JP7002811B2 - 抗ピログルタミン酸化アミロイドβヒト化抗体 - Google Patents
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Description
本発明は、ピログルタミン酸化されたアミロイドβ(AβN3pE)ペプチドのN-末端のエピトープへ結合するヒト化抗体、並びにアミロイドーシスなどの、アミロイドペプチドの蓄積及び沈着に関連している疾患及び状態の、アルツハイマー病、ダウン症、脳アミロイド血管障害及び他の関連局面のような、ピログルタミン酸化されたアミロイドペプチドに関連した障害及び異常の群の、予防的及び治療的処置に関する。より具体的には、これは、脳内及び末梢の様々な組織内のAβN3pEの蓄積を防止するか又は沈着を逆転するため、並びにアミロイドーシスを軽減するための、血漿、脳、及び脳脊髄液中のピログルタミン酸化されたアミロイドβペプチドに結合するヒト化モノクローナル抗体の使用に関連する。本発明は更に、本発明のヒト化抗体を使用するアミロイドーシスの診断のための、診断アッセイに関連している。
アミロイドーシスは、単独の疾患実体ではなく、むしろ1以上の器官又は体組織に蓄積する、アミロイドと称されるろう状のデンプン様タンパク質の細胞外組織沈着物によって特徴付けられる多様な進行性疾患過程群である。アミロイド沈着物が蓄積するにつれて、それらは器官又は体組織の正常な機能を妨害し始める。少なくとも15種の異なるタイプのアミロイドーシスが存在する。主な形態は、既知の前駆状態のない原発性アミロイドーシス、何らかの他の状態に続く続発性アミロイドーシス、及び遺伝性アミロイドーシスである。
1. いくつかの研究において、QCがAβのN-末端におけるグルタメートからのpyroGlu残基の形成を触媒することが示された(Cynisらの文献、Biochim Biophys Acta. 2006 Oct;1764(10):1618-25、Schillingらの文献、FEBS Lett. 2004 Apr 9;563(1-3):191-6);
2. AβペプチドとQCは両方とも、海馬及び皮質で大量に発現されている。これらの脳領域は、特に、ADのリスクが高い(Pohlらの文献、Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Nov 15;88(22):10059-63、Selkoeの文献、Physiol Rev. 2001 Apr;81(2):741-66);
3. APPは、形質膜への輸送中にβ-セクレターゼによって切断され、それにより、遊離グルタメート残基を有するAβのN-末端を生成させることができる(Greenfieldらの文献、Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Jan 19;96(2):742-7)。分泌小胞において、プロセシングされたAPPとQCの共局在が明らかにされた。従って、小胞の弱酸環境において、グルタメート残基からピログルタメートへの加速的修飾が起こり得る。
4. また、他の神経変性疾患(家族性デンマーク型認知症(FDD)又は家族性イギリス型認知症(FBD))は、N-末端pyroGlu修飾ペプチド、例えば、Bri2と関連しているが、対照的に、それらは、その一次構造の点では、Aβと関連していない(Vidal R.らの文献、1999 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 4920-4925)。
本発明は、モノマー、ダイマー、トリマー型など、又はポリマー型で、凝集物、線維、フィラメントの形状もしくは斑の凝縮した形状で、抗体に提示され得る、広範なβ-アミロイド抗原由来の、特にAβN3pEペプチド由来の特異的エピトープを特異的に認識しかつこれに結合する能力を有する、部分的又は完全なヒト化抗体及びそれらの断片を含み、キメラ抗体及びそれらの断片を含む、高度に特異性がありかつ高度に有効な抗体を含む、新規方法及び組成物を提供する。
X1は、Y及びHから選択され;並びに
X2は、A、I及びTから選択される);
もしくは、
並びに/又は、
ここで、該抗体の重鎖の可変部分が、アミノ酸配列:
X3は、Y及びHから選択され;
X4は、Y及びSから選択され;
X5は、G、T、A及びEから選択され;
X6は、K及びQから選択され;
X7は、L及びIから選択され;
X8は、I及びTから選択され;
X9は、Y及びHから選択され;並びに
X10は、V及びTから選択される);
もしくは、
(定義)
用語「抗体」は、最も広範な意味で使用されており、かつ具体的には、それらが所望の生体活性を示す限り、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの無傷の抗体から形成された多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び抗体断片を対象としている。抗体は、例えば、IgM、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4)、IgD、IgA、又はIgEであることができる。しかしながら、好ましくは、抗体は、IgM抗体ではない。
X1は、Y及びHから選択され;並びに
X2は、A、I及びTから選択される);
を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、ヒト化抗体に関する。
X3は、Y及びHから選択され;
X4は、Y及びSから選択され;
X5は、G、T、A及びEから選択され;
X6は、K及びQから選択され;
X7は、L及びIから選択され;
X8は、I及びTから選択され;
X9は、Y及びHから選択され;並びに
X10は、V及びTから選択される);
を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、ヒト化抗体に関する。
-本発明のヒト化抗体の軽鎖の可変部分は、配列番号:14のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり;並びに
