JP2014509860A - 診断用抗体アッセイ - Google Patents

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Abstract

本発明は、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病、及び関連態様の診断のための新規の診断アッセイに関する。特に、モノクローナル抗体及び抗体アッセイが提供される。
【選択図】なし

Description

本発明は、アミロイドタンパク質と関連する障害及び異常の群である、アミロイドーシス、例えば、アルツハイマー病及び関連態様の診断のための新規の診断アッセイに関する。特に、抗体アッセイが提供される。
アミロイドーシスは、単独の疾患実体ではなく、むしろ1以上の器官又は体組織に蓄積する、アミロイドと呼ばれるろう状のデンプン様タンパク質の細胞外組織沈着物によって特徴付けられる多様な進行性疾患過程群である。アミロイド沈着物が蓄積するにつれて、それらは器官又は体組織の正常な機能を妨害し始める。少なくとも15種の異なるタイプのアミロイドーシスが存在する。主な形態は、既知の前駆状態のない原発性アミロイドーシス、何らかの他の状態に続く続発性アミロイドーシス、及び遺伝性アミロイドーシスである。
続発性アミロイドーシスは、結核、家族性地中海熱と呼ばれる細菌感染症、骨感染症(骨髄炎)、関節リウマチ、小腸の炎症(肉芽腫性回腸炎)、ホジキン病、及びハンセン病などの、慢性感染症又は炎症疾患時に生じる。
アミロイド沈着物は、正常な血清アミロイドP(SAP)に関連する糖タンパク質であるアミロイドP(五角形)成分(AP)、及び結合組織の複合糖質である硫酸化グリコサミノグリカン(GAG)を含む。アミロイドタンパク質原線維は、アミロイド物質の約90％を占めるが、これは、いくつかの異なるタイプのタンパク質の1つを含む。これらのタンパク質は、いわゆる「β-プリーツ」シート原線維へのフォールディングが可能であり、これは、アミロイドタンパク質の独特な染色特性を生じるコンゴレッドの結合部位を示す独特なタンパク質立体形状である。
多くの加齢疾患は、アミロイド様タンパク質に基づくか又はそれと関連しており、かつ一つには、発病、及び疾患進行の一因となるアミロイド又はアミロイド様物質の細胞外沈着物の集積を特徴とする。このような疾患としては、神経学的障害、例えば、軽度認知障害(MCI)、例えば、孤発性アルツハイマー病(SAD)又は家族性イギリス型認知症(FBD)及び家族性デンマーク型認知症(FDD)のような家族性アルツハイマー型認知症(FAD)のようなアルツハイマー病(AD)、ダウン症の神経変性、レヴィー小体型認知症、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血(オランダ型);グアム島パーキンソン認知症複合が挙げられるが、これらに限定されない。アミロイド様タンパク質に基づくか又はそれと関連する他の疾患は、進行性核上麻痺、多発性硬化症;クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病、HIV関連認知症、ALS(筋萎縮性側索硬化症)、成人発症型糖尿病;老人性心アミロイドーシス;内分泌腫瘍、及び黄斑変性症を含むその他のものである。
これらの疾患の病因は多様であり得るが、それらの特徴的沈着物は、多くの共通の分子構成成分を含むことが多い。これは、かなりの程度まで、炎症促進性経路の局所的活性化に起因し得、それにより、活性化された補体成分、急性期反応物質、免疫調節因子、及び他の炎症メディエーターの同時沈着が生じる(McGeerらの文献、Tohoku J Exp Med. 174(3):269-277(1994))。
最近、累積証拠により、アルツハイマー病におけるN-末端修飾Aβペプチド変異体の関与が立証されている。狙い撃ち生検(aiming biopsy)により、アルツハイマー患者の脳だけではなく、罹患していない個体の老人斑でも、Aβ1-40及びAβ1-42の存在が示されている。しかしながら、N-末端切断型及びpyroGlu修飾型AβN3pE-40/AβN3pE-42は、ほぼ例外なく、アルツハイマー病患者の斑内に染み付いており、そのため、このAβ変異体が適格な診断マーカー及び潜在的な創薬標的となっている。
現在、いくつかの商業的製造業者が、低ピコグラム(pg)範囲でのAβ1-40/1-42及びAβN3pE-40/AβN3pE-42の検出を可能にするELISAキットを提供している。
アルツハイマー病(AD)患者の脳は、神経原線維変化の存在によって、及び新皮質脳構造体におけるAβペプチドの沈着物によって形態学的に特徴付けられる(Selkoe, D.J.及びSchenk, D.の文献、アルツハイマー病:分子的理解は、アミロイドに基づく治療法を予測する(Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics.), Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 545-584(2003))。Aβペプチドは、β-及びγ-セクレターゼによる連続切断の後、アミロイド前駆体タンパク質(APP)から遊離される。γ-セクレターゼ切断は、Aβ1-40及びAβ1-42ペプチドの生成をもたらし、これらのペプチドは、そのC-末端が異なり、かつ凝集、原線維形成、及び神経毒性の異なる潜在能力を示す(Shin, R. W.らの文献、アミロイドβ-タンパク質(Aβ)1-40は、ラット脳内のアルツハイマー病アミロイド原線維の実験的形成に寄与するが、Aβ1-42は寄与しない(Amyloid beta-protein (Abeta) 1-40 but not Abeta 1-42 contributes to the experimental formation of Alzheimer disease amyloid fibrils in rat brain.), J. Neurosci. 17, 8187-8193(1997); Iwatsubo, T.らの文献、末端特異的Aβモノクローナルを用いた老人斑のAβ42(43)及びAβ40の可視化:最初に沈着する種がAβ42(43)である証拠(Visualization of Abeta 42 (43) and Abeta 40 in senile plaques with end-specific Abeta monoclonals: evidence that an initially deposited species is Abeta 42(43).), Neuron 13, 45-53(1994); Iwatsubo, T., Mann, D.M., Odaka, A., Suzuki, N. 及びIhara, Y.らの文献、アミロイドβタンパク質(Aβ)沈着:ダウン症において、Aβ42(43)はAβ40よりも前に現われる(Amyloid beta protein (Abeta) deposition: Abeta 42(43) precedes Abeta 40 in Down syndrome.), Ann. Neurol. 37, 294-299(1995); Hardy, J.A.及びHiggins, G.A.の文献、アルツハイマー病:アミロイドカスケード仮説(Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis.), Science 256, 184-185(1992); Roβner, S., Ueberham, U., Schliebs, R., Perez-Polo, J.R.及びBigl, V.の文献、コリン作動性機構及び神経栄養因子受容体シグナル伝達によるアミロイド前駆体タンパク質代謝の調節(The regulation of amyloid precursor protein metabolism by cholinergic mechanisms and neurotrophin receptor signaling.), Prog. Neurobiol. 56, 541-569(1998))。
びまん性斑に沈着したAβペプチドの大部分は、N-末端が切断又は修飾されている。Piccini及びSaidoの研究は、老人斑及び血管沈着物のコア構造が50％のピログルタメート(pyroGlu)修飾ペプチドからなることを示した(Picciniらの文献、J Biol Chem. 2005 Oct 7;280(40):34186-92; Saidoらの文献、Neuron. 1995 Feb; 14(2): 457-66)。pyroGlu修飾ペプチドは、他のAβ種よりも細胞毒性が強く、アミノペプチダーゼに対して安定である(Russoらの文献、J Neurochem. 2002 Sep;82(6):1480-9)。したがって、pyroGlu Aβ種は、半減期がより長く、それにより、これらの種の蓄積、並びに神経毒性オリゴマー及び凝集体の形成が有利になる(Saido, Neurobiol Aging. 1998 Jan-Feb;19(1 Suppl):S69-75)。グルタメートからpyroGluへの環化により、荷電アミノ酸が消失し、それにより、ペプチドの溶解性が強く低下し、凝集傾向の増加が生じる。インビトロ研究により、例えば、Aβ3(pE)の初期のオリゴマー化が、非修飾ペプチドと比較して、はるかにより速いことが示されている(Schillingらの文献、Biochemistry. 2006 Oct 17;45(41):12393-9)。
本出願人らによって行なわれた研究により、Aβ11(pE)が、Aβ3(pE)よりも高い凝集力及びはるかに低い溶解性を有することが示されている。Naslund J.らのグループ(Proc. Natl. Acad. Sci. Neurobiology, Vol. 91 pp.8378-8382)は、マススペクトロメトリーによって、孤発性ADの脳において最も顕著な切断型変異体AβpE(11-42)を検出した。これまで、Naslund J.らの研究は、斑におけるAβ11(pE)の沈着を調べた数少ない研究のうちの1つである。
あらゆる事実から、pyroGlu Aβが原線維形成の初期化の一種の萌芽であることが示唆されている。新たな研究(Picciniらの文献、2005, 前掲)において、斑沈着を有するが、AD特異的な病変を有さないボランティアを、Aβ種の特徴的な量によってAD患者と区別することができた。それに関して、N-末端切断型のpyroGlu修飾ペプチドの量は、AD患者の脳で有意により多かった。
Aβ-ペプチドの位置3又は11でのpyroGluの翻訳後形成は、N-末端グルタメート残基の環化を示唆する。グルタミニルシクラーゼ(QC)は、pyroGluペプチドの生成において重要な役割を果たす。QCは、植物界及び動物界に広く見られ、とりわけ、ペプチドホルモンの成熟に関与する。アンモニアの放出によるグルタミンのpyroGluへの環化と水の放出によるグルタメートのpyroGluへの環化は両方とも、QCによって行なわれる。グルタミン環化と対照的に、グルタメート環化は、自然には起こらない。QCは、グルタメートからpyroGluへの効率的な(望ましくない)副反応を触媒する。生成したpyroGlu残基は、タンパク質をタンパク質分解から保護する。QCがpyroGlu Aβの生成において重要な役割を果たすことを示すいくつかの参考文献がある:
1.いくつかの研究において、QCがAβのN-末端におけるグルタメートからのpyroGlu残基の形成を触媒することが示された(Cynisらの文献、Biochim Biophys Acta. 2006 Oct;1764(10):1618-25、Schillingらの文献、FEBS Lett. 2004 Apr 9;563(1-3):191-6);
2.AβペプチドとQCは両方とも、海馬及び皮質で大量に発現されている。これらの脳領域は、特に、ADのリスクが高い(Pohlらの文献、Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Nov 15;88(22):10059-63、Selkoeの文献、Physiol Rev. 2001 Apr;81(2):741-66);
3.APPは、形質膜への輸送中にβ-セクレターゼによって切断され、それにより、遊離グルタメート残基を有するAβのN-末端が生成させることができる(Greenfieldらの文献、Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Jan 19;96(2):742-7)。分泌小胞において、プロセシングされたAPPとQCの共局在が明らかにされた。したがって、小胞の弱酸環境において、グルタメート残基からピログルタメートへの加速的修飾が起こり得る。
4.また、他の神経変性疾患(neurodegeneratuve disease)(家族性デンマーク型(FDD)又はイギリス型認知症(FBD))は、N-末端pyroGlu修飾ペプチド、例えば、Bri2と関連しているが、対照的に、それらは、その一次構造の点では、Aβと関連していない(Vidal R.らの文献、1999 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 4920-4925)。
QCによって触媒されるpyroGlu Aβの形成は、神経変性疾患の発症及び進行に関与する可能性がある。N-末端修飾アミロイドペプチドの形成は、明らかに、Aβ凝集の過程における根本的要因であり、疾患の開始となり得る。QCの阻害によるpyroGlu Aβ形成の抑制は、治療アプローチを代表するものとなり得る。QC阻害剤ならば、pyroGlu Aβの形成を予防し、脳のピログルタメートAβの濃度を低下させ、したがって、Aβ-ペプチドのオリゴマー化を遅延させることができるであろう。Schillingらは、QC発現がAD患者の皮質で上方調節され、pyroGlu修飾Aβ-ペプチドの出現と相関したことを示している。QC阻害剤の経口適用は、ADの2つの異なるトランスジェニックマウスモデルにおいて、及び新しいショウジョウバエ(Drosophila)モデルにおいて、ピログルタメート修飾AβpE(3-42)レベルの低下をもたらした(Schillingらの文献、2008 Biol. Chem.(389), 983-991)。
レヴィー小体型認知症(LBD)は、65歳を超える人々に生じることがあり、通常、認知(思考)障害の症状及び異常な行動変化を引き起こす神経変性障害である。症状としては、認知障害、神経学的徴候、睡眠障害、及び自律神経障害を挙げることができる。認知障害は、大抵の症例において、LBDの主症状である。患者は、進行性に悪化する錯乱に繰り返し見舞われる。認識能のゆらぎは、多くの場合、注意及び警戒の程度の変化を伴う。認知障害及び思考のゆらぎは、数分間、数時間、又は数日間にわたって変化し得る。レヴィー小体は、リン酸化された及びリン酸化されていないニューロフィラメントタンパク質から形成され;それらは、シナプスタンパク質のα-シヌクレイン、及び損傷タンパク質又は異常タンパク質の排除に関与するユビキチンを含む。レヴィー小体に加えて、神経細胞の細胞突起における封入体であるレヴィー神経突起も存在し得る。アミロイド斑は、DLBに罹患した患者の脳で形成され得るが、それらは、アルツハイマー病患者で見られるよりも数が少ない傾向にある。ADの他の顕微病理学的特徴である神経原線維変化は、LBDの主要な特徴ではないが、アミロイド斑に加えて、高い頻度で存在する。
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、上位及び下位運動ニューロンの変性を特徴とする。一部のALS患者において、認知症又は失語症が存在し得る(ALS-D)。認知症は、最も一般的には、前頭側頭型認知症(FTD)であり、これらの症例の多くは、歯状回、並びに前頭葉及び側頭葉表層のニューロンに、ユビキチン陽性、タウ陰性の封入体を有する。
封入体筋炎(IBM)は、通常50歳を超える人々に見られる、手足が不自由になる疾患であり、この疾患では、筋繊維が炎症を発症して、萎縮し始めるが、脳は危害を受けず、患者はその完全な知力を保持している。アミロイド-βタンパク質の生成に関与する2つの酵素が、高齢者のこの最も一般的な進行性筋疾患を有する患者の筋細胞の内部で増加することが分かった。高齢者では、アミロイド-βも増加している。
アミロイド様タンパク質の蓄積及び沈着物に基づくか又はそれらと関連する別の疾患は、黄斑変性症である。黄斑変性症は、網膜(光感受性細胞が視覚シグナルを脳に送る眼底の紙のように薄い組織)の中心領域である黄斑の劣化を引き起こす一般的な眼疾患である。はっきりした明瞭な「直進性」の視覚は、黄斑によって処理される。黄斑の損傷は、盲点の発生及び不鮮明な又は歪んだ視覚をもたらす。加齢黄斑変性症(AMD)は、米国における視力障害の大きな原因であり、また、65歳を超える人々にとって、それは、白色人種における法的盲の主因である。40歳以上の約180万人の米国人が進行期AMDを有し、中間期AMDを有する別の730万人は、失明のリスクがかなりある。米国政府は、2020年までに、進行期AMDの人が290万人に達すると推定している。AMDの犠牲者は、この失明状態の原因及び治療についていかに何も分かっていないかということを知って驚き、苛立つことが多い。
2つの形態の黄斑変性症:乾燥型黄斑変性症及び湿潤型黄斑変性症が存在する。黄斑の細胞が徐々に崩壊し始める乾燥型は、黄斑変性症症例の85％で診断される。通常、両目が乾燥型AMDに冒されるが、一方の目が視力を失っても、もう一方の目は冒されずにいることがある。網膜下の黄色い沈着物であるドルーゼンは、乾燥型AMDの一般的な初期徴候である。ドルーゼンの数又はサイズが増大するにつれて、進行期乾燥型AMD又は湿潤型AMDが発症するリスクは増大する。乾燥型AMDが、本疾患の湿潤型に変わることなく進行し、視力喪失を引き起こすことがあり得るが;初期の乾燥型AMDが突然湿潤型に変わることもあり得る。
湿潤型は、本症例のわずか15パーセントを占めるに過ぎないが、失明の90パーセントを生じさせ、進行期AMDと考えられる(湿潤型AMDの初期段階も中間段階も存在しない)。湿潤型AMDに先立って、本疾患の乾燥型が必ず生じる。乾燥型が悪化するにつれて、黄斑の裏側に異常な血管成長を有し始める患者もいる。これらの血管は、非常に脆く、体液及び血液を漏出し(それ故、「湿潤型」黄斑変性症)、黄斑に急速な損傷を引き起こす。
乾燥型のAMDは、多くの場合、最初にわずかな目のかすみを生じさせる。その後、特に視覚中心がかすみ始め、この領域は疾患が進行するにつれて大きく成長する。一方の目のみが冒されている場合は、症状に気付かないことがある。湿潤型AMDでは、直線が波状に見えることがあり、中心視力の喪失が急速に起こり得る。
黄斑変性症の診断は、通常、散瞳検査と、視力検査と、AMDの診断を助ける眼底検査と呼ばれる手順を用いた眼底の観察とを伴い、湿潤型AMDが疑われる場合は、蛍光眼底血管造影を実施することもできる。乾燥型AMDが進行期に達している場合、今のところ、視力喪失を予防する治療はない。しかしながら、特定の高用量処方の抗酸化剤及び亜鉛は、中間期AMDが進行期に進むのを遅延させるか又は予防することができる。Macugen(登録商標)(ペグアプタニブナトリウム注射液)、レーザー光凝固術、及び光線力学的療法は、黄斑における異常な血管成長及び出血を制御することができ、湿潤型AMDを有する一部の人々には有益であるが;既に喪失した視力がこれらの技術によって回復することはない。視力を既に喪失している場合、生活の質を改善するのに役立ち得る低視力補助器具が存在する。
加齢黄斑変性症(AMD)の最も初期の徴候の1つは、網膜色素上皮(RPE)の基底膜とブルッフ膜(BM)との間での、ドルーゼンとして知られる細胞外沈着物の蓄積である。Andersonらによって行われた最近の研究により、ドルーゼンがアミロイドβを含有することが確認された。(Experimental Eye Research 78(2004) 243-256)。
本発明の目的は、生体試料、例えば、体液(liquor)又は血清試料、好ましくは、血清試料中の、Aβ変異体、特に、AβpGlu(11-x)ペプチドの定量的測定を可能にする高感度でかつ同時に堅牢な検出技術を確立することである。これは、血液中のAβペプチドの存在量が少ないことを考慮すると、途方もない挑戦である。しかしながら、そのような検出技術を利用可能にすることは、薬物スクリーニングプログラムで小分子阻害剤の効力を検討するための前提条件である。
本発明は、単量体、二量体、三量体など、もしくは重合体の形態で、凝集体、線維、フィラメントの形態で、又は凝縮した斑の形態で、抗体に提示され得る、様々なβ-アミロイド抗原、特に、AβpGlu(11-x)ペプチド由来の特異的エピトープを特異的に認識し、それに結合する能力を有する、部分的に又は完全にヒト化された抗体及びその断片を含む、キメラ抗体及びその断片を含む、極めて特異的かつ極めて有効な抗体を含む、新規の方法及び組成物を提供する。本発明の教示によって可能とされる抗体は、続発性アミロイドーシス及び加齢関連アミロイドーシスを含む、アミロイド斑形成と関連する疾患及び障害の群であるアミロイドーシスの診断に特に有用であり、これには、いくつか例を挙げると、神経学的障害、例えば、アルツハイマー病(AD)、レヴィー小体型認知症、ダウン症、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血(オランダ型);グアム島パーキンソン認知症複合;並びにアミロイド様タンパク質に基づくか又はそれと関連する他の疾患、例えば、進行性核上麻痺、多発性硬化症;クロイツフェルト・ヤコブ病、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血(オランダ型)、パーキンソン病、HIV関連認知症、ALS(筋萎縮性側索硬化症)、成人発症型糖尿病;老人性心アミロイドーシス;内分泌腫瘍、及び黄斑変性症を含むその他のものが含まれるが、これらに限定されない。
(発明の概要)
本発明は特に、AβpGlu(11-x)ペプチドに高い親和性で結合することを特徴とする、抗体又はその変異体に関する。該高い親和性は、本発明との関連において、10-7M以下のKD値、好ましくは、10-8M以下のKD値、さらにより好ましくは、10-9M〜10-12MのKD値の親和性を意味する。
特に、本抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体であり、以後クローン13と呼ばれる、Aβ13-11-6から選択される。
本発明の抗体は、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病を検出する診断法において特に有用である。
(図面の説明)
