CN115551886A - 用于ttr淀粉样变性的联合疗法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于在治疗受试者的甲状腺素转运蛋白淀粉样变性(ATTR)的方法中的用途的联合疗法，所述方法包括给药治疗有效量的抗‑甲状腺素转运蛋白(TTR)抗体和治疗有效量的TTR四聚体稳定剂。此外，描述了包括抗TTR抗体和TTR四聚体稳定剂的药物组合产品和部件试剂盒以及在治疗ATTR中的它们的联合使用的治疗方案。

Description

用于TTR淀粉样变性的联合疗法
本申请要求于2020年5月12日提交的欧洲专利申请EP20174177.4的优先权，其全部内容通过援引并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及用于在治疗甲状腺素转运蛋白淀粉样变性(ATTR)的方法中的用途的联合疗法，所述方法包括给药治疗有效量的抗-甲状腺素转运蛋白(TTR)抗体和治疗有效量的TTR四聚体稳定剂。
背景技术
甲状腺素转运蛋白淀粉样变性(ATTR)是严重的年龄相关性疾病，导致心肌病和/或感觉运动性多神经病(Gertz et al.,J.Am.Coll.Cardiol.66(2015),2451–24661)，并且包括两种亚型-野生型ATTR(wtATTR)和变异型ATTR(vATTR)-它们的发病机制各不相同。它们常见的前体蛋白甲状腺素转运蛋白(TTR)在生理上作为甲状腺素和视黄醇结合蛋白的转运蛋白起作用。TTR主要在肝脏中合成，并以其天然形式的四聚体形式存在(Alshehri etal.,J.Neuroendocrinol.27(2015),303–3239)。vATTR，以前称为遗传型/突变型ATTR，是常染色体显性疾患。对于野生型TTR(wtTTR)蛋白和突变型/变异型TTR(vTTR)蛋白两者，ATTR的致病机制是由TTR蛋白的部分展开和随后聚集成β-折叠片形成淀粉样原纤维而触发(Eisele et al.,Nat.Rev.Drug Discov.14(2015),759–780)。
ATTR的特征在于两种主要形式的临床表现。在心脏组织中的主要淀粉样原纤维的积聚导致心肌病，而原纤维在神经纤维中的沉积导致多神经病(Ando et al.,Guidelineof transthyretin-related hereditary amyloidosis for clinicians.OrphanetJ.Rare Dis.2013；8:31)。目前尚未阐明触发在特定器官中淀粉样沉积的因素。患者通常表现为多种症状，只有少数的TTR突变已知仅引起纯心脏或神经性疾病(Maurer et al.,J.Am.Coll.Cardiol.68(2016),161–172)。
在ATTR的治疗中，目前存在三个建立的概念：
(i)原位肝移植后，外周血中的vTTR几乎完全被供体肝脏中合成的wtTTR所取代。当然，移植不是常见的治疗疾病的选择。
(ii)低分子量化合物稳定TTR四聚体，并且从而最大限度地减少淀粉样前体的形成。二氟尼柳、AG10和他法米迪(tafamidis)稳定生理性TTR四聚体。自2011年以来，他法米迪已被批准用于治疗第1阶段ATTR。
(iii)基因沉默子(抑制mRNA的寡核苷酸)降低肝脏分泌的vTTR和wtTTR。伊诺特生代表一种反义寡核苷酸，将其每周皮下(s.c.)给药一次。帕替西兰作为siRNA寡核苷酸与术前用药联合使用，每三周静脉内(i.v.)给药。这两种基因沉默子均于2018年被批准用于ATTR治疗的第1阶段和第2阶段。
同时，研究单克隆抗体作为用于ATTR的潜在治疗的另一个概念，包括抗TTR和抗血清淀粉样P组分(抗SAP)]单克隆抗体。
在Müller et al.,European Journal of Heart Failure 22(2020),39-53和Gertz et al.,Brain Behav.9(2019),e01371中给出了不同治疗策略的概述。
虽然目前的每种药物和概念在改善ATTR和与此相关的病症上都有很大的希望，但是仍然需要治疗策略来解决在ATTR的早期和晚期阶段可能需要不同治疗的临床问题，并且需要额外的研究来确定用于特定患者的最佳治疗。
