pE)抗体(克隆13)纯化的SDS-凝胶电泳图
预染色蛋白质梯：10-250kDa(Fermentas)。分析的纯化级分：泳道1，6:蛋白G纯化之前；泳道2，7:流经液；泳道3；8:洗涤级分；泳道4，9:用KSCN洗脱，使用30μg/ml抗体；泳道5:非还原样品缓冲液。抗体纯化使用蛋白G HP柱进行，用0-2M KSCN pH7.0洗脱。还原样品在具有β-巯基乙醇的SDS缓冲液(1，BioRad)中1:3稀释，在95℃温育10分钟。非还原样品在无β-巯基乙醇的样品缓冲液中1:4稀释，在30℃振荡30分钟。SDS-PAGE分离时间(12%，1mm SDS-凝胶)：在100V分离10分钟，在200V分离35分钟。将凝胶用考马斯亮蓝-G250染色，用10%乙酸脱色。
图11:抗Aβ11(pE)抗体的UV-光谱
使用通过蛋白G柱从杂交瘤细胞培养上清(克隆13)中纯化的抗体。在240nm-339nm之间测量光谱。在透析缓冲液(D-PBS，2mM EDTA，pH7.13)中1:20稀释。探针的厚度为1cm，使用UV-光谱仪UV1测量在240-339nm之间的UV-光谱。
图12:抗Aβ11(pE)抗体的UV-光谱
抗体稀释：在D-PBS、2mM EDTA中1:10稀释。在生物素化之前和之后使用UV-光谱仪UV1测量在240nm-339nm之间的光谱。探针厚度为1cm。
图13:抗Aβ11(pE)抗体的CD-光谱
使用Jasco J-710spectro-polarimeter在20℃测量在190-260nm之间的生物素化和未生物素化的抗体的光谱。抗体浓度为在10mM NaH2PO4(pH7.1)中0.13mg/ml。以20次累积(accumulation)、1s积分及1mm厚的探针进行测量。
图14:抗Aβ11(pE)抗体的热稳定性
使用Jasco J-710spectro-polarimeter在20℃直至80℃温度测量在190-260nm之间的CD-光谱。抗体浓度为在10mM NaH2PO4(pH7.14)中0.13mg/ml。以5℃间隔、加热速率为30K/小时的10次累积、1s积分、及厚的探针进行测量，每次测量前平衡180秒。
图15:生物素化的抗Aβ11(pE)抗体的热稳定性
使用Jasco J-710spectro-polarimeter在20℃直至80℃温度测量在190-260nm之间的CD-光谱。抗体浓度为在10mM NaH2PO4(pH7.14)中0.13mg/ml。以5℃间隔、加热速率为30K/小时的10次累积、1s积分、及厚的探针进行测量，每次测量前将温度平衡180秒。抗体浓度为在10mMNaH2PO4(pH7.14)中0.13mg/ml。间隔5℃测量，加热速率为30K/小时，10次扫描，1秒积分，1mm厚度的探针，每次测量前平衡180秒。
图16：Aβ(pE11-18)-PEG与抗Aβ11(pE)抗体(克隆13)的ITC滴定曲线
使用ITC MicroCalorimeter(MicroCal)。实验包括30次在20℃注射(1次2μl，29次10μl)，每次注射在ITC缓冲液pH7.1中的81.78μMAβ(pE11-18)-PEG，两次注射间隔4分钟(黑色线条)。上面的踪迹例证了ITC缓冲液中Aβ(pE11-18)-PEG的稀释热。下面的踪迹示出了将Aβ(pE11-18)-PEG注射进含有在ITC缓冲液pH7.1中的5.13μM抗体的样品池中(体积=1.405ml)。红色线条是基线。
图17:Aβ(pE11-18)-PEG与抗Aβ11(pE)抗体(克隆13)的ITC结合曲线
抗体用蛋白G琼脂糖凝胶纯化，并用KSCN-梯度(pH7.0)洗脱。实验包括在20℃的30次注射(1次2μl，29次10μl)，每次注射于ITC缓冲液pH7.1中81.78μM Aβ(pE11-18)-PEG，两次注射间隔4分钟。样品池(体积=1.405ml)含有在ITC缓冲液pH7.1中的5.13μM抗体。Aβ(pE11-18)-PEG稀释进ITC缓冲液中的热从所有配体注射中减去。使用ITCMicroCalorimeter(MicroCal)。使用Origin7.0确定热力学参数反应化学计量(N)、结合常数(K)、键焓(binding enthalpy，ΔH)以及熵(ΔS)。
图18:Aβ(pE11-18)-PEG与Aβ11(pE)抗体(克隆13)的ITC结合曲线
抗体用蛋白G琼脂糖凝胶纯化，并用0.1M甘氨酸-HCl盐酸(pH2.7)洗脱。实验包括在20℃的30次注射(1次2μl，29次10μl)，每次注射于ITC缓冲液pH7.1中686.31μM Aβ(pE11-18)-PEG，两次注射间隔4分钟。样品池(体积=1.405ml)含有在ITC缓冲液pH7.1中的32.85μM抗体。Aβ(pE11-18)-PEG稀释进ITC缓冲液中的热从所有配体注射中减去。使用ITC MicroCalorimeter(MicroCal)进行。使用Origin7.0确定热力学参数反应化学计量(N)、结合常数(K)、键焓(binding enthalpy，ΔH)以及熵(ΔS)。
图19：Aβ(pE11-18)-PEG与生物素化的抗Aβ11(pE)抗体(克隆13)的ITC结合曲线
所示实验包括在20℃的30次注射(1次2μl和29次10μl)，每次注射在ITC缓冲液pH7.1中的101.8μM Aβ(pE11-18)-PEG，两次注射间隔4分钟。样品池(体积=1.405ml)含有在ITC缓冲液pH7.1中的5.12μM生物素化的抗体。Aβ(pE11-18)-PEG的稀释进ITC缓冲液中的热从所有配体注射中减去。使用ITC MicroCalorimeter(MicroCal)进行。使用Origin7.0确定热力学参数反应化学计算(N)、结合常数(K)、键焓(binding enthalpy，ΔH)以及熵(ΔS)。
图20：抗Aβ11(pE)与抗Aβ3(pE)抗体的交叉反应性
在Biacore3000上通过SPR确定抗Aβ11(pE)抗体(克隆13)与AβpE(11-30)和AβpE(3-40)肽的交叉反应性。使用具有固定化的大约1000RU的AβpE(11-30)和1830RU的AβpE(3-40)的CM5芯片。以30μl/分钟的速度注射1μg/ml抗体300秒，记录300秒解离时间，在运行缓冲液中稀释。在具有固定化的Aβ的流动池中测量的信号从未包被的流动池中测量的信号中减去。
图21：在自身-Ig-ELISA中抗Aβ11(pE)抗体(克隆13)的标准曲线
将200ng/ml Aβ(pE11-20)-生物素固定化在链霉抗生物素包被的微平板上(2小时，室温)。用200μl ELISA-Blocker(-T)在室温封闭1小时，随后进行洗涤循环(3×300μl/孔洗涤缓冲液)。将标准抗Aβ11(pE)抗体(克隆13)在ELISA-Blocker(+T)中稀释，以根值除法(radix division)从3500pg/ml稀释至55pg/ml，在4℃温育2小时。进行一次洗涤循环，使用多克隆兔抗小鼠Ig′s HRP在4℃检测1小时。在洗涤循环之后加入TMB/H2O2，在室温温育30分钟(避光)，用1M H2SO4终止酶反应。在TECAN Sunrise测量在450/540nm的光吸收。
图22：直接Aβ11(pE)ELISA(克隆13)
将不同浓度的AβpE(11-30)肽在4℃包被过夜，然后用ELISA-Blocker(-T)在室温封闭2小时。将生物素化的抗Aβ11(pE)抗体(克隆13)与链霉抗生物素-HRP缀合物在室温预温育10分钟，在ELISA-Blocker(+T)中稀释。加入1μg/ml抗体(克隆13)。用6×300μl/孔TBS-T buffer在两次温育之间(除了在肽包被之后)进行洗涤循环。加入TMB/H2O2，在室温温育30分钟(避光)，用1M H2SO4终止酶反应。在TECAN Sunrise中测量在450/540nm的光吸收。
图23：直接Aβ11(pE)ELISA(4G8)
将不同浓度的AβpE(11-30)肽在4℃包被过夜，然后用ELISA-Blocker(-T)在室温封闭2小时。将生物素化的4G8与链霉抗生物素-HRP缀合物在室温预温育10分钟，在ELISA-Blocker(+T)中进行二基数稀释(radix twodilution)。加入1μg/ml4G8抗体。用6×300μl/孔TBS-T在两次温育之间(除了在肽包被之后)进行洗涤循环。加入TMB/H2O2，在室温温育(避光)30分钟，用1M H2SO4终止酶反应。在TECAN Sunrise中测量在450/540nm的光吸收。
图24：人AD脑的β-淀粉样蛋白染色
使用抗Aβ11(pE)(克隆13)抗体进行免疫染色。AD脑切片是经石蜡包埋的。细胞核用苏木精染色。来自AD病例1和3的海马及来自AD病例2的额叶皮质的系列切片照相。AD病例1和2示出Aβ11(pE)沉积的细胞外大斑块(见箭头和放大方图所示)。在AD病例2中示出细胞内Aβ11(pE)沉积(见下右侧放大方图所示)，在AD病例3中示出Aβ11(pE)沉积(见箭头所示)。在左图和右图中的放大率是相似的。该图像由C.Lemere实验室(HavardMedical School,Boston)友好提供。
图25：APP/PS1小鼠脑的β-淀粉样蛋白染色
用抗Aβ11(pE)抗体对福尔马林固定的石蜡包埋的AD脑切片进行免疫染色。细胞核用苏木精染色。对转基因小鼠的海马进行系列切片。系列切片示出Aβ11(pE)的血管沉积。褐色染色在脑血管中出现。图像由C.Lemere实验室(Havard Medical School,Boston)友好提供。
图26:自身-Ig-ELISA中抗Aβ11(pE)IgG和Ig水平
在抗Aβ11(pE)自身抗体ELISA中关于总免疫球蛋白和IgG水平分析阿尔兹海默病(AD)和对照组(13个AD，30个对照)的EDTA-血浆。示出对照组和AD组的平均值和标准偏差。一式两份确定结果，样品在标准曲线内测量。
图27：自身-Ig-ELISA中抗Aβ11(pE)IgG2、IgG3、IgM和IgA水平
在抗Aβ11(pE)自身抗体ELISA中，分析阿尔兹海默病(AD)和对照组(13个AD；30个对照)的EDTA-血浆的IgG2、IgG3、IgM和IgA水平。示出对照组和AD组的平均值和标准偏差。一式两份确定结果，样品在标准曲线内测量。
发明详述
定义
术语“抗体”以其最广泛的含义使用，特别涵盖完整的单克隆抗体，多克隆抗体，从至少两个完整抗体中形成的多特异性抗体(例如双抗体)，以及抗体片段，只要其呈现出希望的生物学活性即可。抗体可以是例如IgM，IgG(如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4)，IgD，IgA或IgE。然而，优选抗体不是IgM抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合区或可变区。举例的抗体片段包括Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段：双抗体，单链抗体分子，及从抗体片段中形成的多特异性抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指得自一群基本同源的抗体的抗体，即该群包含的各个抗体除了以较少量存在的可能的天然发生的突变之外是相同的。单克隆抗体针对单一抗原性位点是高特异性的。此外，与“多克隆抗体”制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上一个单一决定簇，而多克隆抗体典型包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体。除了其特异性之外，单克隆抗体通常是有利的，其是通过杂交瘤培养合成的，不受其它免疫球蛋白污染。“单克隆”是指抗体得自基本同源的抗体群的特征，不是解释为需要通过任何特定方法产生所述抗体。例如，本发明中使用的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法产生，所述杂交瘤方法首先由
Figure BDA0000382775580000131
et al.,Nature,256:495(1975)描述。或者可以通过熟知的重组DNA方法产生。“单克隆抗体”也可以分离自噬菌体抗体文库，使用例如Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述技术。
本发明中的单克隆抗体特别包括嵌合抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的相应序列是相同或同源的，同时所述链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的相应序列相同或同源，还包括这种抗体的片段，只要其呈现出希望的生物活性即可。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合的免疫球蛋白、其免疫球蛋白链或片段(如Fv,Fab,Fab',F(ab')2或者抗体的其它抗原结合亚序列)，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小的序列。对于大多数而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基由具有希望的特异性、亲和性和能力(capacity)的来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR置换。在一些情况中，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基由相应的非人残基置换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体及在输入的CDR或构架序列中均未发现的残基。
产生这些修饰是为了进一步改善和优化抗体性能。通常地，人源化抗体包含基本上全部的至少一个及典型二个可变结构域，其中全部或基本上全部的CDR区相应于非人免疫球蛋白的那些区域，全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白序列的那些区域。人源化抗体理想地还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型为人免疫球蛋白的恒定区。进一步的详细描述见Jones et al.,Nature,321:522-525(1986),Reichmann et al,Nature.332:323-329(1988)及Presta,Curr.Op.Struct.Biel.,2:593-596(1992)所述。人源化抗体包括PrimatizedTM抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过用感兴趣的抗原免疫恒河猴产生的抗体。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一个多肽链中。通常地，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的一个多肽接头，其使得sFv形成抗原结合希望的结构。关于sFv的回顾见Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)所述。
术语“双抗体(Diabodies)”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在同一多肽链(VH–VD)中与轻链可变结构域(VD)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用非常短的以至于同一链上两个结构域之间不能配对的接头，使得所述结构域与另一链的互补结构域配对。双抗体在Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sol.USA,90:6444-6448(1993)中更充分描述。
“分离的”抗体是已经从其天然环境的成分中鉴别和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分是干扰抗体的诊断或治疗性应用的材料，可包括酶、激素及其它蛋白质样或非蛋白质样溶质。在优选的实施方案中，所述抗体被纯化为：(1)通过Lowry方法确定抗体95%重量以上，最优选99%以上；(2)通过使用spinning cup sequenator，足以获得N末端至少15个残基或者内部氨基酸序列的程度；或者(3)在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染色，通过SDS-PAGE纯化为均质性。分离的抗体包括重组细胞内原位抗体，由于抗体天然环境的至少一种成分不存在。然而，通常分离的抗体是通过至少一个纯化步骤制备的。