抗Aβ11(pE)抗体のスクリーニング 細胞融合及びHAT培地選択後の26種のハイブリドーマ細胞上清を解析した。これらのmAbを、配列EVHHを部分的に含む様々な修飾Aβペプチドに対して試験した。灰色で表示されているペプチドAβpE(11-23)(スポット10を参照)は、N-末端にピログルタメートを有する標的配列(pEVHH)を含む。各々のメンブレンにペプチド1-16をスポットした。枠で囲ったメンブレンのハイブリドーマ細胞(n＝9)を再クローニング用に選択した。実線で囲ったメンブレンの細胞のみが再クローニング後に安定であった。 Aβ(pE11-30)によるCM5チップのコーティング センサーチップ表面をEDC/NHSにより10μl/分で8分間活性化した。アミンカップリングによるリガンドの固定化を: A) 10mM KH2PO4、pH 6中の10μg/ml Aβ(pE11-30)、及びB) 10mM酢酸ナトリウム、pH 5中の50μg/ml Aβ(pE11-30)を用いて行なった。ペプチドを10μl/分で5分間(A)及び20分間(B)注入した。その後、反応基(遊離エステル)を1Mエタノールアミン、pH 8.5により10μl/分で10分間不活化した。固定化されなかったペプチドを0.1M HCl(3×10μl)の注入によって除去し、その後、チップをランニングバッファーで一晩すすいだ。最終的に、シグナルは1000RUであった。リガンドの固定化をBiacore 3000で行なった。 抗Aβ11(pE)抗体のSPR測定 クローン13由来のハイブリドーマ細胞培養上清のBiacore 3000による解析。1000RUのAβ(pE11-30)が固定化されたCM5チップの使用(フローセル4)。図示されているのは、Aβ(pE11-30)に対する結合の経時的なリアルタイムプロットである。ランニングバッファー中で1:100の試料希釈、及び30μl/分で300秒にわたる注入、及び300の解離時間の記録。コーティングされていないフローセルからのシグナルを、Aβが固定化されたフローセル4における測定シグナルから差し引いた。 抗Aβ11(pE)抗体の曲線 0.04〜10μg/mlの濃度の精製抗体をBiacore 3000でのSPRにより測定した。曲線の線形範囲は、0.040μg/ml〜最大1.25μg/ml抗体である。ランニングバッファー中での抗体希釈及び30μl/分で300秒にわたる注入。各々のSPRシグナルを解離期の最後から選択した。コーティングされていないフローセルからのシグナルを、Aβが固定化されたフローセルにおける測定シグナルから差し引いた。 抗Aβ11(pE)抗体の標準曲線 既知濃度の精製抗体をBiacore 3000でのSPRにより測定した。0.040〜最大1.25μg/ml抗体の濃度範囲。線形回帰方程式: y＝3033.7x＋50.099(R2＝0.991)。各々のSPRシグナルを解離期の最後から選択した。コーティングされていないフローセルからのシグナルを、Aβが固定化されたフローセルにおける測定シグナルから差し引いた。 細胞数及び産生抗Aβ11(pE)抗体濃度の比較 使用直前に2mM L-グルタミン及び50μM β-メルカプトエタノールを補充した、血清含有培地及び無血清培地(Hybridoma SFM)中で、37℃及び5％CO2で培養されたクローン13(細胞継代数19)のハイブリドーマ細胞。細胞を、約10日間、振盪フラスコ中で培養し、定期的に試料を採取して、細胞成長(A)及び抗体濃度(B)をSPRにより決定した。 培養時間依存的な比成長速度μ 使用直前に2mM L-グルタミン及び50μM β-メルカプトエタノールを補充した、血清含有培地及び無血清培地(Hybridoma SFM)中で、37℃及び5％CO2で培養されたクローン13(細胞継代数19)のハイブリドーマ細胞。データは、振盪フラスコ中での10日間にわたる成長曲線に基づく。 抗Aβ11(pE)の濃度を生細胞の積分に対してプロットした 使用直前に2mM L-グルタミン及び50μM β-メルカプトエタノールを補充した、血清含有培地及び無血清培地(Hybridoma SFM)中で、37℃及び5％CO2で培養されたハイブリドーマ細胞クローン13(細胞継代数19)。データは、振盪フラスコ中での10日間にわたる成長曲線に基づく。生細胞の積分は、時間依存的細胞数のプロットから得られ、それにより、5、24、48、72時間でのデータ点が積分された。抗体生産性率は、曲線の傾きから得られる(線形関数を参照)。R2＝決定係数。 抗Aβ11(pE)精製のクロマトグラム AktaTMPurifierでプロテインG HPカラム(V＝5ml)を用いて1800mlのハイブリドーマ(クローン13)細胞培養上清を精製した。このカラムを4℃で冷却し、1×結合バッファー(20mM Na2HPO4、pH 7.0)で平衡化した。細胞培養上清の38400×g、4℃、30分間の遠心分離、2×結合バッファーとの1:1混合。AktaTMPurifiers P-950ポンプの使用。1.5ml/分での培養上清(氷冷したもの)の適用。A)280nmでの吸光度及び精製プロセス時の伝導度を示すクロマトグラム。0〜2M NaCl勾配で5カラム体積かけて洗浄し、その後、1×結合バッファーで再び洗浄する。0〜2M KSCN勾配(pH 7.0)で5カラム体積かけて2.5ml/分の逆流で溶出。B)0〜2M KSCN勾配及び溶出画分V＝20mlの高拡大図。示された体積は技術システムフローであり、実際の体積ではない。 抗Aβ11(pE)抗体(クローン13)精製のSDS-ゲル電気泳動図 プレステインタンパク質ラダー:10〜250kDa、Fermentas社。解析された精製画分:スロット1; 6:プロテインG精製前、スロット2; 7:フロースルー、スロット3; 8:洗浄画分、スロット4; 9:KSCNでの溶出、30μg/ml抗体を適用した、スロット5:非還元試料バッファー。抗体精製は、プロテインG HPカラム、及び0〜2M KSCN pH 7.0での溶出によって行なった。還元試料を、β-メルカプトエタノールを含むSDSバッファー(Roti(登録商標)-Load 1、BioRad社)に1:3で希釈し、10分間、95℃でインキュベートした。非還元試料を、β-メルカプトエタノールを含まない試料バッファーに1:4で希釈し、30分間、30℃で振盪させた。SDS-PAGE(12％、1mm SDS-ゲル)の分離時間:100Vで10分、200Vで35分。クマシーブリリアントブルー-G250で染色し、10％酢酸で脱染したゲル。 抗Aβ11(pE)抗体のUVスペクトル ハイブリドーマ細胞培養上清(クローン13)由来のプロテインGカラム精製抗体の使用。240nm〜339nmで測定したスペクトル。透析バッファー(D-PBS、2mM EDTA、pH 7.13)中での1:20希釈。プローブの厚さは1cmであり、240〜339nmのUVスペクトルをUV-分光計UV1で測定した。 抗Aβ11(pE)抗体のUVスペクトル 抗体希釈: D-PBS、2mM EDTA中で1:10。ビオチン化の前後に、240nm〜339nmのUVスペクトルをUV-分光計UV1で測定した。プローブの厚さは1cmであった。 抗Aβ11(pE)抗体のCDスペクトル ビオチン化及び非ビオチン化抗体のスペクトルを、20℃でJasco J-710分光旋光計で190〜260nmで測定した。抗体濃度は、10mM NaH2PO4(pH 7.1)中、0.13mg/mlであった。20回の蓄積、1秒の積分、及び1mmのプローブ厚での測定。 抗Aβ11(pE)抗体の熱安定性 CDスペクトルを、20℃〜最大80℃の温度でJasco J-710分光旋光計で190〜260nmで測定した。抗体濃度は、10mM NaH2PO4(pH 7.14)中、0.13mg/mlであった。5℃の間隔、10回の蓄積、30K/hの発熱率、1秒の積分、及び1mmのプローブ厚での測定。各測定の前に、温度を180秒間平衡化した。 ビオチン化抗Aβ11(pE)抗体の熱安定性 CDスペクトルを、20℃〜最大80℃の温度でJasco J-710分光旋光計で190〜260nmで測定した。抗体濃度は、10mM NaH2PO4(pH 7.14)中、0.13mg/mlであった。5℃の間隔、30K/hの発熱率、10回の蓄積、1秒の積分、及び1mmのプローブ厚での測定。各測定の前に、温度を180秒間平衡化した。 Aβ(pE11-18)-PEGの抗Aβ11(pE)抗体(クローン13)に対するITC滴定曲線 ITC MicroCalorimeter(MicroCal)の使用。実験は、20℃での、ITCバッファー、pH 7.1中、各々81.78μM Aβ(pE11-18)-PEGの30回の注入(1×2μl及び29×10μl)からなり、次の注入との間を4分間隔とした(黒線)。上のトレースは、Aβ(pE11-18)-PEGのITCバッファーへの希釈熱を示す。下のトレースは、ITCバッファー、pH 7.1中に5.13μMの抗体を含む試料セル(体積＝1.405ml)へのAβ(pE11-18)-PEGの注入を示す。赤線は、ベースラインである。 Aβ(pE11-18)-PEGの抗Aβ11(pE)抗体(クローン13)に対するITC結合曲線 抗体をプロテインGセファロースで精製し、KSCN勾配(pH 7.0)で溶出させた。実験は、20℃での、ITCバッファー、pH 7.1中、各々81.78μM Aβ(pE11-18)-PEGの30回の注入(1×2μl及び29×10μl)からなり、次の注入との間を4分間隔とした。ITCバッファー、pH 7.1中に5.13μMの抗体を含む試料セル(体積＝1.405ml)。Aβ(pE11-18)-PEGのITCバッファーへの希釈熱を全てのリガンド注入から差し引いた。ITC MicroCalorimeter(MicroCal)の使用。熱力学的パラメータである反応化学量論比(N)、会合定数(K)、結合エンタルピー(ΔH)、及びエントロピー(ΔS)をOrigin 7.0で測定した。 Aβ(pE11-18)-PEGの抗Aβ11(pE)抗体(クローン13)に対するITC結合曲線 抗体をプロテインGセファロースで精製し、0.1Mグリシン-HCl溶液(pH 2.7)で溶出させた。実験は、20℃での、ITCバッファー、pH 7.1中、各々686.31μM Aβ(pE11-18)-PEGの30回の注入(1×2μl及び29×10μl)からなり、次の注入との間を4分間隔とした。ITCバッファー、pH 7.1中に32.85μMの抗体を含む試料セル(体積＝1.405ml)。Aβ(pE11-18)-PEGのITCバッファーへの希釈熱を全てのリガンド注入から差し引いた。ITC MicroCalorimeter(MicroCal)の使用。熱力学的パラメータである反応化学量論比(N)、会合定数(K)、結合エンタルピー(ΔH)、及びエントロピー(ΔS)をOrigin 7.0で測定した。 Aβ(pE11-18)-PEGのビオチン化抗Aβ11(pE)抗体(クローン13)に対するITC結合曲線 実験は、20℃での、ITCバッファー、pH 7.1中、各々101.8μM Aβ(pE11-18)-PEGの30回の注入(1×2μl及び29×10μl)からなり、次の注入との間を4分間隔とした。ITCバッファー、pH 7.1中に5.12μMのビオチン化抗体を含む試料セル(体積＝1.405ml)。Aβ(pE11-18)-PEGのITCバッファーへの希釈熱を全てのリガンド注入から差し引いた。ITC MicroCalorimeter(MicroCal)の使用。熱力学的パラメータである反応化学量論比(N)、会合定数(K)、結合エンタルピー(ΔH)、及びエントロピー(ΔS)をOrigin 7.0で測定した。 抗Aβ11(pE)抗体と抗Aβ3(pE)抗体の交差反応性 Biacore 3000でのSPRによる抗Aβ11(pE)抗体(クローン13)のAβpE(11-30)及びAβpE(3-40)ペプチドに対する交差反応性の決定。約1000RUのAβ(pE11-30)、及び1830RUのAβpE(3-40)が固定化されたCM5チップの使用。30μl/分で300秒にわたる1μg/mlの抗体の注入、及び300秒の解離時間の記録、ランニングバッファーへの希釈。Aβが固定化されたフローセルにおける測定シグナルを、コーティングされていないフローセル由来のシグナルから差し引いた。 自己-Ig-ELISAにおける抗Aβ11(pE)抗体(クローン13)の標準曲線 200ng/ml Aβ(pE11-20)-ビオチンのストレプトアビジンコーティングマイクロプレートに対する固定化(2時間、RT)。200μl ELISA-Blocker(-T)によるRTで1時間のブロッキング及びその後の洗浄サイクル(3×300μl/ウェルの洗浄バッファー)。標準的な抗Aβ11(pE)抗体(クローン13)を3500pg/mlから55pg/mlへの基数分割でELISA-Blocker(+T)に希釈し、4℃で2時間インキュベートした。続いて、洗浄サイクル、及びポリクローナルウサギ抗マウスIg HRPによる4℃で1時間の検出。洗浄サイクルの後、TMB/H2O2を添加し、RT(暗所)で30分間インキュベートし、酵素反応を1M H2SO4で停止させた。吸収をTECAN Sunriseで450/540nmで測定した。 直接的Aβ11(pE)ELISA(クローン13) 様々な濃度のAβpE(11-30)ペプチドを4℃で一晩コーティングし、その後、ELISA-Blocker(-T)でRTで2時間ブロッキングした。ビオチン化抗Aβ11(pE)抗体(クローン13)をストレプトアビジン-HRPコンジュゲートとともにRTで10分間プレインキュベートし、ELISA-Blocker(+T)への希釈を行なった。1μg/ml 抗体(クローン13)の添加。インキュベーションの合間の6×300μl/ウェルのTBS-Tバッファーによる洗浄サイクル(ペプチドコーティング後を除く)。TMB/H2O2を添加し、RT(暗所)で30分間インキュベートし、酵素反応を1M H2SO4で停止させた。吸収をTECAN Sunriseで450/540nmで測定した。 直接的Aβ11(pE)ELISA(4G8) 様々な濃度のAβpE(11-30)ペプチドを4℃で一晩コーティングし、その後、ELISA-Blocker(-T)でRTで2時間ブロッキングした。ビオチン化4G8をストレプトアビジン-HRPコンジュゲートとともにRTで10分間プレインキュベートし、ELISA-Blocker(+T)への基数2の希釈を行なった。1μg/ml 4G8抗体の添加。インキュベーションの合間の6×300μl/ウェルのTBS-Tバッファーによる洗浄サイクル(ペプチドコーティング後を除く)。TMB/H2O2を添加し、RT(暗所)で30分間インキュベートし、酵素反応を1M H2SO4で停止させた。吸収をTECAN Sunriseで450/540nmで測定した。 ヒトAD脳のβアミロイド染色 抗Aβ11(pE)(クローン13)抗体を用いて免疫染色を行なった。AD脳切片をパラフィン包埋した。細胞核をヘマトキシリンで染色した。AD症例1;3の海馬からの、及びAD症例2の前頭皮質からの連続切片をイメージングする。AD症例1及び2は、Aβ11(pE)の沈着を伴う細胞外の大きい斑を示した(矢印及び拡大四角形を参照)。AD症例2の細胞内Aβ11(pE)沈着物(右下の拡大四角形を参照)及びAD症例3のAβ11(pE)沈着物(矢印を参照)が示された。左右の画像の倍率は同様である。これらの画像は、C. Lemereの研究室から好意により提供された(Havard Medical School, Boston)。 APP/PS1マウス脳のβアミロイド染色 抗Aβ11(pE)抗体を用いたホルマリン固定化パラフィン包埋AD脳切片の免疫染色。細胞核をヘマトキシリンで染色した。トランスジェニックマウスの海馬からの連続切片。連続切片は、Aβ11(pE)の血管沈着物を示した。褐色の染色が脳の血管で示されている。これらの画像は、C. Lemereの研究室から好意により提供された(Havard Medical School, Boston)。 自己-Ig-ELISAにおける抗Aβ11(pE)IgG及びIgのレベル アルツハイマー病(AD)及び対照群(13人のAD;30人の対照)のEDTA-血漿を、全免疫グロブリン及びIgGに関して、抗Aβ11(pE)自己抗体ELISAで解析した。図示されているのは、対照及びAD群の平均及び標準偏差である。二連の測定の結果。試料を標準曲線範囲内で測定した。 自己-Ig-ELISAにおけるAβ11(pE)IgG2、IgG3、IgM、及びIgAレベル アルツハイマー病(AD)及び対照群(13人のAD;30人の対照)のEDTA-血漿を、IgG2、IgG3、IgM、及びIgAに関して、抗Aβ11(pE)自己抗体ELISAで解析した。図示されているのは、対照及びAD群の平均及び標準偏差である。二連の測定の結果。試料を標準曲線範囲内で測定した。
(発明の詳細な説明)
(定義)
用語「抗体」は、最も広範な意味で使用されており、かつ具体的には、それらが所望の生体活性を示す限り、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの無傷の抗体から形成された多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び抗体断片を対象としている。抗体は、例えば、IgM、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4)、IgD、IgA、又はIgEであることができる。しかしながら、好ましくは、抗体は、IgM抗体ではない。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、通常、無傷の抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体断片の例としては、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFv断片:ダイアボディ;単鎖抗体分子;並びに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を構成している個々の抗体は、少量で存在し得る可能な天然の突然変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、極めて特異的であり、単一の抗原性部位に対するものである。さらに、通常、様々な抗原決定基(エピトープ)に対する様々な抗体を含む「ポリクローナル抗体」調製物とは対照的に、各々のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、多くの場合、それが、他の免疫グロブリンが夾雑していない、ハイブリドーマ培養物によって合成されるという点で有利であり得る。「モノクローナル」とは、抗体が、実質的に均質な抗体の集団から得られるという性格を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohlerらの文献(Nature, 256:495 (1975))に最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができるか、又は一般に周知の組換えDNA法によって作製することができる。「モノクローナル抗体」は、例えば、Clacksonらの文献、Nature, 352:624-628 (1991)及びMarksらの文献、J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載された技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
本明細書におけるモノクローナル抗体は、具体的には、重鎖及び/又は軽鎖の一部が、特定の種に由来するか又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、該鎖(複数)の残りの部分は、別の種に由来するか又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である、キメラ抗体(免疫グロブリン)、並びに所望の生体活性を示す限り、そのような抗体の断片を含む。
「ヒト化」型の非ヒト(例えば、マウス)抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖又は断片(例えば、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、もしくは抗体の他の抗原結合性部分配列)である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、又はウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のCDR由来の残基によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDR又はフレームワーク配列にも見られない残基を含むことができる。
これらの修飾は、抗体性能をさらに精緻化及び最適化するために行なわれる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、通常2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、CDR領域の全て又は実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、かつFR領域の全て又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のFR領域である。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域(Fc)、通常、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Jonesらの文献、Nature, 321:522-525 (1986)、Reichmannらの文献、Nature, 332:323-329 (1988):及びPrestaの文献、Curr. Op. Struct. Biel., 2:593-596 (1992)を参照されたい。ヒト化抗体としては、抗体の抗原結合領域が、マカクザルを関心対象の抗原で免疫化することによって産生された抗体に由来している、Primatized(商標)抗体が挙げられる。
「単鎖Fv」又は「sFv」抗体断片は、抗体のVHドメイン及びVLドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このリンカーによって、sFvは、抗原結合のための望ましい構造を形成することができる。sFvの総説については、Pluckthunの文献、モノクローナル抗体の薬理学(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies), 113巻, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag社, New York, pp.269-315(1994)を参照されたい。
用語「ダイアボディ」は、2つの抗原結合部位を有する抗体小断片を指し、この断片は、重鎖可変ドメイン(VH)が同じポリペプチド鎖中の軽鎖可変ドメイン(VD)に接続したもの(VH-VD)を含む。同じ鎖上のこれら2つのドメイン間で対を形成させるには短すぎるリンカーを用いることによって、これらのドメインは、別の鎖の相補的なドメインとの対の形成を強いられ、2つの抗原結合部位を生成させる。ダイアボディは、Hollingerらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)において、さらに十分に説明されている。
「単離された」抗体は、同定され、かつその天然の環境の成分から分離及び/又は回収された抗体である。その天然の環境の夾雑成分は、該抗体の診断的又は治療的使用を妨げる物質であり、かつこれは、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を含むことができる。好ましい実施態様において、該抗体は、(1)Lowry法で決定したときに抗体の95重量％を超えるまで、及び最も好ましくは99重量％を上回るまで、(2)スピニングカップシーケネーター(spinning cup sequenator)の使用により、N-末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで、又は(3)クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いる、還元もしくは非還元条件下でのSDS-PAGEによって均質になるまで精製される。単離された抗体は、組換え細胞内のインサイチュの抗体を含むが、それは、抗体の天然環境の少なくとも1つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも1つの精製工程によって調製される。
本明細書で使用される場合、表現「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」は、互換的に使用されており、そのような表記は全て子孫を含む。したがって、語句「形質転換体」及び「形質転換された細胞」は、継代(transfer)の数とは関係なく、それらから派生した初代の対象細胞及び培養物を含む。全ての子孫は、意図的な又は意図的でない突然変異のために、DNA含有量が正確には同一でないことがあり得ることも理解される。最初に形質転換された細胞でスクリーニングされたものと同じ機能又は生体活性を有する突然変異体子孫が含まれる。異なる表記が意図される場合、これは文脈から明らかになるであろう。
本明細書で使用される用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、互換性があり、かつペプチド結合によって連結されたアミノ酸から構成された生体分子を意味するものと定義される。
本明細書で使用される用語「a」、「an」、及び「the」は、「1以上」を意味するものと定義され、文脈が不適切でない限り、複数を含む。