这一技术问题通过权利要求中所称和下文进一步描述的实施方式解决，并在实施例和附图中予以解释。
发明内容
本发明基于以下观察：抗TTR抗体与TTR四聚体稳定剂的联合使用令人惊讶地显示出对在体内淀粉样TTR原纤维的清除的协同效应。特别地，如在实施例中所示，用TTR四聚体稳定剂他法米迪对在小鼠中患者来源的淀粉样TTR原纤维移植物的共同治疗，通过仅靶向具有高亲和力的疾病相关淀粉样TTR构象的重组人单克隆抗TTR抗体，增加了对病理性淀粉样TTR原纤维清除的诱导。因此，本发明总体上涉及用于在治疗受试者的ATTR的方法中的用途的联合疗法，所述方法包括给药治疗有效量的抗TTR抗体和治疗有效量的TTR四聚体稳定剂。根据本发明，抗TTR抗体特异性地识别错误折叠的TTR，高亲和力地靶向与疾病相关的淀粉样构象但不靶向生理形式的TTR，并且能够促进TTR淀粉样的去除，同时TTR四聚体稳定剂防止TTR四聚体解离成淀粉样原性单体。根据本发明，抗TTR抗体和TTR四聚体稳定剂可以在医药产品中提供，例如在单独的区室中并且设计用于如本文以下所描述和所附实施例中所示的联合使用。
最近建议用发明背景部分中提到的不同药物概念的药物共同治疗ATTR，用于未来的临床研究；参见Müller et al.(2020)和Gertz et al.(2019)，上文。然而，正如作者也指出的那样，尽管原则上许多组合在理论上可能是可以想象的，但需要仔细考虑，例如由于潜在的药物相互作用。
事实上，在本发明的过程中进行的实验表明，特异性识别错误折叠的TTR的抗TTR抗体(例如抗TTR抗体NI-301.37F1)与TTR淀粉样的结合，在TTR四聚体稳定剂二氟尼柳、他法米迪和AG10的存在下保存(参见图1和实施例1；图5A和实施例4)，虽然EC50值在二氟尼柳存在下增加，但在他法米迪存在下同样方式的抗体的EC50值基本上保持不受影响。更重要的是，由于申请人在WO 2020/094883 A1中公开的新的和专有的患者来源的淀粉样异种移植(PDAX)小鼠模型，其可以令人惊讶地显示，尽管p值并不显著，在他法米迪存在的情况下，由抗体诱导的病理性TTR原纤维的体内清除甚至似乎增加，而在用二氟尼柳共同治疗后，与对照相比尽管病理性淀粉样原性TTR原纤维在很大程度上仍然被去除，但是与单独使用抗体治疗相比清除率似乎更低；参见图2和实施例2。
因此，考虑到添加的TTR四聚体稳定作用，在本发明范围内进行的实验表明，TTR稳定剂诸如他法米迪、二氟尼柳和AG10适合于ATTR的联合疗法。然而，如在实施例中所示，抗TTR抗体和TTR四聚体稳定剂之间可能存在药物相互作用，其在通过抗TTR抗体对病理性TTR淀粉样原纤维的清除上可能的支持和协同效应方面可能有所不同。
在不希望受理论束缚的情况下，据信二氟尼柳由于其已知的抗炎特性而具有降低免疫的活性，这可能无助于抗TTR抗体诱导的通过免疫细胞清除TTR原纤维。同样，使用申请人在WO 2020/094883 A1中公开的专有PDAX小鼠模型，可以验证抗TTR抗体通过抗体效应功能介导ATTR原纤维清除，特别是抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)；参见实施例3和图3，这表明抗体介导的通过体内吞噬免疫细胞去除原纤维需要活性Fc结构域。因此，由于其降低免疫的活性，二氟尼柳可能无法增强由抗TTR抗体促进的吞噬作用。
因此，在本发明的ATTR联合疗法的一种实施方式中，抗TTR抗体具有活性Fc结构域以及能够诱导ADCP并且稳定剂基本上没有抗炎特性，即降低免疫的活性可能无助于由抗TTR抗体促进的吞噬作用。这两种活性都可以通过使用在WO 2020/094883 A1中公开并且在实施例中说明的PDAX小鼠模型进行测试。
在这种情况下，本领域技术人员意识到，效应子功能和强度尤其取决于IgG类别或同种型，并且与IgG1或IgG3相比较，IgG2和IgG4具有只衰减的效应子功能。因此，在优选的实施方式中，用于本发明的联合疗法的抗TTR抗体是属于IgG1或IgG3类或同种型，最优选IgG1。当然，除了使用天然IgG免疫球蛋白外，还可以对相应的效应子功能进行基因工程改造；参见例如，Saunders KO(2019)Conceptual Approaches to Modulating AntibodyEffector Functions and Circulation Half-Life.Front.Immunol.10:1296.doi:10.3389/fimmu.2019.01296。