如本文所用，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，所有这些名称均包括其后代。因此，术语“转化体”和“转化的细胞”包括原代对象细胞以及衍生自其中的培养物，无关于传代(transfers)次数。也应理解所有后代在DNA含量方面由于有意或无意的突变所致可以不是精确相等的。包括经筛选与在最初转化的细胞具有相同功能或生物活性的突变后代。在明确命名的情况中，从上下文可明了。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，定义为是指由通过肽键连接的氨基酸组成的生物分子。
如本文所用，术语“一个…”、“所述…”等定义为是指“一或多个”，除非根据上下文语境是不当的，则还包括多个。
短语“由淀粉样蛋白或淀粉样蛋白样蛋白(amyloid-like proteins)导致或与其相关的疾病或失调”包括但不限于由于存在单体、原纤维或多聚体状态或者这三种状态的任意组合的淀粉样蛋白样蛋白或其活性所致的疾病或失调。这种疾病和失调包括但不限于淀粉状变性，内分泌肿瘤及黄斑变性。
术语“淀粉状变性”是指与淀粉样斑块形成相关的一组疾病和失调，包括但不限于继发淀粉状变性和年龄相关的淀粉状变性，例如包括但不限于神经失调如阿尔兹海默病(AD)，包括特征在于认知记忆能力丧失的疾病或病症，如轻度认知损伤(MCI)，散发性阿尔兹海默病，路易体痴呆(Lewybody dementia)，唐氏综合征，遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆综合征(Guam Parkinson-Dementia)，家族性阿尔兹海默病如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)；以及基于或与淀粉样蛋白质相关的其它疾病，如进行性核上性麻痹，多发性硬化症；Creutzfeld Jacob病，帕金森病，HIV-相关痴呆，ALS(肌萎缩性脊髓侧索硬化症)，包涵体肌炎(IBM)，成人型糖尿病，及老年性心脏淀粉状变性；以及各种眼病，包括黄斑变性，玻璃膜疣-相关的视神经病变，及由于β-淀粉样沉积所致白内障。
“淀粉样蛋白β、Aβ或者β-淀粉样蛋白”是本领域认可的术语，是指淀粉样β蛋白和肽，淀粉样蛋白β前体蛋白(APP)，以及其修饰物、片段及任何功能等价物。特别地，本发明使用的淀粉样蛋白β是指通过APP的蛋白酶解产生的任何片段，但特别是参与淀粉状变性或与其相关的那些片段，包括但不限于Aβ1-38，Aβ1-40，Aβ1-42。这些Aβ肽的氨基酸序列如下示出：
Aβ1-42(SEQ ID NO.1):
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala
Aβ1-40(SEQ ID NO.2):
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val
Aβ1-38(SEQ ID NO.3):
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly
“pGlu-Aβ”或“AβN3pE”是指Aβ的N末端截短形式，其起自于在Aβ氨基酸序列第3位的谷氨酸残基，其中所述谷氨酸残基被环化形成焦谷氨酸残基。特别地，如本发明所用pGlu-Aβ是指参与淀粉状变性或者与其相关的那些片段，包括但不限于pGlu-Aβ3-38，pGlu-Aβ3-40，p-Glu-Aβ3-42。
Aβ的N-末端截短形式Aβ3-38、Aβ3-40、Aβ3-42的序列如下示出：
Aβ3-42(SEQ ID NO.4):
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala
Aβ3-40(SEQ ID NO.5):
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val
Aβ3-38(SEQ ID NO.6):
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly
“AβpGlu(11)”、“Aβ(pE11)”或“Aβ11(pE)”是指Aβ的N-末端截短形式，其起自于Aβ氨基酸序列第11位的谷氨酸，所述谷氨酸残基被环化形成焦谷氨酸残基。特别地，本发明所用AβpGlu(11-x)是指参与淀粉状变性或者与其相关的那些片段，包括但不限于pGlu-Aβ11-38、pGlu-Aβ11-40、p-Glu-Aβ11-42。
Aβ的N末端截短形式Aβ11-38、Aβ11-40、Aβ11-42的序列如下示出：
Aβ11-42(SEQ ID NO.7):
Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala
Aβ11-40(SEQ ID NO.8):
Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val
Aβ11-38(SEQ ID NO.9):
Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly
特别地，本发明涉及如下项目：
1.抗体，特征在于其结合AβpGlu(11)肽或其变体，优选以高亲和性结合。
2.条目1的抗体，其中所述高亲和性是指解离常数(KD)值为10-7M或者更好。
3.条目1或2的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
4.前述任一条目的抗体，其中所述抗体的轻链的可变部分具有SEQ IDNO:51的核苷酸序列或者SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
5.前述任一条目的抗体，其中所述抗体的重链的可变部分具有SEQ IDNO:53的核苷酸序列或者SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
6.前述任一条目的抗体，其中所述抗体的轻链的可变部分具有SEQ IDNO:51的核苷酸序列或者SEQ ID NO:52的氨基酸序列，及其中所述抗体的重链的可变部分具有SEQ ID NO:53的核苷酸序列或者SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
7.前述任一条目的抗体，其中所述抗体是Aβ13-11-6(保藏号DSMACC3100)或者其功能变体。
8.条目7的抗体，其中所述抗体是Aβ13-11-6(保藏号DSM ACC3100)。
9.前述任一条目的抗体，其中所述抗体是保留高亲和性的人源化或嵌合抗体、或者抗体片段。
10.前述任一条目的抗体，用于检测AβpGlu(11)肽或其变体
11.条目10的抗体，其中所述变体选自：
pGlu-Aβ11-38
pGlu-Aβ11-40
pGlu-Aβ11-42，及
pGlu-Aβ11-x变体，
其中x是18-42之间的整数，更优选是30-42之间的整数。
12.前述任一条目的抗体，其是人抗体。
13.前述任一条目的抗体，其是保留高亲和性的双抗体(diabody)或者单链抗体。
14.前述任一条目的抗体，其结合由条目11定义的抗体所结合的表位。
15.前述任一条目的抗体，其具有条目11所定义抗体的互补决定区。
16.前述任一条目的抗体，其中所述抗体的轻链可变部分具有一或多个如一个、两个或三个互补决定区，所述互补决定区与具有SEQ ID NO:51的核苷酸序列或SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链可变部分的抗体的一个或多个如一个、两个或三个互补决定区相同。
17.前述任一条目的抗体，其中所述抗体的轻链可变部分具有一或多个如一个、两个或三个互补决定区，所述互补决定区与具有SEQ ID NO:53的核苷酸序列或SEQ ID NO:54的氨基酸序列的重链可变部分的抗体的一个或多个如一个、两个或三个互补决定区相同。
18.前述任一条目的抗体，其是经标记的。
19.前述任一条目的抗体，其被固定化在固相上。
20.可得自杂交瘤细胞系DSM ACC3100的抗体。
21.包含前述任何条目的抗体的组合物。
22.条目21的组合物，用于治疗、预防或者延缓淀粉状变性。
23.条目21或22的组合物，其中所述淀粉状变性是神经变性疾病，所述神经变性疾病选自唐氏综合征中的神经变性、轻度认知损伤和阿尔兹海默病。
24.条目21或22的组合物，其中所述淀粉状变性是散发性阿尔兹海默病或者家族性阿尔兹海默痴呆。
25.条目24的组合物，其中所述家族性阿尔兹海默痴呆是家族性英国型痴呆或者家族性丹麦型痴呆。
26.杂交瘤细胞系DSM ACC3100。
27.条目1-20任一项的抗体或者项目21-25任一项的组合物在诊断或治疗方法中的应用。
28.条目27的应用，其用于诊断淀粉状蛋白相关疾病或病症。
29.条目28的应用，其中所述淀粉状变性是神经变性疾病，所述神经变性疾病选自唐氏综合征中的神经变性、轻度认知损伤和阿尔兹海默病。
30.条目28的应用，其中所述淀粉状变性是散发性阿尔兹海默病或者家族性阿尔兹海默痴呆。
31.条目28的应用，其中所述家族性阿尔兹海默痴呆是家族性英国型痴呆或者家族性丹麦型痴呆。
32.诊断淀粉状蛋白相关疾病或病症、特别是阿尔兹海默病的体外诊断方法，包括如下步骤：
将条目1-20任一项的抗体与来自怀疑患有所述疾病或病症的对象的样品接触，及
检测所述抗体与来自样品的AβpGlu(11)蛋白的结合。
33.诊断试剂盒，包含条目1-20任一项的抗体及使用说明书、及任选存在的-(a)进一步的生物活性物质。
34.条目33的诊断试剂盒，其中所述进一步的生物物质是谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂。
35.选自SEQ ID NO:26至50的寡核苷酸。
本发明的抗体可用于诊断淀粉状变性。
本发明的抗体可用作亲和性纯化剂。在这种方法中，使用本领域熟知的方法，将所述抗体固定化在固相支持物如Sephadex树脂或滤纸上。将固定化的抗体与含有待纯化的AβpGlu(11)肽的样品接触，之后用合适的溶剂洗涤该支持物，基本上除去所述样品中除了AβpGlu(11)-肽之外的所有材料，所述AβpGlu(11)-肽与固定化的抗体结合。最后，将该支持物用另一种合适的溶剂如甘氨酸缓冲液pH5.0洗涤，这样将从所述抗体中释放AβpGlu(11)-肽。
抗-AβpGlu(11)-肽抗体也可用于AβpGlu(11)-肽的诊断性测定，例如在特定的细胞、组织或血清中检测其存在。因此，所述抗体可用于诊断淀粉状变性，特别是选自如下一组的神经变性疾病：轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)，如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或者家族性阿尔兹海默痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，以及唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔兹海默病。
对于诊断性应用，抗体典型用可检测成分进行标记。许多标记可以利用，其通常可被分为如下类别：
(a)放射性同位素，如35S，14C，125I，3H和131I。抗体可以使用如CurrentProtocols in Immunology,Volumes1and2,Gütigen et al.,Ed.,Wiley-Interscience.New York,New York.Pubs.,(1991)中所述技术用放射性同位素标记，放射性可以通过使用闪烁计数器测量。
(b)荧光标记如稀土金属螯合物(铕螯合物)或者荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、dansyl、Lissamine、藻红蛋白和Texas Red是可利用的。荧光标记可以使用如Current Protocols in Immunology,supra中所述技术与抗体缀合。荧光可以通过使用荧光计量化。
(c)各种酶-底物标记是可利用的。所述酶通常催化生色底物的化学改变，这种改变可以通过使用各种技术测量。例如所述酶可催化底物中颜色改变，这种改变可以使用分光光度计测量。或者，所述酶可改变底物的荧光或化学发光性。量化荧光改变的技术在上文描述。化学发光底物通过化学反应变成电子激发的，然后可发射可测量的光(使用如化学发光测量仪测量)，或者将能量提供给荧光受体。举例的酶标记包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No,4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、O-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶。酶与抗体缀合的技术在O'Sullivan etal.,Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use inEnzyme Immunoassay,in Methods in Enzym(ed Langone & H.Van Vunakis),Academic Press,New York,73:147-166(1981)中描述。
举例的酶-底物组合包括例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRPO)与作为底物的过氧化氢酶，其中过氧化氢酶氧化染料前体(如邻苯二胺(orthophenylene diamine，OPD)或者3,3',5,5'-四甲基盐酸联苯胺(TMB))；
(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为生色底物的对硝基苯磷酸；以及
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(如p-硝基苯-β-D-半乳糖苷酶)或者荧光底物4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷酶。
本领域技术人员可利用许多其它酶-底物组合。
有时，标记与抗体间接缀合。技术人员已知许多实现这种缀合的技术。例如，抗体可以与生物素缀合，上述三种广谱标记的任何标记均可以与抗生物素蛋白缀合，或者反之亦然。生物素选择性结合抗生物素蛋白，因此标记可以与抗体以这种间接方式缀合。或者，为了实现标记与抗体的间接缀合，使抗体与小的半抗原(如地高辛)缀合，并将上述不同类型的标记之一与抗-半抗原抗体(如抗-地高辛抗体)缀合。由此，可以实现标记与抗体的间接缀合。
AβpGlu(11)-抗体不需要被标记，其存在可以通过使用与AβpGlu(11)-抗体结合的标记的抗体检测。
本发明的抗体可用于任何已知测定方法中，如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定以及免疫沉淀测定。Zola,Monoclonal Antibodies A Manualof Techniques,pp.147-158(CRC Press.Inc.,1987)。
竞争性结合测定依赖于标记的标准物与检测样品分析物竞争结合有限量的抗体的能力。测试样品中的AβpGlu(11)肽的量与变为结合抗体的标准物的量成反比。为了便于确定变为结合抗体的标准物的量，抗体在竞争之前或之后通常被不溶解化，由此结合抗体的标准物和分析物与保持未结合的标准物和分析物可便利地分离。
夹心测定包括使用两种抗体，每种抗体均能结合待检测的蛋白质的不同的免疫原性部分或表位。在夹心测定中，检测样品分析物由固定在固体支持物上的第一种抗体结合，之后第二种抗体与该分析物结合，因此形成不溶的三部分复合物。第二种抗体自身可用可检测部分标记(直接夹心测定)，或者可以使用可检测部分标记的抗-免疫球蛋白抗体测量(间接夹心测定)。例如，一种优选的夹心测定类型是ELISA测定，其中所述可检测部分是酶。
对于免疫组织化学，组织样品可以是新鲜的或者是冷冻的，可以将其包埋在石蜡中并用防腐剂如福尔马林固定。
诊断试剂盒
为了方便起见，本发明的抗体可以在试剂盒中提供，即预定量试剂连同进行诊断测定的说明书的包装组合。在抗体是用酶标记的情况中，试剂盒将包括所述酶需要的底物和辅因子(如提供可检测的生色团或荧光团的底物前体)。此外，可包括其它添加剂如稳定剂，缓冲液(如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。不同试剂的相对量可以非常不同，以提供所述试剂溶液的浓度充分优化测定的敏感性。特别地，所述试剂可以作为干粉形式提供，通常是冻干的，包括赋形剂，当其溶解时提供具有适当浓度的试剂溶液。