-本発明のヒト化抗体の重鎖の可変部分は、配列番号:27のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり;並びに
-配列番号:14のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、該抗体の軽鎖の可変部分は、配列番号:12のVL CDR1、配列番号:9のVL CDR2及び配列番号:10のVL CDR3であるCDR領域を含み;並びに
-配列番号:27のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、該抗体の重鎖の可変部分は、配列番号:25のVH CDR1、配列番号:26のVH CDR2及び配列番号:20のVH CDR3であるCDR領域を含む。
-本発明のヒト化抗体の軽鎖の可変部分は、配列番号:14のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり;並びに
-本発明のヒト化抗体の重鎖の可変部分は、配列番号:70のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり;並びに
-配列番号:14のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、該抗体の軽鎖の可変部分は、配列番号:12のVL CDR1、配列番号:9のVL CDR2及び配列番号:10のVL CDR3であるCDR領域を含み;並びに
-配列番号:70のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、該抗体の重鎖の可変部分は、配列番号:25のVH CDR1、配列番号:71のVH CDR2及び配列番号:20のVH CDR3であるCDR領域を含む。
Aβ5-5-6 (寄託番号DSM ACC 2923)
Aβ6-1-6 (寄託番号DSM ACC 2924)
Aβ17-4-3 (寄託番号DSM ACC 2925)
Aβ24-2-3 (寄託番号DSM ACC 2926)
これらは、WO 2010/009987に記載されている。
-本発明のヒト化抗体の軽鎖の可変部分は、配列番号:14のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり;並びに
-本発明のヒト化抗体の重鎖の可変部分は、配列番号:27のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり;並びに
-ヒトIgG Fc領域は、配列番号:74のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり;並びに
-配列番号:14のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、該抗体の軽鎖の可変部分は、配列番号:12のVL CDR1、配列番号:9のVL CDR2、及び配列番号:10のVL CDR3であるCDR領域を含み;並びに
-配列番号:27のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、該抗体の重鎖の可変部分は、配列番号:25のVH CDR1、配列番号:26のVH CDR2、及び配列番号:20のVH CDR3であるCDR領域を含む。
-本発明のヒト化抗体の軽鎖の可変部分は、配列番号:14のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり;並びに
-本発明のヒト化抗体の重鎖の可変部分は、配列番号:70のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり;並びに
-ヒトIgG Fc領域は、配列番号:74のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり;並びに
-配列番号:14のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、該抗体の軽鎖の可変部分は、配列番号:12のVL CDR1、配列番号:9のVL CDR2、及び配列番号:10のVL CDR3であるCDR領域を含み;並びに
-配列番号:70のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、該抗体の重鎖の可変部分は、配列番号:25のVH CDR1、配列番号:71のVH CDR2、及び配列番号:20のVH CDR3であるCDR領域を含む。
pE-Aβ3-38、
pE-Aβ3-40、
pE-Aβ3-42
である。
a)本発明のヒト化抗体又はそれらの断片を、対象へ投与すること;及び
b)対象から採取された生体試料中のAβN3pEの濃度を測定すること:を含む。
a)抗体又はそれらの断片の第一の量を対象へ投与すること;
b)第一の投与量を投与した後3時間~2週間以内に、対象から採取された生体試料中のAβN3pEの濃度を測定すること;
c)必要ならば、工程b)の結果を基に、抗体又はそれらの断片の第二の量を計算することであって、ここで第二の量は、第一の量と同じか又は異なること;並びに
d)抗体又は断片の第二の量を投与すること:を含む。
a)対象から第一の生体試料を入手すること;
b)第一の試料中のAβN3pEのベースライン濃度を測定すること;
c)対象へ、本発明のヒト化抗体又はそれらの断片を投与すること;
d)抗体又はそれらの断片の投与後3時間~2週間以内に、対象から第二の生体試料を入手すること;並びに
e)第二の生体試料中のAβN3pEの濃度を測定すること:を含み、ここで、有効性は、血液中の抗体に結合したAβN3pEの量、及びAβN3pEの濃度、特に第一の生体試料と比べて第二の生体試料中のそれらの濃度の低下に関連している方法を含む。
