KR20160113206A

KR20160113206A - 항-트랜스티레틴 인간화 항체

Info

Publication number: KR20160113206A
Application number: KR1020167023087A
Authority: KR
Inventors: 아키히코 호소이; 마사하루 토리카이; 토모요 타케오; 마사요 우에노; 히로푸미 히구치; 켄지 소에지마; 토시히로 나카시마; 유키오 안도; 히로푸미 주노; 유 수
Original assignee: 잇빤 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼; 고꾸리쯔다이가꾸호오진 구마모또 다이가꾸
Priority date: 2014-01-29
Filing date: 2015-01-23
Publication date: 2016-09-28
Also published as: US20160347832A1; PT3101131T; JP6818268B2; CN106574258A; EP3101131A4; KR102538555B1; JPWO2015115331A1; EP3101131B1; EP3101131A1; CN106574258B; WO2015115331A1; US10604562B2

Abstract

서열번호 1∼3의 아미노산 서열로 이루어지는 H 체인의 상보성 결정영역과, 서열번호 4∼6의 아미노산 서열로 이루어지는 L 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 인간화 항체. 본 발명의 인간화 항체는 구조변화를 일으킨 트랜스티레틴(TTR)에 특이적으로 결합하는 활성이나 TTR의 섬유화를 저해하는 활성을 가지고, 인체로의 적용에 적합한 인간화 항체이다.

Description

항-트랜스티레틴 인간화 항체{ANTI-TRANSTHYRETIN HUMANIZED ANTIBODY}

본 발명은 트랜스티레틴(TTR: transthyretin)의 아밀로이드 섬유의 형성이나 조직으로의 침착을 효과적으로 억제하는 항체 및, 당해 항체를 사용한 치료법을 제공한다. 본 항체요법은 정상형 TTR에는 작용하지 않고, 이상형 TTR의 아밀로이드 형성만을 억제한다는 새로운 치료 전략에 의거하는 것으로, 안전성이 우수한 신규치료법이 될 수 있다고 기대된다.

아밀로이드시스는 섬유구조를 형성한 단백질이 전신의 장기에 침착함으로써 기능장애를 발생시키는 일련의 질병군으로, 알츠하이머형 인지증이나 프라이온병 등의 다양한 질병이 포함된다(비특허문헌 1).

가족성 아밀로이드 다발신경병증(Familial Amyloidotic Polyneuropathy: FAP)은 TTR, 아포리포단백질 A1, 겔솔린 등의 유전자의 점돌연변이나 결실이 원인이 되어서 발생하는 상염색체 우성의 유전성 전신성 아밀로이드시스이다(비특허문헌 2). 그 중에서, TTR의 유전적인 돌연변이에 의해서 발생하는 FAP가 가장 많다. 돌연변이형의 TTR이 아밀로이드 섬유를 형성하고, 통상, 중년기 이후에 말초신경이나 심장, 신장, 소화관, 눈, 뇌, 수막과 같은 거의 전신의 조직에 침착해서 기능 부전을 일으키는 것이 알려져 있다. 환자의 예후는 매우 나빠서 발증으로부터 10년 정도에서 사망에 이르는 난병이다.

현재까지 100을 넘는 TTR 유전자의 점돌연변이나 결실이 보고되고 있다. 그 중에서도, TTR의 30번째의 발린이 메티오닌으로 변이한 Val30Met 돌연변이(이하, V30M과 같이 표기)이 가장 많으며, 환자는 포르투갈, 스웨덴, 일본에 많다. 포르투갈에 6,000명 이상의 FAP 환자가 확인되고 있는 것, 아직 FAP가 조사되고 있지 않다고 생각되는 지역도 적지 않아, 향후 FAP 환자군의 세계적인 발견이 계속될 것이 예상되고 있기 때문에, 전세계에는 1만명을 충분하게 상회하는 환자가 있는 것으로 생각되고 있다. 최근의 연구로부터 FAP의 임상상(발증 연령이나 침착 장기 특이성 등)은 TTR 유전자의 돌연변이 종류에 크게 영향을 주지 않음이 밝혀지고 있다(비특허문헌 3). 예를 들면 FAP의 발증 연령에 대해서는 L55P 돌연변이는 10대에 발증하는 극증형의 임상상을 초래하지만, V122I 돌연변이는 60세 이후에 발증한다. 한편, V30M 돌연변이에서는 청년에서 발증하는 병형과 고령에서 발증하는 병형의 양쪽이 존재하는 것이 알려져 있다. 침착하는 장기의 특이성에 대해서는 D18G 돌연변이는 뇌나 수막에 침착해서 중추신경 장애를 발생시키는 한편으로, V30M 돌연변이는 전신의 조직에 침착하고, 말초신경 장애나 심근 장애를 발생시킨다(비특허문헌 3, 4).

TTR은 127개의 아미노산으로 이루어지는 분자량 14 kDa의 단백질로 내부에 존재하는 8개의 β-스트랜드가 2개의 역평행 β-시트를 형성한 구조를 갖는다(비특허문헌 5). TTR의 주된 생산 장소는 간장이지만, 뇌실 맥락총, 망막의 망막 색소 상피세포, 비장 등에서도 생산되고 있다. TTR은 통상, 혈중에서 분자량 55 kDa의 사량체를 형성해서 안정된 구조를 취하고, 주로 혈중 및 골수액 중에서, 비타민A-레티놀 결합 단백질 복합체, 및 갑상선 호르몬 T4의 수송 담체로서 기능하고 있다. 그 혈중 농도는 200-400㎍/㎖로 높지만, 반감기는 2일로 짧다(비특허문헌 2∼6). TTR 사량체의 중심부에는 2개의 상동의 T4 결합부위가 존재하고, T4가 결합하는 것에 의해 사량체 구조는 안정화되는 것이 알려져 있다(비특허문헌 3). 기타의 기능으로서, 인슐린 분비 촉진작용, 뇌신경 보호작용, 지방질대사에 관계하는 작용 등 다양한 보고가 이루어지고 있다(비특허문헌 2). 한편, TTR 유전자를 녹아웃한 마우스에서는 혈중의 레티놀이나 갑상선 호르몬 농도는 저하되지만, 생존률이나 번식능과 같은 표현형에 큰 변화는 인정되지 않았기 때문에(비특허문헌 7), TTR이 실제의 생명활동의 유지에 있어서 직접 필수적인 것인지의 여부는 불분명한 상태이다.

TTR의 아밀로이드 형성에는 사량체로부터 단량체로의 해리와, 단량체의 구조변화가 매우 중요한 스텝이다(비특허문헌 3). 그 중에서도, 사량체로부터 단량체로의 해리가 반응의 률속단계인 것이 밝혀져 있다. 한편, TTR이 아밀로이드를 형성해서 조직에 침착하고, 전신의 장기에 장애를 미치게 하는 과정에서, 조직에 대해서 독성을 발휘하는 분자형태는 완전하게는 밝혀져 있지 않다. 단량체, 이량체 등의 저분자량 올리고머가 세포독성을 가지고, 한편으로 100 kDa 이상의 TTR 아밀로이드는 세포독성을 가지지 않는다는 보고도 있고(비특허문헌 5), 독성과 분자형태와의 관련성의 해명이 요망된다.

TTR의 유전자 이상에 기인하는 FAP의 치료 전략은 주로 이하에 4종류로 분류된다.

(1) 돌연변이형 TTR의 생산 레벨을 억제한다

(2) 돌연변이형 TTR을 포함하는 TTR 사량체 구조를 안정화시킨다

(3) 사량체로부터 분해한 TTR의 아밀로이드화를 저지한다

(4) 조직에 침착한 TTR 아밀로이드를 제거한다

혈중 TTR의 대부분이 간장에서 생산되기 때문에(비특허문헌 2), 그 중에서 현재 가장 일반적인 치료법은 (1)로 분류되는 간이식이다. 간이식을 수행함으로써 병태진행의 지연을 확인할 수 있지만, 면역억제제를 평생 사용하지 않으면 안되어 도너나 환자에 대한 부담도 크다. 또 눈이나 심장을 포함하는 몇 개의 장기에서의 침착은 계속되기 때문에 이들 장기의 증상이 증악하는 예가 적지 않은 등(비특허문헌 8), 문제점도 많아 유효한 치료법의 개발이 요망되고 있다.

간이식 이외의 치료법으로서, (1)의 전략에서는, siRNA나 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 사용한 치료법이 임상개발 단계에 있지만, 어느 것이나 돌연변이형뿐만 아니라 야생형 TTR의 생산도 억제해버리기 때문에 장기에 걸쳐 사용했을 경우의 안전성 평가는 신중하게 이루어져야만 한다. (2)의 전략에서는 TTR 사량체의 T4 결합부위에 결합함으로써 사량체 구조를 안정화시키는 약제가 개발되고 있다. 동전략에서 개발된 신약 Vyndaquel^R이 2011년에 EU에서, 2013년에는 일본 국내에서 승인되었다. 30개월에 달하는 임상시험의 결과, Vyndaqel^R은 FAP 환자의 말초신경 장애를 늦추는 효과를 나타내고 있지만, 증상의 진행을 완전하게 억제하기까지는 이르지 않고 있다(비특허문헌 9). 기타 (3)이나 (4)의 전략에 있어서도 복수 종류의 약제가 임상개발 단계에 있지만, 어느 쪽의 치료법도 근치요법은 될 수 없는 것이 현재의 상태이다.

국제공개 WO2010030203호 국제공개 WO03004647호 특허공개 2010-195710호

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최근, 면역요법에 의한 FAP의 치료가 주목받고 있다. TTR 아밀로이드가 형성되는 과정에서, TTR의 구조변화에 동반해서 새로운 에피토프(크립틱 에피토프, Cryptic Epitope)가 분자표면에 노출하는 것이 밝혀졌다(비특허문헌 10).

그래서, Terazaki들은 Cryptic Epitope가 노출하는 돌연변이로서 알려져 있었던 TTR Y78F 돌연변이체로 FAP의 모델 동물인 인간 TTR V30M 트랜스제닉 마우스(hTTR Tg 마우스)를 면역하고, 마우스 조직으로의 TTR 아밀로이드 침착에 대한 영향을 평가했다(비특허문헌 11). 그 결과, TTR Y78F 돌연변이체로 면역한 마우스 그룹에서, 유의하게 항-TTR 항체의 항체의 상승이 확인되고, 그것에 동반해서 식도, 위 및 장에 있어서의 TTR 침착량의 감소가 인정되었다. 또, 이미 TTR 침착이 인정되는 생후 18개월령의 hTTR Tg 마우스를 사용한 동일한 시험에 있어서도, Y78F 면역그룹에서 유의하게 TTR 아밀로이드 침착량의 감소가 인정되었다. 이상의 결과로부터 Cryptic Epitope가 노출하는 TTR 돌연변이체로 마우스를 면역하는 것에 의해, TTR에 대한 항체가 마우스 체내에서 생산되고, 그 결과 TTR 아밀로이드의 침착이 억제될 가능성이 시사되었다.

한편, Bergstroem들은 Cryptic Epitope의 1개인 TTR 115-124 부위의 펩티드로 토끼를 면역하고, 항-TTR115-124 폴리클로널 항체를 조제했다(비특허문헌 12). 이 폴리클로널 항체를 hTTR V30M 트랜스제닉 랫트에 투여하고, 랫트 조직으로의 TTR 침착에 미치는 영향을 평가한 바, 랫트 장관에 있어서의 TTR의 침착량은 폴리클로널 항체를 투여한 그룹에서 유의하게 감소하고 있었다(특허문헌 3)

이것들의 결과로, TTR의 Cryptic Epitope를 특이적으로 인식하는 항체가 TTR 아밀로이드(혹은 TTR 아밀로이드를 구성하는 구조변화를 일으킨 TTR)에 특이적으로 결합하고, TTR 아밀로이드의 형성 저해 또는 제거의 촉진을 하고 있을 가능성을 생각할 수 있다. 즉, TTR의 Cryptic Epitope를 특이적으로 인식하는 항체는 FAP의 신규치료약이 될 수 있을 가능성이 시사된다.

이러한 컨셉트에 의거하는 항-TTR 항체의 연구는 BIOCODEX사에 의해 보고되고 있다. 그 회사는 아밀로이드 형성성의 TTR에 특이적인 마우스 모노클로널 항체 AD7F6을, TTR 녹아웃 마우스를 사용해서 제작하고, FAP 병태모델인 Tg 마우스(ATTR V30M)를 사용해서 TTR의 조직 침착을 억제하는 것을 나타냈다(특허문헌 1). BIOCODEX사의 특허는 마우스 항체의 아미노산 서열을 클레임하고 있고, 인간으로의 투여는 곤란하다. 또, 본 항체에 대해서는 사량체 구조를 취한 V30M 돌연변이체에 대한 반응성의 유무에 대해서는 명언하지 않고 있다. V30M 돌연변이를 가지는 FAP 환자에 있어서는 혈중에 존재하는 V30M 돌연변이체는 사량체 구조를 취하고 있지만, 단량체로 해리 후 그 일부가 구조변화를 일으켜서 아밀로이드를 형성한다고 생각되고 있다. 따라서, 사량체 구조를 취한 V30M 돌연변이체에는 반응하지 않고, 아밀로이드화한(또는 아밀로이드를 형성하는 도중 단계의) V30M 돌연변이체에만 반응하는 항체라는 것이 보다 효과적이고 안전한 항체 요법을 실현시키는데 있어서는 필요한 요건으로 생각된다. 또, 본 항체의 반응성에 대해서는 임상 샘플로서는 V30M 캐리어의 혈청을 사용하고 있을 뿐이기 때문에 환자의 체내에 존재하는 조직 침착성의 아밀로이드와의 반응성은 불분명하다.