本发明的诊断试剂盒可含有如下文所述的进一步的生物活性物质。特别优选用于所述诊断试剂盒中的是谷氨酰胺酰环化酶抑制剂。
本发明的诊断试剂盒可特别用于检测和诊断淀粉样物-相关的疾病和病症，特别是神经变性疾病，所述神经变性疾病选自轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或家族性阿尔兹海默病(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔兹海默病。
本发明特别涉及抗体，其特征在于以高亲和性结合AβpGlu(11)-肽。本发明还涉及抗体，其特征在于以高亲和性结合AβpGlu(11)-肽或其变体。所述高亲和性在本发明中是指亲和性KD值为10-7M或更好，优选KD值为10-8M或更好，甚至更优选KD值为10-9M至10-12M。从而，本发明的抗体以比先前已知的抗体更高的亲和性结合AβpGlu(11)-肽。
特别地，所述抗体优选是单克隆抗体，是Aβ13-11-6(DSM ACC3100)。
本发明的抗体可特别用于诊断方法中，以检测淀粉状变性，特别是神经变性疾病，所述神经变性疾病选自轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或家族性阿尔兹海默病(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔兹海默病。
根据本发明的一个优选实施方案，所述抗体可以是人源化抗体或者是嵌合抗体或者是人抗体。
此外，选自上述一组的抗体也可以是所述一组抗体的功能变体。
在本发明中，AβpGlu(11)肽的变体特别是：
pGlu-Aβ11-38，
pGlu-Aβ11-40，
pGlu-Aβ11-42。
AβpGlu(11)肽的进一步的变体是所有pGlu-Aβ11-x变体，其示出由于阿尔兹海默病的结果或者在阿尔兹海默病之前已经在脑中积累。X被定义为18-42之间的整数，如在pGlu-Aβ11-42中，“42”是“x”表示的整数。
在本发明中，本发明抗体的“功能变体”是保留与pGlu-Aβ11-x肽的结合能力、特别是高亲和性结合能力的抗体或其功能变体。这种功能变体的提供是本领域已知的，涵盖上述在抗体或其片段的定义下的可能性。
在一个优选的实施方案中，抗体是如上文定义的抗体片段。
在进一步优选的实施方案中，本发明的抗体是结合由上文定义的抗体结合的表位的抗体，特别是抗体13-11-6。
在进一步优选的实施方案中，本发明的抗体是具有上文定义的抗体的互补决定区(CDR)的抗体。优选地，所述抗体可以被标记；可能的标记是上文提及的那些标记以及特别是抗体的诊断性应用领域技术人员已知的所有那些标记。
优选地，抗体被固定在固相支持物上。
本发明还涉及可得自杂交瘤细胞系13-11-6(DSM ACC3100)的抗体。
本发明还涉及包含上述抗体的组合物。特别地，所述组合物是诊断性应用组合物，特别用于诊断神经变性疾病，所述神经变性疾病选自轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或家族性阿尔兹海默病(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔兹海默病；通过是通过检测生物样品中的AβpGlu(11)肽或其变体进行诊断。
在另一实施方案中，本发明的和如本文所述的抗体或其片段呈现出与AβpGlu(11)寡聚体、纤维、原纤维或丝状体的结合亲和性比与AβpGlu(11)单体的结合亲和性高至少2倍，特别是至少4倍，特别是至少10倍，特别是至少15倍，更特别是至少20倍，但尤其是至少25倍。
在再一个实施方案中，提供了如前文所述的抗体或其片段或者嵌合抗体或其片段，或者人源化抗体或其片段，所述抗体充分结合哺乳动物、特别是人脑中聚集的Aβ，包括Aβ斑块，但是优选未示出与淀粉样前体蛋白(APP)的任何显著的交叉反应性。
在本发明的另一方面中，提供了如前文所述的抗体或其片段或者嵌合抗体或其片段，或者人源化抗体或其片段，所述抗体充分结合哺乳动物、特别是人脑中可溶的聚合的淀粉样物、特别是淀粉样蛋白β(Aβ)，包括Aβ单体，但是优选未示出与淀粉样前体蛋白(APP)的任何显著的交叉反应性。
本发明还涉及如上文定义的人源化形式的抗体，包含所述人源化抗体的组合物，以及所述组合物在治疗淀粉状变性、尤其是治疗哺乳动物特别是人的神经变性疾病中的应用。所述神经变性疾病特别选自轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或家族性阿尔兹海默病(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性。优选所述神经变性疾病是阿尔兹海默病。
本发明还涉及杂交瘤细胞系13-11-6。
本发明还涉及如上文定义的抗体或者包含所述抗体的组合物在体外诊断方法中的应用。特别地，这种诊断方法涉及诊断神经变性疾病，所述神经变性疾病选自轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或家族性阿尔兹海默病(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔兹海默病；尤其是通过检测生物样品中的AβpGlu(11)肽或其变体而进行诊断。
优选地，所述样品是血清样品。
根据另一优选的实施方案，所述样品是液剂(liquor)或脑脊液(CSF)样品。
在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及如下方法：
体外或原位诊断方法，用于诊断淀粉样物相关的疾病或病症，优选阿尔兹海默病，所述方法包括如下步骤：
将本发明的抗体与来自怀疑患有所述病症或疾病的对象的样品接触，优选选自血清、液剂或CSF样品，最优选血清样品；或者与所述对象的特异身体部分或身体区域接触，及
检测所述抗体与来自样品的AβpGlu(11)肽的结合。
更特别地，本发明涉及诊断淀粉样物相关疾病或病症、优选阿尔兹海默病的方法，包括检测与样品中或原位的AβpGlu(11)肽的抗体或其活性片段的免疫特异性结合，所述方法包括如下步骤：
(a)将怀疑含有淀粉样蛋白的样品或特异身体部分或身体区域与本发明的抗体和/或其功能部分接触，所述抗体是如前文所述抗体、特别是本发明的单克隆抗体或者嵌合抗体或其片段或者人源化抗体或其片段，所述抗体结合AβpGlu(11)肽；
(b)使得所述抗体和/或其功能部分结合AβpGlu(11)肽以形成免疫复合物；
(c)检测所述免疫复合物的形成；以及
(d)将所述免疫复合物的存在与否与样品或特异身体部分或区域中AβpGlu(11)肽的存在与否相关联。
本发明还包括一种确定组织和/或体液中成淀粉样斑块负荷(burden)程度的方法，所述方法包括：
(a)获得待研究的组织和/或体液的代表性样品；
(b)使用本发明的及如前文所述的抗体、特别是单克隆抗体或者嵌合抗体或其片段或者人源化抗体或其片段和/或其功能部分检测所述样品中淀粉样蛋白质的存在情况；
(c)确定与所述蛋白质结合的抗体的量；及
(d)计算组织和/或体液中斑块负荷(burden)。
本发明特别涉及一种确定组织和/或体液中成淀粉样斑块负荷(burden)的程度的方法，其中确定在步骤c)中免疫复合物的形成，由此所述免疫复合物的存在与否与淀粉样蛋白、特别是AβpGlu(11)肽的存在与否相关联。
在再一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含治疗有效量的本发明的抗体，或者本发明的及如前文所述的嵌合抗体或其片段，或者人源化抗体或其片段，包括任何功能等价抗体或者任何衍生或功能部分，本发明特别涉及任选进一步包含药物可接受的载体的药物组合物。
在本发明另一实施方案中，所述组合物包含治疗有效量的抗体。
本发明进一步包含一种混合物，其包含治疗有效量的本发明的及如前文描述的抗体，特别是单克隆抗体或者嵌合抗体或其片段或者人源化抗体或其片段，包括其任何功能等价抗体或任何衍生或功能部分，以及任选进一步的生物活性物质和/或药物可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。
特别地，本发明涉及一种混合物，其中进一步的生物活性物质是用于治疗淀粉状变性的化合物，所述淀粉状变性是与淀粉样物或淀粉样蛋白质如AβpGlu(11)蛋白的参与相关的一组神经变性疾病和失调，如轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)，如散发性阿尔兹海默病(SAD)或者家族性阿尔兹海默痴呆(FAD)，如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔兹海默病。
在本发明另一实施方案中，所述其它生物活性物质或化合物也可以是可用于治疗由AβpGlu(11)导致的淀粉状变性或者可用于治疗其它神经失调的治疗剂。
所述其它生物活性物质或化合物可通过与本发明的抗体相同或相似机制或者通过不相关的作用机制或者通过多种相关和/或不相关的作用机制发挥其生物学作用。
通常地，所述其它生物活性化合物可包括中子传输增强剂，精神神经疾病治疗药物，乙酰胆碱酯酶抑制剂，钙通道阻断剂，生物胺，苯并二氮镇定剂，乙酰胆碱合成、贮存或释放增强剂，乙酰胆碱突触后受体激动剂，单胺氧化酶-A或-B抑制剂，N-甲基-D-天冬氨酸谷氨酸受体拮抗剂，非类固醇抗炎药物，抗氧化剂，及5-羟色胺受体拮抗剂。
更特别地，本发明涉及包含至少一种化合物及本发明的抗体以及任选药物可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂的混合物，所述化合物选自有效抗氧化的化合物，抗凋亡化合物，金属螯合剂，DNA修复抑制剂如哌仑西平(pirenzepin)及代谢物，3-氨基-1-丙磺酸(3-APS)，1,3-丙二磺酸(1,3PDS)，α-分泌酶激活物，β-和γ-分泌酶抑制剂，tau蛋白，神经递质，β-折叠破坏剂(breakers)，淀粉样β清除/耗竭细胞成分引诱剂，N-末端截短的淀粉样-β抑制剂包括焦谷氨酸化的淀粉样β3-42，如谷氨酰胺酰环化酶抑制剂，抗炎分子，或者胆碱酯酶抑制剂(ChEIs)如他克林(tacrine),利斯的明(rivastigmine)，多奈哌齐(donepezil)和/或加兰他敏(galantamine)，Ml激动剂以及其它药物包括任何淀粉样或tau修饰药物及营养补充剂，以及营养补充剂。
本发明进一步涉及一种混合物，其中所述化合物是胆碱酯酶抑制剂(ChEIs)，特别是这样的混合物，其中所述化合物选自，利斯的明(rivastigmine)，多奈哌齐(donepezil)，加兰他敏(galantamine)，烟酸和美金刚胺(memantine)。
在进一步的实施方案中，本发明的混合物可包含烟酸或美金刚胺(memantine)以及本发明的抗体，及任选包含药物可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。
在进一步的实施方案中，本发明的混合物可包含一种谷氨酰胺酰环化酶抑制剂以及本发明的抗体，任选包含药物可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。
优选的谷氨酰胺酰环化酶抑制剂在WO2005/075436中描述，特别是在pp.31-40所示的实施例1-141中描述。实施例1-141的合成在WO2005/075436的pp.40-48示出。WO2005/075436关于实施例1-141、其合成及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在WO2008/055945中描述，特别是在pp.45-155示出的实施例1-473中描述。实施例1-473的合成在WO2008/055945的pp.156-192描述。WO2008/055945关于实施例1-473、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在WO2008/055947中描述，特别是在pp.53-118示出的实施例1-345中描述。实施例1-345的合成在WO2008/055947的pp.119-133描述。WO2008/055947关于实施例1-345、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在WO2008/055950中描述，特别是在pp.57-120示出的实施例1-212中描述。实施例1-212的合成在WO2008/055950的pp.121-128描述。WO2008/055950关于实施例1-212、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在WO2008/065141中描述，特别是在pp.56-59示出的实施例1-25中描述。实施例1-25的合成在WO2008/065141的pp.60-67描述。WO2008/065141关于实施例1-25、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在WO2008/110523中描述，特别是在pp.55-59示出的实施例1-27中描述。实施例1-27的合成在WO2008/110523的pp.59-71描述。WO2008/110523关于实施例1-27、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在WO2008/128981中描述，特别是在pp.62-65示出的实施例1-18中描述。实施例1-18的合成在WO2008/128981的pp.65-74描述。WO2008/128981关于实施例1-18、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在WO2008/128982中描述，特别是在pp.61-67示出的实施例1-44中描述。实施例1-44的合成在WO2008/128982的pp.68-83描述。WO2008/128982关于实施例1-44、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在WO2008/128983中描述，特别是在pp.64-68示出的实施例1-30中描述。实施例1-30的合成在WO2008/128983的pp.68-80描述。WO2008/128983关于实施例1-30、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在WO2008/128984中描述，特别是在pp.63-69示出的实施例1-36中描述。实施例1-36的合成在WO2008/128984的pp.69-81描述。WO2008/128984关于实施例1-36、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在WO2008/128985中描述，特别是在pp.66-76示出的实施例1-71中描述。实施例1-71的合成在WO2008/128985的pp.76-98描述。WO2008/128985关于实施例1-71、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
进一步优选的谷氨酰胺酰环化酶的抑制剂在WO2008/128986中描述，特别是在pp.65-66示出的实施例1-7中描述。实施例1-7的合成在WO2008/128986的pp.66-73描述。WO2008/128986关于实施例1-7、其合成以及用作谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的描述在此并入本文作参考。
在本发明的另一实施方案中，提供了包含“非典型抗精神病药”如氯氮平(clozapine)、齐拉西酮(ziprasidone)、利培酮(risperidone)、阿立哌唑(aripiprazole)或奥氮平(olanzapine)与本发明的及如前文所述的抗体、特别是单克隆抗体、嵌合抗体或其片段、人源化抗体或其片段的混合物，任选包含药物可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂，以治疗阳性和阴性精神病症状，包括幻觉，妄想，思维障碍(表现为明显的语无伦次，derailment，词不达意(tangentiality))，及离奇或混乱的行为，以及快感缺乏。
在本发明的一特定实施方案中，本发明的及如前文所述的组合物和混合物包含治疗有效量的抗体和生物活性物质。