(a)放射性同位体、例えば、35S、14C、125I、3H、及び131I。抗体は、例えば、「免疫学の最新プロトコール(Current Protocols in Immunology)」、第1巻及び第2巻, Gutigenら編, Wiley-Interscience社. New York, New York. Pubs,(1991)に記載されている技術を用いて放射性同位体で標識することができ、放射能は、シンチレーションカウンティングを用いて測定することができる。
(b)蛍光標識、例えば、希土類キレート(ユーロピウムキレート)又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリスリン、並びにテキサスレッドが利用可能である。蛍光標識は、例えば、「免疫学の最新プロトコル」(前掲)に開示されている技術を用いて、抗体にコンジュゲートすることができる。蛍光は、蛍光光度計を用いて定量することができる。
(c)様々な酵素-基質標識が利用可能である。酵素は一般に、様々な技術を用いて測定することができる発色基質の化学的変化を触媒する。例えば、酵素は、基質の色の変化を触媒することができ、この変化は、分光光度法によって測定することができる。あるいは、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変化させることができる。蛍光の変化を定量するための技術は上で説明されている。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起されるようになり、その後(例えば、化学発光計を用いて)測定し得る光を放出することができるか、又は蛍光受容体にエネルギーを供与する。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ(例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ;米国特許第4,737,456号)、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRPO)などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、O-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ(例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ)、複素環オキシダーゼ(例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ)、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。酵素を抗体にコンジュゲートさせるための技術は、O'Sullivanらの文献、「酵素イムノアッセイにおける使用のための酵素-抗体コンジュゲートの調製方法(Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay)」、Methods in Enzym(Langone及びH. Van Vunakis編), Academic Press社, New York, 73:147-166(1981)に記載されている。
(i)セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRPO)と、基質としての水素ペルオキシダーゼ、ここで、該水素ペルオキシダーゼは、色素前駆体(例えば、オルトフェニレンジアミン(OPD)又は3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン塩酸塩(TMB))を酸化する;
(ii)アルカリホスファターゼ(AP)と、発色基質としてのパラ-ニトロフェニルホスフェート;及び
(iii)β-D-ガラクトシダーゼ(β-D-Gal)と、発色基質(例えば、p-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシダーゼ)又は蛍光基質4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシダーゼ
が挙げられる。
便宜上、本発明の抗体は、キット、すなわち、所定の量の試薬と診断アッセイを実施するための指示書とを包装して組み合わせたものとして提供することができる。抗体が酵素で標識されている場合、キットは、その酵素が必要とする基質及び補因子(例えば、検出可能な発色団又は蛍光団を提供する基質前駆体)を含む。さらに、他の添加剤、例えば、安定化剤、緩衝液(例えば、ブロック緩衝液又は溶解緩衝液)などが含まれていてもよい。アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中濃度を提供するために、様々な試薬の相対量を幅広く変化させることができる。特に、試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、通常凍結乾燥された乾燥粉末として提供することができる。
本発明のヒト化抗体を、試料、好ましくは血清、体液又はCSF試料から選択された試料、最も好ましくは血清試料と;あるいは、該状態又は疾患に罹患したことが疑われる対象の特定の体の一部又は体の領域と、接触させる工程、並びに
試料から、AβN3pEへの抗体の結合を検出する工程:
を含む、アミロイド関連の疾患又は状態、好ましくはアルツハイマー病の診断のためのインビトロ又はインサイチュ診断方法に関する。
(a)アミロイドタンパク質を含むことが疑われる試料又は特定の体の一部もしくは体の領域を、本発明のヒト化抗体又はそれらの断片と接触させる工程;
(b)抗体及び/又はそれらの機能的部分を、AβN3pEに結合させ、免疫複合体を形成させる工程;
(c)免疫複合体の形成を検出する工程;並びに
(d)免疫複合体の存在又は非存在を、試料又は特定の体の一部もしくは領域中のAβN3pEの存在又は非存在と相関させる工程:
を含む、試料中の又はインサイチュでの、AβN3pEへの、本発明のヒト化抗体又はそれらの免疫活性のある断片の免疫特異的結合を検出することを含む、アミロイド関連の疾患又は状態、好ましくはアルツハイマー病の診断方法に関する。