동일한 컨셉트에 의거하는 항-TTR 항체의 연구는 포르투갈의 Porto 대학의 그룹으로부터도 보고되고 있다(비특허문헌 10). 구조변화를 일으킨 TTR에 특이적인 마우스 모노클로널 항체 mAb 39-44 및 mAb 56-61을 제작한 것, 이들이 생체유래의 V30M 돌연변이체의 아밀로이드와 반응하는 것이 보고되고 있다. 그러나 이것들은 아밀로이드 형성에 대해서 저해작용을 나타내지 않았던 점이 명기되어 있고, FAP의 진단에 이용할 수 있는 가능성에 대해서 언급되고 있을 뿐이다.

전술한 바와 같이, TTR의 Cryptic Epitope를 마우스(또는 랫트)에 면역해서 수득된 폴리클로널 항체나 모노클로널 항체가, TTR의 침착을 억제하는 것은 보고되고 있지만, 구조변화를 일으킨 TTR에 특이적으로 결합하는 활성, TTR의 섬유화를 저해하는 활성을 가지는 항체나, 인체로의 투여에 적합한 인간화 항체나 인간 항체는 보고되고 있지 않다.

본 발명자들은 TTR 아밀로이드시스에서는 일부의 사량체 TTR이 단량체에 해리 후, 단량체 TTR이 구조변화를 일으키고, 아밀로이드를 형성하는, 그 한편으로, 정상적으로 기능하는 사량체 TTR도 존재한다고 생각했다. 그래서, 본 발명자들은 구조변화를 일으킨 TTR에 특이적으로 결합하고, TTR의 섬유화를 저해하는 활성을 가지는 항체에 대해서 검토를 실시했다. 또, 최종적으로 TTR 아밀로이드시스에 대한 항체 의료를 목표로 해서, 상기의 활성을 가지는 인간화 항체에 대해서 예의 검토를 거듭하고 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 하기에 관한 것이다.

(1) 트랜스티레틴(TTR)의 섬유화를 저해하는 활성을 가지는 인간화 항체.

(2) 상기 (1)에서, 구조변화를 일으킨 TTR을 특이적으로 인식하는 인간화 항체.

(3) 상기 (1) 또는 (2)에서, TTR 아밀로이드와 특이적으로 결합하는 인간화 항체.

(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에서, 2종류 이상의 돌연변이 TTR에 유래하는 TTR 아밀로이드와 결합하는 인간화 항체.

(5) 상기 (4)에서, 돌연변이 TTR이 D18G, V30M, E54K, L55P, Y114C, Y116S 및 V122I로 이루어지는 그룹에서 선택되는 돌연변이를 가지는 TTR인 인간화 항체.

(6) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에서, TTR 아밀로이드의 제거를 촉진하는 인간화 항체.

(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에서, TTR 아밀로이드에 대한 마크로파지 탐식능을 촉진하는 인간화 항체.

(8) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에서, 에피토프가 TTR의 118번 위치에서 122번 위치를 포함하는 서열인 인간화 항체.

(9) 상기 (8)에서, 에피토프가 TTR의 118번 위치에서 122번 위치인 인간화 항체.

(10) 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에서, TTR 아밀로이드시스에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 가지는 인간화 항체.

(11) 상기 (10)에서, TTR 아밀로이드시스가 가족성 아밀로이드 다발신경병증(FAP)인 인간화 항체.

(12) 상기 (10)에서, TTR 아밀로이드시스가 노인성 전신성 아밀로이드시스(SSA)인 인간화 항체;

(13) 상기 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에서, 이하의 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드로 이루어지는 H 체인의 상보성 결정영역과, (c) 또는 (d)의 폴리펩티드로 이루어지는 L 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 인간화 항체:

(a) 서열번호 1∼3의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.

(b) 서열번호 1∼3의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또, TTR에 대한 H 체인의 상보성 결정영역이 되는 폴리펩티드.

(c) 서열번호 4∼6의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.

(d) 서열번호 4∼6의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또, TTR에 대한 L 체인의 상보성 결정영역이 되는 폴리펩티드.

(14) 상기 (1) 내지 (13) 중 어느 하나에서, 이하의 (e) 또는 (f)의 폴리펩티드로 이루어지는 H 체인 가변영역과, (g) 또는 (h)의 폴리펩티드로 이루어지는 L 체인 가변영역을 포함하는 인간화 항체:

(e) 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.

(f) 서열번호 7의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또, TTR에 대한 H 체인 가변영역이 되는 폴리펩티드.

(g) 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.

(h) 서열번호 8의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또, TTR에 대한 L 체인 가변영역이 되는 폴리펩티드.

(15) 이하의 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드로 이루어지는 H 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 H 체인 가변영역 단편:

(a) 서열번호 1∼3의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드

(16) 이하의 (c) 또는 (d)의 폴리펩티드로 이루어지는 L 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 L 체인 가변영역 단편:

(17) 이하의 (e) 또는 (f)의 폴리펩티드로 이루어지는 H 체인 가변영역 단편:

(e) 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.

(18) 이하의 (g) 또는 (h)의 폴리펩티드로 이루어지는, L 체인 가변영역 단편:

(g) 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.

(19) 상기 (15)에 기재된 H 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 H 체인 가변영역 단편 또는 상기 (17)에 기재된 H 체인 가변영역 단편과, 상기 (16)에 기재된 L 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 L 체인 가변영역 단편 또는 상기 (18)에 기재된 L 체인 가변영역 단편을 연결해서 이루어지는 TTR에 대한 항체의 싱글 체인 가변영역 단편.

(20) 상기 (15)에 기재된 H 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 H 체인 가변영역 단편 또는 상기 (17)에 기재된 H 체인 가변영역 단편, 및/또는 상기 (16)에 기재된 L 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 L 체인 가변영역 단편 또는 상기 (18)에 기재된 L 체인 가변영역 단편에, 인간 유래의 정상영역을 연결해서 이루어지는 상기 (1) 내지 (12)에 기재된 인간화 항체 또는 그 단편.

(21) 상기 (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 단편을 코딩하는 유전자.

(22) 상기 (21)에 기재된 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.

(23) 상기 (21)에 기재된 유전자 또는 상기 (22)에 기재된 발현 벡터가 도입된 형질 전환체.

(24) 상기 (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 단편을 포함하는 TTR 아밀로이드를 검출하는 기구.

(25) 상기 (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 단편을 포함하는 TTR 아밀로이드를 제거하는 담체.

(26) 상기 (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 단편을 포함하는 TTR 아밀로이드를 검출하는 시약.

(27) 상기 (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 단편을 포함하는 TTR 아밀로이드시스 진단약.

(28) 상기 (27)에서, TTR 아밀로이드시스가 가족성 아밀로이드 다발신경병증(FAP)인 진단약.

(29) 상기 (27)에서, TTR 아밀로이드시스가 노인성 전신성 아밀로이드시스(SSA)인 진단약.

(30) 상기 (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 단편을 포함하는 TTR의 섬유화 저해제.

(31) (1) 내지 (20)의 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편을 포함하는 TTR 아밀로이드시스를 예방 및/또는 치료하기 위한 의약 조성물.

(32) 상기 (31)에서, TTR 아밀로이드시스가 가족성 아밀로이드 다발신경병증(FAP)인 의약 조성물.

(33) 상기 (31)에서, TTR 아밀로이드시스가 노인성 전신성 아밀로이드시스(SSA)인 의약 조성물.

본 발명자들은 구조변화를 일으킨 TTR을 특이적으로 인식하는 모노클로널 항체를 창출하고, FAP의 치료를 가능하게 하는 항체 의약 개발으로의 길을 여는데 성공했다. 본 발명의 항체는 TTR의 아밀로이드 섬유의 형성이나 조직으로의 침착을 효과적으로 억제하고, 추가로 혈중에서 기능하는 정상의 TTR과는 반응하지 않기 때문에, 안전성이 우수한 항체 의약이 되는 것이 기대된다. 또, 작용 메커니즘으로서, (1) TTR의 아밀로이드의 형성과 조직 침착을 억제한다, 게다가 (2) 조직에 침착되어 있는 TTR 아밀로이드에도 작용해서 클리어런스를 촉진하는, 즉, 일단 축적된 아밀로이드를 감소시킨다는 2개의 효과를 기대할 수 있다. 그러한 효과는 종래의 기술이나 선행 개발품에서는 이룰 수 없는 것으로, TTR 아밀로이드시스에 대한 신규치료 전략으로서의 본 항체요법에 기대가 모아진다.

본 발명의 항체는 전술한 바와 같이, FAP에 대해서 간이식 이외가 새로운 치료법을 제공하는 것이 기대할 수 있을 뿐만 아니라, 노인성 전신성 아밀로이드시스(SSA) 치료약으로서의 가능성도 갖는다. TTR 아밀로이드시스에는 TTR 유전자의 돌연변이가 원인이 되어서 발생하는 FAP의 이외에도, 야생형 TTR이 주로 심장에 아밀로이드 침착을 일으키는 것에 의해 발증하는 SSA가 알려져 있다. 심장에서의 알츠하이머병으로도 위치가 부여되고 있다. 아밀로이드 침착은 폐나 혈관벽, 신수질 등에도 인정된다. 환자는 무증상이거나, 심증상(완서진행성의 심부전)을 나타내는 경우가 많고, 수근관 증후군을 나타내는 경우도 있다. 60세대부터 발증이 인정되고, 80세 이상에서는 대략 4명에서 1명꼴로 발증하고 있다고도 이야기되고 있다. 미국에서만 40만명을 넘는 환자 추계값도 보고되고 있다. 본 질병에도 유효한 치료법은 확립되지 않고 있다. 본 발명의 항체는 야생형 TTR의 섬유화를 저해하는 활성을 가지기 때문에 SSA로의 적용도 기대된다.

본 항체 제제에는 FAP 뿐만 아니라 TTR에 기인하는 각종 장기에 대한 아밀로이드 형성성의 질병으로의 적용이 기대되고, 현재 치료방법이 없는 많은 이것들의 질환 환자로의 치료공헌을 할 수 있는 것으로 기대된다.

도 1의 (a)는 마우스 T24 항체 H 체인 발현 벡터 pKMA010-T24-mCg1, 및 (b)는 마우스 T24 항체 L 체인 발현 벡터 pKMA009-T24-mCk의 맵을 나타낸다.
도 2는 에피토프 해석의 결과를 나타낸다.
도 3은 표면 플라스몬 공명법을 사용한 반응 특이성 해석의 결과를 나타낸다. (a)는 RT24 항체, (b)는 Dako사의 폴리클로널 항체, (c)는 음성 컨트롤 항체에서의 결과를 각각 나타낸다.
도 4는 환자 혈청으로의 반응성해석의 결과를 나타낸다.
도 5a는 환자조직으로의 반응성해석의 결과를 나타낸다(파라핀 절편).
도 5b는 환자조직으로의 반응성해석의 결과를 나타낸다(동결 절편).
도 6은 TTR 섬유로의 반응성해석의 결과를 나타낸다. (a)는 은염색, (b)는 웨스턴 블로팅의 결과를 각각 나타낸다.
도 7은 TTR 섬유화 저해시험의 결과를 나타낸다. (a)는 RT24 항체, (b)는 RT24-a 항체 및 RT24-b 항체의 결과를 각각 나타낸다.
도 8은 마크로파지 탐식능시험의 결과를 나타낸다. (a)는 미처리의 정제 V30M, (b)는 TTR 섬유에서의 결과를 각각 나타낸다.
도 9는 V30M Tg 랫트를 사용한 약효 평가시험의 결과를 나타낸다.

본 발명의 구체적 형태에 대해서 설명하면 다음과 같다. 또, 본 발명은 이것에 한정되는 것은 아니다.

1. 본 발명의 항체 및 그 단편

본 발명에서는 TTR의 115-124번 위치는 정상형(사량체) TTR에서는 분자표면에 나와 있지 않지만, TTR이 섬유화했을 경우에 표면에 노출하는 것에 착안하고, TTR115-124를 항체 제작의 항원으로서 선택하고, 당해 항원을 TTR 녹아웃 마우스에 면역한 후에 마우스 항체를 제작하고, 마우스 항체의 아미노산 서열을 인간화함으로써 인간화 항체를 제작했다.