可适用于与本发明的抗体组合成的混合物中的其它化合物在WO2008/065141(特别见第37/38页)中描述，包括PEP-抑制剂(pp.43/44)，LiCl，二肽氨基肽酶的抑制剂，优选DP IV或DP IV-样酶的抑制剂(见pp.48/49)；乙酰胆碱酯酶(ACE)抑制剂(见p.47)，PIMT增强剂，β-分泌酶抑制剂(见p.41)，γ-分泌酶抑制剂(见pp.41/42)，中性肽链内切酶抑制剂，磷酸二酯酶抑制剂-4(PDE-4)(见pp.42/43)，TNFα抑制剂，毒蕈碱M1受体拮抗剂(见p.46)，NMDA受体拮抗剂(见pp.47/48)，σ-1受体抑制剂，组胺H3拮抗剂(见p.43)，免疫调节剂，免疫抑制剂或者选自如下的制剂：Antegren(那他珠单抗(natalizumab))，Neurelan(氨吡啶-SR)，Campath(阿伦珠单抗(alemtuzumab))，IR208，NBI5788/MSP771(替力莫肽(tiplimotide))，紫杉醇，Anergix.MS(AG284)，SH636，Differin(CD271，阿达帕林(Adapalene))，BAY361677(白细胞介素-4)，基质-金属蛋白酶抑制剂(如BB76163)，干扰素-tau(滋养层素)和SAIK-MS；β-淀粉样抗体(见p.44)，半胱氨酸蛋白酶抑制剂(见p.44)；MCP-1拮抗剂(见pp.44/45)，淀粉样蛋白沉积抑制剂(见p.42)和β淀粉样蛋白合成抑制剂(见p.42)，所述文献并入本文作参考。
在另一实施方案中，本发明涉及一种混合物，其包含治疗有效量的本发明的及如前文所述的抗体、特别是单克隆抗体或者嵌合抗体或其片段或者人源化抗体或其片段和/或生物活性物质。
本发明进一步涉及本发明的及如前文所述的抗体、特别是单克隆抗体、嵌合抗体或其片段或者人源化抗体或其片段和/或其功能部分和/或包含所述抗体和/或其功能部分的药物组合物或混合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗或减轻淀粉状变性的影响，所述淀粉状变性是与淀粉样斑块形成相关的一组疾病和失调，包括继发淀粉状变性和年龄相关的淀粉状变性，包括但不限于神经失调疾病如轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或者家族性阿尔兹海默病(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；路易体痴呆，遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆综合征；以及基于或与淀粉样蛋白相关的其它疾病如进行性核上性麻痹，多发性硬化症；Creutzfeld Jacob病，帕金森症，HIV相关痴呆，ALS(肌萎缩性侧索硬化症)，成人型糖尿病；老年性心脏淀粉状变性；内分泌肿瘤等，包括黄斑变性。
本发明还包含一种制备本发明的及如前文所述的抗体、特别是单克隆抗体、嵌合抗体或其片段或者人源化抗体或其片段和/或其功能部分和/或包含所述抗体和/或其功能部分的药物组合物或混合物的方法，特别以治疗有效量配制，用于预防、治疗或减轻淀粉状变性的影响，所述淀粉状变性是与淀粉样斑块形成相关的一组疾病和失调，包括继发淀粉状变性和年龄相关的淀粉状变性，包括但不限于神经失调疾病如轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或者家族性阿尔兹海默病(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；路易体痴呆，遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆综合征；以及基于或与淀粉样蛋白相关的其它疾病如进行性核上性麻痹，多发性硬化症；Creutzfeld Jacob病，帕金森症，HIV相关痴呆，ALS(肌萎缩性侧索硬化症)，成人型糖尿病；老年性心脏淀粉状变性；内分泌肿瘤等，包括黄斑变性，所述方法包括配制药物可接受形式的本发明的抗体、特别是单克隆抗体、嵌合抗体或其片段或者人源化抗体或其片段。
本发明进一步包括一种预防、治疗或减轻淀粉状变性的影响的方法，所述淀粉状变性是与淀粉样斑块形成相关的一组疾病和失调，包括继发淀粉状变性和年龄相关的淀粉状变性，包括但不限于神经失调疾病如轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或者家族性阿尔兹海默病(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；路易体痴呆，遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆综合征；以及基于或与淀粉样蛋白相关的其它疾病如进行性核上性麻痹，多发性硬化症；Creutzfeld Jacob病，帕金森症，HIV相关痴呆，ALS(肌萎缩性侧索硬化症)，成人型糖尿病；老年性心脏淀粉状变性；内分泌肿瘤等，包括黄斑变性，所述方法通过将本发明的抗体和/或其功能部分，特别是给予人源化抗体和/或其功能部分给予受这种失调病症困扰的动物或人，或者给予这种抗体和/或其功能部分的组合物或混合物而进行，包括给予治疗有效量的抗体。
本发明另一目的是提供一种通过将本发明的及如前文所述的抗体、特别是药物组合物给予所述动物、特别是哺乳动物或人而治疗淀粉状变性的方法，所述淀粉状变性是与淀粉样斑块形成相关的一组疾病和失调，包括继发淀粉状变性和年龄相关的淀粉状变性，包括但不限于神经失调疾病如轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或者家族性阿尔兹海默病(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；特别是特征在于丧失认知记忆能力的疾病或病症。
在本发明的一特定实施方案中，提供了一种通过给予所述动物、特别是哺乳动物或人本发明的及如前文所述的抗体、特别是药物组合物，在患有记忆损伤的动物、特别是哺乳动物或人中保留或增加认知记忆能力、但特别是恢复认知记忆能力的方法。
本发明的再一目的是提供使用本发明的及如前文所述抗体治疗组合物和产生这种治疗组合物的方法，以及治疗淀粉状变性的方法，所述淀粉状变性是与淀粉样斑块形成相关的一组疾病或失调，包括继发淀粉状变性和年龄相关的淀粉状变性，包括但不限于神经失调疾病如轻度认知损伤(MCI)，阿尔兹海默病(AD)如散发性阿尔兹海默病(SAD)，或者家族性阿尔兹海默病(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；特别是特征在于丧失认知记忆能力的疾病或病症。
特别地，本发明涉及患有淀粉样物相关病症的动物、特别是哺乳动物或人的治疗，所述病症特征在于丧失认知记忆能力，通过治疗使得认知记忆能力得以保留。
实施例
1.材料和方法
1.1细胞培养技术
杂交瘤细胞和抗体筛选
产生抗Aβ种类的单克隆抗体(mAb)的鼠杂交瘤细胞由Biogenes GmbH(Berlin)提供。将雌性BALB/c小鼠用化学合成的Aβ(pE11-14)抗原免疫，所述抗原在C-末端半胱氨酸残基与钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)蛋白连接。KLH是潜在免疫原性的，用作疫苗载体蛋白。
使用经免疫的小鼠的脾细胞和鼠骨髓瘤细胞系SP2/0-Ag14进行细胞融合。在细胞融合后，使用次黄嘌呤氨蝶呤胸苷培养基(HAT)选择杂交瘤细胞。由此，HAT培养基使得可以选择杂交瘤细胞，其从B细胞中遗传获得次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)基因，并且从骨髓瘤细胞中获得致肿瘤性质。之后，筛选杂交瘤上清中抗Aβ(pE11-14)的特异性mAb的存在。检测mAb的结合不同的修饰的Aβ-肽的能力。因此，将Aβ-肽点印在羟基-纤维素膜上，与来自细胞培养上清的mAb一起温育，通过标记的抗体进行检测。选择产生抗N-末端修饰的Aβ11(pE)肽的特异性mAb并且示出与其它修饰的Aβ-肽无显著交叉反应性的杂交瘤细胞进行再克隆(见表1)。通过限制稀释技术，克隆杂交瘤细胞，获得一个单独的克隆。
如下杂交瘤克隆在再克隆后是稳定的，由BioGenes提供：
pEVHH-5902513-11-6(克隆13)
本发明研究目的是成功培养杂交瘤细胞以在细胞培养上清中产生mAb。克隆的细胞培养上清中mAb的浓度应通过表面等离子体共振(SPR)确定。另外的目的是培养的优化，由此应将杂交瘤细胞从含有无血清培养基的血清中进行适应，以简化mAb的纯化。此外，所述mAb应该被纯化，经生物物理学鉴定并且用于测定或用于免疫染色中。
表1：Aβ11(pE)和修饰的Aβ-肽的氨基酸序列
灰色标记的肽AβpE(11-23)含有在N-末端具有焦谷氨酸的靶序列
Figure BDA0000382775580000331
1.1.2杂交瘤细胞的培养
将杂交瘤细胞在细胞培养瓶中在37℃及在5%CO2的增湿气氛中培养。D-MEM培养基培养(具有L-谷氨酰胺，丙酮酸钠，4.5g/l葡萄糖，Invitrogen)补加15%FBS和1%MEM-NEA(非必需氨基酸，Invitrogen)。在即将使用该培养基之前，使用50mMβ-巯基乙醇原种溶液和200mM L-谷氨酰胺的新鲜解冻的原种溶液，终浓度为至少50μMβ-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺。根据细胞密度每周常规进行两次细胞的传代培养。细胞密度应在1×106至2×106个活细胞/ml之间。对于杂交瘤细胞的传代，将部分贴壁细胞通过轻轻上下移吸细胞悬浮液而从瓶底分离，移至falcon管中，在300×g离心5分钟。之后，吸取含有mAb的细胞培养上清，收集在储存容器中在4℃贮存。对于SPR测量，从细胞培养上清中取样品(100μl)。在用新鲜培养基重悬浮细胞沉淀之后，使用
Figure BDA0000382775580000332
细胞计数仪(
Figure BDA0000382775580000333
SystemGmbH,Reutlingen)确定细胞密度。因此，将细胞悬浮液在
Figure BDA0000382775580000334
ton(生理盐水溶液)中10倍稀释，然后将100μl细胞稀释液移至9900μl 
Figure BDA0000382775580000335
ton中。该装置通过电流排阻确定样品每毫升中活细胞和死亡细胞的量以及总细胞量。具有完整细胞膜的活细胞排斥电流，而具有缺陷的细胞膜的死亡细胞是导电的。然后将细胞根据细胞生长情况接种在T型瓶(根据需要为25cm2–175cm2)中，密度为1×105至5×105个活细胞/ml。
1.1.3杂交瘤细胞的低温贮藏
将处于对数生长期及存活率超过85%的杂交瘤细胞低温贮藏。细胞的冷冻应在低传代数尽可能早地进行。将杂交瘤细胞在300×g离心5分钟，以7×106个活细胞/ml浓度重悬浮于45%培养基(D-MEM，1%MEM-NEA，15%FBS)，45%热失活的胎牛血清(FBS)和10%二甲亚砜(DMSO)中。将该细胞悬浮液以1ml等份迅速移至冷冻保存管中。将冷冻保存管置于充填了QUALIFREEZE的异丙醇的冷冻容器内部，以保证1℃/分钟的缓慢冷却速度。将冷冻容器在-80℃贮存最多48小时。之后，将冷冻保存管移至-196℃液氮中。
1.1.4杂交瘤细胞的解冻
将贮存在液氮中的杂交瘤细胞在37℃水浴中快速解冻直至里面只剩下一小块冰。使用的冷冻介质含有DMSO，其在高于4℃具有细胞毒性作用。因此，细胞培养基应冷却至4℃。将细胞悬浮液移至falcon管中，用5ml的4℃培养基逐滴稀释。将细胞立即在300×g离心5分钟，吸掉具有细胞毒性的抗冷冻剂DMSO的上清。将细胞沉淀重悬浮于在37℃加热的细胞培养基中，以5-7×105个活细胞/ml密度接种在25cm2T-形瓶中。
1.1.5污染物筛选
每两个月检测杂交瘤细胞的支原体污染情况。因此，使用来自Lonza的
Figure BDA0000382775580000341
Mycoplasma检测试剂盒检测细胞培养上清。该检测是利用一些支原体酶的活性进行的选择性生物化学检测。存活的支原体被裂解，所述酶与MycoAlertTM底物反应催化ADP转变为ATP。ATP水平的增加可以使用生物发光反应检测，因为发射的光强度与ATP浓度相关联。
因此，将细胞培养上清样品在200×g离心5分钟，然后将100μl杂交瘤上清与100μl MycoAlertTM试剂在96孔平板中混合，在室温温育5分钟。使用光度计GeniosPro(Tecan)测量发光情况，然后加入100μl MycoAlertTM底物，在室温温育10分钟，再次测量发光情况。当第二次发光测量与第一次测量比率低于1时，所述细胞未污染。
1.1.6在摇瓶中培养杂交瘤细胞
将杂交瘤细胞静止悬浮培养生长(如T形瓶)及搅动悬浮培养生长(如摇瓶)。对于抗体产生，将杂交瘤细胞在摇瓶中培养及平行地在T-形瓶中静止培养培养大约7天。将细胞以3×105至5×105个细胞/ml密度接种在摇瓶中。细胞培养基(D-MEM，1%MEM-NEA，15%FBS或超低IgG FBS)中补加0.5%庆大霉素，50μMβ-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺。为了便于最佳气体交换，用培养基仅充填摇瓶总体积的大约30%。将摇瓶中的悬浮培养物在37℃、5%CO2以80rpm旋转温育。在温育7天后，将细胞悬浮液用移液管移至falcon管中，在500×g离心10分钟。之后，将含有抗体的细胞培养上清收集在储存容器中，在4℃贮存。取细胞培养上清样品进行SPR测量。弃去细胞沉淀。
1.1.7使杂交瘤细胞适应无血清培养基
应用无血清培养基与补加血清的培养基相比使产生的mAb的纯化得以简化。无血清培养基是无BSA和牛免疫球蛋白(如IgG)的培养基，便于纯化mAb。通过逐步降低血清浓度使所述细胞必须从含有血清的培养基(D-MEM，15%FBS，1%MEM-NEA)条件适应为无血清条件，以保证高细胞存活率和抗体产生速率。因此，细胞在适应前应处于温和对数生长期，存活率超过90%。随后检测不同的无血清培养基和无蛋白质培养基(见表2)。
表2：进行杂交瘤培养的检测的无血清培养基和无蛋白质培养基
Figure BDA0000382775580000351
所有检测的培养基均补加0.5%庆大霉素。在即将使用培养基之前，加入50μMβ-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺。平行于无血清培养基适应，也检测具有含有少于5μg/ml IgG的15%超低IgG-FBS(Invitrogen)的培养基(D-MEM，1%MEM-NEA)。由于FBS的存在，使细胞直接适应培养基。因此，将细胞以4×105个活细胞/ml接种密度在具有15%超低IgG-FBS的培养基中传代培养。根据细胞密度每周两次常规进行进一步的细胞传代培养。
将杂交瘤细胞在175cm2T-形瓶中在37℃及在5%CO2增湿气氛条件下培养。
1.1.8生长曲线的制备
产生7天生长曲线以对在无血清培养基及含血清培养基中的杂交瘤细胞生长进行长期分析。将杂交瘤细胞在摇瓶中培养。因此，将125ml-摇瓶接种30ml工作体积的细胞悬浮液，在37℃、5%CO2条件下以80rpm摇动培养。定期从摇瓶中获得300μl样品，以确定细胞培养上清中的细胞数和抗体浓度。为了使培养基优化，检测来自PAA和GIBCO公司的具有15%FBS或15%超低IgG-FBS(Invitrogen)的含血清培养基和无血清培养基以及无蛋白质培养基。
1.2抗体纯化
1.2.1亲和性层析
杂交瘤细胞培养上清中富集的mAb使用亲和性-层析法纯化。因此，使用具有与6%交联葡聚糖支持物(GE Healthcare,Uppsala)偶联的重组蛋白G的HiTrap Protein G HP(5ml)柱。蛋白G，是一种G群链球菌的细胞表面蛋白，是III型Fc受体，通过非免疫机制结合哺乳动物IgG的Fc区。Fc受体也具有白蛋白结合区。但是白蛋白结合位点在重组形式的蛋白G中遗传缺失，从而避免了不希望的与白蛋白的交叉反应性，因此可能从含有FBS的细胞培养上清中纯化抗体。然而，蛋白G除了结合小鼠-IgG之外还结合牛-IgG。由于这个原因，为了培养杂交瘤细胞，使用含有低于5μg/ml IgG的超低IgG-FBS(Invitrogen)，也检测无血清和无蛋白质培养基的杂交瘤培养情况。
亲和性层析在
Figure BDA0000382775580000361