「アミロイドもしくはアミロイド様タンパク質によって引き起こされるか、又はそれらと関連する疾患及び障害」という言い回しは、単量体、原線維、もしくは重合体状態、又はこれら3つの任意の組合せのアミロイド様タンパク質の存在又は活性によって引き起こされる疾患及び障害を含むが、これらに限定されない。そのような疾患及び障害としては、アミロイドーシス、内分泌腫瘍、及び黄斑変性症が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アミロイドーシス」は、アミロイド斑形成と関連する疾患及び障害の群を指し、これは、限定されないが、続発性アミロイドーシス及び加齢関連アミロイドーシス、例えば、限定されないが、神経学的障害、例えば、アルツハイマー病(AD)を含む、疾患を含み、これには、認知記憶能力の損失を特徴とする疾患又は状態、例えば、軽度認知障害(MCI)、孤発性アルツハイマー病、レヴィー小体型認知症、ダウン症、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血(オランダ型);グアム島パーキンソン認知症複合、家族性イギリス型認知症(FBD)及び家族性デンマーク型認知症(FDD)のような家族型のアルツハイマー病など;並びにアミロイド様タンパク質に基づくか又はそれと関連する他の疾患、例えば、進行性核上麻痺、多発性硬化症;クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病、HIV関連認知症、ALS(筋萎縮性側索硬化症)、封入体筋炎(IBM)、成人発症型糖尿病、及び老人性心アミロイドーシス;並びにβ-アミロイド沈着による黄斑変性症、ドルーゼン関連視神経症、及び白内障を含む様々な眼疾患が含まれる。
「アミロイドβ、Aβ、又はβ-アミロイド」は、当技術分野で認識されている用語であり、アミロイドβタンパク質及びペプチド、アミロイドβ前駆体タンパク質(APP)、並びにこれらの修飾物、断片、及び任意の機能的同等物を指す。特に、本明細書で使用されるアミロイドβとは、APPのタンパク質分解的切断によって生成される任意の断片を意味するが、とりわけ、アミロイド病変に関与又は関連する断片を意味し、これには、限定されないが、Aβ1-38、Aβ1-40、Aβ1-42が含まれる。これらのAβペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである:
Figure 2014509860
「pGlu-Aβ」又は「AβN3pE」は、Aβのアミノ酸配列中の位置3のグルタミン酸残基から始まるN-末端切断型のAβを指し、ここで、該グルタミン酸残基は環化されて、ピログルタミン酸残基を形成する。特に、本明細書で使用されるpGlu-Aβとは、限定されないが、pGlu-Aβ3-38、pGlu-Aβ3-40、p-Glu-Aβ3-42を含む、アミロイド病変に関与又は関連する断片を意味する。
N-末端切断型のAβであるAβ3-38、Aβ3-40、Aβ3-42の配列は以下の通りである:
Figure 2014509860
「AβpGlu(11)」、「Aβ(pE11)」、又は「Aβ11(pE)」は、Aβのアミノ酸配列中の位置11のグルタミン酸残基から始まるN-末端切断型のAβを指し、ここで、該グルタミン酸残基は環化されて、ピログルタミン酸残基を形成する。特に、本明細書で使用されるAβpGlu(11-x)とは、限定されないが、pGlu-Aβ11-38、pGlu-Aβ11-40、p-Glu-Aβ11-42を含む、アミロイド病変に関与又は関連する断片を意味する。
N-末端切断型のAβであるAβ11-38、Aβ11-40、Aβ11-42の配列は以下の通りである:
Figure 2014509860
特に、本発明は、以下の項目に関する:
1.AβpGlu(11)ペプチド又はその変異体に、好ましくは高い親和性で結合することを特徴とする、抗体。
2.前記高い親和性が、10-7M以下の解離定数(KD)値を意味する、項目1記載の抗体。
3.前記抗体が、モノクローナル抗体である、項目1又は2記載の抗体。
4.前記抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号51のヌクレオチド配列、又は配列番号52のアミノ酸配列を有する、項目1〜3のいずれか一項記載の抗体。
5.前記抗体の重鎖の可変部分が、配列番号53のヌクレオチド配列、又は配列番号54のアミノ酸配列を有する、項目1〜4のいずれか一項記載の抗体。
6.前記抗体の軽鎖の可変部分が、前記配列番号51のヌクレオチド配列、又は前記配列番号52のアミノ酸配列を有し、かつ前記抗体の重鎖の可変部分が、配列番号53のヌクレオチド配列、又は前記配列番号54のアミノ酸配列を有する、項目1〜5のいずれか一項記載の抗体。
7.前記抗体が、Aβ13-11-6(寄託番号DSM ACC 3100)又はその機能的変異体である、項目1〜6のいずれか一項記載の抗体。
8.前記抗体が、Aβ13-11-6(寄託番号DSM ACC 3100)である、項目7記載の抗体。
9.前記抗体が、ヒト化もしくはキメラ抗体、又は高親和性を保持する抗体断片である、項目1〜8のいずれか一項記載の抗体。
10.AβpGlu(11)ペプチド又はその変異体の検出における使用のための、項目1〜9のいずれか一項記載の抗体。
11.前記変異体が、以下の群:
pGlu-Aβ11-38変異体
pGlu-Aβ11-40変異体
pGlu-Aβ11-42変異体、及び
pGlu-Aβ11-x変異体
から選択され、
ここで、xは、18〜42、より好ましくは、30〜42の整数である、項目10記載の抗体。
12.ヒトのものである、項目1〜11のいずれか一項記載の抗体。
13.高親和性を保持するダイアボディ又は単鎖抗体である、項目1〜12のいずれか一項記載の抗体。
14.項目11に記載の抗体によって結合されるエピトープに結合する、項目1〜13のいずれか一項記載の抗体。
15.項目11に記載の抗体の相補性決定領域を有する、項目1〜14のいずれか一項記載の抗体。
16.前記抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号51のヌクレオチド配列、又は配列番号52のアミノ酸配列を有する軽鎖の可変部分を有する抗体の1以上の、例えば、1つ、2つ、又は3つの相補性決定領域と同じである1以上の、例えば、1つ、2つ、又は3つの相補性決定領域を有する、項目1〜15のいずれか一項記載の抗体。
17.前記抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号53のヌクレオチド配列、又は配列番号54のアミノ酸配列を有する重鎖の可変部分を有する抗体の1以上の、例えば、1つ、2つ、又は3つの相補性決定領域と同じである1以上の、例えば、1つ、2つ、又は3つの相補性決定領域を有する、項目1〜16のいずれか一項記載の抗体。
18.標識されている、項目1〜17のいずれか一項記載の抗体。
19.固相に固定化されている、項目1〜18のいずれか一項記載の抗体。
20.ハイブリドーマ細胞株DSM ACC 3100から得られ得る抗体。
21.項目1〜20のいずれか一項記載の抗体を含む組成物。
22.アミロイドーシスの治療、予防、又は遅延のための、項目21記載の組成物。
23.前記アミロイドーシスが、軽度認知障害、アルツハイマー病、及びダウン症の神経変性からなる群から選択される神経変性疾患である、項目21又は22記載の組成物。
24.前記アミロイドーシスが、孤発性アルツハイマー病又は家族性アルツハイマー型認知症である、項目21又は22記載の組成物。
25.前記家族性アルツハイマー型認知症が、家族性イギリス型認知症又は家族性デンマーク型認知症である、項目24記載の組成物。
26.ハイブリドーマ細胞株DSM ACC 3100。
27.診断法又は治療法における項目1〜20のいずれか一項記載の抗体又は項目21〜25のいずれか一項記載の組成物の使用。
28.アミロイド関連の疾患又は状態の診断のための項目27記載の使用。
29.前記アミロイドーシスが、軽度認知障害、アルツハイマー病、及びダウン症の神経変性からなる群から選択される神経変性疾患である、項目28記載の使用。
30.前記アミロイドーシスが、孤発性アルツハイマー病又は家族性アルツハイマー型認知症である、項目28記載の使用。
31.前記家族性アルツハイマー型認知症が、家族性イギリス型認知症又は家族性デンマーク型認知症である、項目28記載の使用。
32.アミロイド関連の疾患又は状態、特に、アルツハイマー病の診断のためのインビトロ診断法であって、以下の工程:
項目1〜20のいずれか一項記載の抗体を、該疾患又は状態に罹患していることが疑われる対象由来の試料と接触させる工程、及び
該抗体のAβpGlu(11)タンパク質に対する結合を、該試料から検出する工程
を含む、前記インビトロ診断法。
33.項目1〜20のいずれか一項記載の抗体、及び使用説明書、及び‐任意に‐(a)さらなる生体活性物質(複数可)を含む、診断キット。
34.前記さらなる生体活性物質がグルタミニルシクラーゼの阻害剤である、項目33記載の診断キット。
35.配列番号26〜50からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
本発明の抗体は、アミロイドーシスの診断に有用であり得る。
本発明の抗体は、親和性精製剤として用いることができる。このプロセスでは、該抗体を、当技術分野で周知の方法を用いて、Sephadex樹脂又は濾紙などの固相に固定化する。固定化された抗体を、精製すべきAβpGlu(11)ペプチドを含む試料と接触させ、その後、支持体を、固定化された抗体に結合するAβpGlu(11)-ペプチドを除く、試料中の実質的に全ての材料を除去する好適な溶媒で洗浄する。最後に、該支持体を、AβpGlu(11)-ペプチドを抗体から放出する別の好適な溶媒、例えば、グリシンバッファー、pH5.0で洗浄する。
抗AβpGlu(11)-ペプチド抗体は、例えば、特定の細胞、組織、又は血清中のその出現を検出するためのAβpGlu(11)-ペプチドの診断アッセイでも有用であり得る。したがって、該抗体は、アミロイドーシス、特に、軽度認知障害(MCI)、例えば、孤発性アルツハイマー病(SAD)又は家族性アルツハイマー型認知症(FAD)、例えば、家族性イギリス型認知症(FBD)及び家族性デンマーク型認知症(FDD)のようなアルツハイマー病(AD)、並びにダウン症の神経変性からなる群から選択される神経変性疾患;好ましくは、アルツハイマー病の診断において用いることができる。
診断的適用のために、抗体は、通常、検出可能な部分で標識されている。多くの標識が利用可能であり、それらは、通常、以下のカテゴリーに分類することができる:
(a)放射性同位体、例えば、35S、14C、125I、3H、及び131I。抗体は、例えば、免疫学の最新プロトコル(Current Protocols in Immunology), 第1巻及び第2巻, Gutigenら編, Wiley-Interscience社. New York, New York. Pubs,(1991)に記載されている技術を用いて放射性同位体で標識することができ、放射能は、シンチレーションカウンティングを用いて測定することができる。
(b)蛍光標識、例えば、希土類キレート(ユーロピウムキレート)又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリスリン、並びにテキサスレッドが利用可能である。蛍光標識は、例えば、免疫学の最新プロトコル(Current Protocols in Immunology)(前掲)に開示されている技術を用いて、抗体にコンジュゲートすることができる。蛍光は、蛍光光度計を用いて定量することができる。
(c)様々な酵素-基質標識が利用可能である。酵素は一般に、様々な技術を用いて測定することができる発色基質の化学的変化を触媒する。例えば、酵素は、基質の色の変化を触媒することができ、この変化は、分光光度法によって測定することができる。或いは、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変化させることができる。蛍光の変化を定量するための技術は上で記載されている。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起されるようになり、その後(例えば、化学発光計を用いて)測定し得る光を放出することができるか、又は蛍光受容体にエネルギーを供与する。酵素的標識の例としては、ルシフェラーゼ(例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ;米国特許第4,737,456号)、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRPO)などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、O-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ(例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ)、複素環オキシダーゼ(例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ)、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。酵素を抗体にコンジュゲートさせるための技術は、O'Sullivanらの文献、酵素イムノアッセイにおける使用のための酵素-抗体コンジュゲートの調製方法(Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay)， Methods in Enzym(Langone及びH. Van Vunakis編), Academic Press社, New York, 73:147-166(1981)に記載されている。
酵素-基質の組合せの例としては、例えば:
(i)セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRPO)と、基質としての水素ペルオキシダーゼ、ここで、該水素ペルオキシダーゼは、色素前駆体(例えば、オルトフェニレンジアミン(OPD)又は3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン塩酸塩(TMB))を酸化する;
(ii)アルカリホスファターゼ(AP)と、発色基質としてのパラ-ニトロフェニルホスフェート;及び
(iii)β-D-ガラクトシダーゼ(β-D-Gal)と、発色基質(例えば、p-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシダーゼ)又は蛍光基質4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシダーゼ
が挙げられる。
他の多くの酵素-基質の組合せが、当業者に利用可能である。
標識は、抗体と間接的にコンジュゲートされている場合もある。当業者であれば、これを達成するための様々な技術を知っているであろう。例えば、抗体をビオチンとコンジュゲートさせることができ、上述の3つの幅広いカテゴリーの標識のいずれかをアビジンとコンジュゲートさせることができ、又はその逆も可能である。ビオチンはアビジンと選択的に結合し、そのため、この間接的な様式で、標識を抗体とコンジュゲートさせることができる。或いは、標識と抗体との間接的コンジュゲーションを達成するために、抗体を小さいハプテン(例えば、ジゴキシン)とコンジュゲートさせ、上述の異なるタイプの標識のうちの1つを抗ハプテン抗体(例えば、抗ジゴキシン抗体)とコンジュゲートさせる。このようにして、標識と抗体との間接的コンジュゲーションを達成することができる。
AβpGlu(11)抗体は、標識される必要はなく、その存在は、AβpGlu(11)抗体に結合する標識抗体を用いて検出することができる。
本発明の抗体は、任意の公知のアッセイ方法、例えば、競合結合アッセイ、直接的及び間接的サンドイッチアッセイ、並びに免疫沈降アッセイで利用することができる。Zolaの文献、モノクローナル抗体 技術マニュアル(Monoclonal Antibodies A Manual of Techniques), pp.147-158(CRC Press社, 1987)。
競合結合アッセイは、標識された標準が限られた量の抗体との結合を被験試料検体と競合する能力に依存している。被験試料中のAβpGlu(11)ペプチドの量は、抗体に結合し始める標準の量に反比例する。結合し始める標準の量を決定しやすくするために、抗体は、通常、競合の前後に不溶化され、その結果、抗体に結合している標準及び検体を、未結合のままでいる標準及び検体から好都合に分離することができる。
サンドイッチアッセイは、検出すべきタンパク質の異なる免疫原性部分、すなわち、エピトープに各々結合することができる、2つの抗体の使用を伴う。サンドイッチアッセイにおいて、被験試料検体は、固形支持体上に固定化されている第一の抗体によって結合され、その後、第二の抗体が検体に結合し、その結果、3つの部分の不溶性の複合物を形成する。第二の抗体は、検出可能な部分でそれ自体標識することができる(直接サンドイッチアッセイ)か、又は検出可能な部分で標識されている抗免疫グロブリン抗体を用いて測定することができる(間接サンドイッチアッセイ)。例えば、サンドイッチアッセイの1つの好ましいタイプはELISAアッセイであり、その場合、検出可能な部分は酵素である。
免疫組織化学的解析のために、組織試料は、新鮮なものもしくは凍結されたものであってもよく、又はパラフィンに包埋され、例えば、ホルマリンなどの防腐剤で固定されたものであってもよい。
(診断キット)
便宜上、本発明の抗体は、キット、すなわち、所定の量の試薬と診断アッセイを実施するための指示書とを包装して組み合わせたものとして提供することができる。抗体が酵素で標識されている場合、キットは、その酵素が必要とする基質及び補因子(例えば、検出可能な発色団又は蛍光団を提供する基質前駆体)を含む。さらに、他の添加剤、例えば、安定化剤、バッファー(例えば、ブロックバッファー又は溶解バッファー)などが含まれていてもよい。アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中濃度を提供するために、様々な試薬の相対量を幅広く変化させることができる。特に、試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、通常凍結乾燥された乾燥粉末として提供することができる。
本発明の診断用キットは、以下に記載されるようなさらなる生体活性物質を含むことができる。診断用キットでの使用に特に好ましいのは、グルタミニルシクラーゼの阻害剤である。
本発明の診断用キットは、アミロイド関連の疾患及び状態、特に、軽度認知障害(MCI)、例えば、孤発性アルツハイマー病(SAD)又は家族性イギリス型認知症(FBD)及び家族性デンマーク型認知症(FDD)のような家族性アルツハイマー型認知症(FAD)のようなアルツハイマー病(AD)、ダウン症の神経変性からなる群から選択される神経変性疾患;好ましくは、アルツハイマー病の検出及び診断に特に有用である。
本発明は、特に、高い親和性でAβpGlu(11)-ペプチドに結合することを特徴とする抗体に関する。本発明はまた、高い親和性でAβpGlu(11)-ペプチド又はその変異体に結合することを特徴とする抗体に関する。該高い親和性は、本発明との関連において、10-7M以下のKD値、好ましくは、10-8M以下のKD値、及びさらにより好ましくは10-9M〜10-12MのKD値の親和性を意味する。したがって、本発明の抗体は、これまでに知られている抗体よりも高い親和性でAβpGlu(11)-ペプチドに結合する。
特に、該抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体であり、かつAβ13-11-6(DSM ACC 3100)である。
本発明の抗体は、アミロイドーシス、特に、軽度認知障害(MCI)、例えば、孤発性アルツハイマー病(SAD)又は家族性イギリス型認知症(FBD)及び家族性デンマーク型認知症(FDD)のような家族性アルツハイマー型認知症(FAD)のようなアルツハイマー病(AD)、ダウン症の神経変性からなる群から選択される神経変性疾患;好ましくは、アルツハイマー病を検出する診断法において特に有用である。
好ましい実施態様によれば、該抗体は、ヒト化されることができるか、又はキメラ抗体であるか、又はヒト抗体である。
さらに、上述の群から選択される抗体は、該群の機能的変異体であることもできる。
本発明との関連において、AβpGlu(11)ペプチドの変異体は、特に、
pGlu-Aβ11-38、
pGlu-Aβ11-40、
pGlu-Aβ11-42
である。
AβpGlu(11)ペプチドのさらなる変異体は全てpGlu-Aβ11-x変異体であり、これらは、アルツハイマー病の結果として又はアルツハイマー病に先だって脳に蓄積することが示されている。Xは18〜42の整数と定義し、例えば、上記のpGlu-Aβ11-42では、「42」が、「x」を表す整数となる。
本発明との関連において、本発明の抗体の「機能的変異体」は、結合能、特に、pGlu-Aβ11-xペプチド又はその機能的変異体に対する高親和性の結合能を保持している抗体である。そのような機能的変異体の条件は、当技術分野で公知であり、かつ抗体及びその断片の定義において示された、上述の可能性を包含している。
好ましい実施態様において、抗体は、上で定義したような抗体断片である。
さらなる好ましい実施態様において、本発明の抗体は、上で定義した抗体、特に、抗体13-11-6によって結合されるエピトープに結合する抗体である。
さらなる好ましい実施態様において、本発明の抗体は、上で定義した抗体の相補性決定領域(CDR)を有する抗体である。好ましくは、抗体は、標識することができ;可能性のある標識は、上述のもの、及び特に抗体の診断的使用の当業者に公知のもの全てである。
好ましくは、抗体は、固相に固定化されている。
本発明はまた、ハイブリドーマ細胞株13-11-6(DSM ACC 3100)から得られ得る抗体に関する。
本発明はまた、上で定義した抗体を含む組成物に関する。特に、該組成物は、特に、生体試料中のAβpGlu(11)ペプチド又はその変異体の検出による;診断的使用のための、とりわけ、軽度認知障害(MCI)、例えば、孤発性アルツハイマー病(SAD)又は家族性イギリス型認知症(FBD)及び家族性デンマーク型認知症(FDD)のような家族性アルツハイマー型認知症(FAD)のようなアルツハイマー病(AD)、ダウン症の神経変性からなる群から選択される神経変性疾患;好ましくは、アルツハイマー病の診断のための組成物である。
別の実施態様において、本発明の及び本明細書で先に記載したような抗体、又はこれらの断片は、AβpGlu(11)単量体に対する結合親和性よりも、少なくとも2倍、特に少なくとも4倍、特に少なくとも10倍、特に少なくとも15倍、より特に少なくとも20倍、しかしとりわけ、少なくとも25倍高い、AβpGlu(11)オリゴマー、線維、原線維、又はフィラメントに対する結合親和性を示す。
さらに別の実施態様において、抗体もしくはその断片、又はキメラ抗体もしくはその断片、又はヒト化抗体もしくはその断片は、本明細書で先に記載したように提供され、該抗体は、哺乳動物、特にヒトの脳の、Aβ斑を含む、凝集したAβに実質的に結合するが、好ましくは、アミロイド前駆体タンパク質(APP)とのいかなる顕著な交差反応性も示さない。
本発明の別の実施態様において、抗体もしくはその断片、又はキメラ抗体もしくはその断片、又はヒト化抗体もしくはその断片は、本明細書で先に記載したように提供され、該抗体は、哺乳動物、特にヒトの脳の、可溶性重合体アミロイド、特に、Aβ単量体を含む、アミロイドβ(Aβ)に実質的に結合するが、好ましくは、アミロイド前駆体タンパク質(APP)とのいかなる顕著な交差反応性も示さない。
本発明はまた、上で定義した抗体のヒト化型、該ヒト化抗体を含む組成物、及び哺乳動物における、特にヒトにおける、アミロイドーシスの治療のための、とりわけ、神経変性疾患の治療のための該組成物の使用に関する。該神経変性疾患は、特に、軽度認知障害(MCI)、例えば、孤発性アルツハイマー病(SAD)又は家族性イギリス型認知症(FBD)及び家族性デンマーク型認知症(FDD)のような家族性アルツハイマー型認知症(FAD)のようなアルツハイマー病(AD)、ダウン症の神経変性からなる群から選択される。好ましくは、該神経変性疾患は、アルツハイマー病である。