(a)試験下で、組織及び/又は体液を代表する試料を得る工程;
(b)本発明のヒト化抗体、又はキメラ抗体もしくはそれらの断片により、アミロイドタンパク質の存在について該試料を試験する工程;
(c)該タンパク質に結合したヒト化抗体の量を決定する工程;並びに
(d)組織及び/又は体液中の斑負荷を計算する工程:
を含む。
(1. N3pE-Aβ特異的ヒト化抗体を生成するためのヒト化方法)
N3pE-Aβ特異的マウスモノクローナル抗体クローン#6、#17及び#24は、ハイブリドーマ細胞株6-1-6、17-4-3、及び24-2-3から入手し、これらはブダペスト条約に準拠して寄託されており、ドイツブラウンシュヴァイク(Braunschweig, DE)のドイツ微生物・培養細胞収集有限会社(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ))において入手され、寄託日2008年6月17日付けで、それぞれの寄託番号は以下である:
(クローン 6-1-6): DSM ACC2924
(クローン 17-4-3): DSM ACC2925
(クローン 24-2-3): DSM ACC2926。
定常配列の給源として、ヒトB細胞のRNAを、全血液500μlの、1×FACS溶解液(Becton Dickinson社)5mlによる、室温で10分間の溶解により単離した。この溶解液を、300gで5分間遠心し;ペレットを、PBSにより2回洗浄し、その後Nucleo Spin(登録商標)RNA II (Macherey-Nagel社)のRA1緩衝液350μl中に溶解させ、0.5M TCEP(SIGMA社)3.5μlを添加した。このRNAを、製造業者の指示により、単離した。RNA 10μlを最初に、0.5μg/μl OligodTプライマー(Invitrogen社)1μl及び10mM dNTPsの1μlと共に、65℃で5分間、インキュベーションした。次に、5×First Strand緩衝液(Invitrogen社)の4μl、100mM DTTの2μl及びSuperScript III逆転写酵素(Invitrogen社)の0.5μlを、20μlへ添加し、混合物を、25℃で5分間、50℃で50分間、及び70℃で15分間インキュベーションした。表2に示したプライマー対によるPCRにより合成された、軽鎖及び重鎖の定常領域のcDNAを、増幅した。
ヒト化抗体の軽鎖及び重鎖の配列を、各々、2種の異なる哺乳動物発現ベクターpCDNA3.1及びHC-pOptiVECへと、個別にクローニングした。CHO細胞培養物中での組換え抗体を発現するためのベクターの最適組合せを同定するために、異なるプラスミド組合せを使用し、接着性CHO細胞における一過性発現を行った。第二の工程において、LCとHCプラスミド間の異なるDNAの比は、発現レベルに影響を及ぼすかどうかを調べた。3μgのLC-pCDNA3.1及び1μgのHC-pOptiVECのトランスフェクションにより、増加した発現レベルを認めた。
ヒト化抗体クローン#6を精製し、当初のマウス抗体と比較し、このタンパク質の抗原結合特性を調べた。従って、キメラ抗体及びヒト化抗体を発現した上清300mlを作製し、プロテインGクロマトグラフィーにより精製した(図2)。発現された抗体の量は非常に少ないので、その収量は、0.1μg/ml未満であり、合計25μgの精製タンパク質であった。溶離された抗体を、約200μg/mlまで濃縮し、かつタンパク質2μgを、SDS-PAGEに適用し、その後クマーシー染色した(図2)。
表面プラズモン共鳴測定を使用し、ヒト化抗体のAβpE3-18への結合効力を調べた(図3)。測定時の質量移動及びアビディティ効果を防止するために、以下の手順を使用した:
最初にポリクローナルα-ヒト抗体を、SPR-チップにカップリングさせ、引き続き反応単位(Response Unit)が1000を超えるまで、ヒト化抗体を負荷した。
動態測定を、AβpE3-18-ペプチドの異なる濃度(5~1000nM)で行った。測定されたシリーズのグラフは、センサーグラムと重ねたプロットとして示し、流動緩衝液を測定するセンサーグラムにより補正し、注入時点及び注入前にゼロに調節したベースライン時と並置した。これらの結果は、koff及びkon速度定数を推進する、単純な1:1相互作用モデル(ラングミュアフィット)に従い評価した。図3において、結合曲線及び解離曲線からなる、SPR-結合曲線を示した。
安定した細胞株の発達のために、最初に安定したCHO-DG44細胞株のプールを、様々な濃度のメトトレキサート(MTX)による処理により生成した。最良の発現を、濃度0.5μM MTXで低量の死滅細胞を伴い、検出した(図14A、レーン2)。従って、0.5μM MTXで予備処理した細胞を、限定希釈によるクローン選択に使用した。
上清1Lを、40mM Na2HPO4(pH7)の1Lで希釈し、かつプロテインGカラム5mlに、4℃で一晩適用した。そのカラムを結合緩衝液(20mM Na2HPO4(pH7)、画分A1-A3)で洗浄した後、次に高塩緩衝液(2M NaCl、40mM Na2HPO4(pH7)、画分A4-A7)で洗浄し、非特異的に結合したタンパク質を除去した。この抗体を、0.1Mグリシン-HCl(pH2.7)により、カラムから溶離し、1Mトリス(pH9)により直ちに中和した。画分を収集し、24μlを、12%SDS PAGE上に、各々装加した。画分A12+B1をプールし、ITCによるKD決定のために使用した。全般的に、抗体2.5mgが、1Lの培養上清から精製された。
KD値の決定のために、ヒト化抗体クローン#6を、濃度1μMに希釈した。濃度20μMのリガンドAβpE3-18を293.15Kで滴定した。ITC-測定値の生データの積分後(図5B、下側)、化学反応量論1.5を算出した。算出したKD値は、2.7nMであり、SPRデータから算出した値5.3nMと非常によく調和し、このことは、溶媒中でのヒト化クローン#6 HC T97リガンド結合を、高親和性相互作用として特徴付けた。この相互作用は、主にエンタルピー寄与により駆動され(ΔH=-23.45kcal/mol)、かつエントロピーペナルティにより妨害され(TΔS=-11.96 kcal/mol)、このことは、水素結合の形成による結合部位での構造上の再配置の常で、自由度の著しい消失を生じる。