Purifier(GE Healthcare)进行。首先，将层析柱用脱气的双蒸馏水漂洗以除去防腐的乙醇。将整个柱在4℃冷却。然后将蛋白G柱用1×结合缓冲液(20mM Na2HPO4，pH7.0)平衡，以保证最佳pH7及合适的离子浓度以进行抗体结合。将细胞培养上清在4℃以38400×g(AvantiJ-30I，BECKMAN COULTER)离心30分钟，以除去剩余的细胞片段。对于层析，将细胞上清与2×结合缓冲液(40mM Na2HPO4，pH7.0)以1:1比率混合。用Purifiers P-950的样品施加泵，以1.5ml/分钟的流速，在柱中施加探针过夜，其中经冰上冷却上清。因此，最大允许总压力应不超过0.3Mpa，因为过量的压力可破坏支持物的凝胶床。在此之后，用结合缓冲液将过量的和非特异性成分从柱中洗去，随后是5个柱体积的0-2M NaCl梯度。之后，将该柱用1×结合缓冲液再次洗涤。检测从柱中洗脱抗体的两种不同方法。蛋白质以2.5ml/分钟反向流速洗脱，收集在280nm光吸收增加的级分。第一种洗脱方法是使用酸性0.1M甘氨酸-HCl溶液(pH2.7)通过缓冲液转换进行。由于pH改变，结合的免疫球蛋白从蛋白G中释放，然后其被收集。在洗脱后，通过用1M Tris-HCl，pH9.0滴定使洗脱级分中的pH立即中性化。将该柱用1×结合缓冲液漂洗，以使该柱pH平衡为pH7.0。第二种方法是使用5个柱体积的0-2M硫氰酸钾(KSCN)梯度进行，从而pH保持恒定在7.0。抗体与蛋白G之间的相互作用通过KSCN松解。在洗脱后，将该柱用1×结合缓存液漂洗。
之后，将抗体溶液立即透析以置换缓冲液。
1.2.2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳根据其分子量在电场中分离蛋白质。使用洗涤剂SDS(十二烷基硫酸钠)，多肽的内在电荷通过SDS在所述多肽的积累而被覆盖(大约1个分子/1.6个氨基酸)。从而电泳迁移率主要依赖于蛋白质的分子量。对于蛋白质的还原，将探针用SDS样品缓冲液(
Figure BDA0000382775580000372
1,BioRad)以1:3(v/v)比例稀释，在95℃温育10分钟。SDS样品缓冲液含有还原蛋白质二硫键的β-巯基乙醇，导致抗体的重链和轻链分离。不应被还原的样品用不含有β-巯基乙醇的样品缓冲液(250mM Tris-HCl pH8.0，5%(w/v)SDS，50%(v/v)甘油，0.005%(w/v)溴酚蓝)稀释。缓冲液与样品稀释比率为1:4(v/v)。在将样品应用于聚丙烯酰胺凝胶之前，将探针在30℃轻轻摇动30分钟。在本项工作中，亲和性层析的级分(见1.2.1章节)在SDS-PAGE中检测，以检测被分析的抗体的存在与纯度。蛋白质的分离在12%聚丙烯酰胺凝胶中进行(成分见表3)。电泳是在竖切室(vertical cuttingchamber)中进行，其中充填1×运行缓冲液(30.3g/l Tris，10g/l SDS，144g/l甘氨酸)，以100V开始10分钟，然后增加至恒定电压200V。除了探针之外，预染色的蛋白梯(10-250kDa，Fermentas)用作分子量参考。
将蛋白质用考马斯亮蓝-G250染色30分钟。之后，将凝胶用10%乙酸脱色几小时。
表3：SDS-PAGE的堆积和分离凝胶成分
1.2.3蛋白质的透析和浓缩(upconcentration)
通过使用透析膜的半透性性质而使用透析以将抗体溶液转化在贮存缓冲液(D-PBS，具有2mM EDTA(pH7.13))中。在用亲和性层析纯化抗体之后，对含有抗体的洗脱级分进行透析。首先，将透析管在蒸馏水中浸泡以使透析管达到半透性、柔韧性，及除去防腐剂。将截断阈值为6-8kDa的透析管用抗体溶液充填，悬浮于贮存缓冲液中。之后，将抗体溶液在4℃在恒定搅动下针对100倍体积的样品透析过夜。之后，使用UV/VIS光谱学确定浓度。将抗体溶液浓缩为至少2mg/ml，使用来自VIVASCIENCE公司的VIVASPIN20ml CONCENTRATOR-管进行，截断阈值为5kDa。将抗体溶液在来自Sigma的Swing-Out-Rotor中在4℃以3500×g离心。最后，抗体针对D-PBS用2mM EDTA(pH7.13)透析。
1.2.3.1抗体的生物素化
mAb小鼠抗Aβ11(pE)(克隆13)的生物素化是在Aβ11(pE)ELISA中用作抗体所必需的，以检测生物样品中的特异性Aβ(pE11-x)肽。为了进行检测，在生物素化的抗体中加入链霉抗生物素-过氧化物酶聚合物，从而在链霉抗生物素与生物素之间形成强非共价相互作用。
使用浓缩的抗体(见章节1.2.3)进行生物素化。首先，将纯化及浓缩的mAb针对生物素化缓冲液(100mM NaH2PO4，150mM NaCl，pH7.2)在4℃透析过夜。之后，通过UV-光谱确定蛋白质浓度(见章节1.3.1)。将生物素化剂(NHS-PEO4-生物素)溶解于蒸馏水中，制备20mM溶液。以抗体:生物素为1:6的摩尔比率进行反应，在4℃温育4小时。抗体与激活的生物素之间的反应通过加入超过反应混合物量50倍的过量的1M Tris缓冲液pH9.0终止，然后在4℃温育1小时。将所述抗体-生物素溶液用透析缓冲液(D-PBS，2mM EDTA)在两天的时间在4℃透析两次，蛋白质浓度通过UV-光谱确定(见章节1.3.1)。为了估算掺入的生物素水平，将100μl HABA-抗生物素蛋白加入800μl透析缓冲液中，在测量瓶中温育10分钟，然后用UV-Spectrometer UV1测量A500。之后，将100μl抗体-生物素溶液加入测量瓶中的溶液中，混合，当数值保持恒定至少15秒时再次测量光吸收A500。生物素与抗生物素蛋白形成复合物，导致在500nm光吸收降低。然后计算生物素掺入水平(mole生物素/mole蛋白质)。
1.3抗体的生物物理学鉴定方法
1.3.1UV/VIS-光谱学
在抗Aβ11(pE)抗体纯化之后，确定UV/VIS光谱。对于确定蛋白质浓度，使用来自Thermo Scientific的UV-Spectrometer UV1测量在280nm的光吸收及在240nm与339nm之间的UV-光谱。蛋白质浓度通过A280光吸收和消光系数确定。假定抗Aβ11(pE)抗体的消光系数ε=1.5。
1.3.2通过CD-光谱学确定蛋白质热力学稳定性
将纯化的抗Aβ11(pE)抗体用10mM NaH2PO4(pH7.14)透析。通过UV/VIS光谱学确定浓度(见章节1.3.1)。对于CD-光谱学，将抗体稀释为0.13mg/ml浓度，充填在石英玻璃瓶中(直径=0.1cm)。使用Jasco J-710spectro-polarimeter(Jasco GmbH,Groβ-Umstadt)测量在190至260nm之间的CD-光谱。使用20次扫描测量在20℃的光谱。然后，将温度从20℃提升至80℃，由此间隔5℃经10次扫描测量椭圆率(ellipticity)。加热速率为30K/h，在每次测量前将温度平衡180秒。
1.3.3表面等离子体共振(SPR)
1.3.3.1配体固定在CM5芯片上
将在-80℃贮存于六氟异丙醇(HFIP)中的合成Aβ(pE11-30)肽在室温解冻。将含有所述肽的试管开放置于通风处过夜以使溶剂HFIP蒸发。用10mM乙酸钠pH5将所述肽稀释为1mg/ml浓度。
使用的CM5芯片具有羧化葡聚糖基质。为了使Aβ(pE11-30)肽偶联，使用胺偶联方法。这种方法需要在肽偶联之前激活传感器芯片表面。因此，将激活剂0.4M1-乙基-3-(3-二甲基氨基–丙基)–碳二亚胺(EDC)与0.1M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以1:1比率混合，在CM5芯片以10μl/分钟注射8分钟。然后，进行肽偶联。首先，以10μl/分钟流速注射5分钟于10mM二氢正磷酸钾pH6中的10μg/ml肽Aβ(pE11-30)。由于产生信号较低，再次施加在pH5溶液中稀释的较高浓度肽。以10μl/分钟流速注射20分钟于10mM乙酸钠pH5中的50μg/ml肽Aβ(pE11-30)。选择略酸性pH偶联以通过静电吸引在传感器表面(羧基基团负净电荷)提供肽的预浓缩(正净电荷)。通过两个氨基酸残基赖氨酸(在肽位置16和28)与在芯片表面的激活的羧基基团的反应形成肽的共价键。过量的反应性酯基团用1M乙醇胺pH8.5失活，流速为10μl/分钟，运行10分钟。未固定化的肽通过注射0.1M HCl(3×10μl)除去，随后将芯片用运行缓冲液漂洗过夜。在结束时，信号为大约1000反应单位(RU)，由此芯片表面用肽饱和。因此，将此包被的芯片用于确定细胞培养上清中抗Aβ11(pE)抗体含量。
1.3.3.2抗Aβ11(pE)抗体的量化
为了测量抗Aβ11(pE)抗体浓度，使用Aβ(pE11-30)包被的CM5芯片。所述芯片表面用所述肽饱和，信号为大约1000反应单位(RU)(见章节1.3.3.1)。将细胞培养上清中含有的mAb在运行缓冲液(HEPES EDTA缓冲液(HBS-EP)，Biacore)中适当稀释以进行抗体分析。首先，将传感器芯片的流动池用运行缓冲液漂洗。之后，以30μl/分钟流速注射300秒含有抗Aβ11(pE)的抗体溶液，以鉴定抗体与抗原的结合。未修饰的流动池用作参考，其应仅示出与基质的非特异性抗体相互作用。之后，将运行缓冲液通过转换阀门再次自动注射，以诱导抗体的解离。最后，将芯片通过注射0.1MHCl(10μl)再生，由此从传感器表面除去剩余的抗体。使用程序BIAevaluation(Biacore,Freiburg)评估结合情况。
为了量化细胞培养上清样品中抗体浓度，测量具有通过来自杂交瘤克隆13的纯化和透析的mAb的UV/VIS光谱学确定的已知浓度标准曲线。如章节1.2.1所述纯化mAb。对于最高标准浓度，应用10μg/ml mAb，在运行缓冲液中通过根值2除法(radix two division)稀释直至最低浓度0.04μg/ml。
1.3.3.3通过SPR确定交叉反应性
通过SPR确定抗Aβ11(pE)抗体(克隆13)与焦谷氨酸-肽Aβ3(pE)、Aβ11(pE)、CCL2(称作MCP-1)、CCL8(称作MCP-2)、大胃泌素、促性腺激素释放激素、神经紧张素、增食欲素(orexin)A、纤连蛋白、胶原蛋白1和TRH(促甲状腺激素释放激素)的交叉反应性。因此，使用具有高浓度固定化的焦谷氨酸肽的CM5芯片。将抗体克隆13在运行缓冲液中稀释，以30μl/分钟流速在300秒期间注射1μg/ml。
1.3.4等温滴定量热法(ITC)
1.3.4.1确定热力学参数
使用ITC，确定来自克隆13的抗Aβ11(pE)抗体与抗原Aβ11(pE)的结合的热力学参数。对于ITC实验，使用肽Aβ(pE11-18)-PEG，因为亲水性PEG基团赋予亲水性性质，因此所述肽能在ITC缓冲液中直接溶解。先前使用Aβ(pE11-20)的实验仅可以使用1-2%DMSO进行，这是由于所述肽的强疏水性导致必需用DMSO溶解其，而DMSO对ITC结合性质有影响。首先，将抗体用ITC缓冲液(150mM NaCl，25mM Na2HPO4，25mMKH2PO4，1mM EDTA，pH=7.1)在4℃透析过夜。将在-20℃贮存的冻干的肽溶解于用于抗体透析相同的ITC缓冲液pH=7.1中。抗体和抗原必须在相同溶液中，否则大量稀释热将掩盖希望的观测结果。在ITC实验之前，抗体浓度通过UV/VIS光谱学(见章节1.3.1)确定。首先，将例如5.13μM抗体(见表4)加入样品池中，参考池充填蒸馏水。然后，将抗原注射进样品池中，例如81.78μM(见表4)。抗原通常应超过抗体两倍，注意抗原具有两个结合位点，因此池中的抗原要超过抗体至少4倍。两次注射间隔4分钟，注射30次(1次2μl及29次10μl)。反应热的测量在20℃进行。此外，确定的反应热仅是通过滴定进ITC缓冲液(pH=7.1)中稀释抗原产生的。因此，将抗原注射进充填ITC缓冲液的样品池中。将抗原与抗体滴定期间产生的反应热依据这个数值进行校正。原始数据分析及结合常数(KA)、反应化学计量(n)、键焓(ΔH)和熵(ΔS)的确定是使用MicroCal的Origin软件进行的。
使用ITC分析使用KSCN-梯度(pH7.0)及使用0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7)从蛋白G柱中洗脱的抗Aβ11(pE)抗体及生物素化的抗体的结合参数。在表4中列出了使用的抗原和抗体浓度。
表4：ITC中Aβ(pE11-18)-PEG肽和抗Aβ11(pE)抗体的浓度
使用分别经KSCN-梯度(pH7.0)和0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7)从蛋白G柱中洗脱的抗体及生物素化的抗Aβ11(pE)抗体的浓度。在ITC中分析Aβ(pE11-18)-PEG肽与三种抗体的相互作用。
甘氨酸洗脱的抗Aβ11(pE)抗体以比KSCN洗脱的抗体高的浓度使用，推测该抗体由于通过酸洗脱而部分失活。
1.4单克隆抗Aβ11(pE)抗体的应用
1.4.1研究PBD-0316
在本项研究中分析来自AD患者(n=13)和30个健康对照对象的血浆和血清样品。此43个分析样品来自最初的研究，通过CRO(GALMED GmbH)募集。样品源自临床诊断的AD患者及来自对照组。在先前的研究检验中，所有研究参与者的神经心理学功能通过一些心理学测试检测(DemTect，简易精神状态检测(Mini-Mental-State Test)，画钟测验(Clock-drawing test))。DemTect评分是一种简便的痴呆筛选检测，包括5个短的子测验(10个单词表重复，数字编码转换，语义字流畅性任务，逆序数字记忆广度，单词表延缓回忆(number transcoding,semantic word fluency task,backward digitspan,delayed word list recall)(Kessler et al.,2000,Psycho26343-347).简易精神状态检查(MMSE)或Folstein测试是简短的30道题问卷测试，用于评估认知。其通常在医学中用于筛查痴呆。在约10分钟时间内，其测试各种功能，包括算数、记忆和方向。所述测试包括一些领域中的简单问题：测试时间和地点，重复单词表，算数，语言运用和理解，及基本运动技能。
钟的评分(画钟测验)是基于Shulmann et al.,1986所使用的规格的修改。所有圆圈均是预先画好的，对对象发出的指令是“将时间10放在11之后”。
在先前的研究检验中，在从所有参与者中抽取血液之后2周开始研究，定义为0时间点。用于确定AD生物标记的所有血样均收集在聚丙烯试管(Sarstedt Monovette)中，对于EDTA血浆，管中含有钾-EDTA，对于血清，管中是空白的。所有样品均通过静脉穿刺或者通过从插入前臂的静脉留置管中重复抽取收集，在4℃以1550g(3000rpm)离心10分钟，以提供血浆。在抽血后1小时内对样品进行离心。吸取出每个单独样品的血浆和血清，充填于一个5ml聚丙烯冷冻管中，在-80℃冷冻贮存。在3、6和12个月后，再次从所有参与者中抽血，如上述处理。
1.4.2自身-Ig ELISA
1.4.2.1自身-Ig-ELISA的性能和建立
进行及建立自身-Ig-ELISA以分析来自阿尔兹海默病(AD)患者和健康对照者的血浆样品中的自身-免疫球蛋白。特别应检测针对pE-N-末端Aβ肽和Bri2肽的自身-免疫球蛋白。所述自身-Ig-ELISA根据直接夹心-ELISA的原理构建。因此，使用链霉抗生物素包被的微平板(Thermo Scientific)固定在C末端生物素化的肽Aβ(pE3-12)、Aβ(pE11-20)和Bri2(1-23)。首先，将链霉抗生物素平板用300μl洗涤缓冲液(25mM Tris，150mM NaCl，0.05%Tween，0.1%BSA)洗涤3次，以清洁该平板及除去防腐剂。之后，加入100μl浓度为200ng/ml的肽溶液，在室温温育2小时。将微平板(MTP)用盖板覆盖，以防止在温育期间蒸发。将MTP用200μl/孔无Tween20的ELISA-Blocker(ELISA-Blocker(-T))封闭，在室温温育1小时。随后，未结合的肽通过用300μl洗涤缓冲液洗涤三次而除去。将EDTA-血浆样品在ELISA-Blocker+Tween20(ELISA-Blocker(+T))中适当稀释。对于校准曲线，将mAb在ELISA-Blocker(+T)或洗涤缓冲液中通过根值2除法(radix twodivision)稀释。将稀释的标准物和EDTA-血浆样品移至MTP中，100μl/孔。根据确定的量，将样品和校准物移液至几个孔中。在4℃温育2小时后，进行新的洗涤循环(用300μl/孔洗涤缓冲液洗涤3次)。使用与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的多克隆兔抗小鼠Ig′s检测校准物。与HRP缀合的多克隆人Ig′s、IgG、IgG2、IgG3、IgM或IgA用作酶-缀合物溶液以检测EDTA-血浆中自身-免疫球蛋白。将所述酶缀合物溶液用ELISA-Blocker(+T)稀释至浓度为1μg/ml。在每个孔中，移液入100μl酶-缀合物溶液，在4℃温育1小时。进行一次洗涤循环(用300μl/孔洗涤缓冲液洗涤3次)。加入100μl/孔的含有Tetramethylbenzidin(TMB，生色团)和过氧化氢(底物)的过氧化物酶底物溶液Sure Blue(KLP公司)。HRP催化两个过氧化氢分子分解为水和氧，由此来自生色团TMB的氨基基团中的两个电子被转移至底物。电子从TMB中的释放(氧化作用)产生自由基阳离子，其通过二聚体化是稳定的，及呈现出典型的蓝色。因此，生色团的颜色通过电子的转移而由无色改变为蓝色。所述溶液的颜色强度与分析物浓度成比例。在室温温育30分钟后，酶反应通过加入1M H2SO4溶液使过氧化物酶失活及TMB二聚体化消除而终止。在不成比例之后，强黄色二价阳离子形成。光吸收在450nm波长测量，用在540nm的光吸收校正。在450nm和540nm的光吸收使用TECANSunrise平板读器测量。