本発明はまた、ハイブリドーマ細胞株13-11-6に関する。
本発明はまた、インビトロ診断法における、どちらも上で定義した、抗体又は該抗体を含む組成物の使用に関する。特に、この診断法は、とりわけ、生体試料中のAβpGlu(11)ペプチド又はその変異体を検出することによる;軽度認知障害(MCI)、例えば、孤発性アルツハイマー病(SAD)又は家族性イギリス型認知症(FBD)及び家族性デンマーク型認知症(FDD)のような家族性アルツハイマー型認知症(FAD)のようなアルツハイマー病(AD)、ダウン症の神経変性からなる群から選択される神経変性疾患;好ましくは、アルツハイマー病の診断に関する。
好ましくは、該試料は、血清試料である。
別の好ましい実施態様によれば、該試料は、体液(liquor)又は脳脊髄液(CSF)試料である。
特に好ましい実施態様において、本発明は、以下の方法に関する:
アミロイド関連の疾患又は状態、好ましくは、アルツハイマー病の診断のためのインビトロ又はインサイチュ診断法であって、以下の工程:
本発明の抗体を、該状態又は疾患に罹患していることが疑われる対象の、好ましくは、血清、体液、もしくはCSF試料から選択される試料、最も好ましくは、血清試料;又は特定の身体部分もしくは身体領域と接触させる工程;及び
該抗体のAβpGlu(11)ペプチドに対する結合を、該試料から検出する工程:
を含む方法。
より具体的には、本発明は、試料中又はインサイチュで、AβpGlu(11)ペプチドに対する抗体又はその活性断片の免疫特異的結合を検出することを含む、アミロイド関連の疾患又は状態、好ましくは、アルツハイマー病の診断方法であって、
(a)アミロイドタンパク質を含むことが疑われる試料又は特定の身体部分もしくは身体領域を、AβpGlu(11)ペプチドに結合する、本発明の抗体、特に、モノクローナル抗体、又はキメラ抗体もしくはその断片、又は本発明の及び本明細書で先に記載したようなヒト化抗体もしくはその断片、及び/或いはこれらの機能的部分と接触させる工程;
(b)該抗体及び/又はその機能的部分を、AβpGlu(11)ペプチドに結合させて、免疫複合体を形成させる工程;
(c)該免疫複合体の形成を検出する工程;並びに
(d)該免疫複合体の有無を、該試料又は特定の身体部分もしくは身体領域中のAβpGlu(11)ペプチドの有無と相関させる工程
を含む、方法に関する。
また含まれるのは、組織及び/又は体液中のアミロイド原性斑負荷の程度を決定する方法であって、
(a)検討中の組織及び/又は体液を代表する試料を得ること;
(b)該試料を、アミロイドタンパク質の存在について、本発明の抗体、特に、モノクローナル抗体、又はキメラ抗体もしくはその断片、又は本発明の及び本明細書で先に記載したようなヒト化抗体もしくはその断片、並びに/又はこれらの機能的部分を用いて、試験すること;
(c)該タンパク質に結合した抗体の量を決定すること;並びに
(d)該組織及び/又は体液中の斑負荷を算出すること
を含む、方法である。
特に、本発明は、組織及び/又は体液中のアミロイド原性斑負荷の程度を決定する方法に関するものであり、ここで、工程c)における免疫学的複合体の形成は、該免疫学的複合体の有無が、アミロイドタンパク質、特に、AβpGlu(11)ペプチドの有無と相関するように決定される。
さらに別の実施態様において、本発明は、治療的有効量の、任意の機能的に同等な抗体又はその任意の誘導体もしくは機能的部分を含む、本発明の抗体、又はキメラ抗体もしくはその断片、又は本発明の及び本明細書で先に記載したようなヒト化抗体もしくはその断片を含む組成物、特に、医薬として許容し得る担体を任意にさらに含む医薬組成物である組成物に関する。
本発明の別の実施態様において、該組成物は、治療的有効量の抗体を含む。
さらに本発明に含まれるのは、治療的有効量の、任意の機能的に同等な抗体又はその任意の誘導体もしくは機能的部分を含む、本発明の抗体、特に、モノクローナル抗体、又はキメラ抗体もしくはその断片、又は本発明の及び本明細書で先に記載したようなヒト化抗体もしくはその断片、並びに任意にさらなる生体活性物質及び/又は医薬として許容し得る担体及び/又は希釈剤及び/又は賦形剤を含む混合物である。
特に、本発明は、該さらなる生体活性物質が、軽度認知障害(MCI)、例えば、孤発性アルツハイマー病(SAD)又は家族性イギリス型認知症(FBD)及び家族性デンマーク型認知症(FDD)のような家族性アルツハイマー型認知症(FAD)のようなアルツハイマー病(AD)、ダウン症の神経変性からなる群から選択される神経変性疾患;好ましくは、アルツハイマー病に関与するアミロイド又はアミロイド様タンパク質、例えば、AβpGlu(11)タンパク質と関連する疾患及び障害の群であるアミロイドーシスの薬物治療において使用される化合物である混合物に関する。
本発明の別の実施態様において、他の生体活性物質又は化合物は、AβpGlu(11)によって引き起こされるアミロイドーシスの治療において使用され得る、又は他の神経学的障害の薬物治療において使用され得る治療剤であってもよい。
他の生体活性物質又は化合物は、本発明の抗体と同じもしくは同様の機序によるか、又は無関係の作用機序によるか、又は多くの関連する及び/もしくは無関係の作用機序によって、その生物学的効果を発揮することができる。
一般に、他の生体活性化合物としては、神経(neutron)伝達エンハンサー、精神治療薬、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、カルシウム-チャネル遮断薬、生体アミン、ベンゾジアゼピン系精神安定薬、アセチルコリンの合成、貯蔵、もしくは放出のエンハンサー、アセチルコリンシナプス後受容体アゴニスト、モノアミンオキシダーゼ-Aもしくは-B阻害剤、N-メチル-D-アスパラギン酸グルタミン酸受容体アンタゴニスト、非ステロイド系抗炎症薬、抗酸化剤、及びセロトニン受容体アンタゴニストを挙げることができる。
より具体的には、本発明は、酸化的ストレスに対して有効な化合物、抗アポトーシス化合物、金属キレート剤、DNA修復阻害剤、例えば、ピレンゼピン及び代謝産物、3-アミノ-1-プロパンスルホン酸(3APS)、1,3-プロパンジスルホネート(1,3PDS)、α-セクレターゼ活性化因子、β-及びγ-セクレターゼ阻害剤、タウタンパク質、神経伝達物質、β-シート破壊因子、アミロイドβを除去する/枯渇させる細胞成分に対する誘引物質、ピログルタミン酸修飾アミロイドβ3-42を含むN-末端切断型アミロイドβの阻害剤、例えば、グルタミニルシクラーゼ阻害剤、抗炎症分子、又はコリンエステラーゼ阻害剤(ChEI)、例えば、タクリン、リバスチグミン、ドネペジル、及び/もしくはガランタミン、M1アゴニスト、並びに任意のアミロイドもしくはタウ修飾薬及び栄養補助物質を含む他の薬物、並びに栄養補助物質からなる群から選択される少なくとも1つの化合物を、本発明の抗体、並びに任意に医薬として許容し得る担体及び/又は希釈剤及び/又は賦形剤と一緒に含む混合物に関する。
本発明はさらに、化合物がコリンエステラーゼ阻害剤(ChEI)である混合物、特に、化合物が、タクリン、リバスチグミン、ドネペジル、ガランタミン、ナイアシン、及びメマンチンからなる群から選択される化合物である混合物に関する。
さらなる実施態様において、本発明の混合物は、ナイアシン又はメマンチンを、本発明の抗体、並びに任意に医薬として許容し得る担体及び/又は希釈剤及び/又は賦形剤と一緒に含むことができる。
さらなる実施態様において、本発明の混合物は、グルタミニルシクラーゼ阻害剤を、本発明の抗体、並びに任意に医薬として許容し得る担体及び/又は希釈剤及び/又は賦形剤と一緒に含むことができる。
好ましいグルタミニルシクラーゼ阻害剤は、WO 2005/075436号、特に、31〜40頁に示された実施例1〜141に記載されている。実施例1〜141の合成は、WO 2005/075436号の40〜48頁に示されている。実施例1〜141、それらの合成、及びグルタミニルシクラーゼ阻害剤としてのそれらの使用に関するWO 2005/075436号の開示は、引用により本明細書中に組み込まれる。
さらに好ましいグルタミニルシクラーゼ阻害剤は、WO 2008/055945号、特に、46〜155頁に示された実施例1〜473に記載されている。実施例1〜473の合成は、WO 2008/055945号の156〜192頁に示されている。実施例1〜473、それらの合成、及びグルタミニルシクラーゼ阻害剤としてのそれらの使用に関するWO 2008/055945号の開示は、引用により本明細書中に組み込まれる。
さらに好ましいグルタミニルシクラーゼ阻害剤は、WO 2008/055947号、特に、53〜118頁に示された実施例1〜345に記載されている。実施例1〜345の合成は、WO 2008/055947号の119〜133頁に示されている。実施例1〜345、それらの合成、及びグルタミニルシクラーゼ阻害剤としてのそれらの使用に関するWO 2008/055947号の開示は、引用により本明細書中に組み込まれる。
さらに好ましいグルタミニルシクラーゼ阻害剤は、WO 2008/055950号、特に、57〜120頁に示された実施例1〜212に記載されている。実施例1〜212の合成は、WO 2008/055950号の121〜128頁に示されている。実施例1〜212、それらの合成、及びグルタミニルシクラーゼ阻害剤としてのそれらの使用に関するWO 2008/055950号の開示は、引用により本明細書中に組み込まれる。
さらに好ましいグルタミニルシクラーゼ阻害剤は、WO2008/065141号、特に、56〜59頁に示された実施例1〜25に記載されている。実施例1〜25の合成は、WO2008/065141号の60〜67頁に示されている。実施例1〜25、それらの合成、及びグルタミニルシクラーゼ阻害剤としてのそれらの使用に関するWO2008/065141号の開示は、引用により本明細書中に組み込まれる。
さらに好ましいグルタミニルシクラーゼ阻害剤は、WO 2008/110523号、特に、55〜59頁に示された実施例1〜27に記載されている。実施例1〜27の合成は、WO 2008/110523号の59〜71頁に示されている。実施例1〜27、それらの合成、及びグルタミニルシクラーゼ阻害剤としてのそれらの使用に関するWO 2008/110523号の開示は、引用により本明細書中に組み込まれる。
さらに好ましいグルタミニルシクラーゼ阻害剤は、WO 2008/128981号、特に、62〜65頁に示された実施例1〜18に記載されている。実施例1〜18の合成は、WO 2008/128981号の65〜74頁に示されている。実施例1〜18、それらの合成、及びグルタミニルシクラーゼ阻害剤としてのそれらの使用に関するWO 2008/128981号の開示は、引用により本明細書中に組み込まれる。
さらに好ましいグルタミニルシクラーゼ阻害剤は、WO 2008/128982号、特に、61〜67頁に示された実施例1〜44に記載されている。実施例1〜44の合成は、WO 2008/128982号の68〜83頁に示されている。実施例1〜44、それらの合成、及びグルタミニルシクラーゼ阻害剤としてのそれらの使用に関するWO 2008/128982号の開示は、引用により本明細書中に組み込まれる。
さらに好ましいグルタミニルシクラーゼ阻害剤は、WO 2008/128983号、特に、64〜68頁に示された実施例1〜30に記載されている。実施例1〜30の合成は、WO 2008/128983号の68〜80頁に示されている。実施例1〜30、それらの合成、及びグルタミニルシクラーゼ阻害剤としてのそれらの使用に関するWO 2008/128983号の開示は、引用により本明細書中に組み込まれる。
さらに好ましいグルタミニルシクラーゼ阻害剤は、WO 2008/128984号、特に、63〜69頁に示された実施例1〜36に記載されている。実施例1〜36の合成は、WO 2008/128984号の69〜81頁に示されている。実施例1〜36、それらの合成、及びグルタミニルシクラーゼ阻害剤としてのそれらの使用に関するWO 2008/128984号の開示は、引用により本明細書中に組み込まれる。
さらに好ましいグルタミニルシクラーゼ阻害剤は、WO 2008/128985号、特に、66〜76頁に示された実施例1〜71に記載されている。実施例1〜71の合成は、WO 2008/128985号の76〜98頁に示されている。実施例1〜71、それらの合成、及びグルタミニルシクラーゼ阻害剤としてのそれらの使用に関するWO 2008/128985号の開示は、引用により本明細書中に組み込まれる。
さらに好ましいグルタミニルシクラーゼ阻害剤は、WO 2008/128986号、特に、65〜66頁に示された実施例1〜7に記載されている。実施例1〜7の合成は、WO 2008/128986号の66〜73頁に示されている。実施例1〜7、それらの合成、及びグルタミニルシクラーゼ阻害剤としてのそれらの使用に関するWO 2008/128986号の開示は、引用により本明細書中に組み込まれる。
本発明のさらに別の実施態様において、幻覚、妄想、思考障害(顕著な思考散乱、脱線、脱線思考を呈する)、及び突飛な行動又は解体した行動、並びに無快感症、平坦情動、感情鈍麻、及び社会的引きこもりを含む、精神病の陽性及び陰性症状の治療のための「非定型抗精神病薬」、例えば、クロザピン、ジプラシドン、リスペリドン、アリピプラゾール、又はオランザピンなどを、抗体、特に、本発明のモノクローナル抗体、しかし特に、キメラ抗体もしくはその断片、又は本発明の及び本明細書で先に記載したようなヒト化抗体もしくはその断片、並びに任意に医薬として許容し得る担体及び/又は希釈剤及び/又は賦形剤と一緒に含む混合物が提供される。
本発明の特定の実施態様において、本発明の及び本明細書で先に記載したような組成物及び混合物は、それぞれ、治療的有効量の該抗体及び生体活性物質を含む。
本発明の抗体と組み合わせた混合物中で好適に使用することができる他の化合物は、WO2008/065141号に記載されており(特に、37/38頁を参照)、これには、PEP阻害剤(43/44頁)、LiCl、ジペプチジルアミノペプチダーゼ阻害剤、好ましくは、DP IV又はDP IV様酵素阻害剤(48/49頁を参照);アセチルコリンエステラーゼ(ACE)阻害剤(47頁を参照)、PIMTエンハンサー、βセクレターゼ阻害剤(41頁を参照)、γセクレターゼ阻害剤(41/42頁を参照)、中性エンドペプチダーゼ阻害剤、ホスホジエステラーゼ-4(PDE-4)阻害剤(42/43頁を参照)、TNFα阻害剤、ムスカリンM1受容体アンタゴニスト(46頁を参照)、NMDA受容体アンタゴニスト(47/48頁を参照)、σ-1受容体阻害剤、ヒスタミンH3アンタゴニスト(43頁を参照)、免疫調節剤、免疫抑制剤、又はアンテグレン(ナタリズマブ)、Neurelan(ファムプリジン-SR)、campath(アレムツズマブ)、IR 208、NBI 5788/MSP 771(チプリモチド)、パクリタキセル、Anergix.MS(AG 284)、SH636、Differin(CD 271、アダパレン)、BAY 361677(インターロイキン-4)、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤(例えば、BB 76163)、インターフェロン-τ(トロホブラスチン)及びSAIK-MSからなる群から選択される薬剤;β-アミロイド抗体(44頁を参照)、システインプロテアーゼ阻害剤(44頁を参照);MCP-1アンタゴニスト(44/45頁を参照)、アミロイドタンパク質沈着阻害剤(42を参照)、並びにβアミロイド合成阻害剤(42頁を参照)が含まれ、この文献は、引用により本明細書中に組み込まれる。
別の実施態様において、本発明は、治療的有効量の、抗体、特に、本発明のモノクローナル抗体、又はキメラ抗体もしくはその断片、又は本発明の及び本明細書で先に記載したようなヒト化抗体もしくはその断片、並びに/或いは生体活性物質を含む混合物に関する。
本発明はさらに、抗体、特に、本発明のモノクローナル抗体、しかし特に、キメラ抗体もしくはその断片、又は本発明の及び本明細書で先に記載したようなヒト化抗体もしくはその断片、並びに/或いはこれらの機能的部分、並びに/或いは該抗体を含む医薬組成物、又は混合物の、続発性アミロイドーシス及び加齢関連アミロイドーシスを含む、アミロイド斑形成と関連する疾患及び障害の群であるアミロイドーシス、例えば、限定されないが、神経学的障害、例えば、アルツハイマー病(AD)、レヴィー小体型認知症、ダウン症、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血(オランダ型);グアム島パーキンソン認知症複合;並びにアミロイド様タンパク質に基づくか又はそれと関連する他の疾患、例えば、進行性核上麻痺、多発性硬化症;クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病、HIV関連認知症、ALS(筋萎縮性側索硬化症)、成人発症型糖尿病;老人性心アミロイドーシス;内分泌腫瘍、及び黄斑変性症を含むその他のものを含む疾患の作用を治療又は緩和する薬剤の調製における使用に関する。
また本発明によって含まれるのは、続発性アミロイドーシス及び加齢関連アミロイドーシスを含む、アミロイド斑形成と関連する疾患及び障害の群であるアミロイドーシス、例えば、限定されないが、神経変性疾患、例えば、軽度認知障害(MCI)、例えば、孤発性アルツハイマー病(SAD)又は家族性イギリス型認知症(FBD)及び家族性デンマーク型認知症(FDD)のような家族性アルツハイマー型認知症(FAD)のようなアルツハイマー病(AD)、ダウン症の神経変性;レヴィー小体型認知症、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血(オランダ型);グアム島パーキンソン認知症複合;並びにアミロイド様タンパク質に基づくか又はそれと関連する他の疾患、例えば、進行性核上麻痺、多発性硬化症;クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病、HIV関連認知症、ALS(筋萎縮性側索硬化症)、成人発症型糖尿病;老人性心アミロイドーシス;内分泌腫瘍、及び黄斑変性症を含むその他のものを含む疾患の作用を予防、治療、又は緩和する方法で使用される、特に、治療的有効量の、抗体、特に、本発明のモノクローナル抗体、しかし特に、キメラ抗体もしくはその断片、又は本発明及び本明細書で先に記載したようなヒト化抗体もしくはその断片、並びに/或いはこれらの機能的部分、並びに/或いは該抗体及び/又はその機能的部分を含む医薬組成物、又は混合物を調製する方法であって、抗体、特に、本発明のモノクローナル抗体、しかし特に、キメラ抗体もしくはその断片、又は本発明のヒト化抗体もしくはその断片を、医薬として許容し得る形態で製剤化することを含む、方法に関する。
さらに本発明によって含まれるのは、続発性アミロイドーシス及び加齢関連アミロイドーシスを含む、アミロイド斑形成と関連する疾患及び障害の群であるアミロイドーシス、例えば、限定されないが、神経変性疾患、例えば、軽度認知障害(MCI)、例えば、孤発性アルツハイマー病(SAD)又は家族性イギリス型認知症(FBD)及び家族性デンマーク型認知症(FDD)のような家族性アルツハイマー型認知症(FAD)のようなアルツハイマー病(AD)、ダウン症の神経変性;レヴィー小体型認知症、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血(オランダ型);グアム島パーキンソン認知症複合;並びにアミロイド様タンパク質に基づくか又はそれと関連する他の疾患、例えば、進行性核上麻痺、多発性硬化症;クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病、HIV関連認知症、ALS(筋萎縮性側索硬化症)、成人発症型糖尿病;老人性心アミロイドーシス;内分泌腫瘍、及び黄斑変性症を含むその他のものを含む疾患の作用を、抗体及び/又はその機能的断片、しかし特に、ヒト化抗体及び/もしくはその機能的断片、又はそのような抗体及び/もしくはその機能的断片を含む組成物もしくは混合物を、そのような障害に罹患した動物又はヒトに投与することによって予防、治療、又は緩和する方法であって、治療的有効量の該抗体を投与するを含む、方法である。
動物、特に、哺乳動物又はヒトに、抗体、特に、本発明の及び本明細書で記載したような医薬組成物を投与することによる、限定されないが、神経変性疾患、例えば、軽度認知障害(MCI)、例えば、孤発性アルツハイマー病(SAD)又は家族性イギリス型認知症(FBD)及び家族性デンマーク型認知症(FDD)のような家族性アルツハイマー型認知症(FAD)のようなアルツハイマー病(AD)、ダウン症の神経変性;特に、認知記憶能力の損失を特徴とする疾患又は状態を含む、続発性アミロイドーシス及び加齢関連アミロイドーシスを含む、アミロイド斑形成と関連する疾患及び障害の群であるアミロイドーシスの治療方法を提供することも本発明の目的である。
具体的な実施態様において、本発明は、動物、特に、哺乳動物又はヒトに、抗体、特に、本発明の及び本明細書で先に記載したような医薬組成物を投与することによって、認知記憶能力を保持するか又は増大させるための、しかし特に、記憶障害に苦しむ動物、特に、哺乳動物又はヒトの認知記憶能力を回復させるための方法を提供する。
治療的組成物及びそのような組成物を生産する方法、並びに本発明の及び本明細書で先に記載したような抗体を用いる、限定されないが、神経変性疾患、例えば、軽度認知障害(MCI)、例えば、孤発性アルツハイマー病(SAD)又は家族性イギリス型認知症(FBD)及び家族性デンマーク型認知症(FDD)のような家族性アルツハイマー型認知症(FAD)のようなアルツハイマー病(AD)、ダウン症の神経変性;特に、認知記憶能力の損失を特徴とする疾患又は状態を含む、続発性アミロイドーシス及び加齢関連アミロイドーシスを含む、アミロイド斑形成と関連する疾患及び障害の群であるアミロイドーシスの治療方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
特に、本発明は、認知記憶能力の保持をもたらす、認知記憶能力の損失を特徴とするアミロイド関連状態に苦しむ動物、特に、哺乳動物又はヒトの治療に関する。
(1.材料及び方法)
(1.1 細胞培養技術)
(1.1.1 ハイブリドーマ細胞及び抗体のスクリーニング)
Aβ種に対するモノクローナル抗体(mAb)を産生するマウスハイブリドーマ細胞は、Biogenes GmbH社(Berlin)から提供された。雌BALB/cマウスを、C-末端システイン残基にキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)タンパク質が連結された化学合成抗原Aβ(pE11-14)で免疫化した。KLHタンパク質は強力な免疫原であり、ワクチンキャリアタンパク質として適用された。
免疫化したマウスの脾臓細胞及びマウス骨髄腫細胞株SP2/0-Ag14を用いて細胞融合を行なった。細胞融合後、ハイブリドーマ細胞をヒポキサンチンアミノプテリンチミジン培地(HAT)で選択した。したがって、HAT培地は、B細胞由来のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)遺伝子と骨髄腫細胞由来の腫瘍形成特性とを受け継いでいるハイブリドーマ細胞の選択を可能にする。その後、ハイブリドーマ上清をAβ(pE11-14)に対する特異的mAbの存在についてスクリーニングした。mAbを、様々な修飾Aβ-ペプチドに結合するその能力に関して調べた。したがって、Aβ-ペプチドをヒドロキシ-セルロース-メンブレンにスポットし、細胞培養上清由来のmAbとともにインキュベートし、標識抗体により検出した。N-末端修飾Aβ11(pE)ペプチドに対する特異的mAbを産生し、かつ他の修飾Aβ-ペプチドとの顕著な交差反応を示さなかったハイブリドーマ細胞(表1を参照)を再クローニング用に選択した。限界希釈技術によって、ハイブリドーマ細胞をクローニングし、1つの単離クローンを得た。
以下のハイブリドーマクローンは、再クローニング後に安定であり、これらは、BioGenes社から提供されたものであった:
pEVHH-59025 13-11-6(クローン13)
本研究は、細胞培養上清中でmAbを産生するために、ハイブリドーマ細胞の培養に成功することを目的としていた。このクローンの細胞培養上清中のmAb濃度は、表面プラズモン共鳴(SPR)により決定することとした。さらなる目的は、培養の最適化であり、それにより、血清含有培地から無血清培地へのハイブリドーマ細胞の適応を行ない、mAbの精製を簡単にすることとした。さらに、このmAbを、精製し、生物物理学的に特徴付け、アッセイで適用するか、又は免疫染色に用いることとした。