2種の更なるAβpE3-特異的抗体クローン#17及びクローン#24のヒト化、発現及び精製は、クローン#6について使用したものと同じプロトコール、材料及び方法並びに実験条件を用いて行った。
pE3-Aβ18リガンドを使用するSPR測定は、両方のヒト化抗体は、pE3-Aβペプチドに結合することが可能であることを明らかにした。速度定数及びKD値は、ラングミュア1:1モデルフィットにより非常に良く計算することができた。マウス抗体のpE3-Aβへの当初のKD値は、表5に示している。ヒト化抗体クローン#24のkoff値は、マウス抗体クローン#24のkoff値よりも、20倍高いことが、明らかになり始めた。このことは、ヒト化後に、pE3-Aβペプチドは、その抗体の抗原結合ポケットからより迅速に解離することを意味する。
配列番号:73のヒトIgG1 Fc野生型領域又はそれらのK322A変異体バリアント(配列番号:74)のいずれかを含む2種の抗体の、様々なFcγ受容体(CD16A、CD32A、CD32B、及びCD64)への結合を、比較した。
抗体のエフェクター機能をより良く特徴付けるために、配列番号:73のヒトIgG1 Fc野生型領域又はそれらのK322A変異体バリアント(配列番号:74)のいずれかを含む2種の抗体の、C1qへの結合を、比較した。
a)2種の抗体の、プレートへの直接結合、その後の溶液中のC1qへの結合;並びに
b)ストレプトアビジンコートされたプレートのビオチン化されたpE-Aβペプチドとの最初のインキュベーション、抗体への結合、その後のC1qへの結合:を含む。
ELISAプレートを、配列番号:73のヒトIgG1 Fc野生型領域又はそれらのK322A変異体バリアント(配列番号:74)を含む抗体、及びC1qに結合しないK322A対照(hu14.18K322A)により、10、8、6、4、3、2、1及び0μg/mlで、3つ組でコートし、4℃で一晩インキュベーションした。翌日、プレートを、1×PBSにより3回洗浄し、その後1×PBS中の1%BSAにより、50μl/ウェルでブロックした。C1q(Sigma社、カタログ番号C1740)を、各ウェルに、ブロック緩衝液中2μg/mlで添加し、室温で1時間インキュベーションした。次にプレートを、1×PBSの200μlにより3回洗浄した。抗-C1q-HRP(Thermo社、カタログ番号PA1-84324)を、プレートに添加し、ブロック緩衝液(50μl/ウェル)中に1:250で希釈して、1時間結合を検出した。プレートを、再度1×PBSの200μlにより3回洗浄した。TMB(Invitrogen社、カタログ番号002023)の50μlを、各ウェルに添加し、その相互作用(Invitrogen社、カタログ番号002023)を2分間可視化した。停止溶液(1M硫酸)50μlを各ウェルに添加し、その後450nmでの吸光度を測定した。
IHCにより、抗原AβN3pEは、脳の組織切片において局在化され得る。従って、本発明のヒト化抗体を、AβN3pEの検出に使用した。
合計62匹のオスのマウスを、本試験に利用した。免疫化を開始する前に、アルツハイマー病の現存するマウスモデル(平均5.6±0.45月齢)のマウスの中の4匹のマウスを、屠殺し、治療開始時の脳のAβ斑負荷を評価するための、ベースライン対照とした。残りのマウスを、4群に分け、以下の治療を受けさせた:250μlの滅菌PBS(n=12;平均5.89±0.13月齢)、200μgの本発明のヒト化抗体。月齢及び性別が合致したWt同腹仔の群に、250μlのPBS(n=12;平均5.80±0.12月齢)を注射し、行動対照として使用した。マウスを、28週間にわたる総容量250μl(抗体又はPBS)の腹腔内注射により治療した。
月齢6ヶ月(ベースライン)又は13ヶ月で、マウスを安楽死させ、灌流し、血漿を収集した。脳を摘出し、矢状に分割した。海馬、皮質及び小脳を、一方の脳半球から切断し、生化学分析のために瞬間凍結させた。他方の脳半球を、4%パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Sciences社)中で、4℃で24時間、浸漬固定し、4℃のショ糖溶液勾配中で凍結防止し、OCTコンパウンド(Tissue Tek社)中に包埋した。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
(構成1)
ヒト化抗体又はその機能的バリアントであって、ここで該抗体の軽鎖の可変部分が、アミノ酸配列:
(化1)
(ここで、
X 1 は、Y及びHから選択され;並びに
X 2 は、A、I及びTから選択される);
もしくは、
(化2)
から選択されるアミノ酸配列:を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり、
並びに/又は、
ここで、該抗体の重鎖の可変部分が、アミノ酸配列:
(化3)
(ここで、
X 3 は、Y及びHから選択され;
X 4 は、Y及びSから選択され;
X 5 は、G、T、A及びEから選択され;
X 6 は、K及びQから選択され;
X 7 は、L及びIから選択され;
X 8 は、I及びTから選択され;
X 9 は、Y及びHから選択され;並びに
X 10 は、V及びTから選択される);
もしくは、
(化4)
から選択されるアミノ酸配列:を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、ヒト化抗体又はその機能的バリアント。
(構成2)
前記軽鎖中にCDR領域:
(化5)
(ここで、X 1 は、Y及びHから選択される);
(化6)
を含む、請求項1記載のヒト化抗体。
(構成3)
前記軽鎖の可変部分が、アミノ酸配列:
(化7)
を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、請求項1又は2記載のヒト化抗体。