TTR115-124를 제작하는 방법은 화학합성일 수도 있고, 대장균 등에서 발현시킨 것을 정제할 수도 있다. 후자의 경우에는 인간 TTR의 염기서열을 주형으로 해서, 115-124에 상당하는 염기서열이 증폭되도록 설계한 프라이머 DNA를 사용해서 당해 염기서열을 증폭한다. 그리고 발현 벡터에 통합하고, 숙주(대장균 등)에 도입한다. 숙주를 사용해서 TTR115-124를 발현시킨 후에 정제하고, 항원으로 한다. 화학합성이나 발현법으로 수득된 TTR115-124는 담체 단백질(KLH, BSA 등)과 결합시킨 후에 마우스에 면역해도 상관없다. 담체 단백질을 결합시키는 방법으로서는 Immunogen EDC Kit with mcKLH and BSA(Thermo)를 사용한 방법이 예시된다. TTR115-124는 담체 단백질에 1분자 결합시켜도, 2분자 이상 결합시켜도 상관없다. TTR115-124를 담체 단백질에 결합되는 부위는 N말단, C말단, 분자 내의 어느 쪽의 부위라도 상관없다.

다음에, 마우스 항체를 제작하는 방법을 예시한다. TTR115-124를 TTR 녹아웃 마우스에 면역한다. TTR 녹아웃 마우스는 비특허문헌 13에 기재된 방법으로 제작해도 상관없다. TTR115-124를 면역하는 회수는 2회 이상이 바람직하고, 각 면역은 3주 정도 비우는 것이 바람직하다. 면역 회수나 기간은 TTR에 대한 항체가의 상승 정도를 확인하면서, 적당하게 변경해도 상관없다. 그리고 마우스의 비장으로부터 항체 생산세포를 회수하고, 종래 방법의 하이브리도마법에 의해 항체 생산세포와 미에로마세포를 융합시키고, 하이브리도마를 제작한다. 그리고 하이브리도마를 한계 희석한 후에 배양하고, 배양 상청을 회수한다. 배양 상청에 포함되는 마우스 항체를 정제하고, TTR115-124와의 반응성을 ELISA 시험으로 검증한다. ELISA 시험의 일례로서는 TTR115-124를 직접 또는 간접적으로 ELISA 플레이트 상에 고상화한다. TTR115-124를 플레이트에 고상화한 경우에는, TTR115-124의 N말단측, C말단측의 어느 쪽이더라도 상관없다. 다음에, 마우스 항체를 플레이트에 첨가하고, 반응시킨다. 그리고 효소 표지된 항 마우스 항체, 기질의 순서로 플레이트에 첨가하고, 기질을 검출하는 방법이 예시된다. 그러한 ELISA 시험을 지표로 해서 TTR115-124에 대한 항체를 선발한다.

다음에, TTR 아밀로이드에 대해서 특이적으로 결합하는 항체를 선발하는 스텝을 설치해도 상관없다. TTR 아밀로이드로의 결합성을 검증하는 방법을 예시한다. TTR 펩티드를 산성 조건하에서 섬유화를 형성하는 기간으로 스탠딩(정치)하고, TTR 아밀로이드를 형성시킨다. 산성조건이나 섬유화를 형성하는 기간은 TTR 펩티드의 종류에 따라 적당하게 변경해도 상관없다. TTR의 섬유화의 유무는 티오플라빈 T 어세이에 의해 확인하는 것이 가능한다. 산성조건으로서 바람직하게는 pH5.0 이하, 더욱 바람직하게는 pH3.0-pH4.0이다. 섬유화를 형성하는 기간은 바람직하게는 하룻밤이다. 그리고 산처리한 TTR(TTR 아밀로이드) 또는 미처리의 TTR(정상형 TTR)을 ELISA 플레이트에 결합시키고, 이어서 마우스 항체를 반응시킨다. 정상형 TTR과 비교해서 TTR 아밀로이드에 대한 결합성이 높은 항체를 선발해도 상관없다.

다음에, 마우스 항체로부터 인간화 항체를 제작하는 방법을 예시한다. 마우스 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 mRNA를 회수한 후에 역전사를 실시하고, cDNA를 제작한다. cDNA를 주형으로 해서 VH영역과 VL영역을 증폭하고, 당해 영역을 적당한 플라스미드에 도입한 후, VH영역 또는 VL영역의 염기서열을 해석한다. 그리고 VH영역 또는 VL영역 중, CDR에 상당하는 부분(CDR1-3)을 특정한다. 다음에, 마우스 항체에 있어서의 CDR의 아미노산 서열을 인간 항체의 VH영역 또는 VL영역의 아미노산 서열에 이식하기 위해서, CDR의 이식에 적합한 인간 항체를 선택한다. 그리고 인간 항체에 있어서의 VH영역 또는 VL영역의 아미노산 서열에 대해서, 마우스 항체에 있어서의 CDR1-3의 아미노산 서열을 삽입한 아미노산 서열을 설계한다. 당해 아미노산 서열을 염기서열로 변환하고, 화학합성한다. 당해 염기서열을 H 체인 또는 L 체인의 정상영역을 코딩하는 염기서열을 포함하는 발현 벡터에 삽입한 발현 벡터를 제작한다. 당해 발현 벡터를 적당한 숙주(동물 세포)에 도입하고, 숙주를 사용해서 인간화 항체를 발현시킨다.

본 발명에서는 당해 인간화 항체에 있어서, VH영역 또는 VL영역의 프레임워크 부분에 대해서 아미노산 서열을 개변시킨 아미노산 서열을 설계하고, 개변 아미노산 서열에 의거하는 염기서열을 화학합성했다. 그렇게 해서, 상기의 같은 방법으로 개변형의 인간화 항체를 제작했다.

상기의 마우스 항체나 인간화 항체(그것들을 정리해서 항체라고 언급하는 경우가 있다)에 대해서 에피토프를 해석하는 방법을 예시한다. 인간 TTR의 115-124번 위치의 아미노산 서열 가운데, 1아미노산을 개변시킨 인간 TTR 개변체를 제작한다. 종래 방법의 site-directed mutagenesis법에 의해 개변체의 유전자를 제작하고, 발현 벡터에 삽입 후, 적당한 숙주(바람직하게는 대장균)를 사용해서 발현시켜 정제한다. 그러한 개변체로서는 Y114C, S115A, Y116A, S117A, T118A, T119A, A120S, V121A, V122A, V122I, T123A, N124A가 예시된다. 종래 방법의 웨스턴 블로팅법을 사용해서 당해 개변체를 SDS-PAGE에서 전기영동시킨 후, 해석대상의 항체와 반응시키고, 당해 개변체와 항체의 반응성을 검출한다. 항체와의 결합성이 저하된 개변체가 존재하는 경우, 개변한 부분을 항체의 에피토프 부분으로 생각해도 상관없다. 본 발명의 항체는 118-122번 위치에 에피토프 부분이 존재하고 있었다.

상기의 마우스 항체나 인간화 항체는 구조변화를 일으킨 TTR에 대한 특이적 반응성, 섬유화한 TTR과의 반응성, TTR 환자유래의 조직에 대한 면역염색, 돌연변이 TTR의 섬유화에 대한 저해활성, TTR 아밀로이드에 대한 마크로파지 탐식작용의 촉진 활성, FAP 모델동물을 사용한 약효평가를 실시해도 상관없다.

구조변화를 일으킨 TTR에 대한 특이적 반응성을 해석하는 방법으로서, 표면 플라스몬 공명법을 사용한 방법이 예시된다. 야생형 TTR 사량체, 돌연변이 TTR(V30M 등) 사량체, 또는 돌연변이 TTR 아밀로이드를 제작한다. 야생형 TTR 사량체나 돌연변이 TTR 사량체를 제작하는 방법으로서는 Matsubara들의 방법(비특허문헌 14)이 예시된다. 돌연변이 TTR 아밀로이드를 제작하는 방법으로서는 상기의 사량체의 TTR 펩티드를 3mg/㎖으로 조정한 후, 등량으로 200mM 아세트산 버퍼와 100mM NaCl의 용액과 혼합하고, 37℃에서 16시간 반응시키는 방법이 예시된다. 반응 후의 TTR에 대해서는 ThioflavinT assay(여기파장 440 nm, 형광파장 480 nm)에 의해 형광강도를 측정하고, 섬유가 형성되고 있는 것을 확인할 수도 있다.

다음에, 이것들의 조정물을 센서칩에 결합시킨다. 그리고 해석대상의 항체를 흘려보내고, 센서칩과 반응시키는 것으로 TTR과 항체의 결합성이 리스펀스 유닛(RU)으로서 나타난다. 이 경우에, 돌연변이 TTR 아밀로이드에 대한 RU가 야생형 TTR 사량체나 돌연변이 TTR 사량체에 대한 RU보다도 우수하게 높은 항체는 구조변화를 일으킨 TTR을 특이적으로 인식하는 것으로 생각된다. 그러한 사량체 TTR과 비교해서 사량체 이상의 분자구조를 가지는 TTR(예를 들면, TTR 아밀로이드)을 특이적으로 인식하는 항체를 구조변화를 일으킨 TTR을 특이적으로 인식하는 항체로 해도 상관없다.

돌연변이 TTR의 섬유화를 저해하는 활성을 해석하는 방법을 예시한다. TTR 및 평가항체를 함유하는 용액에 대해서 계면활성제를 최종 농도 0.01-1%가 되도록 혼합하고, TTR이 섬유를 형성하는 온도와 시간 스탠딩한다. 그리고 ThioflavinT assay(여기파장 440 nm, 형광파장 480 nm)로 형광강도를 측정하고, TTR 섬유화의 정도를 평가한다. 계면활성제의 종류는 염화 벤즈알코늄, 데옥시콜산 나트륨, Zwittergent3-16, NP-40이 예시된다. 특히 데옥시콜산이 바람직하다. 최종 농도 0.01-1%가 예시되지만, 0.1%가 특히 바람직하다. 시간과 온도는 37℃에서 3∼4일간이 예시되지만, 시간이나 온도의 조합에 따라서 적시변경해도 상관없다. 본 해석방법은 중성 부근의 pH에서 해석을 실시할 수 있기 때문에 평가항체의 변성을 억제한 뛰어난 평가계이다.

TTR 아밀로이드에 대한 마크로파지 탐식작용을 해석하는 방법을 예시한다. FAP 환자 유래의 피부 조직으로부터 종래 방법에 따라서 인간 iPS세포를 제작하고, 추가로 종래 방법에 따라서 iPS 세포를 마크로파지에 분화시킨다. TTR 섬유와 분화시킨 마크로파지 5×10⁴개를 혼합하고, 평가항체를 첨가하고, 일정 기간(예를 들면, 3일간)배양한다. 배양 후의 TTR 잔량을 ELISA법으로 정량하고, 마크로파지에 의한 탐식능을 평가한다.

본 발명의 항체와 TTR 아밀로이드와의 반응성을 해석하는 방법을 예시한다. 야생형 TTR이나 돌연변이 TTR을 TTR이 섬유화하는 시간, 산성조건으로 처리하고, TTR 섬유를 제작한다. 섬유화의 시간은 pH나 TTR의 종류에 따라 적당하게 선택하는 것이 가능한다. 산처리 후의 샘플을 Native PAGE에서 영동하고, 은염색을 실시한 후에, 60kDa보다 높은 위치에 브로드 밴드가 확인되었을 경우에는, TTR이 섬유화하고 있는 것의 지표로 해도 상관없다. 그리고 종래 방법의 웨스턴 블롯법을 사용해서 TTR 아밀로이드를 SDS-PAGE에서 영동하고, 해석대상의 항체를 반응시키고, 검출한다. 산처리하지 않은 TTR(섬유화 하지 않는TTR)과 비교해서 TTR 아밀로이드에 대한 반응성이 높은 항체를, TTR 아밀로이드에 대한 결합작용을 가지는 항체로 해도 상관없다.

FAP 모델동물을 사용한 약효평가의 방법을 예시한다. V30M Tg 랫트(비특허문헌 15, TTR의 아미노산 서열에 있어서 30번 위치를 발린에서 메티오닌으로 변이시킨 인간 TTR의 유전자를 도입한 트랜스제닉 랫트)을 사용하고, 일정량의 평가항체를 (예를 들면, 10mg/kg), 일정 기간에 걸쳐서(예를 들면, 6개월간), 일정 빈도로 투여한다(예를 들면, 주1회). 투여 후에 부검해서 대장을 채취하고, 포르말린 고정을 실시한다. 고정한 대장조직을 파라핀 블록에 포매하고, 조직 절편을 제작한다. 조직 절편을 Polyclonal Rabbit Anti-Human Prealbumin(Dako), HRP 표지 Goat anti-Rabbit IgG(Dako)을 사용해서 면역염색하고, 대장의 근육층에 있어서의 TTR 침착의 정도를 수치화해서 그룹 간 비교를 실시한다.