Figure 2014509860
(1.1.2 ハイブリドーマ細胞の培養)
ハイブリドーマ細胞を、細胞培養フラスコ中、37℃で、及び5％CO2の加湿雰囲気で培養した。培養用D-MEM培地(L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、4.5g/lグルコース入り、Invitrogen社)に、15％FBS及び1％MEM-NEA(非必須アミノ酸、Invitrogen社)を補充した。培養培地の使用直前に、50mM β-メルカプトエタノールのストック溶液及び200mM L-グルタミンの新鮮な解凍ストック溶液を、少なくとも50μM β-メルカプトエタノール及び2mM L-グルタミンの最終濃度で用いた。細胞の継代培養を、ルーチンに、細胞密度に応じて、週に2回行なった。細胞密度は、1×106〜2×106生細胞/mlであることとした。ハイブリドーマ細胞の継代のために、部分的接着細胞を、細胞懸濁液をピペッティングで慎重に上下させることによりボトルの底から剥離させ、ファルコンチューブに移し、300×gで5分間遠心分離した。その後、mAbを含む細胞培養上清を吸引し、その後、リザーバに収集して、4℃で貯蔵した。SPR測定のために、試料(100μl)を細胞培養上清から採取した。細胞ペレットを新鮮な培養培地で再懸濁した後、細胞密度を、Casy(登録商標) Cell Counter(Scharfe System GmbH社、Reutlingen)を用いることにより決定した。したがって、細胞懸濁液をCasy(登録商標)ton(生理食塩水溶液)に10倍希釈し、その後、100μlの細胞希釈液を9900μl Casy(登録商標)tonに移した。この装置は、電流排除により、生細胞及び死細胞の量、並びに試料中の1ml当たりの全細胞量を決定した。無傷の細胞膜を有する生細胞が電流を排除するのに対し、欠陥細胞膜を有する死細胞は導電性となる。その後、細胞を、細胞成長に応じて、1×105〜5×105生細胞/mlの密度で、T型フラスコ(要件に応じて、25cm2〜175cm2)中に播種した。
(1.1.3 ハイブリドーマ細胞の凍結保存)
対数成長期にあり、かつ85％を超える生存率を有するハイブリドーマ細胞を凍結保存した。細胞の凍結は、できるだけ早く、少ない継代数で行なうこととした。ハイブリドーマ細胞を300×gで5分間遠心分離し、7×106生細胞/mlの濃度で、45％培養培地(D-MEM、1％MEM-NEA、15％FBS)、45％非働化胎仔ウシ血清(FBS)、及び10％ジメチルスルホキシド(DMSO)に再懸濁した。細胞懸濁液を1mlアリコートでクライオバイアルに素速く移した。1分間当たり1℃の緩徐な冷却速度を保証するために、クライオバイアルを、QUALIFREEZEのイソプロピルアルコールで満たした凍結容器の内部に入れた。この凍結容器を-80℃で最大48時間貯蔵した。その後、クライオバイアルを-196℃の液体窒素に移した。
(1.1.4 ハイブリドーマ細胞の解凍)
液体窒素中で貯蔵したハイブリドーマ細胞を、氷の塊が内部に少ししか残らなくなるまで、37℃の水浴中で急速解凍した。使用された凍結培地は、4℃よりも高い温度で細胞毒性効果を有するDMSOを含んでいた。したがって、細胞培養培地は、4℃に冷却することとした。細胞懸濁液をファルコンチューブ中に移し、5mlの4℃の培養培地で液滴希釈した。細胞をすぐに300×gで5分間遠心分離し、細胞毒性のある凍結防止剤DMSOを含む上清を吸引した。細胞ペレットを37℃の加熱細胞培養培地に再懸濁し、25cm2 T型フラスコに、1 ml当たり5〜7×105生細胞の細胞密度で播種した。
(1.1.5 汚染のスクリーニング)
ハイブリドーマ細胞を2カ月毎にマイコプラズマ汚染について調べた。したがって、Lonza社製のMycoAlert(登録商標)マイコプラズマ検出キットを用いて、細胞培養上清を検査した。このアッセイは、特定のマイコプラズマ酵素の活性を利用する選択的生化学検査である。生きたマイコプラズマを溶解させると、その酵素がMycoAlert(商標)基質と反応して、ADPからATPへの変換を触媒する。放出される光の強度がATP濃度と相関するので、ATPレベルの増加を、生物発光反応を用いて検出することができる。
したがって、細胞培養上清の試料を200×gで5分間遠心分離し、その後、100μlのハイブリドーマ上清を100μlのMycoAlert(商標)試薬と96ウェルプレート中で混合し、室温で5分間インキュベートした。発光をルミノメーターGeniosPro(Tecan社)で測定し、その後、100μlのMycoAlert(商標)基質を添加し、室温で10分間インキュベートし、発光を再び測定した。1回目の発光測定に対する2回目の発光測定の比が1未満の場合、細胞は汚染されていない。
(1.1.6 振盪フラスコでのハイブリドーマ細胞培養)
ハイブリドーマ細胞は、静止懸濁培養(例えば、T型フラスコ)で、及び撹拌懸濁培養(例えば、振盪フラスコ)で成長する。抗体産生のために、ハイブリドーマ細胞を、T型フラスコ中での静止培養と並行して、約7日間、振盪フラスコ中で培養した。細胞を、3×105及び5×105細胞/mlの密度で振盪フラスコ中に播種した。細胞培養培地(D-MEM、1％MEM-NEA、15％FBS、又は超低IgG FBS)に、0.5％ゲンタマイシン、50μM β-メルカプトエタノール、及び2mM L-グルタミンを補充した。最適なガス交換を促進するために、全振盪フラスコ体積の約30％しか培地で満たさなかった。振盪フラスコ中の懸濁培養物を、37℃、5％CO2でインキュベートし、80rpmで回転させた。7日間のインキュベーションの後、細胞懸濁液をピペットでファルコンチューブに移し、500×gで10分間遠心分離した。その後、抗体を含む細胞培養上清をリザーバに収集し、4℃で貯蔵した。SPR測定のために、細胞培養上清の試料を採取した。細胞ペレットを廃棄した。
(1.1.7 ハイブリドーマ細胞の無血清培地への適応)
無血清培地の適用は、血清補充培地とは対照的に、産生されたmAbの精製を簡単にする。無血清培地は、BSA及びウシ免疫グロブリン(例えば、IgG)を含まず、mAbの精製を容易にする。高い細胞生存率及び抗体産生率を保証するために、細胞を、血清濃度の段階的低下によって、血清含有培地(D-MEM、15％FBS、1％MEM-NEA)から無血清条件へと適応させなければならない。したがって、細胞は、適応前に、穏やかな対数成長期にあり、生存率は90％超であることとした。以下の様々な無血清培地及び無タンパク質培地を試験した(表2を参照)。
Figure 2014509860
試験された全ての培地に0.5％ゲンタマイシンを補充した。培養培地の使用直前に、50μM β-メルカプトエタノール及び2mM L-グルタミンを添加した。無血清培地適応と並行して、5μg/ml未満のIgGを含有する15％超低IgG-FBS(Invitrogen社)を含む培養培地(D-MEM、1％MEM-NEA)も試験した。FBSが存在したため、細胞はこの培養培地にすぐに適応した。したがって、細胞を、4×105生細胞/mlの播種密度で、15％超低IgG-FBSを含む培養培地に継代培養した。細胞のさらなる継代培養を、ルーチンに、細胞密度に応じて、週に2回行なった。
ハイブリドーマ細胞を、175cm2 T型フラスコ中、37℃で、及び5％CO2の加湿雰囲気で培養した。
(1.1.8 成長曲線の作成)
7日間にわたる成長曲線を無血清培地及び血清含有培地中でのハイブリドーマ細胞成長の長期解析用に作成した。ハイブリドーマ細胞を振盪フラスコ中で培養した。したがって、125ml-振盪フラスコに、30mlの作業容量の細胞懸濁液を、37℃、5％CO2で播種し、80rpmで振盪させた。細胞培養上清中の細胞数及び抗体濃度の決定のために、定期的に、300μlの試料を振盪フラスコから得た。培地の最適化のために、15％FBS又は15％超低IgG-FBS(Invitrogen社)を含む血清含有培地、並びにPAA社及びGIBCO社製の無血清無タンパク質培地を試験した。
(1.2 抗体精製)
(1.2.1 親和性クロマトグラフィー)
ハイブリドーマ細胞培養上清中に濃縮されたmAbを親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。したがって、6％架橋デキストラン支持材(GE Healthcare社、Uppsala)にカップリングした組換えプロテインGを含むHiTrap プロテインG HP(5ml)カラムを用いた。プロテインGは、G群連鎖球菌細菌の細胞表面タンパク質であるが、これは、非免疫機構によって哺乳動物IgGのFc領域に結合するIII型Fc受容体である。Fc受容体は、アルブミンの結合領域も有する。しかし、アルブミン結合部位は、組換え型のプロテインGから遺伝的に欠失されており、その結果、アルブミンとの望ましくない交差反応を回避し、したがって、FBSを含有する細胞培養上清からの抗体の精製が可能となる。しかしながら、プロテインGは、マウスIgGの他に、ウシIgGにも結合する。この理由により、ハイブリドーマ細胞の培養には、5μg/ml未満のIgGを含有する超低IgG-FBS(Invitrogen社)を用い、また、無血清及び無タンパク質培地もハイブリドーマ培養に用いた。
親和性クロマトグラフィーは、Akta(商標)Purifier(GE Healthcare社)で行なった。最初に、カラムを脱気した再蒸留水(bi-distilled water)ですすぎ、防腐用エタノールを除去した。カラム全体を4℃で冷却した。その後、抗体結合のための最適なpH7及び好適なイオン強度を保証するために、プロテインGカラムを1×結合バッファー(20mM Na2HPO4、pH7.0)で平衡化した。細胞培養上清を38400×g(Avanti J-30I、BECKMAN COULTER社)で4℃で30分間遠心分離して、残存する細胞断片を除去した。クロマトグラフィーのために、細胞培養上清を1:1で2×結合バッファー(40mM Na2HPO4、pH7.0)と混合した。カラムに対するプローブの適用は、Akta(商標)Purifiers P-950の試料適用ポンプを1.5ml/分の流量で一晩用いて行ない、それにより、上清を氷冷した。それに関して、最大許容全圧は0.3MPaを超えてはならなかったが、それは、超過圧力によって支持材のゲル床が破壊される可能性があったからである。この後、余分でかつ非特異的な成分を、結合バッファーで、その後、0〜2M NaClの勾配で5カラム体積かけてカラムから洗浄した。その後、カラムを1×結合バッファーで再び洗浄した。抗体をカラムから溶出させるために、2つの異なる方法を試験した。タンパク質を2.5ml/分の逆流で溶出させ、280nmでの吸収が増加するとともに、画分を収集した。第一の溶出方法は、酸性の0.1Mグリシン-HCl溶液(pH2.7)を用いてバッファーの切替えにより行なった。pH変化のために、結合した免疫グロブリンがプロテインGから放出され、その後、収集された。溶出後、溶出画分のpHを、1M Tris-HCl、pH9.0による滴定によって、すぐに中和した。カラムを1×結合バッファーですすぎ、カラムをpH7.0に平衡化した。第二の方法は、0〜2Mチオシアン酸カリウム(KSCN)の勾配で5カラム体積かけて行なった。この方法では、pHは7.0で一定のままである。抗体とプロテインGの相互作用は、KSCNによって緩くなった。溶出後、カラムを1×結合バッファーですすいだ。
その後、抗体溶液をすぐに透析して、バッファーを交換した。
(1.2.2 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE))
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法は、タンパク質を電場内でのその分子量によって分離するために用いられる。洗剤のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を用いて、ポリペプチドの固有の電荷をポリペプチドに対するSDSの蓄積(1.6アミノ酸当たり約1分子)によって隠した。それに関して、電気泳動移動度はタンパク質の分子量に大きく左右される。タンパク質の還元のために、プローブをSDS試料バッファー(Roti(登録商標)-Load 1、BioRad社)で1:3(v/v)の割合で希釈し、95℃で10分間インキュベートした。SDS試料バッファーは、タンパク質のジスルフィド結合を還元するβ-メルカプトエタノールを含み、抗体の重鎖と軽鎖を生じさせる。還元すべきでない試料は、β-メルカプトエタノールを含まない試料バッファー(250mM Tris-HCl pH8.0、5％(w/v)SDS、50％(v/v)グリシン、0.005％(w/v)ブロモフェノールブルー)で希釈した。バッファーを試料と1:4(v/v)の割合で希釈した。試料をポリアクリルアミドゲルに適用する前に、プローブを、30℃で30分間、軽く振盪させた。本研究では、解析すべき抗体の存在及び純度の検討のために、親和性クロマトグラフィーの画分(第1.2.1章を参照)をSDS-PAGEで調べた。タンパク質の分離を12％ポリアクリルアミドゲル(組成については、表3を参照)中で行なった。電気泳動を、1×ランニングバッファー(30.3g/l Tris、10g/l SDS、144g/lグリシン)を満たした水平カッティングチャンバー内で行ない、100Vで10分間から始めて、その後、200の定電圧に上昇させた。プローブの他に、プレステインタンパク質ラダー(10〜250kDa、Fermentas社)を分子量を参照として適用した。
タンパク質をクマシーブリリアントブルー-G250で30分間染色した。この後、ゲルを、10％酢酸で数時間かけて脱染した。
Figure 2014509860
(1.2.3 タンパク質の透析及び高濃縮(upconcentration)
透析膜の半透性を用いることによる貯蔵バッファー(2mM EDTAを含むD-PBS(pH7.13))中での抗体溶液の変換のために、透析を用いた。親和性クロマトグラフィーによる抗体精製の後、抗体を含む溶出画分を透析した。最初に、チューブの半透性、柔軟性を得るために、及び防腐剤を除去するために、透析チューブを蒸留水に浸漬させた。6〜8kDaのカットオフ閾値を有する透析チューブを抗体溶液で満たし、貯蔵バッファーに懸濁させた。この後、抗体溶液を、4℃で一晩、常に撹拌しながら、試料の100倍の容量に対して透析した。その後、濃度をUV/VIS分光法で決定した。抗体溶液を、5kDaのカットオフ閾値を有するVIVASCIENCE社製のVIVASPIN 20ml CONCENTRATOR“-チューブを用いて、少なくとも2mg/mlに高濃縮した。抗体溶液を、4℃及び3500×gで、Sigma社製のSwing-Out-Rotor中で遠心分離した。最後に、抗体を、2mM EDTAを含むD-PBS(pH7.13)に対して透析した。
(1.2.3.1 抗体のビオチン化)
mAbマウス抗Aβ11(pE)(クローン13)のビオチン化は、Aβ11(pE)ELISAで、生体試料中のAβ(pE11-x)ペプチドを特異的に検出する抗体として適用するために必要とされた。検出のために、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼポリマーをビオチン化抗体に添加し、それにより、ストレプトアビジンとビオチンの間での強い非共有結合的相互作用が形成された。
ビオチン化は、濃縮抗体を用いて行なった(第1.2.3節を参照)。最初に、精製され、濃縮されたmAbをビオチン化バッファー(100mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH7.2)に対して4℃で一晩透析した。その後、タンパク質濃度をUVスペクトルにより決定した(第1.3.1節を参照)。ビオチン化剤(NHS-PEO4-ビオチン)を蒸留水に溶解させて、20mM溶液を調製した。反応を1:6の抗体:ビオチンのモル比で行ない、4℃で4時間インキュベートした。抗体と活性化ビオチンの間の反応は、1M Trisバッファー、pH9.0を、反応混合物の量に対して50倍過剰で添加して停止させ、その後、4℃で1時間インキュベートした。抗体-ビオチン溶液を、透析バッファー(D-PBS、2mM EDTA)に対して、4℃で2日間かけて2回透析し、タンパク質濃度をUVスペクトルにより決定した(第1.3.1節を参照)。取り込まれたビオチンレベルの概算のために、100μlのHABA-アビジン溶液を800μlの透析バッファーに添加し、測定キュベット中で10分間インキュベートし、その後、UV-分光計UV1でA500を測定した。その後、100μlの抗体-ビオチン溶液をキュベット中の溶液に添加し、混合し、吸収A500を、値が少なくとも15秒間一定にとどまったときに、再び測定した。ビオチンはアビジンとの複合体を形成し、500nmでの吸収の低下をもたらす。その後、ビオチン取込みのレベル(タンパク質1モル当たりのビオチンのモル)を計算した。
(1.3 抗体の生物物理学的特徴付け方法)
(1.3.1 UV/VIS-分光法)
抗Aβ11(pE)抗体の精製後、UV/VISスペクトルを決定した。タンパク質濃度の決定のために、280nmでの吸収、さらには240nm〜339nmのUVスペクトルを、Thermo Scientific社のUV-分光計UV1で測定した。タンパク質濃度を吸収A280及び減衰係数により決定した。ε＝1.5の減衰係数を抗Aβ11(pE)抗体について仮定した。
(1.3.2 CD分光法による熱力学的なタンパク質安定性の決定)
精製抗Aβ11(pE)抗体を10mM NaH2PO4(pH7.14)に対して透析した。濃度をUV/VIS分光法により決定した(第1.3.1節を参照)。CD分光法のために、抗体を0.13mg/mlの濃度に希釈し、石英ガラスキュベット(d＝0.1cm)に入れた。CDスペクトルをJasco J-710分光旋光計(Jasco GmbH社、Groβ-Umstadt)で190〜260nmで測定した。20℃の温度でのスペクトルを20回蓄積して測定した。その後、温度を20℃〜最大80℃に上昇させ、それにより、楕円率を5℃間隔で10回蓄積して測定した。発熱率は30K/hであり、温度は、各測定の前に180秒間平衡化された。
(1.3.3 表面プラズモン共鳴(SPR))
(1.3.3.1 CM5チップ上へのリガンドの固定化)
ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)中に-80℃で貯蔵された合成Aβ(pE11-30)ペプチドを室温で解凍した。このペプチドを含むチューブをドラフト下で一晩開けたままにして、溶媒のHFIPを蒸発させた。10mM酢酸ナトリウム、pH5を用いて、ペプチドを1mg/mlの濃度に希釈した。
使用されたCM5チップは、カルボキシル化デキストランマトリックスを有する。ペプチドAβ(pE11-30)のカップリングのために、アミンカップリング法を用いた。ペプチドカップリングの前に、センサーチップ表面を活性化する必要があった。したがって、活性化試薬の0.4M 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノ-プロピル)-カルボジイミド(EDC)及び0.1M N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を1:1の比で混合し、10μl/分で8分間、CM5チップに対して注入した。その後、ペプチドのカップリングを続けた。最初に、10mMオルトリン酸二水素カリウム、pH6中の10μg/mlのペプチドAβ(pE11-30)を10μl/分の流速で5分間注入した。シグナルの立ち上がりが小さかったので、ペプチドをより高い濃度でpH5の溶液に希釈して、再び適用した。10mM酢酸ナトリウム、pH5中の50μg/mlのペプチドAβ(pE11-30)を10μl/分の流速で20分間注入した。弱酸pHをカップリングに選び、静電気引力によるセンサー表面(カルボキシル基の負の正味電荷)でのペプチド(正の正味電荷)の予備濃縮をもたらした。チップ表面での2つのアミノ酸リジン(ペプチド位置16及び28)と活性化カルボキシル基との反応によって、ペプチドの共有結合が形成された。余分な反応性エステル基を、1Mエタノールアミン、pH8.5で、10μl/分の流速で10分間不活化した。固定化されなかったペプチドを0.1M HCl(3×10μl)の注入により除去し、その後、チップをランニングバッファーで一晩すすいだ。最終的に、シグナルは、約1000反応単位(RU)となり、それにより、チップ表面はペプチドで飽和していた。したがって、コーティングされたチップを細胞培養上清からの抗Aβ11(pE)の抗体含有量の決定のために用いた。
(1.3.3.2 抗Aβ11(pE)抗体の定量)
抗Aβ11(pE)抗体濃度の測定のために、Aβ(pE11-30)がコーティングされたCM5チップを用いた。チップ表面をペプチドで飽和させると、シグナルは約1000応答単位(RU)となった(第1.3.3.1節を参照)。細胞培養上清中に含まれるmAbを、抗体解析のためにランニングバッファー(HEPES EDTAバッファー(HBS-EP)、Biacore社)に適切に希釈した。最初に、センサーチップのフローセルをランニングバッファーですすいだ。その後、抗原に対する抗体の結合を特徴付けるために、抗Aβ11(pE)を含む抗体溶液を30μl/分の流速で300秒かけて注入した。未修飾のフローセルを参照として用いた。これは、抗体とマトリックスとの非特異的な相互作用しか示さないはずである。その後、ランニングバッファーを切替えバルブによって再び自動的に注入し、抗体の解離を誘発させた。最後に、チップを0.1M HCl(10μl)の注入によって再生し、それにより、残存する抗体をセンサー表面から除去した。結合の評価は、プログラムBIAevaluation(Biacore社、Freiburg)によって行なった。
細胞培養上清の試料中の抗体濃度の定量のために、ハイブリドーマクローン13から精製され、透析されたmAbのUV/VIS分光法により決定される既知濃度の標準曲線を決定した。mAbを第1.2.1節に記載の通りに精製した。最高標準濃度については、10μg/ml mAbをランニングバッファーに適用し、基数2の分割を行なうことによって、0.04μg/mlの最低濃度まで希釈した。
(1.3.3.3 SPRによる交差反応性の決定)
ピログルタメート-ペプチドAβ3(pE)、Aβ11(pE)、CCL2(MCP-1として知られる)、CCL8(MCP-2として知られる)、大ガストリン、ゴナドリベリン、ニューロテンシン、オレキシンA、フィブロネクチン、コラーゲン1、及びTRH(チロトロピン放出ホルモン)に対する抗Aβ11(pE)抗体(クローン13)の交差反応性をSPRにより試験した。したがって、高濃度のピログルタメートペプチドが固定化されたCM5チップを用いた。抗体クローン13をランニングバッファーに希釈し、1μg/mlで30μl/分の流速で300秒かけて注入した。
(1.3.4 等温滴定熱量測定(ITC))
(1.3.4.1 熱力学的パラメータの決定)
ITCにより、クローン13由来の抗Aβ11(pE)抗体の抗原Aβ11(pE)に対する結合の熱力学的パラメータを決定した。ITC実験については、親水性PEG基が親水特性を与えるという理由で、ペプチドAβ(pE11-18)-PEGを用いたため、ペプチドをITCバッファーに直接溶解させることができた。Aβ(pE11-20)を用いた以前の実験は、ペプチドの強い疎水性のために、1〜2％DMSOを用いてしか行なうことができず、それを、ITC結合特性に影響を及ぼし得るDMSOに溶解させる必要があった。最初に、抗体をITCバッファー(150mM NaCl、25mM Na2HPO4、25mM KH2PO4、1mM EDTA、pH=7.1)に対して4℃で一晩透析した。-20℃で貯蔵された凍結乾燥ペプチドを、抗体透析に使用されるのと同一のITCバッファー、pH＝7.1に溶解させた。抗体と抗原は両方とも同一の溶液中になければならず、さもなければ、大きな希釈熱によって、所望の観察結果が見られなくなる。ITC実験の前に、抗体の濃度をUV/VIS 分光法により決定した(第1.3.1節を参照)。最初に、例えば、5.13μMの抗体(表4を参照)を試料セルに添加し、参照セルを蒸留水で満たした。その後、抗原を、例えば、81.78μM(表4を参照)で試料セルに注入した。抗体が2つの結合部位を有するということを念頭に置いて、抗原は、通常、抗体に対して2倍過剰であることとし、抗原は、抗体に対して少なくとも4倍過剰でセルに存在した。30回の注入(1×2μl及び29×10μl)を行ない、次の注入までの間を4分間隔とした。反応熱の測定を20℃で行なった。さらに、ITCバッファー(pH＝7.1)中への滴定による抗原の希釈によってしか生成されない反応熱を決定した。したがって、抗原をITCバッファーで満たした試料セルに注入した。抗体に対する抗原の滴定時に生成される反応熱をこの値について補正した。生データの解析、並びに会合定数(KA)、反応化学量論比(n)、結合エンタルピー(ΔH)、及びエントロピー(ΔS)の決定をOriginソフトウェアのMicroCalを用いて行なった。