TTR四聚体稳定剂是影响淀粉样原纤维形成(TTR四聚体解离成淀粉样原性单体)中的限速步骤的小分子。1996年首次表明，配体与在TTR上的甲状腺素或视黄醇结合蛋白的两个结合位点的任何一个的结合稳定了它的四聚体结构并且可靠地防止TTR解离。他法米迪是属于苯并噁唑羧酸基团的小分子，其具有高的口服生物利用度，同时没有非甾体类抗炎药活性。通过与在具有高亲和力和选择性的TTR上的甲状腺素结合位点结合，他法米迪诱导wtTTR和一系列vTTR变体(例如V30M、V122I等)的剂量依赖性动力学稳定。二氟尼柳是非甾体抗炎药(NSAID)，其具有降低免疫的活性，并且此外还具有TTR四聚体稳定特性。
如前所述，二氟尼柳的降低免疫的活性可能不支持或不利于抗TTR抗体诱导的通过免疫细胞清除TTR原纤维。由于他法米迪不具有所提到的降低免疫的活性，它可能能够支持或增强抗TTR抗体介导的TTR淀粉样的去除，并且因此优选用于与抗TTR抗体的联合疗法。AG10是另一种TTR四聚体稳定剂，如他法米迪那样不具有抗炎特性，预期也适用于与抵抗错误折叠的TTR的抗TTR抗体联合疗法，并且像他法米迪一样支持或增强抗体促进TTR淀粉样原纤维去除的能力。
在实施例中所示的实验中获得的结果非常重要和特别令人感兴趣，因为由于本发明，可以为ATTR的治疗提供更有效的概念。特别地，目前已知的ATTR治疗方法，特别是TTR四聚体稳定剂和反义/siRNA寡核苷酸只能稳定结构和功能性的疾病进展，并且通常仅对处在疾病早期阶段的患者有效，而对晚期或迟发性疾病的患者无效。
相反，本发明的联合疗法可以为新的和其他治疗方法做好准备，使得TTR四聚体稳定并在人体内保留足够的量以承担它们的生理功能，以及同时从患者身上去除病理性的TTR淀粉样和防止它的重新形成。
本发明的进一步实施方式将由下文的描述和实施例而显而易见。
附图说明
图1：抗体NI-301.37F1在TTR四聚体稳定剂的存在下结合淀粉样原性TTR。在10μg/mL的他法米迪或二氟尼柳的存在下，通过ELISA评估结合亲和力。
图2：对用于体内消除TTR原纤维的联合疗法的评估。A)代表图。B)治疗开始后96小时的剩余TTR原纤维量的定量，以移植物面积的百分比表示。N＝每组6-8只小鼠，每只小鼠4片非连续切片。**p<0.01，****p<0.001。
图3：体内抗体介导的原纤维去除活性需要活性Fc结构域。ATTR原纤维移植小鼠以5mg/kg iv接受ch.NI-301.37F1、ch.NI-301.37F1-LALAPG或同种型对照的单次给药，并且在5天后收集皮肤活检用于组织学分析。A)代表图。B)在原纤维移植和治疗给药后5天，剩余的TTR原纤维量的定量，ATTR原纤维覆盖同种型治疗的小鼠46％的移植面积、ch.NI-301.37F1治疗的小鼠的23.6％和用ch.NI-301.37F1-LALAPG治疗的小鼠的46.5％。相反，与同种型治疗的小鼠相比，在用ch.NI-301.37F1-LALAPG治疗的小鼠中没有观察到原纤维的去除活性。
图4：使用BLI在他法米迪和二氟尼柳存在下NI-301.37F1的结合选择性。NI-301.37F1结合至A)可溶性ATTR低聚物(mis.WT-TTR)和NI-301.37F1没有结合至B)TTR四聚体(tetr.WT-TTR)的代表图。
图5：使用BLI在他法米迪和AG10存在下NI-301.37F1的结合选择性。NI-301.37F1结合至A)可溶性ATTR低聚物(mis.WT-TTR)和NI-301.37F1没有结合至B)TTR四聚体(tetr.WT-TTR)的代表图。
具体实施方式
本发明总体上涉及用于在治疗甲状腺素转运蛋白淀粉样变性(ATTR)的方法中的用途的联合疗法，所述方法包括给药治疗有效量的抗TTR抗体和治疗有效量的TTR四聚体稳定剂。更具体地说，本发明涉及如权利要求中所称、描述中所公开并在下文的实施例和附图中进一步说明的实施方式。