본 발명의 인간화 항체는 TTR의 섬유화를 저해하는 활성, 구조 변화한 TTR에 대하는 특이한 결합 활성, 마크로파지에 의한 TTR 아밀로이드의 탐식작용을 촉진하는 효과, TTR 아밀로이드에 대한 결합 작용, FAP모델 동물에 대한 효과를 가진다. 또, 본 발명의 항체에 대해서 에피토프를 해석한 결과, TTR118-122에 존재하고 있었다. 그 때문에 본 발명에는 다음의 인간화 항체가 포함된다.

(1) TTR의 섬유화를 저해하는 활성을 가지는 항체.

(2)　구조변화를 일으킨 TTR을 특이적으로 인식하며, 또, 사량체의 기능성 TTR을 인식하지 않는 항체.

(3) TTR 아밀로이드와 특이적으로 결합하는 항체.

(4) TTR 아밀로이드의 제거를 촉진하는 항체.

(5) TTR 아밀로이드에 대한 마크로파지 탐식능을 촉진하는 항체.

(6) TTR 아밀로이드시스에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 가지는 항체.

(7) TTR118-122를 에피토프로 하는 인간화 항체.

상기의 (1)에서 (7)의 항체는 (1) 내지 (7)에 기재된 바와 같이, 하나의 특징을 가질 수도 있고, 또는 (1) 내지 (7)에 기재되는 특징을 함께 가지고 있을 수도 있다.

본 발명의 인간화 항체에서는 VH영역 또는 VL영역 상의 CDR1-3의 아미노산 서열이나 염기서열은 하기 표가 된다.

그 때문에 본 발명에는 아미노산 서열에 있어서 다음의 특징을 가지는 인간화 항체가 포함된다.

(8) 이하의 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드로 이루어지는 H 체인의 상보성 결정영역과, (c) 또는 (d)의 폴리펩티드로 이루어지는 L 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 인간화 항체:

또, 당해 인간화 항체는 (1) 내지 (7)에 기재되는 특징을 겸비하고 있을 수도 있다.

본 발명에서는 VH영역이나 VL영역의 프레임워크 영역에 있어서의 아미노산 서열을 변이시킨 인간화 항체를 복수 종류 제작했다. 그러한 인간화 항체의 일례로서는 다음의 아미노산 서열이나 염기서열에 의해 코딩된 VH영역 또는 VL영역이 예시된다.

그 때문에 본 발명에는 다음의 인간화 항체가 포함된다.

(9) 이하의 (e) 또는 (f)의 폴리펩티드로 이루어지는 H 체인 가변영역과, (g) 또는 (h)의 폴리펩티드로 이루어지는 L 체인 가변영역을 포함하는 인간화 항체:

(e) 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.

(g) 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.

당해 인간화 항체는, (1) 내지 (8)에 기재되는 특징을 겸비하고 있어도 상관없다.

본 발명에는 다음의 H 체인의 CDR을 포함하는 H 체인 가변영역 단편이 포함된다.

(10) 이하의 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드로 이루어지는 H 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 H 체인 가변영역 단편

본 발명에는 다음의 L 체인의 CDR을 포함하는 L 체인 가변영역 단편이 포함된다.

(11) 이하의 (c) 또는 (d)의 폴리펩티드로 이루어지는 L 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 L 체인 가변영역 단편.

본 발명에는 다음의 H 체인 가변영역 단편이 포함된다.

(12) 이하의 (e) 또는 (f)의 폴리펩티드로 이루어지는 H 체인 가변영역 단편:

(e) 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.

본 발명에는 다음의 L 체인 가변영역 단편이 포함된다.

(13) 이하의 (g) 또는 (h)의 폴리펩티드로 이루어지는, L 체인 가변영역 단편:

(g) 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.

본 발명에는 다음의 싱글 체인 가변영역 단편이 포함된다.

(14) 상기 (10)에 기재된 H 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 H 체인 가변영역 단편 또는 상기 (12)에 기재된 H 체인 가변영역 단편과, 상기 (11)에 기재된 L 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 L 체인 가변영역 단편 또는 상기 (13)에 기재된 L 체인 가변영역 단편을 연결해서 이루어지는, TTR에 대한 항체의 싱글 체인 가변영역 단편.

싱글 체인 가변영역 단편에 있어서, H 체인 가변영역 단편과 L 체인 가변영역 단편을 연결하는 경우, 통상, 적당한 펩티드 링커 등에 의해 연결된다. 이 펩티드 링커로서는 예를 들면, 10∼25 아미노산 잔기로 이루어지는 임의의 싱글 체인 펩티드를 사용할 수 있다.

본 발명에는 다음의 H 체인 가변영역 단편 및/또는 L 체인 가변영역 단편에 인간 유래의 정상영역을 연결한 항체 또는 그 단편이 포함된다.

(15) 상기 (10)에 기재된 H 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 H 체인 가변영역 단편 또는 상기 (12)에 기재된 H 체인 가변영역 단편, 및/또는 상기 (11)에 기재된 L 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 L 체인 가변영역 단편 또는 상기 (13)에 기재된 L 체인 가변영역 단편에, 인간 유래의 정상영역을 연결해서 이루어지는 TTR에 대한 인간 유래의 항체 또는 그 단편.

상기의 인간 유래의 정상영역을 연결한 항체 또는 그 단편은, Fab, Fab＇, F(ab＇)₂나, 적어도 일부의 Fc부를 가지는 scAb, 또는 scFvFc, 게다가 완전 항체일 수도 있다. 또, scAb와는 scFv에 L 체인 또는 H 체인의 정상영역의 일부 도메인(C도메인)이 결합한 것, scFvFc란 scFv에 H 체인의 정상영역의 일부(Fc영역)가 결합한 것이다.

또, 상기 항체는 항체와 구조적으로 관련된 단백질도 포함하고, 면역 글로블린의 의미다. 또한, 본 발명의 항체는, IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM의 어느 것의 클래스에서도 좋다. 바꿔 말하면, 단량체일 수도 있고, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체와 같은 다량체일 수도 있다.

여기에서, 상기 「1개 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된」이란 부위 특이적 돌연변이 유발법 등의 공지 돌연변이 단백질 제작법에 의해 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가할 수 있는 정도의 수 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되는 것을 의미한다. 따라서 예를 들면, 상기(b)의 폴리펩티드는 상기 (a)의 폴리펩티드의 돌연변이 펩티드이며, 여기에서 말하는 「돌연변이」는 주로 공지의 돌연변이 단백질 제작법에 의해 인위적으로 도입된 돌연변이를 의미하지만, 천연(예를 들면 인간)에 존재하는 것과 같은 돌연변이 폴리펩티드를 단리 정제한 것일 수도 있다.

또, 상기 「돌연변이」는 후술과 같이 본 발명의 항체 또는 그 단편을, 의약 조성물로서 이용하는 경우(인간에 투여할 경우)에는 인간 유래의 구조 또는 인간이 면역반응을 일으키지 않는 범위에서 수행하고, 검출기구나 진단약 등으로 이용하는 경우(인간에 투여하지 않을 경우)에는 특별하게 제한되지 않는다. 또, 본 발명의 항체 또는 그 단편을, 인간에게 투여하는 경우, 항원을 인식하는 CDR의 고차 구조를 유지하는 범위에서 돌연변이를 실시하는 것이 바람직하다.

본 발명의 항체 및 그 단편은 부가적인 폴리펩티드를 포함하는 것 일 수도 있다. 이러한 폴리펩티드가 부가되는 경우로서는 예를 들면, His나 Myc, Flag 등에 의해 본 발명의 단백질이 에피토프 표지되는 것과 같은 경우를 들 수 있다.

또, 본 발명의 항체 및 그 단편에는 안정성이나 항체가를 향상시키기 위해서 변형제가 결합되어 있을 수도 있다. 즉, 본 발명의 항체 및 그 단편은 변형 항체일 수도 있다. 이 변형제로서는 예를 들면, 당쇄나 고분자 등을 들 수 있다. 당쇄 변형을 실시했을 경우에는, 그 당쇄가 어떤 생리활성을 가질 가능성이 있지만, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등이 단순한 고분자 변형을 실시했을 경우에는 그것 자체 생리활성을 나타내지 않는다. 또, PEG화에 의해 간장에서의 흡수를 억제하거나, 혈중에서의 안정성을 향상시키나 할 가능성이 있다. 즉, 변형제로서는 PEG 등의 단순 고분자가 바람직하다.

또, 본 발명의 항체 및 그 단편의 변형제에 의한 변형은 전술한 돌연변이 펩티드의 제작과 동일하게, 치료약으로서 이용하는 경우에는 인간이 면역반응을 일으키지 않는 범위에서 수행하고, 검출기구나 진단 키트 등으로 이용하는 경우에는 특별히 제한되지 않는다. 또, 본 발명의 항체 또는 그 단편을 인간에게 투여하는 경우, 항원을 인식하는 CDR의 고차 구조를 유지하는 범위에서 변형하는 것이 바람직하다.

2. 본 발명의 유전자

본 발명에는, 상기 1의 항체 또는 그 단편을 코딩하는 유전자가 포함된다. 예를 들면, 하기의 염기서열을 오픈 리딩 프레임(ORF) 영역으로서 가지는 유전자, 및 그 염기서열의 일부를 개변한 개변 유전자 등이 포함된다.

(1) 서열번호 1∼3, 및/또는, 서열번호 4∼6을 포함하는 염기서열

(2) 서열번호 7, 및/또는, 서열번호 8을 포함하는 염기서열

상기의 유전자는, 본 발명의 항체 또는 그 단편을 코딩하고 있으므로, 적당한 숙주 (예를 들면 세균, 효모)에 도입하고, 본 발명의 항체 또는 그 단편을 발현시킬 수 있다.

또한, 상기의 유전자는, 상기 1의 항체 또는 그 단편을 코딩하는 염기서열 이외에, 비번역 영역(UTR)의 서열이나 벡터 서열(발현 벡터 서열을 포함한다)등의 서열을 포함하는 것일 수도 있다. 예를 들면, 서열번호 7 또는 8에 기재된 서열을 벡터 서열에 연결해서 본 발명의 유전자를 구성하고, 이것을 적당한 숙주에서 증폭시키는 것에 의해, 본 발명의 유전자를 소망하는 대로 증폭시킬 수 있다. 또, 본 발명의 유전자 일부서열을 프로브로 사용해도 된다.

본 발명의 유전자는 TTR 아밀로이드가 관여하는 질병에 있어서, 유전자 치료제로서 이용해도 상관없다. 이 유전자 치료제는 투여 후에 본 발명의 항체 또는 그 단편을 체내에서 발현하도록 설계하는 것에 의해서, 해당 치료제를 섭취 후에 체내에서 본 발명의 항체 또는 그 단편을 형성시키고, 상기 저해제와 동일한 효과를 갖게 해도 상관없다.

3. 본 발명의 재조합 발현 벡터

본 발명에는 상기 2의 유전자, 즉, 상기 1의 항체 또는 그 단편을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 포함된다. 예를 들면, 서열번호 7 또는 8의 염기서열을 가지는 cDNA가 삽입된 재조합 발현 벡터를 들 수 있다. 재조합 발현 벡터의 제작에는 플라스미드, 파지, 또는 코스미드 등을 사용할 수 있지만 특별히 한정되는 것은 아니다.

벡터의 구체적인 종류는 특별히 한정되는 것은 아니고, 호스트 세포 중에서 발현가능한 벡터를 적당하게 선택하면 좋다. 즉, 호스트 세포의 종류에 따라서 확실하게 유전자를 발현시키기 위해서 적당하게 프로모터 서열을 선택하고, 이것과 본 발명에 따른 유전자를 각종 플라스미드 등에 통합시킨 것을 발현 벡터로서 사용하면 좋다.

본 발명의 유전자가 호스트 세포에 도입되었는 지의 여부, 게다가 호스트 세포 중에서 확실하게 발현하고 있는 지의 여부를 확인하기 위해서, 각종 마커를 사용할 수 있다. 예를 들면, 호스트 세포 중에서 결실하고 있는 유전자를 마커로 사용하고, 이 마커와 본 발명의 유전자를 포함하는 플라스미드 등을 발현 벡터로서 호스트 세포에 도입한다. 이것에 의해 마커 유전자의 발현으로부터 본 발명의 유전자 도입을 확인할 수 있다. 혹은, 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편과 마커 단백질을 융합 단백질로서 발현시킬 수도 있고, 예를 들면, 발광평면 해파리 유래의 녹색형광 단백질 GFP(Green Fluorescent Protein)을 마커로서 사용하고, 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 GFP 융합 단백질로서 발현시킬 수도 있다.

상기 호스트 세포는 특별히 한정되는 것이 아니고, 종래 공지의 각종 세포를 호적하게 사용할 수 있다. 구체적으로는 인간 또는 마우스 유래의 세포를 비롯해서 선충(Caenorhabditis elegans), 아프리카 발톱개구리(Xenopas laevis)의 난모 세포, 각종 포유동물(랫트, 토끼, 돼지, 원숭이 등)의 배양세포, 혹은, 황색 초파리, 누에나방 등의 곤충 배양 세포 등 등의 동물 세포, 대장균(Escherichia coli) 등의 세균, 효모(출아 효모(Saccharomyces cerevisiae)나 분열 효모(Schizosaccharomyces pombe) 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되는 것은 아니다.