ITCにより、KSCN勾配(pH7.0)で、0.1Mグリシン-HCl(pH2.7)で、プロテインGカラムから溶出された抗Aβ11(pE)抗体、さらにはビオチン化抗体の結合パラメータを解析した。表4に、使用された抗原及び抗体濃度を記載する。
Figure 2014509860
グリシン溶出抗Aβ11(pE)抗体は、該抗体が酸性溶出によって一部不活化されると推測されたため、KSCN溶出抗体よりも高い濃度で適用された。
(1.4 モノクローナル抗Aβ11(pE)抗体の適用)
(1.4.1 研究PBD-0316)
AD患者(n＝13)及び30人の健常対照由来の血漿及び血清試料を本研究で解析した。この43の解析試料は初期研究に由来するものであり、これらは、CRO(GALMED GmbH)を通じて集められた。これらの試料は、ADの臨床診断を有する患者及び対照群から得られたものであった。研究前の検査において、本研究の参加者全員の神経心理学的機能をいくつかの心理試験(DemTect、ミニメンタルステートテスト、時計描画テスト)により試験した。DemTectスケールは、5つの短い下位テスト(10単語のリストの反復、数字の変換、意味的単語の流暢性課題、逆方向数唱、単語リストの遅延再生)を含む、認知症についての簡易スクリーニングテストである(Kesslerらの文献、2000, Psycho 26 343-347)。ミニメンタルステート検査(MMSE)又はFolsteinテストは、認知を評価するために用いられる30点の簡易アンケートテストである。それは、認知症についてスクリーニングするために医療で一般に用いられる。約10分間で、それは、計算力、記憶、及び見当識を含む様々な機能をサンプリングする。このテストは、いくつかの領域の簡単な質問及び問題:テストの時間及び場所、単語リストの反復、計算力、言語使用及び理解、並びに基本的な運動能力を含む。
時計の採点(時計描画テスト)は、Shulmannらの文献(1986)で用いられた尺度の変法をベースにした。円は全て予め描かれており、対象に対する指示は、「11時10分を正しい位置に配置する」ことであった。
研究前の検査の後、研究を開始し、ゼロ時点と定義される2週間後に参加者全員から採血した。ADバイオマーカーの決定用の全血液試料を、EDTA血漿用のカリウム-EDTA及び血清用のブランクを含むポリプロピレンチューブ(Sarstedt Monovette社)に収集した。全試料を、静脈穿刺によるか、又は挿入された前腕静脈留置カニューレからの反復採血によって収集し、1550g(3000rpm)で4℃で10分間遠心分離して、血漿を得た。試料は、採血後1時間以内に遠心分離した。各々別々の試料の血漿又は血清をピペッティングして除去し、1本の5mlポリプロピレンクライオチューブに充填し、−80℃で凍結保存した。3;6、及び12カ月後、血液を参加者全員から再び採取し、上記の通りに操作した。
(1.4.2 自己-Ig ELISA)
(1.4.2.1 自己-Ig-ELISAの実施及び確立)
アルツハイマー病(AD)患者及び健常対照由来の血漿試料中の自己免疫グロブリンの解析のために、自己-Ig-ELISAを実施し、確立した。特に、Aβペプチド及びBri2ペプチドのpE-N-末端に対する自己免疫グロブリンを試験することとした。自己-Ig-ELISAは、直接サンドイッチELISAの原理に従って構築される。したがって、ストレプトアビジンコーティングされたマイクロプレート(Thermo Scientific社)を、C-末端でビオチン化されているペプチドAβ(pE3-12);Aβ(pE11-20)、及びBri2(1-23)の固定化に用いた。最初に、ストレプトアビジンプレートを300μlの洗浄バッファー(25mM Tris、150mM NaCl、0.05％Tween、0.1％BSA)で3回洗浄して、プレートを清浄化し、防腐剤を除去した。その後、100μlの200ng/mlのペプチド溶液を添加し、室温(RT)で2時間インキュベートした。マイクロプレート(MTP)をカバーシートで覆って、インキュベーション時間中の蒸発を防止した。MTPを、200μl/ウェルのTween 20を含まないELISA-Blocker(ELISA-Blocker(-T))でブロッキングし、RTで1時間インキュベートした。この後、300μlの洗浄バッファーで3回洗浄することにより、未結合のペプチドを除去した。EDTA-血漿試料をELISA-Blocker＋Tween 20(ELISA-Blocker(+T))に適当に希釈した。校正曲線のために、基数2の分割を行なうことにより、mAbをELISA-Blocker(+T)又は洗浄バッファーに希釈した。希釈した標準及びEDTA-血漿試料を1ウェル当たり100μlでMTPに移した。決定量に応じて、試料及び校正物質をいくつかのウェルにピペッティングして入れた。4℃で2時間のインキュベーション時間の後、新たな洗浄サイクルを続けた(300μl/ウェルの洗浄バッファーで3回)。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)とコンジュゲートしたポリクローナルウサギ抗マウスIgを校正物質の検出に用いた。HRPとコンジュゲートしたポリクローナル抗ヒトIgであるIgG、IgG2、IgG3、IgM、又はIgAを、酵素コンジュゲート溶液として、EDTA-血漿からの自己免疫グロブリンの検出に用いた。酵素コンジュゲート溶液をELISA-Blocker(+T)で1μg/mlの濃度に希釈した。各ウェル中に、100μlの酵素コンジュゲート溶液をピペッティングし、4℃で1時間インキュベートした。洗浄サイクル(300μl/ウェルの洗浄バッファーで3回)を続けた。テトラメチルベンジジン(TMB、色原体)及び過酸化水素(基質)を含むペルオキシダーゼ基質溶液Sure Blue(KLP社)を100μl/ウェルで添加した。HRPは、2つの過酸化水素分子の水と酸素への分解を触媒し、それにより、色原体TMBのアミノ基由来の2つの電子が基質に転移される。TMBからの電子の放出(酸化)によってラジカルカチオンが生じ、これが二量体化によって安定化されて、典型的な青色を呈する。したがって、色原体の色は、電子の転移によって無色から青色へと変化させられる。溶液の色の強度は、検体濃度に比例する。RTで30分間のインキュベーションの後、酵素反応を1M H2SO4溶液でペルオキシダーゼの不活化により停止させ、TMBの二量体化を無効化した。不均衡化の後、強い黄色の二価カチオンが形成された。吸収を450nmの波長で測定し、540nmでの吸光度で補正した。450nm及び540nmでの吸収をTECAN Sunriseプレートリーダーで測定した。
抗Aβ3(pE)、抗Aβ11(pE)、及び抗Bri2(1-23)ELISAを、記載されているプロトコル(表5を参照)に従って完全に確立した。ELISAの確立のために、製造業者(Thermo Fisher Scientific社)の標準プロトコルをモデルとして用いた。固定化される抗原の濃度、検出抗体、並びにインキュベーション時間及び温度、並びに洗浄サイクルなどの様々なパラメータを最適化した後、以下のプロトコルを作成した。
Figure 2014509860
自己-Ig-ELISAの確立後、AD患者及び健常対照由来の血漿試料を試験した。したがって、AD患者由来の13の血漿試料及び健常対照由来の30の血漿試料を解析した。血漿試料は、AD/MCIの臨床診断を有する患者、及び健常対照群から得られたものであった。この43の血漿試料は、GalMed Medical Research Companyとの共同で行なわれた研究PBD-0316に由来するものである。6カ月後に収集された血漿試料(T0+6)を用いた。タンパク質分解を防止するために、及び試料を保護するために、血漿試料に、プロテアーゼ阻害剤及びEDTAを添加した。したがって、1mlの血漿に、25μlのプロテアーゼ阻害剤溶液を添加した。プロテアーゼ阻害剤溶液のために、プロテアーゼ阻害剤の錠剤であるComplete Miniを1mlのPBSに溶解させた。その後、解析される血漿の一定品質を保証するために、試料を分注し、-80℃で保存した。
(1.4.3 Aβ(pE11-x)ELISAの確立)
例えば、マウスモデルの大脳のAβ(pE11-x)ペプチドの解析のために、Aβ(pE11-x)ELISAを確立することとした。血漿又はCSF中のpyroGlu Aβペプチドの検出は、オリゴマーの血液脳関門通過が低下する高い凝集傾向のために不可能である。
Aβ11(pE)ELISAをサンドイッチELISAの原理に従って構築し、モデルとして、Aβ3(pE)ELISAの従来のプロトコルを適用した。市販のモノクローナルマウス抗Aβ(17-24)抗体(クローン4G8、Covance社)をマイクロプレートの表面に吸着させる捕捉抗体として用いた。捕捉されたAβ(pE11-x)に結合したモノクローナルビオチン化抗Aβ11(pE)抗体を、ストレプトアビジン-HRP(SA-HRP)コンジュゲートの添加により検出した。この確立は、合成Aβ(pE11-30)及びAβ(pE11-40)ペプチドを用いて行なわれた。ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)中に-80℃で貯蔵されたAβペプチドを室温で解凍した。このペプチドを含むチューブをドラフト下で開けたままにして、溶媒のHFIPを蒸発させた。ペプチドを100mM NaOHに溶解させ、RTで10分間インキュベートし、0.05％Tween及び1％BSAを含むEIA-バッファーに希釈した。Aβ(pE11-x)ELISAを表6の記載されたプロトコルに従って行なった。
Figure 2014509860
サンドイッチELISAに加えて、マイクロプレートでの吸着抗原Aβ(pE11-30)による直接ELISAを行ない、モノクローナル抗Aβ(17-24)-ビオチン抗体(クローン4G8)及びモノクローナル抗Aβ11(pE)-ビオチン抗体(クローン13)を直接試験した。ビオチン化抗体をストレプトアビジン-HRP(SA-HRP)コンジュゲートの添加により検出した。直接ELISAの確立されたプロトコルを表7に示した。
Figure 2014509860
(1.4.4 免疫組織化学)
免疫組織化学(IHC)画像は、BostonのHarvard Medical SchoolのQiaoqiao Shi(C. Lemereの研究室)から好意により提供された。
IHCにより、抗原Aβ(pE11-x)及びAβ(pE3-x)は、脳組織切片中に局在化した。したがって、抗Aβ11(pE)抗体(クローン13)をpyroglu Aβペプチドの検出に用いた。
IHCのために、AD患者由来の海馬及び前頭皮質のヒト脳組織切片、及びさらにAPP/PS1トランスジェニックマウス由来の海馬の脳組織切片を用いた。APP/PS1マウスは、現在、アミロイド沈着の機構に関する研究のために、いくつかの研究室によって用いられている。マウスモデルは、アミロイド前駆体タンパク質(APP)のスウェーデン型突然変異を発現し、脳Aβレベルの増加と、その後の神経突起斑の発生を示した。突然変異体プレセニリン1(PS1)の共発現は、Aβ(1-42)生成を増大させる。組織切片をパラフィン包埋し、連続的に切断した。切片をヘマトキシリンで染色して、細胞核を着色し、その後、抗Aβ11(pE)抗体で免疫染色した。組織切片の調製及び染色は、標準的な方法に従って行なった。
(1.5 抗体可変領域の配列決定)
(ハイブリドーマ細胞の培養:)
ハイブリドーマ細胞を、15％FBS、1％MEM-NEA(非必須アミノ酸、Gibco社)、50μg/mlゲンタマイシン(Gibco社)、及び50μM β-メルカプトエタノールを添加した、D-MEM(＋L-グルタミン、＋ピルビン酸-Na、4.5g/lグルコース、Gibco社)中で、37℃及び5％CO2で成長させた。細胞密度に応じて、3〜4日後に継代培養を行なった。細胞を、0.5×106細胞/mlの濃度で播種し、2〜5×106細胞/mlの細胞密度で分割を行なった。
(cDNA合成及び逆転写:)
全RNAを、NucleospinRNA単離キット(Macherey-Nagel社)のマニュアルに従って、2×106個の細胞から単離した。100ngのRNAを、オリゴ(dT)15プライマー(Promega社)及びSuperscript III逆転写酵素(Invitrogen社)を用いることにより、cDNA合成に適用した。
(重鎖及び軽鎖の可変領域PCR増幅:)
重鎖可変領域は、Phusion(商標)高忠実度DNAポリメラーゼ(NEW ENGLAND BioLabs社)を、プライマーMHV1〜MHV12と組み合わせたプライマーMHCG1とともに用いることにより、鋳型cDNAから増幅させた。軽鎖可変領域の増幅には、MKCとプライマーMKV1〜MKV11とのプライマー組合せを用いた(表8を参照)。
(pJET1.2におけるPCR産物のクローニング:)
PCRにより増幅された重鎖及び軽鎖可変領域を、pJET1.2/平滑端ベクターに、CloneJET(商標)PCRクローニングキット(Fermentas社)のプロトコルに従ってクローニングした。配列決定は、pJET1.2配列決定プライマーを用いて行なった。
Figure 2014509860
(2.結果)
(2.1 抗体スクリーニング)
細胞融合、及びHAT培地によるハイブリドーマ細胞の選択の後、ハイブリドーマ細胞(いくつかの異なる単一細胞に由来する)をスクリーニングして、標的抗原Aβ11(pE)に対する特異的mAbを同定した。これらのmAbを、異なる修飾Aβペプチドに結合するその能力に関して調べた。その結果、mAbと他の修飾Aβペプチドとの交差反応の可能性が判明した。ヒドロキシ-セルロース-メンブレンにスポットされた異なる配列を有するAβペプチドを図1に示す。スクリーニングは、16種の異なるAβペプチドに対して試験された26種のハイブリドーマ細胞上清を用いて行なわれた。
図1は、メンブレンの上に示された16種のペプチドがスポットされた26枚のメンブレン(P1からP53と表示されている)を示す。スクリーニング解析により、枠で囲まれたメンブレン(P7、P10、P11、P12、P13、P15、P22、P24、P27)のハイブリドーマ細胞由来のmAbが、標的エピトープAβ11(pE)を有するN-末端修飾Aβ(pE11-23)(pEVHHQKLVFFAED)ペプチド(配列番号19)に対する中間〜強いシグナルを示すことが示された。さらに、それらは、他の修飾Aβ-ペプチドとの顕著な交差反応を示さなかった。枠で囲まれたメンブレン上で試験されたmAbは、位置11(スポット9を参照)の非環化N-末端グルタメートに対しても結合せず、結合シグナルは、N-末端に完全なAβ配列pEVHHを有さないスポット4、5、6、7、8、9、13で検出されなかった。さらに、位置3(スポット6を参照)のN-末端ピログルタメートでの結合シグナルは、枠で囲まれたメンブレンで検出されなかった。まとめると、枠で囲まれたメンブレン写真上で試験されたハイブリドーマ細胞由来のmAbは、N-末端Aβ11(pE)ペプチドに特異的であり、Aβ(1-42)ペプチドの他の配列との顕著な交差反応を示さなかったと言える。このため、記載されている9つのハイブリドーマクローンを再クローニング用に選択した。図1において実線で表示されている5つのハイブリドーマクローンは、再クローニング後に安定であり、さらなる再クローニング用に選択された。限界希釈技術を用いて、選択されたハイブリドーマ細胞をクローニングし、1つの単離クローンを得た。本研究において、クローン13と命名された、これら5つの選択されたハイブリドーマクローンのうちの1つを培養し(下の第2.2節を参照)、細胞培養上清中の抗体濃度を決定した。
mAbが、標的抗原Aβ11(pE)に対する、及びさらに、異なるAβペプチドに対する、弱いシグナルを示したか、又はこれらに対するシグナルを全く示さなかったので、メンブレンP4、P5、P16、P25で試験されたハイブリドーマ細胞は、再クローニング用に選択されなかった。さらに、mAbが、標的抗原Aβ(pE11-14)及びスポットされた他のAβペプチドに対する強いシグナルを示し、したがって、それらが抗原Aβ(pE11-14)に対する選択性を示さなかったので、メンブレンP1、P17、P26、P29、P31、P32、P35、P36、P38、P42、P47、P49、及びP53のハイブリドーマ細胞は、再クローニング用に選択されなかった。
(2.2 ハイブリドーマ細胞の培養及び細胞培養培地の最適化)
抗Aβ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を用いて予備試験を行なった。この試験において、Aβ3(pE)に対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞の最適な培養条件を決定した。15％FBS、1％MEM-NEAA、2mM L-グルタミン、及び50μM β-メルカプトエタノールを補充した培地DMEMで培養されたハイブリドーマ細胞は、高い増殖率及び抗体産生率を有することが示された。したがって、本研究では、選ばれたハイブリドーマクローン(クローン13)を最適化された条件に従って培養した。
ハイブリドーマクローンをうまく培養することができることが示された。ハイブリドーマ細胞の解凍後、4〜6回以内の継代で、細胞数を12倍又は20倍増加させることができた。細胞は、懸濁液中に部分的に細胞凝集体を形成し、また、接着細胞を観察することもできた。生細胞は丸い細胞形状を示し、非生存細胞と比べてより大きかった。細胞を、MycoAlert(登録商標)マイコプラズマ検出キットで、マイコプラズマ汚染について定期的に検査した。検査したハイブリドーマ細胞は全て、マイコプラズマを含まなかった。ハイブリドーマ細胞の培養期間中、細胞培養上清中の抗Aβ11(pE)抗体の濃度をSPRにより測定した(第2.2.1節を参照)。本研究のさらなる目的は、産生されたmAbの精製を簡単にするための、血清含有条件から無血清条件へのハイブリドーマ細胞の適応であった。これは、段階的に行なわれた。最適な無血清培地を10日間にわたる適応の後の成長曲線の作成によって同定した。それにより、細胞成長及び抗体産生率を培養期間中に測定した。
(2.2.1 細胞培養上清中の抗体濃度の決定)
細胞培養上清からの抗Aβ11(pE)抗体の濃度を表面プラズモン共鳴(SPR)の原理を用いてBiacore 3000で決定した。したがって、ペプチドAβ(pE11-30)をCM5チップのセンサー表面に固定化した(第1.3.3.1節の方法を参照)。図2に、Aβ(pE11-30)の固定化を経時的なリアルタイムプロットで示す。最初に、10μg/mlのAβ(pE11-30)でカップリングを行なった。ペプチドカップリング中に、シグナルが立ち上がった(図2、印を付けたAを参照)。シグナルが低かったので、ペプチドをより高濃度の50μg/mlで再び適用した(図2、印を付けたBを参照)。手短に言うと、高濃度のペプチドをチップ表面に固定化した。細胞培養上清からの抗体含有量の決定には、高濃度の固定化ペプチドが必要であった。それにより、さらに低い抗体濃度の検出が可能となり、標準曲線の線形範囲も、より低濃度の固定化ペプチドの場合よりも高くなる。チップの過負荷は、結合研究、並びに解離速度kd及び会合速度kaのような結合速度の決定には適さなかった。抗原濃度が高いため、抗体の多重結合相互作用が可能となり(結合力の効果)、それにより、不適切な結合速度及び人為的に低い解離速度(off rate)がもたらされる。
培養されたハイブリドーマクローンの各々の細胞継代物から、細胞培養上清を抗Aβ11(pE)抗体についてBiacore 3000で試験した。ハイブリドーマクローン13の結果を図3に示す。クローン13は、抗Aβ11(pE)抗体を産生する唯一のクローンであった。ハイブリドーマクローン13由来の抗体の高い測定シグナル(RU)を有する曲線が決定され、この曲線から、抗Aβ11(pE)抗体が高い収率で産生されたという結論が導かれる。対照的に、クローン15、22、及び24については、全培養期間を通して、特異的測定(RU)シグナルは得られなかった。このため、クローン13のハイブリドーマ細胞のみをさらに培養し、本研究で説明した全ての実験に用いた。
細胞培養上清中の抗体濃度の定量のために、クローン13由来の既知濃度の精製抗Aβ11(pE)抗体(第1.2節を参照)の標準曲線を測定した。Biacore 3000による測定シグナル(RU)を抗体濃度に対してプロットした。この標準曲線を図4に示す。
この標準は、0.040μg/ml〜1.25μg/mlの抗体濃度の直線軌道を示している(図5を参照)。1.25μg/mlの濃度を超えると、曲線の傾きが減少した。抗体濃度が高いために、抗原に対する抗体の結合時に立体障害が生じることがある。線形回帰方程式: y＝3033.7x＋50.099(r2＝0.991)を細胞培養上清からの抗体濃度の計算に用いた。測定が標準曲線の線形範囲内となるように、細胞培養上清のさらなる測定試料を希釈した。
(2.2.2 ハイブリドーマ細胞の無血清条件への適応)
細胞培養上清からのマウス抗Aβ11(pE)mAbのプロテインG親和性精製を簡単にするために、ハイブリドーマ細胞(クローン13)を血清含有培地(SCM)から様々な無血清(SFM)及び無タンパク質培地へと適応させた。プロテインGは、特異的にかつ高い親和性でマウス免疫グロブリンG分子に結合する。FBSに含まれるウシIgGもプロテインGから強く結合され、望ましくない交差反応が可能になる。したがって、ウシIgGが精製抗体溶出画分に含まれるのを排除するために、無血清培地又は無タンパク質培地をハイブリドーマ細胞の培養に用いることとした。
様々なSFM(Hybridoma Express、Hybridoma Express Plus、Hybridoma SFM)及び無タンパク質培地(CD Hybridoma Medium)への培地適応をT型フラスコ中で行ない、各継代の後、細胞数及び抗体濃度を決定した。表9に、培地適応後の細胞成長及び抗体産生を示す。
Figure 2014509860
表9の結果は、Hybridoma SFM中の細胞だけが増殖し、また、高収率で抗体を産生することを示した。したがって、Hybridoma SFMへの細胞の適応だけが成功した。SCM(DMEM、15％FBS、1％NEAA、及びDMEM、15％低IgG FBS、1％NEAA)中及びHybridoma SFM中で培養された細胞の比較のために、10日間にわたる成長曲線を決定した。したがって、細胞を振盪フラスコ中で培養し、細胞培養上清中の細胞数及び抗体濃度の決定のために、定期的に試料を得た(図6を参照)。
これらの結果から、Hybridoma SFM中の培養細胞がSCM中の細胞と比べて2倍を超えて高い顕著な成長を示すことが示された。Hybridoma SFM中の細胞の指数関数期は、24時間から始まったのに対し、SCM中の細胞の指数関数期は、48時間後に始まった。したがって、Hybridoma SFMは、SCMと比べて、ハイブリドーマ細胞のより早い指数関数的成長をより短い遅滞期を伴って開始した。同様に、SFM及びSCM中で培養された細胞は、72時間後に最大の細胞数になった。SFM中で培養された細胞が72時間及び144時間以内に死期を示し、これが、SCM培養細胞の成長曲線では観察されなかったことは注目に値する。細胞数の測定の他に、抗Aβ11(pE)抗体濃度を測定した。SFM中で培養された細胞は、SCM中よりも有意に高い抗体産生量を示した。一般に、抗体濃度は、指数関数期の細胞数の増加に伴って増加するが、SCM中で培養された細胞は、静止期の始まりとともに72時間で抗体産生を停止した。しかしながら、SFM培養細胞の抗体産生は、72時間後の細胞数の低下とは独立に、わずかに増加する。