根据所述方案完全建立了抗Aβ3(pE)、抗Aβ11(pE)和抗Bri2(1-23)ELISA(见表5)。对于ELISA的建立，使用厂商(Thermo Fisher Scientific)的标准方案作为模型。在优化不同参数如固定化的抗原的浓度、检测抗体、及温育时间和温度以及洗涤循环之后，制备如下方案。
表5：自身-Ig-ELISA的性能
Figure BDA0000382775580000431
Figure BDA0000382775580000441
在建立自身-Ig-ELISA之后，检测来自AD患者和健康对照者的血浆样品。由此，分析13个来自AD患者的血浆样品和30个健康对照者样品。血浆样品源自经临床诊断为AD/MCI患者和来自和健康对照组。这43个血浆样品来自与GalMed Medical Research Company合作进行的研究PBD-0316。使用在6个月(T0+6)后收集的血浆样品。在血浆样品中加入蛋白酶抑制剂和EDTA，以防止蛋白质降解及沉积样品。因此，在1ml血浆中加入25μl蛋白酶抑制剂溶液。对于蛋白酶抑制剂溶液，将1片蛋白酶抑制剂Complete Mini溶解于1ml PBS中。之后，将样品等份，在-80℃贮存，以保证分析的血浆的恒定质量。
1.4.3Aβ(pE11-x)ELISA的建立
应建立Aβ(pE11-x)ELISA以分析如小鼠模型的大脑中的Aβ(pE11-x)肽。由于高聚集倾向导致血浆或CSF中焦谷氨酸Aβ肽的检测是不可能的，寡聚体通过血脑屏障受损。
根据夹心ELISA的原理构建Aβ11(pE)ELISA，应用Aβ3(pE)ELISA传统方案作为模型。可商购的单克隆小鼠抗Aβ(17-24)抗体(克隆4G8,Covance)用作吸附于微平板表面的捕获抗体。与捕获的Aβ(pE11-x)结合的单克隆生物素化抗Aβ11(pE)抗体通过加入链霉抗生物素--HRP(SA-HRP)缀合物进行检测。使用合成的Aβ(pE11-30)和Aβ(pE11-40)肽进行建立。将在-80℃在六氟异丙醇(HFIP)中贮存的Aβ肽在室温解冻。将具有所述肽的试管开口置于通风处以使溶剂HFIP蒸发。将所述肽溶解于100mM NaOH中，在室温温育10分钟，在含有0.05%Tween和1%BSA的EIA-缓冲液中稀释。根据表6中所述方案进行Aβ(pE11-x)ELISA。
表6：夹心Aβ(pE11-x)ELISA的性能
Figure BDA0000382775580000451
除了夹心ELISA之外，在微平板用吸附的抗原Aβ(pE11-30)进行直接ELISA，以直接检测单克隆抗Aβ(17-24)-生物素抗体(克隆4G8)和单克隆抗Aβ11(pE)-生物素抗体(克隆13)。生物素化的抗体通过加入链霉抗生物素-HRP(SA-HRP)缀合物进行检测。建立的直接ELISA方案在表7中示出。
表7：直接Aβ(pE11-x)ELISA的性能
Figure BDA0000382775580000461
1.4.4免疫组织化学
免疫组织化学(IHC)图像由位于波士顿的哈佛医学院Qiaoqiao Shi(C.Lemere实验室)友好提供。
使用IHC，定位脑组织切片中的抗原Aβ(pE11-x)和Aβ(pE3-x)。因此，使用抗Aβ11(pE)抗体(克隆13)检测焦谷氨酸Aβ肽。
为了进行IHC，使用来自AD患者的海马和额叶皮质的人脑组织切片及来自APP/PS1转基因小鼠海马的脑组织切片。APP/PS1小鼠目前由一些实验室用于研究淀粉样物沉积机制。该小鼠模型表达淀粉样前体蛋白(APP)瑞典型突变，示出脑中Aβ水平增加及随后的神经炎斑块发生。突变的presenilin1(PS1)的共表达增加Aβ(1-42)产生。将组织切片用石蜡包埋并连续切片。将切片用苏木精染色至细胞核着色，然后用抗Aβ11(pE)抗体进行免疫染色。根据标准方法学进行组织切片制备和染色。
1.5测序抗体可变区
杂交瘤的培养：
将杂交瘤细胞在添加15%FBS、1%MEM-NEA(非必需氨基酸，Gibco)、50μg/ml庆大霉素(Gibco)和50μMβ-巯基乙醇的D-MEM(+L-谷氨酰胺，+丙酮酸钠，4.5g/l葡萄糖，Gibco)中在37℃和5%CO2条件下生长。根据细胞密度在3-4天后出现传代培养。将细胞以0.5×106个细胞/ml浓度接种，在细胞密度为2-5×106个细胞/ml时发生分裂。
cDNA合成及逆转录：
根据NucleospinRNA分离试剂盒(Macherey-Nagel)手册从2×106个细胞中分离总RNA。100ng RNA用于使用Oligo(dT)15引物(Promega)和SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)进行cDNA合成。
重链和轻链可变区的PCR-扩增：
使用PhusionTM High-Fidelity DNA聚合酶(NEW ENGLAND BioLabs)，引物MHCG1组合引物MHV1-MHV12，从模板cDNA中扩增重链可变区。为了扩增轻链可变区，使用引物组合MKC与MKV1-MKV11(见表8)。
pJET1.2中PCR产物的克隆：
根据CloneJETTMPCR克隆试剂盒(Fermentas)的方案，将通过PCR扩增的重链和轻链可变区克隆进pJET1.2/平端载体中。使用pJET1.2测序引物进行测序。
表8：重链和轻链可变区的PCR扩增引物序列
Figure BDA0000382775580000481
2.结果
2.1抗体筛选
在细胞融合和用HAT培养基选择杂交瘤细胞之后，筛选所述杂交瘤细胞(源自一些不同的单细胞)，以鉴别分泌靶抗原Aβ11(pE)的特异性mAb的细胞。检验mAb结合不同的修饰的Aβ肽的能力。因此，确定所述mAb与其它修饰的Aβ肽的可能的交叉反应。点印在羧基-纤维素-膜上的具有不同序列的Aβ肽在图1中示出。使用26个检测杂交瘤细胞上清及16个不同的Aβ肽进行筛选。
图1示出点印了16个肽的26个膜(标为P1-P53)，示出在膜之上。筛选分析表明来自框起的膜(framed membrane)(P7,P10,P11,P12,P13,P15,P22,P24,P27)的杂交瘤细胞的mAb示出针对具有靶表位Aβ11(pE)的N末端修饰的Aβ(pE11–23)(pEVHHQKLVFFAED)肽(SEQ ID NO:19)的中等至强度信号。此外，其示出与其它修饰的Aβ-肽无显著交叉反应。在框起的膜上检测的mAb也不结合在位置11(见斑点9)的非环化的N-末端谷氨酸，在N末端无完整Aβ序列pEVHH的斑点4,5,6,7,8,9,13检测到无结合信号。此外，在框起的膜检测到在位置3(见斑点6)的N末端焦谷氨酸无结合信号。总而言之，可以说来自框起的膜图片上检测的杂交瘤细胞的mAb是N末端Aβ11(pE)肽特异性的，并且显示与Aβ(1-42)肽其它序列无显著交叉反应。为此，选择所述的9个杂交瘤克隆进行重克隆。在图1中用实线标示的五个杂交瘤克隆在重克隆后是稳定的，选择其进行进一步的重克隆。使用限制稀释技术，将选择的杂交瘤细胞克隆为获得一个分离的克隆。在本项研究中，培养这五个选择的杂交瘤克隆之一，克隆13(见下文章节2.2)，确定细胞培养上清中的抗体浓度。
不选择在膜P4,P5,P16,P25检测的杂交瘤细胞进行重克隆，因为该mAb示出针对靶抗原Aβ11(pE)以及针对不同Aβ肽的弱或无信号。此外，不选择膜P1,P17,P26,P29,P31,P32,P35,P36,P38,P42,P47,P49和P53的杂交瘤细胞进行重克隆，因为该mAb示出在靶抗原Aβ(pE11-14)以及在其它点印的Aβ肽的强信号，因此表明其针对抗原Aβ(pE11-14)无选择性。
2.2杂交瘤的培养及细胞培养基优化
用产生抗Aβ抗体的杂交瘤细胞进行初步检测。在检测期间，确定产生抗Aβ3(pE)抗体的杂交瘤细胞的最佳培养条件。示出用补加15%FBS、1%MEM-NEAA、2mM L-谷氨酰胺和50μMβ-巯基乙醇的培养基DMEM培养的杂交瘤细胞具有较高增殖以及抗体产生率。因此，在本项研究中，根据优化的条件培养选择的杂交瘤克隆(克隆13)。
研究示出所述杂交瘤克隆可以被成功培养。在杂交瘤细胞解冻后4-6个传代内，细胞数可以增加12倍或20倍。可以观测到悬浮液中细胞形成的部分细胞聚集体以及贴壁细胞。活力细胞示出圆形细胞形状，与非活力细胞相比较大。使用
Figure BDA0000382775580000491
Mycoplasma检测试剂盒定期检测细胞的支原体污染情况。所有检测的杂交瘤细胞均是无支原体的。在杂交瘤培养期间，细胞培养上清中抗Aβ11(pE)抗体的浓度通过SPR(见章节2.2.1)测量。本研究的另一目的是将杂交瘤细胞从含有血清的条件适应为适合无血清的条件，以简化产生的mAb的纯化。这个目的是逐步进行的。最佳的无血清培养基是通过在培养基适应10天后制备生长曲线而鉴别的。由此在培养时间期间测量细胞生长和抗体产生率。
2.2.1确定细胞培养上清中抗体浓度
利用表面等离子体共振(SPR)原理使用Biacore3000确定细胞培养上清中抗Aβ11(pE)抗体的浓度。因此，将肽Aβ(pE11-30)固定化在CM5芯片传感器表面上(将章节1.3.3.1所述方法)。在图2中，示出Aβ(pE11-30)固定化的随着时间的实时绘图。首先，使用10μg/ml Aβ(pE11-30)进行偶联。在肽偶联期间信号上升(见图2，以A标示)。由于信号较低，再次应用50μg/ml较高浓度的所述肽(见图2，以B标示)。总而言之，将高浓度的肽固定化在芯片表面上。为了确定细胞培养上清中的抗体含量，必需高浓度的固定化肽。由此，检测极低的抗体浓度是可能的，标准曲线的线性范围高于使用较低浓度的固定化的肽。芯片的过载不适于结合研究及确定结合速率如解离速率kd和结合速率ka。由于较高的抗原浓度，抗体的多个键相互作用是可能的(亲合力作用)，导致错误的结合速率和虚假的低解离速率(off rate)。
从培养的杂交瘤克隆的每个细胞传代中，使用Biacore3000检测细胞培养上清中的抗Aβ11(pE)抗体。杂交瘤克隆13的结果在图3中示出。克隆13是产生抗Aβ11(pE)抗体的唯一克隆。确定来自杂交瘤克隆13的抗体的高测量信号(RU)曲线，这样可以推断抗Aβ11(pE)抗体高产量产生。克隆15、22和24则相反，在整个培养期间未获得特异性测量(RU)信号。为此，仅将克隆13的杂交瘤细胞进一步培养及用于本项研究中所有解释实验。
对于细胞培养上清内抗体浓度的量化，测量具有已知浓度的来自克隆13(见章节1.2)的纯化的抗Aβ11(pE)抗体的标准曲线。将通过Biacore3000获得的测量信号(RU)根据抗体浓度绘图。标准曲线在图4中示出。
标准曲线示出在0.040μg/ml至1.25μg/ml抗体浓度之间的线性过程(见图5)。在1.25μg/ml浓度以上，曲线倾斜下降。由于较高的抗体浓度，可以发生在抗体与抗原结合期间的位阻。线性回归等式y=3033.7x+50.099(r2=0.991)用于计算细胞培养上清中的抗体浓度。将进一步测量的细胞培养上清样品稀释，在标准曲线线性范围内测量。
2.2.2使杂交瘤细胞适合无血清条件
使杂交瘤细胞(克隆13)从含有血清的培养基(SCM)条件适应为适合不同的无血清培养基(SFM)和无蛋白质培养基的条件，以简化从细胞培养上清中经蛋白G亲和性纯化鼠抗Aβ11(pE)mAb。蛋白G特异性及高亲和性结合鼠免疫球蛋白G-分子。FBS中含有的牛IgG也强结合蛋白G，可能存在不希望的交叉反应。因此，应使用无血清培养基或无蛋白质培养基培养杂交瘤细胞，以排除纯化的抗体洗脱级分中含有牛IgG。
适应不同的SFM(Hybridoma Express,Hybridoma Express Plus,Hybridoma SFM)和无蛋白质培养基(CD Hybridoma Medium)是在T形瓶中进行的，在每次传代后确定细胞数和抗体浓度。在表9中示出了在适应培养基后的细胞生长和抗体产生情况。
表9：在适应SFM和无蛋白质培养基之后细胞生长和抗体产生
将杂交瘤细胞(克隆13)相继在T形瓶(37℃，5%CO2)中进行适应。在适应之后，将细胞培养2代，确定细胞生长和抗Aβ11(pE)抗体产生结果(通过SPR)。+：细胞增殖；-：无细胞组织和抗体产生。
Figure BDA0000382775580000511
表9中所示结果示出仅在Hybridoma SFM培养基中细胞增殖，同时产生高产量抗体。因此，只有使细胞适应Hybridoma SFM培养基是成功的。为了对比在SCM(DMEM,15%FBS,1%NEAA；及DMEM,15%低IgG FBS,1%NEAA)和在Hybridoma SFM中培养的细胞，确定10天的生长曲线。因此，将细胞在摇瓶中培养，定期取样以确定细胞培养上清中的细胞数和抗体浓度(见图6)。
结果证实在Hybridoma SFM中培养的细胞示出与在SCM中培养的细胞高两倍的生长。在Hybridoma SFM中培养的细胞的指数生长期在24小时开始，而在SCM中培养的细胞的指数生长期在48小时后开始。因此，杂交瘤细胞在Hybridoma SFM培养基中与在SCM培养基中相比开始较早的指数生长期，具有较短的延滞期。相似地，在SFM和SCM中培养的细胞在72小时后达到最高细胞数。显然在SFM中培养的细胞示出在72小时和144小时内的濒死期，在SCM培养的细胞的生长曲线中未观测到。除了测量细胞数之外，也测量抗Aβ11(pE)抗体浓度。在SFM中培养的细胞示出比在SCM中培养的细胞显著较高的抗体产量。通常地，抗体浓度随着指数生长期细胞数的增多而增加，但是在SCM中培养的细胞在72小时开始处于稳定期而终止抗体产生。然而，在SFM中培养的细胞的抗体产生在72小时后不依赖于细胞数降低而略微增加。
为了确定生长曲线分析的特定参数，计算比生长速率μ和生产速率qp。这个数据应能更好地解释生长和抗体产生情况。在图7中，绘制了对应培养时间的比生长速率图。
在培养开始时，确定高比生长速率曲线，其在72小时指数生长期之后明显下降。比生长速率μ在直至96小时之前还是正性的，表明细胞在生长。细胞的衰退期特征在于负生长速度，因为能量源在96小时后被耗尽。令人瞩目的是在Hybridoma SFM中培养的细胞示出在72小时后由于非常高的细胞浓度导致生长速度显著降低。
此外，计算在培养时间内存活细胞浓度的积分(integral)，称作存活细胞密度积分(IVCD)。IVCD(通过并入时间)是指在培养时间内细胞对抗体产生的贡献程度。从图6(A)例证的曲线中确定积分。在培养时间5小时、24小时、48小时和72小时测量的活细胞数测量点通过指数函数f(t)＝a·ec·t拟合，a和c是恒定的，t是时间。之后，积分指数函数。计算在5小时、24小时、48小时和72小时每个时间点的IVCD。为了确定抗体生产速率qp，将抗体浓度根据IVCD绘图(见图8)，并且从这些曲线qp中获得曲线斜率(Renard et al.,Biotechnol.Lett.1988,10,91-96；Ozturk et al.,J.Biotechnol.1990,16,259-278)。
在图8中个，仅包括在5、24、48和72小时的数据点，因为抗体生产速率在衰退期明显降低，直线不能使下降数据点与指数期相关联。抗体生产比速率在指数期显著高于在静止期。这些数据表明抗体生产速率是在这项研究中使用的杂交瘤细胞系生长依赖性的。相反，Ozturk S.描述了在指数生长期和衰退期的抗体生产比速率是恒定的，因此小鼠杂交瘤细胞的抗体生产不是生长相关的(Ozturk S.et al.supra)。
在表10中示出了获得的抗体生产比速率。
表10：在摇瓶中用SCM和SFM培养的杂交瘤细胞的比生产速率qp
Figure BDA0000382775580000521
在Hybridoma SFM中培养的细胞示出最高的抗体生产速率0.5121pg/(细胞.小时)。因此Hybridoma SFM的qp与在SCM中培养的细胞相比高大约2倍，可能是由于在SFM中高2倍的细胞增殖所致。