除非另有说明，否则本文使用的术语的定义提供在Oxford Dictionary ofBiochemistry and Molecular Biology,Oxford University Press,1997,revised 2000and reprinted 2003,ISBN 0 19 850673 2；Second edition published 2006,ISBN 0-19-852917-1 978-0-19852917-0中。
当使用术语“ATTR”时，如果没有另行说明，通常是指vATTR和wtATTR。同样，如果没有另行说明，“TTR”也指wtTTR和vTTR。术语“抗TTR抗体”通常是指结合错误折叠/聚集的TTR并且不结合生理性TTR四聚体的抗体。
本文使用的术语“联合疗法(combination therapy)”或“联合治疗(combinedtreatment)”或“组合”或“组合的药物产品”表示与至少两种不同治疗剂(即抗TTR抗体和TTR四聚体稳定剂)并行或平行治疗的任何形式。
在本申请的上下文中，与两种或更多种化合物的“共同给药”或“共同治疗”被定义为在特定时间，通常约24h内向患者给药两种或更多种化合物，包括单独给药两种药物，每种药物含有化合物中的一种，以及同时给药，无论两种化合物是否在一种制剂中组合和还是它们在两个单独的制剂中。
物质的“治疗有效量”或“临床活性浓度”，是指将给定的物质向患有某种病症的受试者给药，其量足以确保、减轻或部分阻止该病症或它的一种或多种症状。这种治疗性处理可能导致疾病症状的严重程度的降低，或无症状期的频率或持续时间增加。用于给定目的和给定的剂的有效量将取决于疾病或损伤的严重程度以及受试者的体重和一般状态。如本文所用，术语“受试者”包括任何哺乳动物，优选人。这些化合物的治疗效果和毒性可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定，例如，ED50(在群的50％中具有治疗效果的剂量)和LD50(对群的50％致死的剂量)。治疗作用和毒性作用之间的剂量比是治疗指数，它可以表示为LD50/ED50的比率。
此外，除非另有说明，本文中使用的术语和表达为了表征本发明，特别地用于本发明组合产品的抗TTR抗体，其定义均提供在WO 2015/092077A1中，特别是在第16至42页的“I.定义”小节中，其公开内容通过援引明确并入本文。同样适用于WO 2015/092077 A1中公开的用于抗体、药物组合物等的一般实施方式。
该药物产品包含至少两种不同的组分，抗TTR抗体，其特异性靶向错误折叠的人TTR并且去除淀粉样原性TTR原纤维，这通常是由于活性Fc结构域能够诱导抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)；以及TTR四聚体稳定剂诸如在Müller et al.(2020)和Gertz et al.(2019)，上文中描述的那些，其优选没有抗炎特性。如上所述，抗体优选为IgG1类或同种型。
如上所述，首批实验表明，TTR四聚体稳定剂不会干扰抗TTR抗体与淀粉样原性TTR的结合。因此，谨慎地预期，能够特异性地与错误折叠的TTR结合、不会靶向生理形式的TTR并且具有活性Fc结构域的任何抗TTR抗体，适合作为本发明的联合疗法的组分。
由于本发明的药物产品用于治疗人受试者的ATTR，因此在一种实施方式中抗TTR抗体是人源化的，优选人源的和对人非免疫原性的。
如在实施例中所示，本发明已经用抗TTR抗体NI-301.37F1进行了例证，该抗体能够结合包含或由氨基酸序列TTR41-45(WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：51)组成的人TTR表位，并且在其可变区或结合结构域中包含具有分别在WO 2015/092077 A1的图1C和1M中记载的氨基酸序列的互补决定区(CDR)以及可变重(VH)和可变轻(VL)链。这种抗体和同源抗体来源于健康老年人供体的记忆B细胞库；参见在WO 2015/092077 A1中的实施例的描述。抗体结合特性的表征表明，它对亚纳摩尔级范围内的错误折叠的TTR具有高结合亲和力，对TTR的淀粉样构象具有高度选择性，并且与wtTTR和vTTR具有相似的结合。由于这种人源性的抗体对错误折叠的TTR是选择性的，并且如实施例所示，可以触发心脏淀粉样的去除，因此它代表了本发明的联合疗法的最有利的治疗候选者。