成長曲線の解析用の具体的なパラメータを決定するために、比成長率μ及び比産生率qpを計算した。このデータは、成長及び抗体産生のより良い解釈に役立つはずである。図7において、比成長率を培養時間に対してプロットした。
培養の初めに、高い比成長率が判明したが、これは、指数関数的成長期の後、72時間で強く減少した。比成長率μは、96時間直前までプラスであり、これは、細胞が成長していたことを示している。細胞の衰退期は、マイナスの成長率を特徴としたが、それは、エネルギー源が96時間後に消費されたためである。細胞濃度が非常に高いために、Hybridoma SFM中の細胞が72時間後に成長率の強い減少を示すことは、注目に値することであった。
さらに、生細胞密度の積分(IVCD)と呼ばれる培養時間にわたる生細胞濃度の積分を計算した。IVCDは、時間を導入することによって、どれだけ多くの細胞が培養時間にわたる抗体産生に寄与するかということを意味する。積分は、図6(A)に示された曲線から決定した。培養時間5時間、24時間、48時間、及び72時間での生細胞数の測定点を指数関数f(t)=a・ec・t(式中、a及びcは定数であり、tは時間である)によりフィッティングした。その後、この指数関数を積分した。IVCDを、5時間、24時間、48時間、及び72時間の各時点について計算した。抗体産生率qpの決定のために、抗体濃度をIVCDに対してプロットし(図8を参照)、これらの曲線の傾きからqpを得た。(Renardらの文献、Biotechnol. Lett. 1988, 10, 91-96; Ozturkらの文献、J. Biotechnol. 1990, 16, 259-278)。
図8には、5、24、48、72時間でのデータ点しか含まれなかったが、それは、抗体産生率が衰退期に強く低下し、直線が衰退期及び指数関数期のデータ点と相関することができなかったためである。比抗体産生率は、静止期よりも指数関数期において有意に高かった。これらのデータは、抗体産生率が、この研究で用いたハイブリドーマ細胞株にとって成長依存的であったことを示している。対照的に、Ozturk S.は、比抗体産生率が指数関数的成長と衰退期の両方において一定であり、したがって、マウスハイブリドーマ細胞の抗体産生が成長と関連しないと記載した(Ozturk S.らの文献、前掲)。
表10に、得られた比抗体産生率を示す。
Figure 2014509860
Hybridoma SFM中で培養された細胞は、0.5121pg/(細胞・h)の最大抗体産生率を示した。したがって、Hybridoma SFMのqpは、おそらくはSFM中での2倍高い細胞増殖のために、SCM中で培養された細胞と比べて約2倍高かった。
SCM中で培養されたハイブリドーマ細胞を数回継代培養すると、継代数18から、抗体濃度が連続的に低下した(データは示さない)。継代数27の細胞の抗体産生は完全に停止したが、これらの細胞は、抗体産生の低下とは独立に、正常な細胞成長を示し、これは、抗Aβ3(pE)抗体を産生するハイブリドーマ細胞についても認められた。文献で既に、ハイブリドーマ細胞が不安定であることが多く、抗体産生を停止し得ることが記載されていた。ハイブリドーマ細胞は、多くの場合、抗体産生細胞と抗体非産生細胞の混合物として存在することが明らかにされた(Heathらの文献、J Biotechnol. 1990, Vol.15, S.71-89)。抗体を産生しないハイブリドーマ細胞は、重鎖及び軽鎖の配列に関する遺伝的完全性を欠く場合がある。非産生細胞は、産生細胞よりも高い増殖率を示し、何回かの継代の後、ハイブリドーマ培養物で多数を占めることができる(Kromenakerらの文献、Biotechnol Prog 1994, Vol.10, S.299-307)。対照的に、Hybridoma SFM中で培養された細胞は、27回の継代を超えても依然として高い抗体産生率を示す。これは、SFM中で培養された細胞が連続的な細胞成長、及び細胞継代数とは独立な抗体産生を示したことを示唆する。より多い継代数までのSFM中での細胞の培養は1回だけ行なった。明確な意見を述べるために、実験を2回繰り返すこととした。
まとめると、Hybridoma SFM中で培養された細胞は、SCM中で培養された細胞と比べて、最大の成長率で優れた細胞成長を示し、全培養期間にわたって高い比産生率で顕著な最大の抗体産生収率を示す。使用されたハイブリドーマ細胞は、SCMからHybridoma SFMへのささいな逐次適応しか必要としない。Hybridoma SFMを使用することにより、ハイブリドーマ培養のコストを、低IgG FBSを含むDMEMの代替使用と比べて18％低下させることができた。さらに、ウシIgG、及びプロテアーゼのような他の血清成分を含む血清が存在しないため、細胞培養上清からのmAbの精製が簡単になった。
試験された全ての培地の成長曲線は、L-グルタミンの完全な消費のために、指数関数的成長期の後の72時間で強い減少を示した。Millerらは、細胞成長の限定因子が、主にエネルギー源として使用され、細胞成長及び抗体産生を促進するL-グルタミンであるため、L-グルタミンが消費されると、最大細胞数が高くなると記載した(Millerらの文献、1989, Biotech Bioeng. Vol.32, S.947-965)。このような事実のため、SCM、さらにはSFMに、2mM L-グルタミンを補充した。しかし、細胞成長及び抗体産生は、SCM中よりもHybridoma SFM中の細胞で有意に高かった。
Hybridoma SFMは、ハイブリドーマ細胞培養用に最適化された超低タンパク質培地(20μg/ml)である。この培地は、L-グルタミン、微量元素、ミネラル、並びに少量(20μg/ml)の規定タンパク質(インスリン及びトランスフェリン)を含有する。SFM中のどの物質が高い細胞増殖及び抗体産生量に決定的であるのかは検討しなかったが、以下に推測することができる。ハイブリドーマ細胞の抗体効率を増大させるいくつかの可能性がある。文献には、形質膜の脂質組織化及び流動性が細胞機能に影響を及ぼすので、コレステロール、リン脂質、及び脂肪酸を含む脂質混合物の添加によって、ハイブリドーマ細胞の抗体産生が増強されたと記載されている(Savonniereらの文献、Biotechnol. 1996 Jul 18;48(1-2):161-73)。また、成長因子、例えば、上皮成長因子(EGF)、線維芽細胞成長因子(FGF)、インターロイキン-2(IL-2)、IL-6(B細胞刺激因子)、トランスフェリン、インスリン、及びエタノールアミンも、抗体産生率を増加させることができた(Murakamiらの文献、Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 Feb;79(4):1158-62; Dandulakisらの文献、Biotechnol Prog. 1995 Sep-Oct;11(5):518-24)。
(2.3 抗体精製)
ELISA及びさらなる実験で用いられるように、クローン13由来の抗体である抗Aβ11(pE)を細胞培養上清から均質になるまで精製することとした。抗体をプロテインGセファロースカラムで精製した(第1.2.1節を参照)。結合した抗体を2つの異なる方法に従って溶出させた。最初に、酸性の0.1M グリシン-HCl溶液(pH2.7)を用い、溶出画分を、1M Tris-HCl、pH9.0による滴定によって、すぐに中和した。中和プロセスでは、酸性溶出時の抗体の起こり得る構造変化のために、抗体が強く沈殿した。
このため、pH中和溶出法を、チオシアン酸カリウムの勾配を用いて行なった。KSCNのために、抗体とプロテインGの相互作用が緩くなった。この技術により、抗体を溶出させると、抗体の沈殿は起こらなかった。図9に、精製プロセスのクロマトグラムを示す。
KSCN勾配が増加するとともに、抗体が溶出された。溶出ピークは、1つの抗体種についての均質な溶出を示すガウス関数のようにほぼ対称であった。溶出は、タンパク質-タンパク質相互作用を無効化するカオトロピックイオンSCN-により誘導された。KSCNの濃度が高すぎると、タンパク質が変性することがあるため、抗体溶出を勾配中で行なった後、すぐに透析した。
親和性クロマトグラフィーの後、SDS-PAGEを行ない、プロテインGカラム精製の様々な画分中の抗体の含有量を調べた(図10を参照)。それにより、抗Aβ11(pE)抗体を含む溶出画分の純度を決定することができた。未精製の細胞培養上清、フロースルー画分、洗浄画分、及びプロテインGカラムの溶出画分の試料を解析した。
SDS-ゲルは、プロテインG精製時に、特異的結合抗体が非特異的結合タンパク質から分離されたことを示している。未精製細胞培養上清(スロット1; 6)及びフロースルー(2; 7)では、約66kDaのBSAバンド(ウシ血清アルブミン)が明瞭に同定されたが、溶出画分(スロット4; 9)は、BSAを含まなかった。洗浄サイクルでは、結合抗体のごく一部がカラムから洗い流された(スロット3)。スロット4中の溶出画分は、特異的結合抗体だけが溶出されたことを示している。SDS-PAGEにおいて、抗体は、還元条件に基づいて、約50kDaの重鎖と約25kDaの軽鎖に分離された(スロット4を参照)。無傷のジスルフィド結合を有する完全抗体を示すために、溶出画分を非還元条件下で適用した(スロット9を参照)。抗体は、約150kDaのバンドを有することが確認された。さらに、BSAがカラム中に保持されておらず、したがって、溶出画分中の精製抗体から取り除かれていることが示された。プロテインGはマウスIgGに結合するが、FBSに含まれてるウシIgGにも結合する。ウシIgGを含む不純物を減らすために、5μg/ml未満のIgGを含有する超低IgG-FBS(Invitrogen社)を用いた。この精製法を用いて、抗体を均質になるまで精製し、細胞培養上清中に含まれる他の全てのタンパク質から分離した。透析後、抗体濃度をUV-分光計及びSPRにより決定した。
プロテインGセファロースカラムによる抗Aβ11(pE)抗体の精製において、プロテインGカラムに適用する前の細胞培養上清からの試料と、フロースルー、洗浄画分、及び溶出画分からの試料とを採取した。この後、SPRにより測定した。SPRによる抗Aβ11(pE)抗体の定量のために、図10に示される標準曲線を用いた。精製前に、約14.8μg/mlの抗体が細胞培養上清中に含まれていることが明らかにされた。これは、1800mlの上清中の総量26.7mgの抗体に等しい。フロースルーは、0.8μg/mlの抗体(総量2.4mg)を含み、洗浄画分は8.7μg/ml(総量0.2mg)の抗体を含んでいた。溶出画分中の21mgの抗体に相当する1.07mg/mlの濃度がSPRにより決定された。次いで、親和性クロマトグラフィーの収率は80％であった。抗体の精製、濃縮、及び透析の後、UVスペクトルの測定を行なった(図11を参照)。
UVスペクトルから、精製後の4.09mg/mlの抗体濃度が決定された。したがって、1800mlの細胞培養上清から約21mgの抗体が精製された。したがって、UV/VIS法によって決定された抗体濃度は、SPRの結果と一致した。その後、抗体を滅菌濾過し、分注し、さらなる解析のために4℃で貯蔵した。
提示されている抗体精製の結果は、継代数の多い(継代数17〜22)細胞由来の細胞培養上清を用いて行なわれ、それにより、継代数18を超えての抗体産生率の低下が観察された(第2.2.2節を参照)。しかしながら、継代数のより少ない細胞の細胞培養上清中の抗体濃度は、約30μg/mlであった。
結果として、継代数のより少ない細胞の抗体精製収率は、継代数の多い細胞を用いた場合よりも2倍高く、約42mgであった。
(2.3.1 抗Aβ11(pE)抗体のビオチン化)
Aβ(pE11-x)ELISAにおける検出抗体として適用するために、抗Aβ11(pE)抗体をビオチン化した。抗体-ビオチン溶液を透析して、コンジュゲートされていないビオチンを除去した。1.88mg/mlのビオチン化抗体(MW 150,000)の濃度がUVスペクトルによって決定され、続いて、ビオチン化レベルがHABAアッセイによって決定された。
約2個のビオチン分子が１つの抗体に対してカップリングされる結果となった。図12に、ビオチン化の前後の抗体のUV/VIS スペクトルを示す。2つのスペクトルは、同じ曲線軌道を示し、ビオチン化プロセスの間に凝集が起こらなかったことを示している。したがって、ビオチン化に成功し、抗体をストレプトアビジン-HRPポリマーと組み合わせて検出抗体として用いることができる。
(2.4 抗Aβ11(pE)抗体の特徴付け)
(2.4.1 抗体可変領域の配列決定)
以下の配列を同定した:
(2.4.1.1 クローン13-11-6(クローン13))
Figure 2014509860
(2.4.2 二次構造の決定)
ビオチン化及び非ビオチン化抗Aβ11(pE)抗体の二次構造をCD分光法で調べた。ビオチン化プロセスによる二次構造のあり得る変化を解析した。10mMリン酸ナトリウム、pH7.1に溶解した130μg/mlの抗体(ビオチン化及び非ビオチン化)を用いて、CD測定を行なった。図13に、20℃での抗体の遠UV-CDスペクトルを示す。ビオチン化及び非ビオチン化抗体のスペクトルはほぼ同一であり、どちらの抗体も、β-シートタンパク質に典型的である218nmでの最小値及び200nmでの最大値を示した。これらの結果から、ビオチン化が二次構造に影響を及ぼさないことが示された。同じCDスペクトルは、同一の二次構造を示し、したがって、結合特性への影響がないことを示すが、これは、ITC又はELISAでの結合特性を含意するものではなかった。
(2.4.3 Aβ11(pE)抗体の温度遷移)
円二色性を用いて、環境条件によって二次構造がどのように変化するかを観察することができる。熱的なタンパク質安定性は、温度の増加に伴うスペクトルの変化を追跡することにより、CDを用いて評価される。図14及び図15に、20℃〜最大80℃の温度でのビオチン化及び非ビオチン化抗Aβ11(pE)抗体のスペクトルを示す。60℃の温度から、スペクトルの軌道が変化した。β-シートタンパク質の典型的なシグナルである約201nmでの最大値は、60℃の温度で減少し、80℃で最小になった。これらの結果から、非ビオチン化及びビオチン化抗体が60℃で変性し始めることが示された(Tm≒65℃)。したがって、抗体の温度安定性は、最大60℃まで与えられた。これらの結果は、IgGの正常な範囲内にあり、かつ他の研究と一致しており、例えば、S. Freyは、モノクローナルIgGの融解温度が63℃であることを明らかにした(S. Freyらの文献、2008, Biol. Chem., Vol. 389, pp. 37-45)。どちらの抗体も、20℃〜最大60℃の範囲に、約218nmでの最小値及び201nmでの最大値を有する同一のCDスペクトルを示し、ビオチン化がタンパク質安定性に影響を及ぼさなかったことを示している。
(2.4.4 Aβ11(pE)抗体の結合特性)
抗Aβ11(pE)抗体のAβ(pE11-18)-PEGペプチドに対する結合を特徴付けるために、等温滴定熱量測定法(ITC)という方法を用いた(第1.3.4節を参照)。プロテインGカラムからKSCN勾配(pH7.0)及び0.1M グリシン-HCl(pH2.7)で溶出される抗体を解析した。ITCにより、反応化学量論比(N)、会合定数(KA)、結合エンタルピー(ΔH)、及びエントロピー(ΔS)を決定した。ペプチドを抗Aβ11(pE)抗体に対してITC MicroCalorimeterで第1.3.4.2節に記載の通りに滴定した。滴定曲線は、時間の関数としての秒当たりの熱を示す(図16を参照)。反応パートナーが相互作用し、結合事象の量に正比例して、熱が放出又は吸収される。抗原の各々の注入は、温度の変化をもたらす。試料セルとを参照セルの間の温度差を相殺するために、試料セルに対する熱の付加又は除去が行なわれ、これが測定シグナルとしての役割を果たす。
最初に、ITCバッファーへのAβ(pE11-18)-PEGの希釈熱を決定した(図16、上のトレースを参照)。上のトレースは、測定シグナルと比べて一定のかつ低いシグナル(バックグラウンドシグナル)を示す。その後、ペプチドAβ(pE11-18)-PEGを試料セル中の抗Aβ11(pE)抗体に対して滴定した(図16、下のトレースを参照)。各々の注入後の総熱放出を各ピークとベースラインの間の面積の積分により決定した。その後、希釈熱(図16、上のトレースを参照)を各々の注入の総熱放出から差し引いた。図17は、抗Aβ11(pE)抗体(KSCN勾配で溶出された)とAβ(pE11-18)-PEGとの得られた結合曲線を示しており、この曲線では、各々の注入での総熱放出が抗体とペプチドのモル比に対してプロットされている。この結合曲線から、熱力学的パラメータ定数をプログラムOrigin 7.0により決定した。
表11に、抗Aβ11(pE)抗体のAβ(pE11-18)-PEGペプチドに対する結合についての決定されたパラメータN、KA、KD、ΔH、及びΔS、並びにギブスエネルギーΔGを示す。KD＝1/KAであり、ΔG＝ΔH−TΔSであることに留意されたい。
Figure 2014509860
最初に、KSCN勾配(pH7.0)で溶出された抗Aβ11(pE)抗体の結果を考察した。抗原と抗体の結合の化学量論比は1.88であった。したがって、化学量論比はほぼ2であり、これは、ほぼ全ての抗体に活性があり、2分子のAβ(pE11-18)-PEGペプチドと相互作用したことを意味する。化学量論比の変動の理由は、抗体吸収係数が不明のために、濃度測定が正確でないことであった。2よりも有意に低い化学量論比は、抗体分子の一部が不活性であることを示し、これは、酸性溶出抗体の場合である。
抗体の解離定数は78.74nMであった。例えば、抗hMCP1 N1pE(1-x)抗体(データは示さない)は、抗Aβ11(pE)抗体よりも3倍大きい解離定数を示した。これは、抗Aβ11(pE)の結合強度が抗hMCP1 N1pE(1-x)抗体の結合強度よりも大きかったことを意味する。しかしながら、抗hMCP1 N1pE(1-x)をMCP1 ELISAで用いることに成功しており、これは、抗Aβ11(pE)抗体もELISAで良好な結合特性を示すことを示唆する。抗Aβ11(pE)抗体の決定された解離定数は、文献中の記載されているITCの結果の中ほどで変動した。例えば、D-PAM(プロテインA模倣物)とモノクローナル抗体IgGとの相互作用は、10-5M-1の範囲のKDを示し(D'Agostino B.らの文献、J Immunol Methods. 2008 Apr 20;333(1-2):126-38)、可溶性単量体Aβ(1-40)とマウスモノクローナル抗体との相互作用のKDは、10-7〜10-8M-1の範囲であった(Brockhausらの文献、J Phys Chem B. 2007 Feb 8;111(5):1238-43)。抗Aβ11(pE)抗体のKDは、7.8・10-8M-1に達し、文献中に記載のデータと同程度であった。
一般に、抗体と抗原の相互作用は、水素結合(特異的相互作用)のために、主にエンタルピー駆動型であり、エントロピー変化は、立体構造度の喪失のために、負(ΔS＜0)であることが多い。しかし、Aβ(pE11-18)-PEGの抗Aβ11(pE)抗体に対する結合から、ΔS＝4.33(cal・mol-1・K-1)の軽微なエントロピー増加、ΔH＝-8.259kcal/molの負のエンタルピー、及びΔG＝-9.53kcal/molの低いギブスエネルギーが得られた。したがって、この相互作用は、水素結合の形成のために、弱エンタルピー駆動型(ΔH＜0)であり、また、抗体と抗原の相互作用には稀である、弱エントロピー駆動型(ΔS＞0)でもあった。結合は、強い疎水性エピトープAβ11(pE)による疎水性相互作用を特徴とし、水素分子が置換され、これにより、立体構造の自由度の増加、したがって、軽微なエントロピー増加がもたらされた(Ohtakaらの文献、2002, Protein Sci. 11, 1908-1916)。対照的に、大部分の抗原と抗体の結合は、負のエンタルピー及び望ましくないエントロピー損失によって駆動される(例えば、MCP1 N1pE(1-x)抗体)。
上記のITCの結果は、プロテインGセファロースで精製され、KSCN勾配で溶出された抗体を用いて行なわれたものであった(第2.3節を参照)。さらに、抗体溶出を酸性の0.1Mグリシン-HCl溶液(pH2.7)で試験し、その後、1M Tris-HClですぐに中和し、抗体を沈殿させた。濃度決定の前に、沈殿したタンパク質は遠心分離により除去され、ITC実験では生じない。この酸性溶出抗体の結合パラメータもITCにより特徴付けた。図18は、抗Aβ11(pE)抗体(グリシン-HClで溶出した)とAβ(pE11-18)-PEGとの得られた結合曲線を示しており、この曲線では、各々の注入における総熱放出が抗体とペプチドのモル比に対してプロットされている。
グリシン-HClで溶出された抗Aβ11(pE)抗体の結果は、KD＝105.26nMの解離定数、ΔH＝-7.99kcal/molの負のエンタルピー、及び4.64(cal・mol-1・K-1)のエントロピー増加を示した。酸性溶出抗体及びKSCN溶出抗体のエネルギーパラメータはほぼ同じであったが、対照的に、酸性溶出抗体の化学量論値はわずか1.01であり、したがって、2よりも有意に低かった。これは、抗体の約半分が酸性溶出によって不活化されたことを意味する。最後に、抗体溶出を、酸性グリシン-HClで行なう代わりに、KSCN勾配でさらに行なった。
さらに、ビオチン化抗Aβ11(pE)抗体(第1.2.3.1節を参照)もITCで調べた。表12に、決定された熱力学的結合パラメータを示す。
Figure 2014509860
図19に、ビオチン化抗Aβ11(pE)抗体及びAβ(pE11-18)-PEGの得られた結合曲線を示す。
ビオチン化抗Aβ11(pE)抗体の結果は、ほぼ同じエンタルピー値及びエントロピー値を示すが、非ビオチン化抗体よりもわずかに大きい解離定数(KD＝125nM)を示す。これは、ビオチン化抗Aβ11(pE)の結合強度が非ビオチン化抗体の結合強度よりもわずかに低かったことを意味する。また、1.66の化学量論比は、非ビオチン化抗体の化学量論比よりも低く、これは、抗体分子のごく一部が不活性であることを示したものと思われる。結論として、ビオチン化プロセスによると思われる、わずかな抗体活性の喪失が明らかにされた。
(2.4.5 交差反応性の決定)
ピログルタメート-ペプチドCCL2(MCP-1として知られる)、CCL8(MCP-2として知られる)、大ガストリン、ゴナドリベリン、ニューロテンシン、オレキシンA、フィブロネクチン、コラーゲン1、及びTRH(チロトロピン放出ホルモン)に対する抗Aβ11(pE)抗体(クローン13)の交差反応性をSPRにより試験した(データは示さない)。試験された抗体は、いくつかのピログルタメート-ペプチドとの交差反応性を示さなかった。さらに、AβpE(3-40)及びAβpE(11-30)に対する抗体クローン13の交差反応性をSPRで試験し、それにより、この抗体をその反応性に関して比較することとした。図20に、クローン13のAβpE(11-30)及びAβpE(3-40)ペプチドに対する経時的なリアルタイムプロットを示す。
SPRの結果は、クローン13がAβpE(3-40)に対する弱い交差反応性を示したが、AβpE(11-30)に対してよりも4等級低かったことを示している。ITCの結果(第2.4.3節を参照)は、Aβ11pEとクローン13の結合が、疎水性相互作用のために、弱エントロピー駆動型であったことを示している。これは、一般に、クローン13が、疎水性ペプチド、例えば、Aβ3(pE)と非特異的に相互作用し得ることを意味し、これは、上に示したSPRの結果によって確認された。まとめると、抗Aβ11(pE)抗体は、高い親和性(ITCの結果を参照)及び良好な特異性を示した。
(2.5 抗Aβ11(pE)抗体のサンドイッチELISAへの適用)
(2.5.1 自己-Ig-ELISAの確立)
AD患者及び健常対照由来の血漿試料中の自己免疫グロブリンの解析のために、抗Aβ11(pE)、抗Aβ3(pE)、及び抗Bri-2(pE1)自己抗体ELISAを確立した(表5を参照)。これらのELISAは、異なる抗体クラスIgG、IgM、IgA、サブクラス(IgG2、IgG3)、及び全免疫グロブリンIgの解析用に開発された。最適化プロセスの初めに、あまりにも高いバックグラウンドシグナルが測定され、そのため、ペプチド(200ng/ml)の固定化の後、ブロッキングを行なわなかった。したがって、ELISA-Blocker(-T)及びPBS/10％FBS/0.05％Tweenを、ブロッキングについて、並びに試料及びコンジュゲートの希釈について試験した。ELISA-Blocker(-T)は、全ての自己-Ig-ELISAにおいて最も低いバックグラウンドシグナル及び最も高いシグナルノイズ比を示した。