재조합 발현 벡터를 호스트 세포에 도입하는 방법, 즉 형질전환 방법도 특별히 한정되는 것은 아니고, 전기 천공법, 인산 칼슘법, 리포솜법, DEAE 덱스트란법 등의 종래 공지의 방법을 호적하게 사용할 수 있다.

본 발명의 형질 전환체는 상기 2의 유전자, 즉, 상기 1의 항체 또는 그 단편을 코딩하는 유전자가 도입된 형질 전환체이다. 여기에서, 「유전자가 도입된」이란 공지의 유전자 공학적 수법(유전자 조작 기술)에 의해, 대상 세포(호스트 세포) 내에 발현 가능하게 도입되는 것을 의미한다. 또, 상기 「형질 전환체」란 세포ㆍ조직ㆍ기관뿐만아니라, 동물 개체를 포함하는 의미이다. 대상이 되는 동물은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 소, 돼지, 양, 염소, 토끼, 개, 고양이, 모르모트, 햄스터, 마우스, 랫트 등의 포유동물이 예시된다. 특히, 마우스나 랫트 등의 설치류 동물은 실험동물·병태 모델동물로서 널리 사용되고 있으며, 그 중에서도 마우스는 근교계가 다수 제작되고 있고, 수정란의 배양, 체외수정 등의 기술이 구비되어 있어서 실험동물ㆍ병태 모델동물로서 바람직하다.

또, 상기 1의 항체 또는 그 단편은 본 발명의 재조합 발현 벡터를 사용해서 제작한 본 발명의 형질 전환체에 의해서도 생산하는 것이 가능하다.

4. 본 발명의 인간화 항체 및 그 단편의 이용 방법

본 발명의 항체는 구조변화를 일으킨 TTR(예를 들면, TTR 아밀로이드)을 특이적으로 인식하고, TTR의 섬유화를 저해하고, FAP에 대한 예방효과를 발휘한다. 그 때문에 본 발명은 TTR의 구조변화를 검출하는 기구, TTR 아밀로이드시스(특히 FAP) 진단약, TTR의 섬유화를 저해하는 약제, TTR 아밀로이드시스(특히 FAP)에 대한 예방 및/또는 치료하기 위한 의약 조성물을 포함한다.

본 발명에는 (1)의 항체 또는 그 단편을 포함하는 TTR의 구조변화를 검출하는 기구(TTR 아밀로이드 검출기구)가 포함된다. 본 발명의 검출기구로서는 예를 들면, 구조변화한 TTR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 기반(담체) 상에 고정화한 항체 칩이나 항체 칼럼 등을 들 수 있다. 본 발명의 검출기구는 예를 들면, 혈액이나 요 등의 시료 중에 포함되는 구조변화한 TTR(예를 들면 TTR 아밀로이드)을 검출하는 용도로 사용해도 상관없다. 또한, 구조변화한 TTR(TTR 아밀로이드)이 관여하는 질병의 판정이나 치료효과를 평가하기 위한 진단 용도, 치료 용도로 이용해도 상관없다.

또, 본 발명에는 (1)의 항체 또는 그 단편을 포함하는 TTR 아밀로이드를 제거하는 용도로 사용되는 담체(TTR 아밀로이드 제거 담체)가 포함된다. 당해 제거 담체는 크로마토그래피에 있어서 통상 사용되는 담체에 대해서, 일반적인 방법으로 항체 등을 결합시키는 것에 의해서 작성해도 상관없다. 상기의 제거용 담체는 TTR 아밀로이드가 원인이 되는 아밀로이드시스 환자로부터 혈액을 채취하고, 그 혈액을 제거용 담체가 충전된 칼럼을 통해서, 혈중의 TTR 아밀로이드를 제거하는 등의 용도가 예시된다.

또, 본 발명에는 상기 1의 항체 또는 그 단편을 포함하는 TTR 아밀로이드를 검출하기 위한 시약(TTR 아밀로이드 검출용 시약)이 포함된다. 즉, 이것들의 항체 또는 그 단편에 의한 래디오 이뮤노어세이, 엔자임 이뮤노어세이, 형광 이뮤노어세이 등의 표지 이뮤노어세이를 적용할 때에는, 피검시료 중의 TTR을 신속 또한 정확하게 정성 또는 정량 분석할 수 있다. 이 표지 이뮤노어세이에서는 상기 항체 또는 그 단편은 예를 들면, 방사성 물질, 효소 및/또는 형광 물질에 의해 표지해서 사용할 수 있다. 또, 이것들의 항체 및 그 단편은 TTR 아밀로이드에 특이적으로 반응하고, 면역반응을 나타내므로, 그 면역반응에 대해서 표지 물질을 지표로 측정하면, 피검시료 중의 극히 미량의 TTR 아밀로이드를 고정밀도로 검출할 수 있다. 표지 이뮤노어세이는 바이오어세이와 비교해서 한번에 수많은 피검 시료를 분석할 수 있는 동시에, 분석에 필요로 하는 시간과 노동력이 적어도 도고, 거기에다, 분석이 고정밀도라는 특징이 있다.

본 발명에는 상기 1의 항체 또는 그 단편을 포함하는 TTR 아밀로이드시스 진단약이 포함된다. 본 발명의 진단약에 의한 질병을 진단하는 방법은 피검 시료(혈액이나 체액, 조직 등) 중의 TTR 아밀로이드량을 측정하고, 그 측정결과에 따라 질병의 진단을 실시하는 것이다. 또, 질병은 TTR 아밀로이드가 원인이 되는 질병이 포함된다. 그러한 질병으로서는 노인성 전신성 아밀로이드시스(SSA), 가족성 아밀로이드시스(FAP)가 예시된다.

본 발명의 항체는 TTR의 섬유화를 억제하는 효과가 확인되었다. 그 때문에 본 발명에는 상기 1의 항체 또는 그 단편을 포함하는 TTR의 섬유화를 저해하는 약제(섬유화 저해제)가 포함된다. 섬유화 저해제에는 1종류 이상의 부형제, 1종류 이상의 결합제, 1종류 이상의 붕해제, 1종류 이상의 활택제, 1종류 이상의 완충제 등과 같이, 의약품으로서 허용되는 첨가물이 포함될 수도 있다.

본 발명의 항체는 TTR 아밀로이드시스의 모델 동물에 투여했을 경우에, 효과가 확인되었다. 그 때문에 본 발명은 상기 1의 항체 또는 그 단편을 포함하는 TTR 아밀로이드시스에 대한 예방 및/또는 치료를 실시하기 위한 의약 조성물이 포함된다. 당해 의약 조성물은 1종류 이상의 부형제, 1종류 이상의 결합제, 1종류 이상의 붕해제, 1종류 이상의 활택제, 1종류 이상의 완충제 등과 같이, 의약품으로서 허용되는 첨가물이 포함될 수도 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거해 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이것들에 전혀 한정되는 것은 아니다.

시판하고 있는 키트 혹은 시약을 사용한 부분에 대해서는 특별히 언급이 없는 한 첨부의 프로토콜에 따라서 실험을 실시했다.

실시예 1

TTR 펩티드의 컨주게이션

인간 TTR115-124 펩티드(서열번호 9)에 대해서 N말단 혹은 C말단에 시스테인을 부가한 펩티드를 화학 합성에 의해 제작했다(SIGMA-ALDRICH사에 외주). 이하, N말단에 시스테인을 부가시킨 TTR115-124 펩티드를 TTR02 펩티드, C말단에 시스테인을 부가시킨 TTR115-124 펩티드를 TTR03 펩티드라고 부른다. Immunogen EDC Kit with mcKLH and BSA(Thermo)를 사용해서, KLH 혹은 BSA를 TTR02/TTR03 펩티드의 N말단 또는 C말단의 시스테인에 컨쥬게이트시켰다.

실시예 2

TTR 펩티드의 바이오틴화

Biotin-PE-maleimide(DOJINDO)를 사용해서 실시예 1에서 합성한 2종의 TTR02, TTR03 펩티드를 비오틴화했다. 바이오틴화 후의 TTR02, 03 펩티드를, Superdex peptide(GE Healthcare)를 사용해서 PBS(SIGMA) 하에서 겔여과 정제를 실시하고, 바이오틴화 TTR 펩티드로 했다.

실시예 3

항 인간 TTR 모노클로널 항체의 조제

TTR 녹아웃 마우스(비특허문헌 13, Kumamoto University으로부터 분여)에, KLH 컨쥬게이트 TTR02 펩티드100㎍/㎖과 Freund's Complete Adjuvant(DIFCO)를 1:1로 혼합하고, 200㎕로 마우스를 면역했다. 1회째의 면역으로부터 2주일 이상 간격을 비우고, KLH 컨쥬게이트한 TTR02 펩티드와 Freund's InComplete Adjuvant(DIFCO)를 혼합하고, 마우스를 면역했다. 면역 후, 1∼2주일 간격으로 채혈을 실시하고, 항체가가 충분하게 상승할 때까지 상기와 같은 조건으로 마우스를 면역했다. 항체가는 ELISA법에 의해 확인했다.

항체가가 충분하게 상승한 것을 확인한 후, 마우스로부터 비장 세포를 적출하고, 마우스 미에로마 세포 P3U1과 PEG법으로 세포 융합을 실시했다. 융합 후의 세포를 HAT배지에 현탁하고, 96 well Plate에 파종했다. HAT 배지하에서 배양을 계속하는 것에 의해 하이브리도마만을 선택했다. 파종 후 7일∼11일째에, 이하의 방법으로 배양 상청 중에 포함되는 항체의 인간 TTR로의 결합활성을 평가했다.

실시예 4

항- TTR 항체의 결합 활성 시험

취득한 하이브리도마가 생산한 항체의 항원 결합 활성을 ELISA법으로 평가했다. 실시예 1에서 제작한 BSA 컨쥬게이트한 TTR02, 03 펩티드를 PBS(SIGMA)로 2㎍/㎖로 희석하고, Maxisorp Plate(Nunc)에 각 웰당 100㎕ 넣고, 1시간 실온에서 인큐베이트함으로써 TTR 펩티드를 고상화했다. 고상화한 플레이트에 1% BSA-PBS를 각 웰당 300㎕ 넣고, 1시간 실온에서 인큐베이트함으로써 플레이트의 블록킹을 실시했다. 취득한 하이브리도마의 배양 상청을 플레이트의 각 웰에 100㎕씩 첨가하고, 37℃에서 인큐베이션했다. 1시간 후, PBST로 웰을 세정하고, 1% BSA-PBS로 5000배 희석한 검출항체 anti-mouse IgG(H+L)/HRP(Zymed)을 플레이트의 각 웰에 100㎕씩 첨가하고, 37℃에서 인큐베이션했다. 1시간 후, PBST로 세정하고, TMB(SIGMA)를 플레이트의 각 웰에 100㎕씩 첨가하는 것에 의해 발색시켰다. 30분 후에 1N 황산으로 반응을 정지시키고 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)로 발색값(O.D.450nm/650nm)을 측정했다.

그 결과, 하이브리도마 T24에 있어서 TTR 펩티드에 대해서 뛰어난 결합 활성이 인정되었다.

실시예 5

항- TTR 항체 유전자의 취득

TTR 펩티드에의 결합 활성을 가지는 항체를 발현하는 하이브리도마 T24에 대해서, 한계 희석법에 의해 하이브리도마의 클로닝을 실시했다. 클로닝 후의 하이브리도마 1×10⁷cells를 출발재료로 하고, TRIzol(Invitrogen)을 사용해서 total RNA를 추출했다. total RNA를 주형으로서 random primer (Invitrogen), Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads(GE Healthcare)를 사용해서 First-strand cDNA를 조제했다. 다음에, 이 cDNA를 주형으로 사용하고, Kabat들에 의한 V영역 및 J영역의 서열 분류(Sequences of Proteins of Immunological Interest 4th ed., Public Health Service, NIH, Washington DC, 1987)를 참조해서 디자인한 리더 영역에 대한 프라이머와 J영역에 대한 프라이머를 사용하고, Ex-Taq(Takara)로 VH 및 VL 유전자 단편을 증폭했다. 증폭한 VH영역이나 VL영역의 DNA는 pCR2.1-TOPO(Invitrogen)에 TA 클로닝을 실시하고, 항-TTR 항체의 유전자 배열을 취득했다. 클로닝한 T24 항체의 DNA 염기서열을 Big Dye Terminator V3.1 Cycle sequencing kit(Applied Biosystems) 및 Genetic analyzer ABI Prism 3100(Applied biosystems)을 사용해서 결정했다.