(構成4)
前記軽鎖中にCDR領域:
(化8)
を含む、請求項3記載のヒト化抗体。
(構成5)
前記軽鎖の可変部分が、アミノ酸配列:
(化9)
を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、請求項1記載のヒト化抗体。
(構成6)
前記軽鎖中に、配列番号:12のV L CDR1、配列番号:9のV L CDR2、及び配列番号:10のV L CDR3であるCDR領域を含む、請求項5記載のヒト化抗体。
(構成7)
前記軽鎖の可変部分が、アミノ酸配列:
(化10)
を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、請求項1記載のヒト化抗体。
(構成8)
前記軽鎖中に、配列番号:12のV L CDR1、配列番号:9のV L CDR2、及び配列番号:10のV L CDR3であるCDR領域を含む、請求項7記載のヒト化抗体。
(構成9)
前記軽鎖の可変部分が、アミノ酸配列:
(化11)
を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、請求項1記載のヒト化抗体。
(構成10)
前記軽鎖中にCDR領域:
(化12)
を含む、請求項9記載のヒト化抗体。
(構成11)
前記重鎖中にCDR領域:
(化13)
(ここで、X 3 は、Y及びHから選択される);
(化14)
(ここで、X 4 は、Y及びSから選択され、X 5 は、G、T、A及びEから選択され;並びに、X 6 は、K及びQから選択される);並びに
(化15)
を含む、請求項1~10のいずれか一項記載のヒト化抗体。
(構成12)
前記重鎖の可変部分が、従ってアミノ酸配列:
(化16)
を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、請求項1又は請求項11記載のヒト化抗体。
(構成13)
前記重鎖中にCDR領域:
(化17)
を含む、請求項12記載のヒト化抗体。
(構成14)
前記重鎖の可変部分が、アミノ酸配列:
(化18)
を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、請求項1又は請求項11記載のヒト化抗体。
(構成15)
前記重鎖中にCDR領域:
(化19)
を含む、請求項14記載のヒト化抗体。
(構成16)
前記重鎖の可変部分が、アミノ酸配列:
(化20)
を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、請求項1又は請求項11記載のヒト化抗体。
(構成17)
前記重鎖中にCDR領域:
(化21)
を含む、請求項16記載のヒト化抗体。
(構成18)
前記重鎖の可変部分が、アミノ酸配列:
(化22)
を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、請求項1又は請求項11記載のヒト化抗体。
(構成19)
前記重鎖中にCDR領域:
(化23)
を含む、請求項18記載のヒト化抗体。
(構成20)
前記重鎖の可変部分が、アミノ酸配列:
(化24)
を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、請求項1又は請求項11記載のヒト化抗体。
(構成21)
前記重鎖中にCDR領域:
(化25)
を含む、請求項18記載のヒト化抗体。
(構成22)
前記重鎖の可変部分が、アミノ酸配列:
(化26)
を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、請求項1又は請求項11記載のヒト化抗体。
(構成23)
前記重鎖中にCDR領域:
(化27)
を含む、請求項21記載のヒト化抗体。
(構成24)
前記抗体の軽鎖の可変部分が、アミノ酸配列:
(化28)
を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、請求項1記載のヒト化抗体。
(構成25)
前記軽鎖中にCDR領域:
(化29)
を含む、請求項24記載のヒト化抗体。
(構成26)
前記抗体の重鎖の可変部分が、アミノ酸配列:
(化30)
を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、請求項1又は25記載のヒト化抗体。
(構成27)
前記重鎖中にCDR領域:
(化31)
を含む、請求項26記載のヒト化抗体。
(構成28)
前記抗体の軽鎖の可変部分が、アミノ酸配列:
(化32)
を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、請求項1記載のヒト化抗体。
(構成29)
前記軽鎖中にCDR領域:
(化33)
を含む、請求項28記載のヒト化抗体。
(構成30)
前記抗体の重鎖の可変部分が、アミノ酸配列:
(化34)
を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、請求項1又は請求項29記載のヒト化抗体。
(構成31)
前記重鎖中にCDR領域:
(化35)
を含む、請求項30記載のヒト化抗体。
(構成32)
前記ヒトIgG1 Fc領域が、配列番号:73及び74から選択されたアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、請求項1~31のいずれか一項記載のヒト化抗体。
(構成33)
前記ヒトIgG1 Fc領域が、配列番号:74のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、請求項1~32のいずれか一項記載のヒト化抗体。
(構成34)
前記軽鎖の可変部分が、配列番号:14のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり;及び、重鎖の可変部分が、配列番号:27のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり;及び、ヒトIgG1 Fc領域が、配列番号:74のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、請求項1~33のいずれか一項記載のヒト化抗体。