さらに、抗Aβ11(pE)自己-Ig-ELISAにおける試料の定量のための標準を確立した。したがって、精製され、透析されたmAb(クローン13)(第2.2章を参照)を標準として試験した。このmAbは、Aβ(pE11-x)のN-末端に対するものであり、マウスIgGクラスに属している。図21に、mAbクローン13の標準曲線を示す。標準抗体(クローン13)の検出のために、ウサギ抗マウスIg(HRP)、及び対照的に、ヒト血漿試料について、抗ヒトIgのIgG、IgG2、IgG3、IgM、又はIgAを用いた。各々の自己抗体クラス及びサブクラスの標準は入手できなかったが、試料を同一の条件下で試験し、定量したため、各々の抗体クラス/サブクラスにおけるAD患者及び対照群の自己抗体レベルの比較は可能であった。しかしながら、クラスIgGの標準で定量したため、クラス/サブクラス間、及び自己-Ig-ELISA間の自己抗体濃度の比較は認められなかった。
Aβ11(pE)自己抗体ELISAのLOQは55pg/mlで、S/Nは1.65であり、Aβ3(pE)自己抗体ELISAのLOQは48.8pg/mlで、S/N比は1.88であった。まとめると、ハイブリドーマクローン13由来のmAbは標準として好適であり、これを、抗Aβ11(pE)自己-Ig-ELISAでさらに用いた。
(2.5.2 Aβ(pE11-x)ELISAの開発)
4G8捕捉抗体及びビオチン化抗Aβ11(pE)検出抗体を用いたサンドイッチELISAによるAβ11(pE)ELISAの実施は、弱くかつ一貫性のないシグナルを示した(結果は示さない)。ペプチドAβ(pE11-30)及びAβ(pE11-40)の検出は、弱いシグナルしか検出しなかった。どちらのAβペプチドも非常に疎水性であり、貯蔵時のペプチドの容器壁に対する付着を避けるために、ペプチド溶液をELISAで用いる直前に調製した(HFIPを蒸発させ、アルカリに溶解させた)が、やはりシグナルは検出されなかった。予想される問題は、エピトープAβ(17-24)と一緒になった捕捉4G8抗体と、エピトープAβ(pE11-15)と一緒になった検出抗体との間の立体障害によって生じる可能性があった。4G8及び抗Aβ11(pE)抗体の抗体反応性を直接試験するために、Aβペプチドを吸着させた直接ELISAを行なった。使用直前に、HFIPを蒸発させ、その後、AβペプチドをNaOHに溶解させた(RTで10分)。希釈中のペプチドがポリプロピレンバイアルに対して付着しないことを保証するために、疎水性の強いAβ(pE11-30)ペプチドをマイクロプレートで直接PBSにすぐに希釈することとした。図22及び23に、ビオチン化抗Aβ11(pE)抗体及び4G8の使用によるELISAシグナルを示す。抗Aβ11(pE)抗体は、Aβ(pE11-30)濃度依存的な様式で強いELISAシグナルを示し、ナノグラム範囲のAβペプチドを検出した。結論として、ビオチン化抗Aβ11(pE)抗体は、このペプチドを認識し、検出抗体としての適用に好適であった。
対照的に、ビオチン化4G8抗体は、Aβ(pE11-30)濃度依存的な様式で弱いELISAシグナルしか示さなかった。
クローン13と比較して、4G8のシグナルは、同じ条件下で5倍低かった。通常、市販の4G8は、Aβタンパク質に対する良好な結合特性を示す(Schupfらの文献、Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Sep 16;105(37):14052-7)。しかしながら、Aβ(pE11-30)の場合、4G8は、弱い結合シグナルしか示さなかった。抗体4G8は、Aβペプチドの最初の24アミノ酸に対応する合成ペプチドの免疫化によって作製されたものであり、Aβペプチドの配列17〜24しか認識しない(Kimらの文献、1988)。したがって、4G8は、Aβ(pE11-30)ペプチドの構造以外の構造を認識した。したがって、低いシグナル検出の理由は、使用されたペプチドの構造であった。このことから、4G8抗体は、Aβ11(pE)ELISAにおける捕捉抗体として適していないという結果を断定することができ、これにより、低いか又は一貫性のないシグナルしか検出されないことが説明された。今後、IBL社製の抗ヒトAβ(35-40)マウスIgG mAbをプレコーティングしたプレートを捕捉抗体として試験することとし、その場合に、標準ペプチドAβ(pE11-40)を用いることとした。
(2.5.3 Aβ11(pE)抗体による免疫染色)
抗Aβ11(pE)抗体(クローン13)を用いて、AD患者及びトランスジェニックAPP/PS1マウス由来の脳切片の免疫染色を行なった。ヒトAD症例1〜3のIHC画像を図24に示す。
AD症例1、2、及び3の染色切片は、Aβ11(pE)が細胞外に沈着しており、それにより、AD症例1の斑の中心領域では、主にAβ11(pE)が染色されたことを示している。結論として、Aβ11(pE)は、斑の中心領域だけでなく、末梢領域でも染色されることができた。さらに、細胞内沈着物がAD症例3ではっきりと見えた。AD症例3の拡大図(右下の四角形)は、Aβ11(pE)沈着が細胞核のすぐそばで染色され、半円形に見えることを示した。注目に値するのは、Aβ3(pE)よりも多くの細胞内Aβ11(pE)染色が検出されることであった。
これらの結果は、モノクローナル抗体クローン13が細胞内と細胞外の両方のAβ11(pE)沈着物を特異的に認識することを示している。
ヒトの脳切片の他に、APP/PS1トランスジェニックマウスの脳切片もAβ11(pE)沈着について調べた(図25を参照)。
マウス脳のIHC画像は、Aβ11(pE)ペプチドの血管沈着物を示している。マウス脳の血管壁に沿ってはっきりと見える褐色の染色の他に、細胞内Aβ11(pE)沈着物も見えた。対照的に、ヒト脳の切片では、血管沈着物は見られなかった。
まとめると、これらの結果は、Aβ11(pE)沈着物をニューロン内、ニューロン外、さらには、血管内で検出することができたことを示している。クローン13は、pyroGluペプチドに対する優れた反応性を示し、免疫染色に用いることができた。これまで、ヒトAD脳における細胞内及び細胞間でのAβ11(pE)の沈着が起こることを示した情報源は知られていない。Aβペプチドの斑としての沈着は、ADの最も顕著な病理学的特徴の1つであり、ADにおける認知症の発症と密接に関連すると考えられている。斑の組成は、今までのところ、完全には理解されていない。
(2.6 AD患者及び健常対照における自己抗体レベル)
本研究では、Aβ(pE11-x)エピトープに対するクラス及びサブクラスIgG、IgM、IgA、全免疫グロブリンIg、IgG2、及びIgG3の自己抗体のレベルを検討した。目的は、AD患者のAβ自己抗体プロファイル間のあり得る相関を解析する診断用ADバイオマーカー候補を見出すことであった。したがって、ADの臨床診断を有する患者及び健常対照群に由来する血漿試料を検討した。AD患者由来の13の血漿試料及び健常対照由来の30の血漿試料を研究PBD-0316(T0＋6カ月)から得た。この解析には、本研究で確立された(第1.4.2.1節を参照)自己-Ig-ELISAを用いた。結果を図26及び27に示す。
図26及び図27に、Ig(全免疫グロブリン)、IgG、IgG2、IgG3、IgM、及びIgAの抗Aβ11(pE)自己抗体の濃度を示す。解析された全ての抗Aβ11(pE)抗体クラス及びサブクラスの平均レベルは、IgG2を除いて、対照群と比べてAD患者で増大していた。抗Aβ11(pE)自己抗体の結果は、ADと健常対照の間で有意差を示さず、血漿対照及びAD患者における自己抗体レベルの大きな変動を示した。
(3.寄託)
AβN11pE-xを特異的に認識するモノクローナル抗体を作製した。現在、モノクローナル抗体を発現する対応するハイブリドーマ細胞株13-11-6は、ブダペスト条約に準拠して寄託されており、ドイツブラウンシュヴァイク(Braunschweig, DE)のドイツ微生物・培養細胞収集有限会社(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ))において、寄託日2010年12月14日付けで、それぞれの寄託番号
(クローン13-11-6):DSM ACC 3100
で入手可能である。
この抗体のそのそれぞれの標的配列に対する特異性は確認されている。AβN11pE-xについては、低pg範囲の予想検出限界を有するELISA設定において強いシグナルを生じる高親和性抗体クローンを同定することができた。
Figure 2014509860

Claims (35)

  1. AβpGlu(11)ペプチド又はその変異体に、好ましくは高い親和性で結合することを特徴とする、抗体。
  2. 前記高い親和性が、10-7M以下の解離定数(KD)値を意味する、請求項1記載の抗体。
  3. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項1又は2記載の抗体。
  4. 前記抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号51のヌクレオチド配列、又は配列番号52のアミノ酸配列を有する、請求項1〜3のいずれか一項記載の抗体。
  5. 前記抗体の重鎖の可変部分が、配列番号53のヌクレオチド配列、又は配列番号54のアミノ酸配列を有する、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体。
  6. 前記抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号51のヌクレオチド配列、又は配列番号52のアミノ酸配列を有し、かつ前記抗体の重鎖の可変部分が、配列番号53のヌクレオチド配列、又は配列番号54のアミノ酸配列を有する、請求項1〜5のいずれか一項記載の抗体。
  7. 前記抗体が、Aβ13-11-6(寄託番号DSM ACC 3100)又はその機能的変異体である、請求項1〜6のいずれか一項記載の抗体。
  8. 前記抗体が、Aβ13-11-6(寄託番号DSM ACC 3100)である、請求項7記載の抗体。
  9. 前記抗体が、ヒト化もしくはキメラ抗体、又は高親和性を保持する抗体断片である、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体。
  10. AβpGlu(11)ペプチド又はその変異体の検出における使用のための、請求項1〜9のいずれか一項記載の抗体。
  11. 前記変異体が、以下の群:
    pGlu-Aβ11-38変異体
    pGlu-Aβ11-40変異体
    pGlu-Aβ11-42変異体、及び
    pGlu-Aβ11-x変異体
    から選択され、
    ここで、xは、18〜42、より好ましくは、30〜42の整数である、請求項10記載の抗体。
  12. ヒトのものである、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体。
  13. 高親和性を保持するダイアボディ又は単鎖抗体である、請求項1〜12のいずれか一項記載の抗体。
  14. 請求項11に記載の抗体によって結合されるエピトープに結合する、請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体。
  15. 請求項11に記載の抗体の相補性決定領域を有する、請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体。
  16. 前記抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号51のヌクレオチド配列、又は配列番号52のアミノ酸配列を有する軽鎖の可変部分を有する抗体の1以上の、例えば、1つ、2つ、又は3つの相補性決定領域と同じである、1以上の、例えば、1つ、2つ、又は3つの相補性決定領域を有する、請求項1〜15のいずれか一項記載の抗体。
  17. 前記抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号53のヌクレオチド配列、又は配列番号54のアミノ酸配列を有する重鎖の可変部分を有する抗体の1以上の、例えば、1つ、2つ、又は3つの相補性決定領域と同じである、1以上の、例えば、1つ、2つ、又は3つの相補性決定領域を有する、請求項1〜16のいずれか一項記載の抗体。
  18. 標識されている、請求項1〜17のいずれか一項記載の抗体。
  19. 固相に固定化されている、請求項1〜18のいずれか一項記載の抗体。
  20. ハイブリドーマ細胞株DSM ACC 3100から得られる抗体。
  21. 請求項1〜20のいずれか一項記載の抗体を含む組成物。
  22. アミロイドーシスの治療、予防、又は遅延のための、請求項21記載の組成物。
  23. 前記アミロイドーシスが、軽度認知障害、アルツハイマー病、及びダウン症の神経変性からなる群から選択される神経変性疾患である、請求項21又は22記載の組成物。
  24. 前記アミロイドーシスが、孤発性アルツハイマー病又は家族性アルツハイマー型認知症である、請求項21又は22記載の組成物。
  25. 前記家族性アルツハイマー型認知症が、家族性イギリス型認知症又は家族性デンマーク型認知症である、請求項24記載の組成物。
  26. ハイブリドーマ細胞株DSM ACC 3100。
  27. 診断法又は治療法における請求項1〜20のいずれか一項記載の抗体又は請求項21〜25のいずれか一項記載の組成物の使用。
  28. アミロイド関連の疾患又は状態の診断のための請求項27記載の使用。
  29. 前記アミロイドーシスが、軽度認知障害、アルツハイマー病、及びダウン症の神経変性からなる群から選択される神経変性疾患である、請求項28記載の使用。
  30. 前記アミロイドーシスが、孤発性アルツハイマー病又は家族性アルツハイマー型認知症である、請求項28記載の使用。
  31. 前記家族性アルツハイマー型認知症が、家族性イギリス型認知症又は家族性デンマーク型認知症である、請求項28記載の使用。
  32. アミロイド関連の疾患又は状態、特に、アルツハイマー病の診断のためのインビトロ診断法であって、以下の工程:
    請求項1〜20のいずれか一項記載の抗体を、該疾患又は状態に罹患していることが疑われる対象由来の試料と接触させる工程、及び
    該抗体のAβpGlu(11)タンパク質に対する結合を、該試料から検出する工程
    を含む、前記インビトロ診断法。
  33. 請求項1〜20のいずれか一項記載の抗体、及び使用説明書、及び‐任意に‐(a)さらなる生体活性物質(複数可)を含む、診断キット。
  34. 前記さらなる生体活性物質がグルタミニルシクラーゼの阻害剤である、請求項33記載の診断キット。
  35. 配列番号26〜50からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018524370A (ja) * 2015-07-16 2018-08-30 プロビオドルグ エージー ヒト化抗体

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2970235B1 (en) 2013-03-15 2019-06-19 Probiodrug AG Novel inhibitors
EP3234611A1 (en) 2014-12-19 2017-10-25 Probiodrug AG Novel method for the detection of pglu-abeta peptides
JP2022550017A (ja) * 2019-10-01 2022-11-30 レプリゲン・コーポレーション 流体におけるタンパク質濃度の決定

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006513988A (ja) * 2002-09-27 2006-04-27 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ Ｎ−１１短縮化アミロイド−ベータモノクローナル抗体、組成物、方法および使用
JP2011500059A (ja) * 2007-10-15 2011-01-06 セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド ヒト抗アミロイド抗体、組成物、方法及び使用

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
CN1414976A (zh) * 1999-12-08 2003-04-30 明德塞特生物制药(美国)公司 作为免疫原的嵌合肽及其抗体,以及利用嵌合肽或抗体进行免疫的方法
US7117096B2 (en) * 2001-04-17 2006-10-03 Abmaxis, Inc. Structure-based selection and affinity maturation of antibody library
AU2003250102B2 (en) 2002-07-24 2009-09-17 Innogenetics N.V. Fragments of beta-amyloid as targets for vaccination against alzheimer disease
KR101099206B1 (ko) 2004-02-05 2011-12-27 프로비오드룩 아게 신규한 글루타미닐 시클라제 저해제
ES2259270B1 (es) 2005-03-09 2007-11-01 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Metodo de diagnostico in vitro de la enfermedad de alzheimer mediante un anticuerpo monoclonal.
WO2008002893A2 (en) 2006-06-29 2008-01-03 Centocor, Inc. Anti-amyloid antibodies, compositions, methods and uses
DK2091945T3 (da) 2006-11-09 2014-04-22 Probiodrug Ag Nye inhibitorer af glutaminylcyclase
WO2008055945A1 (en) 2006-11-09 2008-05-15 Probiodrug Ag 3-hydr0xy-1,5-dihydr0-pyrr0l-2-one derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase for the treatment of ulcer, cancer and other diseases
JP5599614B2 (ja) 2006-11-09 2014-10-01 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼの新規阻害剤
US9126987B2 (en) 2006-11-30 2015-09-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase
EP2118101B1 (en) 2007-03-09 2012-09-26 Probiodrug AG Imidazo [1,5-a] pyridine derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
EP2865670B1 (en) 2007-04-18 2017-01-11 Probiodrug AG Thiourea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
EP2160380B1 (en) 2007-04-18 2014-04-02 Probiodrug AG Cyano-guanidine derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
DK2160389T3 (da) 2007-04-18 2014-06-23 Probiodrug Ag Thioxoquinazolinonderivater som glutaminylcyclaseinhibitorer
EP2146968B1 (en) 2007-04-18 2015-09-23 Probiodrug AG Urea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
WO2008128981A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Probiodrug Ag Nitrovinyl-diamine derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
JP5676249B2 (ja) 2007-04-20 2015-02-25 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼ阻害剤としてのアミノピリジン誘導体
AT506820B1 (de) * 2008-06-12 2011-07-15 Affiris Forschungs Und Entwicklungs Gmbh Vakzine gegen alzheimer-krankheit
BRPI0916366B1 (pt) * 2008-07-21 2021-08-10 Probiodrug Ag Anticorpo que se liga às variantes de peptídeos abeta, sua composição, seu uso, seu kit de diagnóstico, e linhagem celular de hibridoma
WO2010128139A1 (en) * 2009-05-08 2010-11-11 Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts, Universitätsmedizin Biomarkers and methods for diagnosing alzheimer's disease and/ or mild cognitive impairment
EP3892633A1 (en) * 2009-06-29 2021-10-13 BioArctic AB Antibodies selective for n-terminaltruncated amyloid-p protofibrils/oligomers

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006513988A (ja) * 2002-09-27 2006-04-27 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ Ｎ−１１短縮化アミロイド−ベータモノクローナル抗体、組成物、方法および使用
JP2011500059A (ja) * 2007-10-15 2011-01-06 セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド ヒト抗アミロイド抗体、組成物、方法及び使用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018524370A (ja) * 2015-07-16 2018-08-30 プロビオドルグ エージー ヒト化抗体
JP7002811B2 (ja) 2015-07-16 2022-03-04 ビボリョン セラピューティクス エヌブイ 抗ピログルタミン酸化アミロイドβヒト化抗体

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EA032054B1 (ru) 2019-04-30
EP2686346A1 (en) 2014-01-22
IL227847A0 (en) 2013-09-30
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