실시예 6

마우스 T24 항체 발현 벡터의 구축

실시예 5로 취득한 서열을 바탕으로, T24 항체 발현 벡터를 구축했다. VH영역에 관해서는 실시예 5에서 구축한 T24VH 삽입 벡터를 주형으로 해서, T24VH-Fw 프라이머(서열번호 10) 및 T24VH-Rv 프라이머(서열번호 11)을 사용해서, primestar GXL(Takara)를 이용해서 PCR법에 의해 VH영역을 증폭했다. VL영역에 대해서는 동일하게 T24VL 삽입 벡터를 주형으로 해서, T24VL-Fw프라이머(서열번호 12) 및 T24VL-Rv프라이머(서열번호 13)를 사용해서 증폭하고, QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)로 정제했다. VH영역 증폭 단편에 대해서는 XhoI, NruI처리한 pKMA010-mCg1 벡터에, VL영역 증폭 단편에 대해서는 XhoI, BamHI처리한 pKMA009-mCk벡터에 각각 In-fusion Enzyme (Clontech)을 사용해서 도입하고, 마우스 정상영역을 가지는 T24 항체(이하 마우스 T24 항체)를 발현하는 벡터(H 체인 발현 벡터 pKMA010-T24-mCg1 및 L 체인 발현 벡터 pKMA009-T24-mCk)를 구축했다(도 1). pKMA010-T24-mCg1 벡터는 CAG 프로모터의 하류에 마우스 T24 항체 H 체인의 서열이 삽입되고 있고, 약제 내성 유전자로서 Dhfr 유전자를 가지고 있다. pKMA009-T24-mCk 벡터는 CAG 프로모터의 하류에 마우스 T24 항체 L 체인의 서열이 삽입된 벡터이다. pKMA010-T24-mCg1 벡터 및 pKMA009-T24-mCk 벡터를 일반적으로 마우스 T24 항체 발현 벡터라고 부른다.

실시예 7

T24 항체의 인간화

취득한 항-TTR 항체를 CDR Grafting법을 사용해서 인간화하고, RT24 항체를 제작했다. T24 항체의 VH영역 또는 VL영역에 있어서의 CDR1∼3은 Kabat의 numbering법에 의해 결정했다. 당해 CDR1∼3의 아미노산 서열 및 염기서열을 서열번호 1∼6에 나타낸다. 인간 항체의 VH영역 또는 VL영역의 아미노산 서열에 대해서, T24의 CDR1∼3의 아미노산 서열을 이식한 아미노산 서열을 설계했다. 또, 설계 후의 VH영역 또는 VL영역의 프레임워크 영역에 있어서, 몇 개의 아미노산을 개변시킨 아미노산 서열도 아울러 설계했다. 그것들의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 화학합성했다(TAKARA BIO INC.에 외주). 그것들의 항체의 하나를 RT24 항체로 하고, 그 VH영역 또는 VL영역의 아미노산 서열 및 염기서열을 서열번호 7, 8에 나타낸다. 인간 정상영역을 가지는 RT24 항체(이하 인간 RT24 항체)을 발현하는 벡터를 이하의 방법으로 구축했다. 화학합성한 RT24가 포함된 플라스미드를 HindIII 및 BamHI로 소화하고, RT24 항체의 VH영역 및 VL영역을 코딩하는 서열이 포함된 영역을 잘라냈다. 잘라낸 RT24 항체의 VH서열을, 동일하게 HindIII 및 BamHI 소화처리한 pUC-hCγ(발현 벡터 pUC19에 인간 Cγ1 유전자가 삽입된 것. 인간 Cγ1 유전자의 상류에는 제한 소 사이트 SalI, HindIII 및 BamHI 사이트가, 하류에는 제한효소 사이트 SalI가 삽입되어 있다)에 도입하고, pUC-RT24-hCγ1을 얻었다. 동일하게, 잘라낸 RT24 항체의 VL서열을, HindIII, BamHI 처리한 pUC-hCκ(발현 벡터 pUC19에 인간 Cκ 유전자가 삽입된 것. 인간 Cκ 유전자의 상류에는 제한효소 사이트 SalI, HindIII 및 BamHI 사이트가, 하류에는 제한효소 사이트 SalI가 삽입되고 있다)에 도입하고, pUC-RT24-hCκ를 얻었다. pUC-RT24-hCγ1을 SalI로 처리하고, 동일하게 SalI 처리한 발현 벡터 pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo (특허문헌 2)에 도입하고, 인간 RT24 항체 H 체인 발현 벡터 pCAGGS1.dhfr.neo-RT24-hCg1을 구축했다. pUC-RT24-hCκ을 SalI로 처리하고, 동일하게 SalI 처리한 발현 벡터 pCAGG-S1(Sal) (특허문헌 2)에 도입하고, 인간 RT24 항체 L 체인 발현 벡터 pKMA009-RT24-hCk를 구축했다. pCAGGS1.dhfr.neo-RT24-hCg1 벡터는 CAG 프로모터의 하류에 인간 RT24 항체 VH영역의 서열 및 인간 Cγ1 유전자가 삽입되어 있고, 약제내성 유전자로서 Dhfr 유전자 및 네오마이신 내성 유전자를 가지고 있다. 또, pKMA009-RT24-hCk 벡터는 CAG 프로모터의 하류에 인간 RT24 항체 VL영역의 서열 및 인간 Cκ 유전자가 삽입된 벡터이다. pCAGGS1.dhfr.neo-RT24-hCg1 벡터, 및 pKMA009-RT24-hCk 벡터를 일반적으로 인간 RT24 항체 발현 벡터라고 부른다.

계속해서, 마우스 정상영역을 가지는 RT24 항체(이하, 키메라 RT24 항체)를 발현하는 벡터의 구축을 실시했다. VH영역에 대해서는 pCAGGS1.dhfr.neo-RT24-hCg1을 주형으로 해서, pCAG-Fw 프라이머(서열번호 14), 및 T24VH-Rv 프라이머를 사용해서, primestar GXL(Takara)을 이용해서 PCR법에 의해 VH영역을 증폭했다. VL영역에 대해서는 pKMA009-RT24-hCk를 XbaI, BamHI 처리하고, RT24의 VL영역을 포함하는 단편을 잘라냈다. VH영역 증폭 단편에 대해서는 XbaI, NruI 처리한 pKMA010-mCg1 벡터에, VL영역단편에 대해서는 XbaI, BamHI 처리한 pKMA009-mCk 벡터에 각각 In-fusion Enzyme(Clontech)을 사용해서 도입하고, 키메라 RT24 항체 H 체인 발현 벡터 pKMA010-RT24-mCg1, 및 키메라 RT24 항체 L 체인 발현 벡터 pKMA009-RT24-mCk를 구축했다. pKMA010-RT24-mCg1 벡터는 CAG 프로모터의 하류에 인간 RT24 항체VH영역의 서열 및 마우스 Cγ1 유전자가 삽입되고 있고, 약제내성 유전자로서 Dhfr 유전자를 가지고 있다. pKMA009-RT24-mCk 벡터는 CAG 프로모터의 하류에 인간 RT24 항체 VL영역의 서열 및 마우스 Cκ 유전자가 삽입된 벡터이다. pKMA010-RT24-mCg1 벡터, 및 pKMA009-RT24-mCk 벡터를 일반적으로 키메라 RT24 항체 발현 벡터라고 부른다.

마우스 T24 항체 발현 벡터, 키메라 RT24 항체 발현 벡터, 인간 RT24 항체 발현 벡터를 각각 Freestyle293F 세포(Invitrogen)에 Neofection(아스텍크)을 사용해서 유전자 도입하고, 37℃, 8% CO₂ 환경하에 있어서 125rpm으로 진탕배양 하고, 마우스 T24 항체, 키메라 RT24 항체, 또는 인간 RT24 항체를 분비 발현시켰다. 배양 5일째에 상청액을 회수하고, HiTrap rProteinA FF(GE Healthcare)를 사용한 크로마토그래피 정제를 실시했다. 마우스 T24 항체, 키메라 RT24 항체, 또는 인간 RT24 항체가 포함된 용출 분획을 PBS(SIGMA)에 대해서 투석하고, 마우스 T24 항체, 키메라 RT24 항체, 또는 인간 RT24 항체의 항체 정제품으로 했다.

실시예 8

인간 TTR 유전자의 클로닝

인간 TTR발현 벡터를 구축하는 에 있어서, 인간 TTR 유전자의 클로닝을 실시했다. Human liver Marathon-Ready cDNA(Clontech)을 주형으로, 성숙형 TTR의 5’말단 또는 3’말단에 설정한 프라이머(TTR-F2: 서열번호 15, 및 TTR-R: 서열번호 16), 및 Ex-Taq(Takara)를 사용해서 PCR을 실시했다. PCR산물을 pCR2.1-TOPO에 TA 클로닝한 후, 시퀀스 해석에 의해 인간 TTR 유전자의 염기서열을 확인했다. 서열이 옳바른 것을 확인한 후, TTR 유전자가 삽입된 pCR2.1-TOPO를 BamHI 및 HindIII 처리하고, TTR 유전자를 코딩하는 서열이 포함된 영역을 잘라냈다. 잘라낸 서열을 BamHI 및 HindIII 처리한 pQE-30(QIAGEN)에 도입하고, 야생형 인간 TTR발현 벡터를 구축했다.

실시예 9

인간 TTR 돌연변이체 발현 벡터의 구축

실시예 8에서 구축한 야생형 인간 TTR발현 벡터를 주형으로, site-directed mutagenesis법을 사용해서 아미노산의 점돌연변이 도입을 실시했다. 아미노산의 점돌연변이 도입은 D18G, V30M, E54K, L55P, Y114C, S115A, Y116S, S117A, T118A, T119A, A120S, V121I, V122A, V122I, T123A, N124A의 16종류에 대해서 각각 실시했다. 상기 16종류의 TTR 돌연변이체를 코딩하는 서열을 pQE-30에 각각 도입했다.

실시예 10

RT24 항체의 에피토프 해석

RT24 항체의 에피토프를 더욱 상세하게 해석하기 위해서, 본 항체의 창출에 사용한 TTR115-124 펩티드 영역의 알라닌 치환 돌연변이체를 사용하고, RT24 항체의 반응성해석을 실시했다. 실시예 9에서 구축한 TTR 돌연변이체 발현 벡터를 대장균주 M15로 형질전환하고, 20㎖의 LB/Ampicilin(50㎍/㎖)/Kanamycin(25㎍/㎖)로 37℃에서 배양했다. O.D.600nm=0.5가 된 시점에서 IPTG을 최종 농도 10mM가 되도록 첨가하고, 하룻밤 배양했다. 배양액을 원심하고, 침전 분획을 Bugbuster(Merck)에 의해 가용화했다. 가용화된 균체액을 8-16% SDS-PAGE 겔에 영동하고, 겔로부터 Immobilon-P(Millipore)에 전사했다. 전사한 막에 2% Skimmilk-PBST를 첨가하고, 실온에서 1시간 진탕함으로써 막의 블록킹을 실시했다. 키메라 RT24 항체를 2% Skimmilk-PBST로 1㎍/㎖의 농도로 희석하고, 10㎖을 막에 첨가해서 실온에서 1시간 진탕했다. PBST로 세정하고, 검출 항체 HRP 표지 anti-mouse IgG(H+L) (AMERICAN QUALEX INTERNATIONAL)을 2% Skimmilk-PBST로 5000배 희석한 후에 막에 첨가하고, 실온에서 1시간 진탕했다. PBST로 세정한 후, Ez West Blue(ATTO)로 발색시켰다.

그 결과, 도 2에 나타내는 바와 같이, RT24 항체는 TTR115-124 부위 중에서도 특히 118-122 부위를 에피토프로 인식하는 것이 밝혀졌다.

실시예 11

재조합 TTR 정제품의 조제

Matsubara들의 방법(비특허문헌 14)을 참고로, 재조합 TTR 정제품의 조제를 실시했다. 실시예 8 및 9에서 구축한 야생형 TTR, 또는 D18G, V30M, E54K, L55P, Y114C, Y116S, V122I TTR 돌연변이체를 발현하는 발현 벡터를 대장균주 M15로 형질전환하고, 20㎖의 LB/Ampicilin(50㎍/㎖)/Kanamycin(25㎍/㎖)로 37℃에서 배양했다. O.D.600nm=0.5가 된 시점에서 IPTG을 최종 농도 10mM이 되도록 첨가하고, 하룻밤 배양했다. 배양액으로부터 균체를 원심해서 회수하고, BufferA(50mM PB +0.3M NaCl+10mM Imidazole+20mM 2-Mercaptoethanol)에 현탁했다. 현탁액을 15분간 소니케이션하고, 추가로 원심을 실시해서 상청액을 회수했다. 상청액을 Ni-NTA Agarose(QIAGEN)를 사용해서 His-tag 정제를 실시하고, 재조합 TTR이 포함된 용출 분획을 20mM NaHCO₃에 대해서 투석했다. 투석 후의 재조합 TTR을, 10 mM PB (pH7.5) 하에서 Superdex75(GE Healthcare)를 사용해서 겔여과 정제하고, 사량체 TTR 분획을 재조합 TTR 정제품으로 했다.