将在SCM中培养的杂交瘤细胞传代培养几代，从第18代开始抗体浓度持续下降(数据未示出)。第27代细胞的抗体生产完全终止，但是细胞示出不依赖于降低的抗体生产的正常细胞生长，产生抗Aβ3(pE)抗体的杂交瘤细胞也是如此。在文献中已经描述了杂交瘤细胞通常是不稳定的，可以终止抗体生产。经确定杂交瘤细胞通常作为抗体产生细胞和非产生细胞的混合物存在(Heath et al.,J Biotechnol.1990,Vol.15,S.71-89)。不产生抗体的杂交瘤细胞缺少涉及重链和轻链序列的遗传完整性。非产生抗体的细胞示出与产生抗体的细胞相比较高的增殖速度，在一些传代之后可占据杂交瘤培养物的优势(Kromenaker et al.,Biotechnol Prog1994,Vol.10,S.299-307)。相反，在Hybridoma SFM中培养的细胞在第27代仍示出高抗体生产速率。这提示在SFM中培养的细胞示出与细胞传代数无关的持续细胞生长以及抗体产生状况。在SFM中一直培养细胞直至更高代。为了更清楚表明，应将实验重复第二次。
总而言之，与在SCM中培养的细胞相比，在Hybridoma SFM中培养的细胞示出具有最大生长速度的极佳的细胞生长状况，并展示出在这个培养时间内具有高比生产速率的明显最高的抗体生产产量。使用的杂交瘤细胞仅需要较小的从SCM相继适应为Hybridoma SFM。使用Hybridoma SFM，杂交瘤培养的成本与另外使用具有低IgG FBS的DMEM相比可降低18%。此外，由于不存在含有牛IgG的血清及其它血清成分如蛋白酶，因此从细胞培养上清中纯化mAb得以简化。
所有检测的培养基的生长曲线均示出在72小时指数生长期之后的明显降低，这是由于L-谷氨酰胺完全耗尽所致。Miller等描述了当L-谷氨酰胺被耗尽时富集最大细胞数，因为细胞生长的限制因素是L-谷氨酰胺，其主要用作能量来源及促进细胞生长和抗体生产(Miller et al.,1989,BiotechBioeng.Vol.32,S.947-965)。由于这些因素，SCM和SFM也补加了2mM L-谷氨酰胺。但是在Hybridoma SFM中的细胞生长和抗体生产显著高于在SCM中。
Hybridoma SFM是为进行杂交瘤培养而优化的一种极低蛋白质培养基(20μg/ml)。该培养基含有L-谷氨酰胺，微量元素，矿物质和少量(20μg/ml)指定的蛋白质(胰岛素和运铁蛋白)。SFM中哪种物质决定高细胞增殖和抗体产量未检验，但是随后可以推断。有一些可能性增加杂交瘤细胞的抗体效力。在文献中描述了加入含有胆固醇、磷脂和脂肪酸的脂质混合物增强杂交瘤细胞的抗体生产，这是由于质膜的脂质组构和流体学对细胞功能有影响的缘故(Savonniere et al.,Biotechnol.1996Jul18;48(1-2):161-73)。生长因子也可增加抗体生产速率，例如表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、白细胞介素-2(IL-2)、IL-6(B-细胞刺激因子)、运铁蛋白、胰岛素和乙醇胺(Murakami et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.1982Feb;79(4):1158-62；Dandulakis et al.Biotechnol Prog.1995Sep-Oct;11(5):518-24)。
2.3抗体纯化
来自克隆13的抗Aβ11(pE)抗体应从细胞培养上清中纯化为同质，用于ELISA和另外的实验中。所述抗体是使用蛋白G琼脂糖柱纯化(见章节1.2.1)。结合的抗体根据两种不同方法洗脱。首先，使用酸性0.1M甘氨酸-HCl溶液(pH2.7)，洗脱级分立即通过用1M Tris-HCl,pH9.0滴定而中和。在中和期间，抗体由于在酸性洗脱期间可能的抗体结构改变而大量沉淀。
为此，使用硫氰酸钾梯度进行pH中性洗脱方法。由于KSCN，抗体与蛋白G之间的相互作用被松解。使用这种技术，抗体被洗脱及抗体未发生沉淀现象。在图9中示出了纯化层析。
随着KSCN-梯度增加，抗体被洗脱。洗脱峰几乎是如高斯函数对称的，表明一种抗体物种的同种洗脱。洗脱是通过离液序列高的离子SCN-诱导的，其消除蛋白质-蛋白质之间的相互作用。太高的KSCN浓度可使蛋白质变性，因此抗体洗脱是梯度进行的，随后立即透析。
在亲和性层析之后，进行SDS-PAGE以检验蛋白G柱纯化的不同级分中抗体的含量(见图10)。从而可以确定具有抗Aβ11(pE)抗体的洗脱级分的纯度。分析未纯化的细胞培养上清的样品、蛋白G柱的流经级分、洗涤级分和洗脱级分样品。
SDS-凝胶示出在蛋白G纯化期间，特异性结合抗体与非特异性结合的抗体分离。在未纯化的细胞培养上清(泳道1，6)和流经级分(2，7)中，明确鉴别了大约66kDa的BSA-条带(牛血清白蛋白)，然而，该洗脱级分(泳道4，9)不含有BSA。在洗涤循环期间，一小部分结合的抗体从柱中洗去(泳道3)。泳道4中的洗脱级分示出仅特异性结合抗体被洗脱。在SDS-PAGE中，基于还原条件所述抗体分离为大约50kDa的重链和大约25kDa的轻链(见泳道4)。为了示出具有完整二硫键的全部抗体，在非还原条件下应用洗脱级分(见泳道9)。所述抗体在大约150kDa条带鉴别。此外，示出在柱中无BSA保留(holding back)，因此在洗脱级分中从纯化的抗体中除去。蛋白G结合小鼠IgG，但是也结合FBS中含有的牛IgG。为了降低牛IgG杂质，使用含有低于5μg/ml IgG的超低IgG-FBS(Invitrogen)。使用这种纯化方法，抗体被纯化为同质及与细胞培养上清中含有的其它蛋白质分离。在透析之后，通过UV-光谱仪和SPR确定抗体浓度。
在使用蛋白G琼脂糖柱纯化抗Aβ11(pE)抗体期间，从应用于蛋白G柱之前的细胞培养上清、从流经级分、洗涤级分和洗脱级分中获取样品。这之后通过SPR进行测量。对于通过SPR量化抗Aβ11(pE)抗体，使用图10中举例的标准曲线。经确定在纯化前细胞培养上清中含有大约14.8μg/ml抗体，这等于在1800ml上清中抗体总量为26.7mg。流经级分含有0.8μg/ml抗体(共2.4mg)，洗涤级分含有8.7μg/ml(共0.2mg)抗体。通过SPR确定洗脱级分中1.07mg/ml浓度，这共计为21mg抗体。随后，亲和性层析的产量为80%。在抗体纯化、浓缩和透析后，测量UV-光谱(见图11)。
从UV-光谱中，确定在纯化后抗体浓度为4.09mg/ml。因此，在1800ml细胞培养上清中纯化大约21mg抗体。因此通过UV/VIS方法确定的抗体浓度与SPR结果最一致。然后将抗体灭菌过滤，等份及在4℃贮存以进行进一步分析。
这个抗体纯化结果是使用来自高传代(17–22代)的细胞的细胞培养上清进行的，观测到高于18代的降低的抗体生产速率(见章节2.2.2)。然而，在较低代数的细胞的细胞培养上清中抗体浓度共计为大约30μg/ml。
因此，较低代数的细胞的抗体纯化产量比使用较高代数细胞高两倍，为大约42mg。
2.3.1抗Aβ11(pE)抗体的生物素化
抗Aβ11(pE)抗体是生物素化的，以在Aβ(pE11-x)ELISA中用作检测抗体。透析抗体-生物素溶液以除去未缀合的生物素。通过UV-光谱(MW150,000)确定1.88mg/ml生物素化抗体的浓度，随后用HABA测定法确定生物素化水平。
结果是在一个抗体偶联大约2个生物素分子。在图12中示出在生物素化之前和之后抗体的UV/VIS光谱。这两个光谱示出相同的曲线进程(courseof the curve)，表明在生物素化期间未发生聚集。因此，生物素化是成功的，所述抗体可与抗生物素蛋白-HRP聚合物组合用作检测抗体。
2.4抗Aβ11(pE)抗体的鉴定
2.4.1测序抗体可变区
鉴别如下序列：
2.4.1.1克隆13-11-6(克隆13)
Aβ克隆13可变部分轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:51)
atggagtcacatacccaggttcttatattgctgctgctatgggtatctggtacctgtggggacattgtgatgtcacagtctccatcctccctggctgtgtcagcaggagagaaggtcactatgagctgcaaatccagtcagagtctgttctacagtagaacccgaaagaactacttggcttggtaccaacagaaaccagggcagtctcctaaattgctgatctactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttattactgcaagcaatcttacaatctgtggtcgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagt
Aβ克隆13可变部分轻链蛋白质序列(SEQ ID NO:52)
MESHTQVLILLLLWVSGTCGDIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLFYSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLWSFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSS
Aβ克隆13可变部分重链核苷酸序列(SEQ ID NO:53)
atgggatggagctgtatcatgttctttttggtagcaacagctacagatgtccactcccaggtccaactgcagcagcctgggactgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggcttcaccttcaccagctactggatgcactgggtgagacagaggcctggacaaggccttgagtggattggagagattaatcctagtaacggtcgtactaactataatgagaagttcaagagcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgaggtctattactgtgcgagaggggatcttgcctgggactggtctgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgcagccaaaacgacacccccatctgtctatccactg
Aβ克隆13可变部分重链蛋白质序列(SEQ ID NO:54)
MGWSCIMXFLVATATDVHSQVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGFTFTSYWMHWVRQRPGQGLEWIGEINPSNGRTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSEVYYCARGDLAWDWSAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPL
2.4.2二级结构的确定
通过CD-光谱学研究生物素化的和非生物素化的抗Aβ11(pE)抗体的二级机构。可以分析由于生物素化过程所致的可能的二级结构改变。使用溶解于10mM磷酸钠pH7.1中的130μg/ml抗体(生物素化和非生物素化)进行CD测量。在图13中，示出在20℃的抗体的远-UV-CD-光谱。生物素化和非生物素化的光谱几乎相同，这两个抗体均示出在218尿嘧啶最小值和在200nm的最大值，这对于β-折叠蛋白是典型的。结果表明生物素化对二级结构无影响。相同的CD-光谱表明相同的二级结构，及因此对结合性质无影响，然而这不涉及在ITC或ELISA中的结合性质。
2.4.3Aβ11(pE)抗体的温度转变
圆二色性可用于观测二级结构随着环境条件怎样转变。使用CD根据随着温度增加光谱中的改变评定蛋白质热稳定性。在图14和图15中，示出从20℃直至80℃温度生物素化和非生物素化的抗Aβ11(pE)抗体光谱。从60℃开始，光谱的进程改变。最大值为大约201nm，是β-折叠蛋白的典型信号，在60℃温度降低，在80℃获得最小值。结果表明非生物素化的以及生物素化的抗体在60℃开始变性(Tm≈65℃)。因此抗体的温度稳定性在直至60℃失去。结果在IgG′s的正常范围内，与其它例如S.Frey确定单克隆IgG的解链温度为63℃的研究结果一致(S.Frey et al.,2008,Biol.Chem.,Vol.389,pp.37–45)。这两个抗体示出在20℃至60℃范围相同的CD-光谱，在218nm最小值及在201nm最大值，表明生物素化对蛋白质稳定性无影响。
2.4.4Aβ11(pE)抗体的结合性质
为了鉴定抗Aβ11(pE)抗体与Aβ(pE11-18)-PEG肽的结合，使用等温滴定热量测定法(ITC)(见章节1.3.4)。分析用KSCN-梯度(pH7.0)和0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7)从蛋白G柱中洗脱的抗体。使用ITC，确定反应化学计量(N)，结合常数(KA)，键焓(ΔH)，以及熵(ΔS)。如章节1.3.4.2所述在ITCMicroCalorimeter中用所述肽滴定Aβ11(pE)抗体。滴定曲线示出与时间成函数的每秒热量(见图16)。反应配体相互作用，热量与结合事件的量成正比地释放或吸收。每次抗原注射均导致温度改变。为了抵消样品与参考细胞之间的温度差异，加入或除去对样品细胞加热发生及作为测量信号。
起初，确定ITC缓冲液中Aβ(pE11-18)-PEG稀释液的热量(见图16，上方)。上方轨迹示出与测量信号相比的恒定信号和低信号(背景信号)。之后，将肽Aβ(pE11-18)-PEG在样品细胞中滴定抗Aβ11(pE)抗体(见图16，下方轨迹图)。每次注射后释放的总热量通过积分每个峰和基线之间的区域而确定。然后将稀释热(见图16，上方轨迹图)从每次注射的总释放热中减去。图17示出使用Aβ(pE11-18)-PEG获得的抗Aβ11(pE)抗体(用KSCN-梯度洗脱)的结合曲线，由此将在每次注射释放的总热量根据抗体和肽的摩尔比率绘图。从结合曲线中，使用程序Origin7.0确定热力学参数常数。
在表11中，示出确定的抗Aβ11(pE)抗体与Aβ(pE11-18)-PEG肽结合的参数N、KA、KD、ΔH和ΔS以及Gibbs能量ΔG。注意KD=1/KA，ΔG=ΔH-TΔS。
表11：Aβ(pE11-18)-PEG肽与抗Aβ11(pE)抗体的热力学结合参数
将抗体分别使用KSCN-梯度(pH7.0)和0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7)从蛋白G柱中洗脱。参数通过ITC MicroCalorimeter在20℃确定。
Figure BDA0000382775580000581
首先论述用KSCN-梯度(pH7.0)洗脱的抗Aβ11(pE)抗体的结果。抗原与抗体键的化学计量为1.88。因此，该化学计量几乎为2，这意味着几乎所有抗体均是活性的及与两个Aβ(pE11-18)-PEG肽分子相互作用。化学剂量变化的原因是由于未知抗体吸收系数所致的不精确的浓度确定。显著低于2的化学计量是指一部分抗体分子是失活的，这是在酸性洗脱抗体的情况中。
抗体的解离常数为78.74nM。例如，抗-hMCP1N1pE(1-x)抗体(数据未示出)示出比抗Aβ11(pE)抗体高3倍的解离常数。这意味着抗Aβ11(pE)的结合强度高于抗-hMCP1N1pE(1-x)抗体。然而，抗-hMCP1N1pE(1-x)成功用于MCP1ELISA中，提示抗Aβ11(pE)抗体在ELISA中也应示出良好的结合性质。确定的抗Aβ11(pE)抗体的解离常数在文献中所述ITC结果中间范围。例如，D-PAM(蛋白质A模拟物)与单克隆抗体IgG的相互作用示出KD在10-5/M范围(D'Agostino B.et al.,J Immunol Methods.2008Apr20;333(1-2):126-38)，可溶的单体Aβ(1-40)与小鼠抗体之间相互作用的KD在10-7至10-8/M范围(Brockhaus et al.,J Phys Chem B.2007Feb8;111(5):1238-43)。抗Aβ11(pE)抗体的KD总计7.8×10-8/M，与在文献中所述数据相应。