(構成35)
前記軽鎖の可変部分が、配列番号:14のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり;及び
重鎖の可変部分が、配列番号:27のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり;及び
ヒトIgG1 Fc領域が、配列番号:74のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり;
軽鎖の可変部分が、配列番号:12のV L CDR1、配列番号:9のV L CDR2、及び配列番号:10のV L CDR3であるCDR領域を含み;並びに
重鎖の可変部分が、配列番号:25のV H CDR1、配列番号:26のV H CDR2、及び配列番号:20のV H CDR3であるCDR領域を含む、請求項1~34のいずれか一項記載のヒト化抗体。
(構成36)
前記軽鎖の可変部分が、配列番号:14のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり;及び、重鎖の可変部分が、配列番号:70のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり;及び、ヒトIgG1 Fc領域が、配列番号:74のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなる、請求項1~34のいずれか一項記載のヒト化抗体。
(構成37)
前記軽鎖の可変部分が、配列番号:14のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり;及び
重鎖の可変部分が、配列番号:70のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり;及び
ヒトIgG1 Fc領域が、配列番号:74のアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか又はこれからなり;
軽鎖の可変部分が、配列番号:12のV L CDR1、配列番号:9のV L CDR2、及び配列番号:10のV L CDR3であるCDR領域を含み;並びに
重鎖の可変部分が、配列番号:25のV H CDR1、配列番号:71のV H CDR2、及び配列番号:20のV H CDR3であるCDR領域を含む、請求項1~34及び36のいずれか一項記載のヒト化抗体。
(構成38)
前記ヒト化抗体が、AβN3pEエピトープのピログルタメートを保有するN-末端へ特異的に結合する、請求項1~37のいずれか一項記載のヒト化抗体。
(構成39)
前記ヒト化抗体が:
(化36)
からなる群から選択されるエピトープに、特異的に結合する、請求項1~38のいずれか一項記載のヒト化抗体。
(構成40)
本発明のヒト化抗体が、AβN3pEバリアントに結合し、ここでAβN3pEバリアントは、pE-Aβ 3-X として定義され、ここでxは、19~42の整数として定義される、請求項1~37のいずれか一項記載のヒト化抗体。
(構成41)
前記AβN3pEバリアントが:
pE-Aβ 3-38 、
pE-Aβ 3-40 、
pE-Aβ 3-42
から選択される、請求項40記載のヒト化抗体。
(構成42)
前記ヒト化抗体が、N-末端にピログルタメートを保有しないエピトープには結合しない、請求項1~41のいずれか一項記載のヒト化抗体。
(構成43)
請求項1~42のいずれか一項記載のヒト化抗体を含む医薬組成物。
(構成44)
更なる生体活性物質及び/又は医薬として許容し得る担体及び/又は希釈剤及び/又は賦形剤を更に含む、請求項43記載の医薬組成物。
(構成45)
前記更なる生体活性物質が、中性子透過増強剤、精神治療薬、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、カルシウム-チャンネル遮断薬、生体アミン、ベンゾジアゼピントランキライザー、アセチルコリンの合成、貯蔵又は放出の増強剤、アセチルコリンシナプス後受容体アゴニスト、モノアミンオキシダーゼ-A又は-B阻害剤、N-メチル-D-アスパラギン酸型グルタミン酸受容体アンタゴニスト、非ステロイド系抗炎症薬、抗酸化剤、及びセロトニン受容体アンタゴニストから選択される、請求項44記載の医薬組成物。
(構成46)
前記更なる生体活性物質が、酸化的ストレスに対し有効な化合物、抗-アポトーシス化合物、金属キレート剤、ピレンゼピン及び代謝産物などのDNA修復阻害剤、3-アミノ-1-プロパンスルホン酸(3APS)、1,3-プロパンジスルホナート(1,3PDS)、α-セクレターゼ活性化剤、β-及びγ-セクレターゼ阻害剤、タウタンパク質、神経伝達物質、β-シート破壊物質、アミロイドβをクリアリング/枯渇する細胞成分の誘引物質、グルタミニルシクラーゼ阻害剤などのピログルタミン酸化されたアミロイドβ3-42を含むN-末端切断型アミロイドβの阻害剤、抗炎症性分子、又はタクリン、リバスチグミン、ドネペジル、及び/もしくはガランタミンなどのコリンエステラーゼ阻害剤(ChEI)、Mlアゴニスト、並びに任意のアミロイドもしくはタウ修飾薬及び栄養補助剤、コリンエステラーゼ阻害剤(ChEI)、メマンチン又はグルタミニルシクラーゼの阻害剤を含む他の薬物からなる群から選択される、請求項44記載の医薬組成物。
(構成47)
アミロイドーシスの診断、予防又は治療のための、特に軽度認知障害(MCI)、例えば孤発性アルツハイマー病(SAD)又は家族性イギリス型認知症(FBD)及び家族性デンマーク型認知症(FDD)のような家族性アルツハイマー型認知症(FAD)のようなアルツハイマー病(AD)、ダウン症の神経変性、並びに臨床期又は前臨床期脳アミロイド血管障害からなる群から選択される神経変性疾患の治療のための、医薬品の調製のための、請求項1~46のいずれか一項記載のヒト化抗体又は医薬組成物の使用。