실시예 12

RT24 항체의 반응 특이성 해석

RT24 항체의 TTR 사량체에 대한 반응성을 해석하기 위해서, 표면 플라스몬 공명법을 사용한 반응 특이성 해석을 실시했다. 실시예 11에서 조제한 V30M TTR 정제품을 3 mg/㎖가 되도록 10mM PB (pH7.5)로 희석하고, 등량의 200 mM 아세트산 버퍼+100 mM NaCl(pH3.0)과 혼합해서 1.5mg/㎖의 농도가 되도록 조제하고, 37℃ 항온조에서 16시간 반응시키는 것으로 V30M TTR 섬유를 조제했다. 반응 후의 TTR에 대해서는 ThioflavinT assay에 의해 섬유가 형성되고 있는 것을 확인했다. ThioflavinT assay는 ThioflavinT가 20μM, TTR이 30∼60㎍/㎖가 되도록, 50mM Glycine-NaOH Buffer(pH9.5)로 희석하고, 분광형광 광도계 FP-6500(JASCO)에 의해 형광강도를 측정하는 것에 의해 실시했다(여기파장 440 nm, 형광파장 480 nm).

Biacore2000(GE Healthcare)을 사용하고, Sensorchip CM5(GE Healthcare)에 WT TTR 사량체, V30M TTR 사량체, V30M TTR 섬유(모두 재조합체)을 1000RU정도 고상화했다. 리간드의 고상화는 10mM 아세트산 버퍼(pH6.0)로 실시했다. HBS-EP Buffer로 10㎍/㎖로 희석한 Polyclonal Rabbit Anti-Human Prealbumin(Dako), RT24 항체, 음성 컨트롤 항체를 20㎕/min으로 2분간 영동했다. 영동 후에 해리를 60분간 실시하고, 10mM Gly-NaOH (pH9.0)로 30초간 재생을 실시했다.

그 결과, 도 3에 나타내는 바와 같이, RT24 항체는 WT TTR 및 V30M 사량체 TTR에는 반응하지 않고, V30M 섬유를 특이적으로 인식하는 것이 분명하게 되었다(a). Dako사의 폴리클로널 항체에서는 WT TTR 및 V30M TTR과 강하게 반응하고, V30M TTR 섬유에의 반응성은 약하고(b), 음성 컨트롤 항체에서는 어느 쪽의 TTR에 대해서도 반응을 나타내지 않았다(c).

실시예 13

T24 항체의 환자 혈청에의 반응성 해석

T24 항체가 FAP 환자 유래의 혈청에 대해서 반응성을 나타내는 지의 여부에 대해서 해석을 실시했다. 투여한 항체가 환자 혈청 중의 인간 TTR을 인식하지 않는 것이, FAP 치료용 항체로서 바람직한 특성이다. 실시예 1에서 조제한 TTR02 및 TTR03펩티드의 BSA 컨쥬게이트, 정상인의 혈청, 및 V30M TTR 돌연변이를 가지는 FAP 환자 유래의 혈청을 2㎍/㎖로, 실시예 12과 동일하게 pH 3.0 처리를 실시한 혈청 유래의 야생형 TTR의 섬유, 및 FAP 환자의 신장으로부터 추출한 TTR 아밀로이드를 약 4㎍/㎖로, Maxisorp plate(Nunc)에 각 웰당 100㎕ 첨가하고, 항원의 고상화를 실시했다. 고상화한 플레이트에 1% BSA-PBS를 각 웰당 300㎕ 넣고, 1시간 실온에서 인큐베이트함으로써 플레이트의 블록킹을 실시했다. T24 항체를 1% BSA-PBS로 단계희석하고, 플레이트의 각 웰에 100㎕씩 첨가하고, 37℃에서 인큐베이션했다. 1시간 후, PBST로 웰을 세정하고, 검출 항체 anti-mouse IgG(H+L)/HRP(Zymed)를 플레이트의 각 웰에 100㎕씩 첨가하고, 37℃에서 인큐베이션했다. 1시간 후, PBST로 세정하고, TMB(SIGMA)을 플레이트의 각 웰에 100㎕씩 첨가하는 것에 의해 발색시켰다. 30분 후, 1N 황산으로 반응을 정지시키고, 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)로 발색값(O.D.450nm)을 측정했다.

그 결과, 도 4에 나타내는 바와 같이, T24 항체는 TTR 펩티드나 FAP 환자 유래의 TTR 아밀로이드, 혈청 유래의 야생형 TTR을 산처리에 의해 아밀로이드화시킨 것에는 분명한 농도 의존적 반응성을 나타낸 것에 대해서, 정상인 및 FAP 환자 유래의 혈청에는 명확한 반응성을 나타내지 않았다.

실시예 14

T24 항체 및 키메라 RT24 항체의 환자조직으로의 반응성 해석

V30M TTR 보유 FAP 환자의 심장을 채취하고, 포르말린 고정을 실시했다. 고정한 심장조직을 파라핀 블록에 포매하고, 조직 절편을 제작했다. 조직 절편을 4μm의 두께로 얇게 썰어서 슬라이드 글래스에 접착시킨 후, 탈파라핀 처리를 실시했다. PBS로 세정한 후, 0.1% 과요오드산 이수화물에 10분간 침투하고, 추가로 PBS로 세정했다. 0.5% BSA-PBS로 50배 희석한 Rabbit serum(Dako)에 실온에서 1시간 침지시키고, 블록킹 처리를 실시했다. PBS로 세정한 후, 1차 항체로서 T24 항체/키메라 RT24 항체/음성 컨트롤 항체를 각각 0.5% BSA-PBS로 10㎍/㎖로 희석하고, 4℃에서 밤새 침지시켰다. 2차항체로서 HRP 표지 Rabbit anti-mouse IgG(Dako)를 0.5% BSA-PBS로 100배 희석하고, 실온에서 1시간 침지시켰다. PBS로 세정하고, DAB를 사용해서 발색시켰다. 헤마톡실린 염색도 아울러 실시했다. 양성 컨트롤에서는 1차 항체에 Polyclonal Rabbit Anti-Human Prealbumin(Dako)을, 2차 항체에 HRP 표지 Goat anti-Rabbit IgG(Dako)를 사용해서 동일한 처리를 실시했다. 또, 포르말린 고정에 의해 TTR이 변성하고, 입체구조가 변화되어버릴 가능성을 고려하고, V30M TTR 보유 FAP 환자의 심장 동결 조직 절편에 대해서도, 동일하게 면역염색을 실시했다. 또, 아밀로이드 섬유의 존재를 확인하기 위해서, Congo red염색도 실시했다. Congo red는 아밀로이드 섬유에 정착해서 단파장 이동을 일으키는 것이 알려져 있다.

이것들의 해석의 결과, 도 5에 나타나내는 바와 같이, T24 항체 및 RT24 항체는 파라핀 절편(도 5a)과 동결 절편(도 5b) 중 어느 것에 있어서도, FAP 환자 유래의 심장에 침착한 TTR을 특이적으로 인식하는 것이 확인되었다.

실시예 15

RT24 항체의 TTR 섬유에의 반응성 해석

실시예 11에서 조제한 D18G, V30M, E54K, L55P, Y114C, Y116S, V122I의 7종류의 돌연변이 TTR정제품, 및 야생형 TTR 정제품을, 실시예 12에 나타낸 방법으로 pH3.0환경 하, 37℃에서 하룻밤 스탠딩하고, 각종 재조합 TTR 섬유를 조제했다. 재조합 TTR을 1.5㎍씩 8-16% SDS-PAGE로 영동하고(2장), 1장은 Silver stain KANTO III(KANTO CHEMICAL CO.,INC.)을 사용해서 은염색을 실시했다. 나머지에 1장은 Immobilon-P(Millipore)에 전사했다. 전사한 막에 2% Skimmilk-PBST를 첨가하고, 실온에서 1시간 진탕함으로써 막의 블록킹을 실시했다. 키메라 RT24 항체를 2% Skimmilk-PBST로 1㎍/㎖의 농도로 희석하고, 10mL을 막에 첨가해서 실온에서 1시간 진탕했다. PBST로 세정하고, 검출 항체 HRP 표지 anti-mouse IgG(H+L)(AMERICAN QUALEX INTERNATIONAL)을 2% Skimmilk-PBST로 5000배 희석하고, 실온에서 1시간 진탕했다. PBST로 세정한 후, Ez West Blue(ATTO)로 발색시켰다.

그 결과, 도 6에 나타내는 바와 같이, RT24 항체는 각종 TTR 섬유를 인식하고, 한편으로 섬유화시키지 않고 있는 야생형 TTR 정제품을 인식하지 않는 것이 밝혀졌다.

실시예 16

V30M TTR 섬유화 저해활성 측정계의 구축

재조합 V30M TTR을 375㎍/㎖가 되도록PBS(-)로 희석하고, 4종류의 계면활성제를 최종 농도가 0.1%, 0.01%, 0.001% 가 되도록 혼합했다. 사용하는 계면활성제로서 (1) 염화벤즈알코늄(Yamazen Corporation), (2) 데옥시콜산 나트륨(Nacalai Tesque), (3) Zwittergent3-16(Carbiochem), (4) NP-40(Wako)을 사용했다. 37℃에서 4일간 스탠딩하고, ThioflavinT assay(여기파장 440 nm, 형광파장 480 nm)로 형광강도를 측정하고, TTR 섬유화의 정도를 평가했다.

ThioflavinT assay의 결과 어느 쪽의 계면활성제에서도, 0.1%의 농도로 사용했을 때에 TTR의 섬유화가 진행하고 있었다. 그 중에서도, 데옥시콜산 나트륨을 사용했을 때가, TTR의 섬유화가 가장 먼저 진행하는 것을 알아냈다. 계속해서, 데옥시콜산 나트륨이 최적인 농도에 대해서 검토했다.

재조합 V30M TTR을 375㎍/㎖가 되도록 PBS(-)로 희석하고, 데옥시콜산 나트륨의 농도가 1%, 0.5%, 0.2%, 0.1%, 0.01%가 되도록 혼합했다. 37℃에서 스탠딩하고, 4일후, 7일후에 ThioflavinT assay를 실시해서 TTR 섬유화의 정도를 평가했다

그 결과, 데옥시콜산 나트륨 농도는 0.1%가 최적인 것이 밝혀졌다. 지금까지, 중성 pH 환경하에서 V30M TTR의 섬유화가 진행하는 조건에 관한 보고는 이루어지지 않았고, pH3.0과 같은 산성환경하에 TTR을 두는 것으로, TTR의 섬유화를 진행시키고 있었다. 한편으로, 항체를 산성환경하에 폭로시키면 항체가 변성하고, 그 활성을 잃어버리는 것으로부터, 항-TTR 항체의 TTR 섬유화 저해능을 평가하는 것은 곤란했다. 이번에 데옥시콜산을 계에 도입함으로써 중성환경하에서도 V30M TTR의 섬유화가 진행하는 것을 새롭게 발견하고, 항-TTR 항체의 섬유화 저해능을 평가할 수 있는 계의 구축에 성공했다.

실시예 17

RT24 항체의 V30M TTR 섬유화 저해 시험

V30M TTR 정제품, 및 RT24 항체 또는 음성 컨트롤 항체의 몰비가 10μM: 0.01∼2μM가 되도록 양자를 혼합하고(TTR: 550㎍/㎖, 항체: 1.5∼300㎍/㎖), PBS+0.1% 데옥시콜산 나트륨 환경하에서 37℃에서 3일간 스탠딩했다. 정치 후의 샘플을 사용해서 ThioflavinT assay(여기파장 440 nm, 형광파장 480 nm)를 실시하고, 형광강도를 측정했다.

그 결과, 도 7에 나타내는 바와 같이, RT24 항체는 항체농도의존적으로 V30M TTR의 섬유화를 저해하는 활성을 가지고 있는 것이 밝혀졌다. 또 RT24 항체를 바탕으로 프레임워크 영역의 아미노산을 몇 개 개변시킨 항체 RT24-a, RT24-b에 대해서도 동일하게 섬유화 저해 시험을 실시했던 바, RT24과 동일하게 V30M TTR의 섬유화 저해활성을 가지고 있었다. 항-TTR 항체의 TTR 섬유화 저해활성을 평가할 수 있는 계는 지금까지 보고되지 않았기 때문에, RT24 항체는 V30M TTR의 섬유화를 저해하는 활성을 가지는 첫 항체라고 할 수 있다.

실시예 18

마크로파지 탐식능 시험

마크로파지가 TTR 섬유를 탐식할 때, RT24 항체가 그 능력을 촉진할 것인지의 여부에 대해서, 마크로파지 탐식능 시험을 실시했다. 본 시험은 TTR 환자조직 내에 침착해 있는 TTR을 마크로파지가 제거하는 과정을 모방하고 있으며, RT24 항체의 첨가에 의해 마크로파지의 탐식 활성이 촉진되면, RT24 항체는 인간 조직 내에서 TTR 침착의 제거를 촉진하는 활성을 가지고 있다고 기대된다.