一般而言，抗体与抗原相互作用主要是由氢键(特异性相互作用)焓(enthalpic)驱动的，并且通常由于构象度的丧失，熵的变化是负值(ΔS<0)。但是从Aβ(pE11-18)-PEG于抗Aβ11(pE)抗体处的键导致了轻度熵增加ΔS=4.33(cal.mol/K)，负焓ΔH=-8.259kcal/mol及低Gibbs能ΔG=-9.53kcal/mol。因此，所述相互作用是由于氢键形成所致的中度焓(ΔH<0)驱动的，并且也是由轻度熵(ΔS>0)驱动的(对于抗体与抗原相互作用而言是罕见的)。所述键的特征在于由于强疏水性表位Aβ11(pE)所致的疏水性相互作用，水分子被替换导致构象自由度增加，因此导致了轻度熵(mild entropy)增加(Ohtaka et al.,2002,Protein Sci.11,1908-1916)。相反，大多数抗原与抗体键是由负焓以及不利的熵损失驱动的，如MCP1N1pE(1-x)抗体。
上述ITC结果是使用用蛋白G琼脂糖纯化剂用KSCN-梯度洗脱的抗体进行的(见章节2.3)。此外，抗体用酸性0.1M甘氨酸-HCl溶液(pH2.7)洗脱随后通过用1M Tris-HCl立即中和而检测，抗体被沉淀。在浓度确定之前，沉淀的蛋白质通过离心除去，在ITC实验内不出现。也通过ITC鉴定这种酸性洗脱的抗体的结合参数。图18示出获得的抗Aβ11(pE)抗体(用甘氨酸-HCl洗脱)与Aβ(pE11-18)-PEG的结合曲线，由此在每个注射点的总释放热根据抗体和肽的摩尔比率绘图。
用甘氨酸-HCl洗脱的抗Aβ11(pE)抗体的结果示出解离常数KD=105.26nM，负焓ΔH=-7.99kcal/mol，熵增加4.64(cal.mol/K)。酸性和KSCN洗脱的抗体的能量参数几乎相同，但是酸性洗脱的抗体的化学计量仅为1.01，明显低于2。这意味着大约一半的抗体由于酸性洗脱被失活。综上所述，使用KSCN-梯度代替用酸性甘氨酸-HCl进一步进行抗体洗脱。
此外，在ITC中也检测生物素化的抗Aβ11(pE)抗体(见章节1.2.3.1)。在表12中示出了确定的热力学结合参数。
表12：Aβ(pE11-18)-PEG肽与生物素化的抗Aβ11(pE)抗体的热力学结合参数
抗体是生物素化的，由此一个抗体偶联两个生物素分子。参数通过ITCMicroCalorimeter在20℃确定。
Figure BDA0000382775580000591
Figure BDA0000382775580000601
在图19中示出了生物素化的抗Aβ11(pE)抗体与Aβ(pE11-18)-PEG的结合曲线。
生物素化的抗Aβ11(pE)抗体的结果示出几乎相同的焓和熵值，但是比非生物素化的抗体略高的解离常数(KD=125nM)。这意味着生物素化的抗Aβ11(pE)的结合强度略低于非生物素化的抗体。化学计量为1.66，低于非生物素化的抗体的化学计量，这可能表示少部分抗体分子是失活的。结论是确定可能是由于生物素化过程所致的抗体活性略微丧失。
2.4.5交叉反应性的确定
通过SPR检测抗Aβ11(pE)抗体(克隆13)与焦谷氨酸-肽CCL2(称作MCP-1)、CCL8(称作MCP-2)、大促胃液素、促性腺激素释放激素、神经降压素、orexin A、纤连蛋白、1型胶原蛋白和TRH(促甲状腺素释放激素)的交叉反应性(数据未示出)。检测的抗体示出与一些焦谷氨酸-肽无交叉反应性。此外，在SPR中检测抗体克隆13与AβpE(3-40)和AβpE(11-30)的交叉反应性，由此应关于此反应性对比抗体。在图20中例证了克隆13与AβpE(11-30)和AβpE(3-40)肽随着时间的实时绘图。
SPR结果表明克隆13示出与AβpE(3-40)的弱交叉反应性，但是比与AβpE(11-30)低4个量级。ITC结果(见章节2.4.3)示出Aβ11pE与克隆13之间的键是由于疏水性相互作用所致驱动的温和熵。这意味着通常克隆13可与疏水性肽如Aβ3(pE)非特异性相互作用，这通过上述SPR结果示出。总之，抗Aβ11(pE)抗体示出高亲和性(见ITC结果)和良好的特异性。
2.5夹心ELIS中抗Aβ11(pE)抗体的应用
2.5.1自身-Ig-ELISA的建立
为了分析来自AD患者和健康对照者的血浆样品中的自身-免疫球蛋白，建立抗Aβ11(pE)、抗Aβ3(pE)和抗Bri-2(pE1)自身抗体ELISA(见表5)。开发ELISA以分析不同抗体类别IgG、IgM、IgA、亚类(IgG2,IgG3)和总免疫球蛋白Ig。在优化过程开始时，测量到太高的背景信号，由此在肽(200ng/ml)固定后进行不了封闭。因此，检测ELISA-Blocker(-T)和PBS/10%FBS/0.05%Tween的封闭以及样品和缀合物的稀释。ELISA-Blocker(-T)示出在所有自身-Ig-ELISA中最低的背景信号和最高的信号-噪音比率。
此外，建立在抗Aβ11(pE)自身-Ig-ELISA中样品量化标准。因此，检测经纯化和透析的mAb(克隆13)(见章节2.2)作为标准。所述mAb直接针对Aβ(pE11-x)的N-末端，属于小鼠IgG类别。在图21中，示出mAb克隆13的标准曲线。为了检测标准抗体(克隆13)，使用兔抗小鼠Ig(HRP)，相反对于人血浆样品，使用抗人Ig,IgG,IgG2,IgG3,IgM或IgA。每个自身抗体类别和亚类的标准不可获得，但是在每个抗体类别/亚类内在AD患者和对照组中对比抗体水平是可能的，因为样品是在相同条件下检测和量化的。然而，类别/亚类之间以及自身-Ig-ELISA之间的自身抗体浓度的对比由于用IgG类别的标准量化而不可采纳。
Aβ11(pE)自身抗体ELISA的LOQ为55pg/ml，S/N为1.65；Aβ3(pE)自身抗体ELISA的LOQ为48.8pg/ml，S/N比率为1.88。总之，来自杂交瘤克隆13的mAb适用作标准，进一步用于抗-Aβ11(pE)自身-Ig-ELISA中。
2.5.2Aβ(pE11-x)ELISA的开发
依据使用4G8捕获抗体及生物素化的抗Aβ11(pE)检测抗体的夹心ELISA的Aβ11(pE)ELISA性能示出微弱或不一致的信号(结果未示出)。肽Aβ(pE11-30)以及Aβ(pE11-40)的检测仅示出微弱信号。两种Aβ肽均是非常疏水性的，为了在肽贮存期间避免肽粘附在容器壁上，所述肽溶液在立即用于ELISA之前制备(蒸发HFIP及碱溶解)，但是检测到也无信号。可能的问题可以是由于捕获4G8抗体与表位Aβ(17-24)之间及检测抗体与表位Aβ(pE11-15)之间的位阻所致。为了直接检测4G8与抗Aβ11(pE)抗体的抗体反应性，进行具有吸附的Aβ肽的直接ELISA。在即将之前，将HFIP蒸发，然后将Aβ肽溶解于NaOH(10分钟，室温)中。强疏水性Aβ(pE11-30)肽应直接在微平板中立即在PBS中稀释以保证在稀释期间所述肽不粘附在聚丙烯小瓶上。在图22和23中，示出使用生物素化的抗i Aβ11(pE)抗体和4G8的ELISA信号。抗Aβ11(pE)抗体示出Aβ(pE11-30)浓度依赖性方式的强ELISA信号及在纳米范围检测的Aβ肽。由此得出结论，生物素化的抗Aβ11(pE)抗体识别所述肽，适合用作检测抗体。
相比之下，生物素化的4G8抗体仅示出Aβ(pE11-30)浓度依赖性方式的微弱信号。
与克隆13对比，在相同条件下4G8的信号低5倍。通常地，可商购的4G8示出与Aβ蛋白质的良好的结合性质(Schupf et al.,Proc Natl Acad Sci US A.2008Sep16;105(37):14052-7)。然而，在Aβ(pE11-30)情况中，4G8仅示出微弱结合信号。抗体4G8是通过用相应于Aβ肽的前24个氨基酸的合成肽免疫而产生，只识别Aβ肽的17-24位氨基酸序列(Kim et al.,1988)。因此，4G8识别除了Aβ(pE11-30)肽之外的其它结构。随后检测到低信号的原因是使用的肽的结构。从这个结果中可以推断4G8抗体在Aβ11(pE)ELISA中不适合用作捕获抗体，这说明了仅检测到较低或不一致的信号的原因。今后应检测用作为捕获抗体的来自IBL公司的抗人Aβ(35-40)小鼠IgG mAb预先包被的平板，从而应使用标准肽Aβ(pE11-40)。
2.5.3用Aβ11(pE)抗体免疫染色
用抗Aβ11(pE)抗体(克隆13)对来自AD患者和转基因APP/PS1小鼠的脑切片进行免疫染色。人AD病例1-3的IHC图片在图24中示出。
AD病例1、2和3的染色切片表明Aβ11(pE)是在胞外沉积的，由此在AD病例1中的斑块核心区主要是Aβ11(pE)染色。由此推断Aβ11(pE)可以在斑块的核心区以及周围区染色。此外，在AD病例3中清晰可见胞内沉积。AD病例3的放大图(右侧底部方块)示出Aβ11(pE)沉积直接在细胞核旁边染色，观测为半圆形。令人瞩目的是检测到比Aβ3(pE)更多的胞内Aβ11(pE)染色。
结果表明单克隆抗体克隆13特异性识别胞内和胞外Aβ11(pE)沉积。
除了人脑切片，也检测了APP/PS1转基因小鼠脑切片的Aβ11(pE)沉积情况(见图25)。
小鼠脑IHC图像示出Aβ11(pE)肽的血管沉积。在小鼠脑内沿着血管清晰可见的褐色染色旁边，也可见胞内Aβ11(pE)沉积。相比之下，在人脑切片未见血管沉积。
总之，结果示出Aβ11(pE)沉积已经可以在神经元内、神经元外以及血管检测到。克隆13示出针对焦谷氨酸肽的极佳反应性，可用于免疫染色。迄今为止，还未知在人AD脑中发生Aβ11(pE)细胞内和细胞间的沉积的根源。Aβ肽作为斑块的沉积是AD的最突出的病理学特征之一，认为其与AD中痴呆的发病机制密切相关。所述斑块的成分目前还未完全了解。
2.6AD患者和健康对照者体内自身抗体水平
在本研究中，研究针对Aβ(pE11-x)表位的IgG、IgM、IgA、总免疫球蛋白Ig、IgG2和IgG3类别和亚类的自身抗体水平。目的是发现潜在的诊断性AD生物标记，从而分析AD患者的Aβ自身抗体之间的可能的相关性。因此，研究源自临床诊断AD患者和源自健康对照组的血浆样品。来自AD患者的13个血浆样品和30个健康对照者的血浆样品得自研究PBD-0316(T0+6个月)。对于这个分析，使用在本研究中建立的自身-Ig-ELISA(见章节1.4.2.1)。结果在图26和27中示出。
在图26和图27中，示出Ig(总免疫球蛋白)、IgG、IgG2、IgG3、IgM和IgA的抗Aβ11(pE)抗体的浓度。除了IgG2之外，与对照组相比在AD患者中所有分析的抗Aβ11(pE)抗体类别和亚类的平均水平均增加。抗Aβ11(pE)自身抗体的结果示出AD患者与健康对照者之间无显著差异，在血浆对照组和AD患者中自身抗体水平明显波动。
3.保藏
产生特异性识别AβN11pE-x的单克隆抗体。目前表达相应单克隆抗体的杂交瘤细胞系13-11-6已经根据布达佩斯条约保藏，可在DeutscheSammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen(German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures)GmbH,DSMZ,Inhoffenstrasse7B,38124Braunschweig,Germany获得，保藏日为2010年12月14日，保藏号为：
(克隆13-11-6):DSM ACC3100
已经证实抗体对其各自靶序列的特异性。对于AβN11pE-x，可以鉴别高亲和性抗体克隆，其在ELISA中提供强信号，提供在低pg范围预期的检测限制。
Figure IDA0000382775640000011
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Figure IDA0000382775640000111

Claims (35)

1.抗体，特征在于其结合AβpGlu(11)肽或其变体，优选以高亲和性结合。
2.权利要求1的抗体，其中所述高亲和性是指解离常数(KD)值为10-7M或者更好。
3.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
4.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体轻链的可变部分具有SEQ ID NO:51的核苷酸序列或者SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
5.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体重链的可变部分具有SEQ ID NO:53的核苷酸序列或者SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
6.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体轻链的可变部分具有SEQ ID NO:51的核苷酸序列或者SEQ ID NO:52的氨基酸序列，及其中所述抗体重链的可变部分具有SEQ ID NO:53的核苷酸序列或者SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
7.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体是Aβ13-11-6(保藏号DSM ACC3100)或者其功能变体。
8.权利要求7的抗体，其中所述抗体是Aβ13-11-6(保藏号DSM ACC3100)。
9.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体是保留高亲和性的人源化或嵌合抗体、或者抗体片段。
10.前述任一项的抗体，用于检测AβpGlu(11)肽或其变体。
11.权利要求10的抗体，其中所述变体选自：
pGlu-Aβ11-38
pGlu-Aβ11-40
pGlu-Aβ11-42，及
pGlu-Aβ11-x变体
其中x是18-42之间的整数，更优选是30-42之间的整数。
12.前述任一项权利要求的抗体，其是人抗体。
13.前述任一项权利要求的抗体，其是保留高亲和性的双抗体或者单链抗体。
14.前述任一项权利要求的抗体，其结合由权利要求11定义的抗体所结合的表位。
15.前述任一项权利要求的抗体，其具有权利要求11定义的抗体的互补决定区。
16.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体的轻链的可变部分具有一或多个如一个、两个或三个互补决定区，所述互补决定区与具有SEQ IDNO:51的核苷酸序列或SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链可变部分的抗体的一或多个如一个、两个或三个互补决定区相同。
17.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体的轻链的可变部分具有一或多个如一个、两个或三个互补决定区，所述互补决定区与具有SEQ IDNO:53的核苷酸序列或SEQ ID NO:54的氨基酸序列的重链可变部分的抗体的一或多个如一个、两个或三个互补决定区相同。
18.前述任一项权利要求的抗体，其是经标记的。
19.前述任一项权利要求的抗体，其被固定化在固相上。
20.可得自杂交瘤细胞系DSM ACC3100的抗体。
21.包含如前述任何权利要求定义的抗体的组合物。
22.权利要求21的组合物，用于治疗、预防或者延缓淀粉状变性。
23.权利要求21或22的组合物，其中所述淀粉状变性是神经变性疾病，所述神经变性疾病选自：唐氏综合征中的神经变性、轻度认知损伤和阿尔兹海默病。
24.权利要求21或22的组合物，其中所述淀粉状变性是散发性阿尔兹海默病或者家族性阿尔兹海默痴呆。
25.权利要求24的组合物，其中所述家族性阿尔兹海默痴呆是家族性英国型痴呆或者家族性丹麦型痴呆。
26.杂交瘤细胞系DSM ACC3100。
27.权利要求1-20任一项的抗体或者权利要求21-25任一项的组合物在诊断或治疗方法中的应用。
28.权利要求27的应用，其用于诊断淀粉状蛋白相关疾病或病症。
29.权利要求28的应用，其中所述淀粉状变性是神经变性疾病，所述神经变性疾病选自唐氏综合征中的神经变性、轻度认知损伤和阿尔兹海默病。
30.权利要求28的应用，其中所述淀粉状变性是散发性阿尔兹海默病或者家族性阿尔兹海默痴呆。
31.权利要求28的应用，其中所述家族性阿尔兹海默痴呆是家族性英国型痴呆或者家族性丹麦型痴呆。
32.用于诊断淀粉状蛋白相关疾病或病症、特别是阿尔兹海默病的体外诊断方法，包括如下步骤：
将权利要求1-20任一项的抗体与来自怀疑患有所述疾病或病症的对象的样品接触，及
检测所述抗体与来自所述样品的AβpGlu(11)蛋白的结合。
33.诊断试剂盒，包含权利要求1-20任一项的抗体及使用说明书，及任选存在的-(a)进一步的生物活性物质。
34.权利要求33的诊断试剂盒，其中所述进一步的生物物质是谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂。
35.选自SEQ ID NO:26至50的寡核苷酸。
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