(構成48)
アミロイドーシスの診断、治療における使用、特に軽度認知障害(MCI)、例えば孤発性アルツハイマー病(SAD)又は家族性イギリス型認知症(FBD)及び家族性デンマーク型認知症(FDD)のような家族性アルツハイマー型認知症(FAD)のようなアルツハイマー病(AD)、ダウン症の神経変性、並びに臨床期又は前臨床期脳アミロイド血管障害からなる群から選択される神経変性疾患の治療における使用のための、請求項1~46のいずれか一項記載のヒト化抗体又は医薬組成物。
(構成49)
アミロイドーシスの、特に軽度認知障害(MCI)、例えば孤発性アルツハイマー病(SAD)又は家族性イギリス型認知症(FBD)及び家族性デンマーク型認知症(FDD)のような家族性アルツハイマー型認知症(FAD)のようなアルツハイマー病(AD)、ダウン症の神経変性、並びに臨床期又は前臨床期脳アミロイド血管障害からなる群から選択される神経変性疾患の診断、予防又は治療の方法であって、かかる治療を必要とする対象へ、請求項1~46のいずれか一項記載のヒト化抗体又はそれらの免疫学的反応性断片又は医薬組成物の治療的又は予防的有効量を投与することを含む、方法。
(構成50)
請求項1~46のいずれか一項記載のヒト化抗体又は医薬組成物の投与が、軽度認知障害(MCI)、例えば孤発性アルツハイマー病(SAD)又は家族性イギリス型認知症(FBD)及び家族性デンマーク型認知症(FDD)のような家族性アルツハイマー型認知症(FAD)のようなアルツハイマー病(AD)、ダウン症の神経変性、並びに臨床期又は前臨床期脳アミロイド血管障害と診断された対象における認知能減退の逆転、認知の改善又は認知能減退の予防につながる、請求項47~49のいずれか一項記載の使用又は方法。
(構成51)
請求項1~46のいずれか一項記載のヒト化抗体又は医薬組成物の投与が、斑又は他の生物学的複合体からのAβN3pEのクリアランス又は除去につながる、請求項47~50のいずれか一項記載の使用又は方法。
(構成52)
請求項1~46のいずれか一項記載のヒト化抗体又は医薬組成物の投与が、斑負荷の減少、及び/又は脳組織などの罹患組織からの完全な斑の除去につながる、請求項47~52のいずれか一項記載の使用又は方法。
Claims (15)
- 配列番号:73及び74から選択されたアミノ酸配列を含むか、又はこれからなるヒトIgG1 Fc領域を有する、請求項1~4のいずれか一項記載のヒト化抗体。
- 前記ヒトIgG1 Fc領域が、配列番号:74のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなる、請求項5記載のヒト化抗体。
- 前記軽鎖の可変部分が、配列番号:14のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり;及び
重鎖の可変部分が、配列番号:27のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり;及び
ヒトIgG1 Fc領域が、配列番号:74のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり;
軽鎖の可変部分が、配列番号:12のVL CDR1、配列番号:9のVL CDR2、及び配列番号:10のVL CDR3であるCDR領域を含み;並びに
重鎖の可変部分が、配列番号:25のVH CDR1、配列番号:26のVH CDR2、及び配列番号:20のVH CDR3であるCDR領域を含む、請求項1~6のいずれか一項記載のヒト化抗体。 - 本発明のヒト化抗体が、AβN3pEバリアントに結合し、ここでAβN3pEバリアントは、pE-Aβ3-Xとして定義され、ここでxは、19~42の整数として定義される、請求項1~8のいずれか一項記載のヒト化抗体。
- 前記AβN3pEバリアントが:
pE-Aβ3-38、
pE-Aβ3-40、
pE-Aβ3-42
から選択される、請求項9記載のヒト化抗体。 - 前記ヒト化抗体が、N-末端にピログルタメートを保有しないエピトープには結合しない、請求項1~10のいずれか一項記載のヒト化抗体。
- 請求項1~11のいずれか一項記載のヒト化抗体を含む医薬組成物。
- 更なる生体活性物質及び/又は医薬として許容し得る担体及び/又は希釈剤及び/又は賦形剤を更に含む、請求項12記載の医薬組成物。
- 前記更なる生体活性物質が、中性子透過増強剤、精神治療薬、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、カルシウム-チャンネル遮断薬、生体アミン、ベンゾジアゼピントランキライザー、アセチルコリンの合成、貯蔵又は放出の増強剤、アセチルコリンシナプス後受容体アゴニスト、モノアミンオキシダーゼ-A又は-B阻害剤、N-メチル-D-アスパラギン酸型グルタミン酸受容体アンタゴニスト、非ステロイド系抗炎症薬、抗酸化剤、及びセロトニン受容体アンタゴニストから選択される、請求項13記載の医薬組成物。
- 前記更なる生体活性物質が、酸化的ストレスに対し有効な化合物、抗-アポトーシス化合物、金属キレート剤、ピレンゼピン及び代謝産物などのDNA修復阻害剤、3-アミノ-1-プロパンスルホン酸(3APS)、1,3-プロパンジスルホナート(1,3PDS)、α-セクレターゼ活性化剤、β-及びγ-セクレターゼ阻害剤、タウタンパク質、神経伝達物質、β-シート破壊物質、アミロイドβをクリアリング/枯渇する細胞成分の誘引物質、グルタミニルシクラーゼ阻害剤などのピログルタミン酸化されたアミロイドβ3-42を含むN-末端切断型アミロイドβの阻害剤、抗炎症性分子、又はタクリン、リバスチグミン、ドネペジル、及び/もしくはガランタミンなどのコリンエステラーゼ阻害剤(ChEI)、Mlアゴニスト、並びに任意のアミロイドもしくはタウ修飾薬及び栄養補助剤、コリンエステラーゼ阻害剤(ChEI)、メマンチン又はグルタミニルシクラーゼの阻害剤を含む他の薬物からなる群から選択される、請求項13記載の医薬組成物。
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