FAP 환자 유래의 피부 조직으로부터, 비특허문헌 17에 기재된 방법에 따라서 인간 iPS세포를 제작하고, 추가로 마크로파지(iPS-MP)로 분화시켰다. 1∼2×10⁶개의 iPS-MP를 10cm dish에서, 50ng/㎖ hGM-SCF 및 25pg/㎖ M-CSF 존재 하에서 24시간 전배양했다. iPS-MP를 PBS 세정 후, 20㎍/㎖ 미토마이신C를 포함하는 배지에서 37℃에서 10분간 인큐베이트하고, 세포 증식능을 정지시키고, 96 wel l플레이트에 5×10⁴개/100㎕/well가 되도록 첨가했다. 미처리 혹은 24시간의 산처리를 실시한 V30M TTR을 3.2㎍/㎖가 되도록 배지로 희석 후, 50㎕씩 첨가했다. 또, PBS/RT24 항체/음성 컨트롤 항체를 각각 40㎍/㎖가 되도록 희석하고, 50㎕씩 첨가했다. 37℃, 5% CO2하에서 3일간 배양한 후, 배양 상청을 회수했다.

배양 후의 TTR잔량을 이하에 기재하는 ELISA법으로 정량하고, 마크로파지에 의한 탐식능을 평가했다. 배양 상청을 5㎕씩 96 well플레이트에 첨가하고, 추가로 코팅 용액(25mM의 탄산나트륨 버퍼)을 100㎕ 첨가한 후, 4℃에서 하룻밤 스탠딩했다. PBST로 세정 후, 블록킹 용액(코팅 용액에 0.5% 젤라틴을 녹인 것)을 250㎕ 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이트했다. PBST로 세정 후, Polyclonal Rabbit Anti-Human Prealbumin(Dako)을 0.05% 젤라틴-PBST로 1000배 희석하고, 100㎕씩 첨가해서 실온에서 1시간 인큐베이트했다. PBST로 세정 후, HRP 표지 Goat anti-Rabbit IgG(Dako)를 0.05% 젤라틴-PBST로 5000배 희석하고, 100㎕씩 첨가해서 실온에서 1시간 인큐베이트했다. PBST로 세정 후, 100㎕의 SureBlue(KPL)로 5분간 발색시키고, 100㎕의 1M 염산으로 발색을 정지시켰다. xMARK 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad Laboratories)로 450nm의 파장을 측정했다.

결과를 도 8에 나타낸다. 미처리의 정제 V30M에 대해서는 어느 쪽의 검체에서도 TTR 잔량에 통계학적 유의차는 인정되지 않은 것에 대해서(a), TTR 섬유에 대해서는 PBS(none)와 비교해서 RT24에서는 통계학적으로 유의한 TTR잔량의 감소가 인정되었고(b), RT24 항체는 인간 iPS세포 분화 마크로파지의 TTR 섬유 탐식작용을 촉진하는 활성을 가지고 있는 것이 밝혀졌다.

실시예 19

V30M Tg 랫트를 사용한 약효 평가시험

3개월령의 V30M Tg 랫트(비특허문헌 15, TTR의 아미노산 서열에 있어서 30번 위치를 발린에서 메티오닌으로 변이시킨 인간 TTR의 유전자를 도입한 트랜스제닉 랫트)를 사용해서 마우스 T24 항체 10mg/kg 혹은 PBS를 각 그룹 4마리씩, 3∼9개월령의 6개월간에 걸쳐서 주 1회씩 26회 투여했다. 투여 후에 부검해서 대장을 채취하고, 포르말린 고정을 실시했다. 고정한 대장조직을 파라핀 블록에 포매하고, 조직 절편을 제작했다. 조직 절편을 1차 항체에 Polyclonal Rabbit Anti-Human Prealbumin(Dako)을, 2차 항체에 HRP표지Goat anti-Rabbit IgG(Dako)를 사용해서 면역염색하고, 대장의 근육층에 있어서의 TTR 침착의 정도를 수치화해서 그룹 간 비교를 실시했다.

그 결과, 도 9에 나타내는 바와 같이, PBS 투여그룹과 비교해서 T24 항체 투여그룹에서는 유의하게 TTR 침착이 억제되고 있었다.

(산업상의 이용가능성)

본 발명의 인간화 항 트랜스티레틴 항체는 활성(TTR 섬유화 저해활성, 마크로파지 탐식능촉진 활성 등) 및/또는 특이성(구조변화를 일으킨 TTR, TTR 섬유를 특이적으로 인식한다)이 우수하기 때문에, TTR의 구조변화나 섬유화가 관여하는 여러가지 질병에 대해서 유효한 약제로서 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute National University Corporation Kumamoto University <120> Anti-transthyretin humanized antibody <130> 672251 <150> JP 2014-014911 <151> 2013-01-29 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mouse <400> 1 Arg Tyr Trp Ile Thr 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mouse <400> 2 Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asn <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Mouse <400> 3 Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Phe Tyr Val 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Mouse <400> 4 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mouse <400> 5 Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mouse <400> 6 Gln Gln Leu Val Glu Tyr Pro Arg Thr 1 5 <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized VH region <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Phe Tyr Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized VL region <400> 8 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu 85 90 95 Val Glu Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Thr Asn 1 5 10 <210> 10 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T24VH-Fw primer <400> 10 tgttgctatt ctcgagggtg tccagtgtca ggtccaactg cagcagc 47 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T24VH-Rv primer <400> 11 ggggtgtcgt tttcgctgag gagacggtga ccgtg 35 <210> 12 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T24VL-Fw primer <400> 12 gggtcccagg ctcgagtggg gaaattgtga taacccagga tgaactc 47 <210> 13 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T24VL-Rv primer <400> 13 aagcgtattt ggatccactc acgttttatt tccagcttgg tccccc 46 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pCAG-Fw primer <400> 14 gaccggcggc tctagagcct ctgctaacca tg 32 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TTR-F2 primer <400> 15 cgcggatccg gccctacggg caccggt 27 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TTR-R primer <400> 16 cccaagcttt tatcattcct tgggattggt gacgac 36 <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> Mouse <400> 17 aggtactgga taacc 15 <210> 18 <211> 51 <212> DNA <213> Mouse <400> 18 gatatttatc ctggtagtgg tagaactaat tacaatgaga agttcaagaa c 51 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Mouse <400> 19 tactacggta gtacctactt ctatgtc 27 <210> 20 <211> 48 <212> DNA <213> Mouse <400> 20 aggtctagta agagtctcct gtataaggac gggaagacat acttgaat 48 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Mouse <400> 21 ttgatgtcca ccagagcatc a 21 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Mouse <400> 22 cagcaacttg tggagtatcc tcggacc 27 <210> 23 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Humanized VH region <400> 23 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact aggtactgga taacctgggt gcgccagcgc 120 cccggacaag gacttgagtg gatgggagat atttatcctg gtagtggtag aactaattac 180 aatgagaagt tcaagaacag agtcaccatt accgtggaca catccgcgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaattactac 300 ggtagtacct acttctatgt ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 24 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Humanized VL region <400> 24 gatgttgtga tgacccagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg tataaggacg ggaagacata cttgaattgg 120 tttcagcaga ggccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgatgtc caccagagca 180 tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgcc agcaacttgt ggagtatcct 300 cggaccttcg gtggaggcac caaggtggaa atcaaa 336

Claims

트랜스티레틴(TTR)의 섬유화를 저해하는 활성을 가지는 인간화 항체.
제 1 항에 있어서, 구조변화를 일으킨 TTR을 특이적으로 인식하는 인간화 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, TTR 아밀로이드와 특이적으로 결합하는 인간화 항체.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 2종류 이상의 돌연변이 TTR에 유래하는 TTR 아밀로이드와 결합하는 인간화 항체.
제 4 항에 있어서, 돌연변이 TTR이 D18G, V30M, E54K, L55P, Y114C, Y116S 및 V122I로 이루어지는 그룹에서 선택되는 돌연변이를 가지는 TTR인 인간화 항체.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, TTR 아밀로이드의 제거를 촉진하는 인간화 항체.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, TTR 아밀로이드에 대한 마크로파지 탐식능을 촉진하는 인간화 항체.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프가 TTR의 118번 위치에서 122번 위치를 포함하는 서열인 인간화 항체.
제 8 항에 있어서, 에피토프가 TTR의 118번 위치에서 122번 위치인 인간화 항체.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, TTR 아밀로이드시스에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 가지는 인간화 항체.
제 10 항에 있어서, TTR 아밀로이드시스가 가족성 아밀로이드 다발신경병증(FAP)인 인간화 항체.
제 10 항에 있어서, TTR 아밀로이드시스가 노인성 전신성 아밀로이드시스(SSA)인 인간화 항체.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 이하의 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드로 이루어지는 H 체인의 상보성 결정영역과, (c) 또는 (d)의 폴리펩티드로 이루어지는 L 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 인간화 항체:
(a) 서열번호 1∼3의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드,
(b) 서열번호 1∼3의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또, TTR에 대한 H 체인의 상보성 결정영역이 되는 폴리펩티드,
(c) 서열번호 4∼6의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드,
(d) 서열번호 4∼6의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또, TTR에 대한 L 체인의 상보성 결정영역이 되는 폴리펩티드.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 이하의 (e) 또는 (f)의 폴리펩티드로 이루어지는 H 체인 가변영역과, (g) 또는 (h)의 폴리펩티드로 이루어지는 L 체인 가변영역을 포함하는 인간화 항체:
(e) 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드,
(f) 서열번호 7의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또, TTR에 대한 H 체인 가변영역이 되는 폴리펩티드,
(g) 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드,
(h) 서열번호 8의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또, TTR에 대한 L 체인 가변영역이 되는 폴리펩티드.
이하의 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드로 이루어지는 H 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 H 체인 가변영역 단편:
(a) 서열번호 1∼3의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드,
(b) 서열번호 1∼3의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또, TTR에 대한 H 체인의 상보성 결정영역이 되는 폴리펩티드.
이하의 (c) 또는 (d)의 폴리펩티드로 이루어지는 L 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 L 체인 가변영역 단편:
(c) 서열번호 4∼6의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.
(d) 서열번호 4∼6의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또, TTR에 대한 L 체인의 상보성 결정영역이 되는 폴리펩티드.
이하의 (e) 또는 (f)의 폴리펩티드로 이루어지는 H 체인 가변영역 단편:
(e) 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드,
(f) 서열번호 7의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또, TTR에 대한 H 체인 가변영역이 되는 폴리펩티드.
이하의 (g) 또는 (h)의 폴리펩티드로 이루어지는, L 체인 가변영역 단편:
(g) 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드,
(h) 서열번호 8의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또, TTR에 대한 L 체인 가변영역이 되는 폴리펩티드.
제 15 항에 기재된 H 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 H 체인 가변영역 단편 또는 제 17 항에 기재된 H 체인 가변영역 단편과, 제 16 항에 기재된 L 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 L 체인 가변영역 단편 또는 제 18 항에 기재된 L 체인 가변영역 단편을 연결해서 이루어지는 TTR에 대한 항체의 싱글 체인 가변영역 단편.
제 15 항에 기재된 H 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 H 체인 가변영역 단편 또는 제 17 항에 기재된 H 체인 가변영역 단편, 및/또는 제 16 항에 기재된 L 체인의 상보성 결정영역을 포함하는 L 체인 가변영역 단편 또는 제 18 항에 기재된 L 체인 가변영역 단편에, 인간 유래의 정상영역을 연결해서 이루어지는 제 1 항 내지 제 12 항에 기재된 인간화 항체 또는 그 단편.
제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편을 코딩하는 유전자.
제 21 항에 기재된 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제 21 항에 기재된 유전자 또는 제 22 항에 기재된 발현 벡터가 도입된 형질 전환체.
제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편을 포함하는 TTR 아밀로이드를 검출하는 기구.
제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편을 포함하는 TTR 아밀로이드를 제거하는 담체.
제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편을 포함하는 TTR 아밀로이드를 검출하는 시약.
제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편을 포함하는 TTR 아밀로이드시스 진단약.
제 27 항에 있어서, TTR 아밀로이드시스가 가족성 아밀로이드 다발신경병증(FAP)인 진단약.
제 27 항에 있어서, TTR 아밀로이드시스가 노인성 전신성 아밀로이드시스(SSA)인 진단약.
제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편을 포함하는 TTR의 섬유화 저해제.
제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편을 포함하는 TTR 아밀로이드시스를 예방 및/또는 치료하기 위한 의약 조성물.
제 31 항에 있어서, TTR 아밀로이드시스가 가족성 아밀로이드 다발신경병증(FAP)인 의약 조성물.
제 31 항에 있어서, TTR 아밀로이드시스가 노인성 전신성 아밀로이드시스(SSA)인 의약 조성물.