然而，WO 2015/092077 A1进一步公开了的人源性抗体，这些抗体可以被证明与NI-301.37F1相同的人TTR表位结合，即抗体NI-301.28B3和NI-301.12D3，其中包括CDR的指示的VH和VL链氨基酸序列，记载在WO2015/092077Al的图1E中(NI-301.28B3)和图1L中(NI-301.12D3)。因此，用于本发明的联合疗法的抗TTR抗体通常可以通过结合包括或由氨基酸序列TTR41-45(WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：51)组成的人TTR表位来表征。因此，为了得到这种抗体，没有必要求助于在WO 2015/092077 A1中公开的手段和方法来重新获得这种抗体，但可以进行一个或多个氨基酸置换，使同样方式的抗体的结合特性不受影响。此外，也可以使用WO2015/092077A1中公开的任何其他人源性抗体。
其他类可能适用于本发明的联合疗法的抗TTR抗体描述在Prothena BiosciencesLimited(Prothena)的国际申请中。特别地，Prothena报道了一种研究性单克隆抗体，该抗体设计为特异性靶向和清除在ATTR中发现的错误折叠(有毒)形式的TTR淀粉样蛋白，其中所述抗体被指定为PRX004并且目前正在ATTR患者中进行1期研究(临床试验政府标识号(Clinical Trials.gov Identifier)：NCT03336580)。根据Karmanos Cancer Institute,Detroit的Jeffrey Zonder在2018年的演讲，抗体PRX004对应于并且是在Higaki etal.,Amyloid 23(2016)86-97中描述的抗体14G8的人源化版本，并且其被公开在WO 2016/120810 A1和WO 2018/007922 A2中，以及更具体地在WO 2019/108689 A1中。因此，除了别的以外，抗体PRX004将是用于本发明的联合疗法的其他优选的抗TTR抗体，其识别与PRX004相同的表位，即氨基酸TTR89-97或包含氨基酸TTR101-109的表位，并且其是WO 2016/120810A1、WO 2018/007924 A2、WO 2018/007924 A2和WO 2018/007923 A1中公开的原始克隆的小鼠单克隆抗体14G8、9D5、5A1、6C1的人源化版本。
其他合适的抗体是抗体18C5的人源化版本或与单克隆抗体18C5竞争结合人TTR的分离的单克隆抗体，优选以与单克隆抗体18C5相同的表位结合在人TTR上，其中18C5是小鼠抗体，其特征在于具有包括SEQ ID NO：81的氨基酸序列的成熟重链可变区和具有包含SEQID NO：87的氨基酸序列的成熟轻链可变区，如在WO 2019/071205 A1中的公开。
还有其他类可能适合于本发明联合疗法的人源化抗TTR抗体分别记载在TheChemo-Sero-Therapeutic Research Institute和KM Biologics Co.,Ltd.的国际申请中，其识别包括在WO 2015/115332中的抗体371M和313M以及在WO 2015/115331 A1中描述的抗体所公开的氨基酸TTR78-89或TR118-122的表位(本文指定其为XY以便于参考)。
由于在优选的实施方式中存在两种形式的ATTR，即wtATTR和vATTR，其分别由wtTTR和vTTR的病理聚集引起，因此抗体结合淀粉样原性wtTTR以及淀粉样原性vTTR。TTR基因中多于120个突变影响患有vATTR的所有年龄段的人员，但最常见的突变是Val30Met和Val122Ile置换。
Val30Met置换在葡萄牙、瑞典和日本的某些地区流行，是导致ATTR多神经病(以前称为家族性淀粉样多神经病)的最常见突变。此外，由于Val122Ile突变而观察到TTR毒性，该突变在非洲裔美国人和西非人群中被发现的频率很高(3-5％)。这种突变与ATTR心肌病相关，以前称为家族性淀粉样心肌病，是一种在心肌中大量积累TTR导致心脏无力并最终导致心力衰竭的病症(Ruberg et al.,Circulation.126(2012),1286-1300)。
因此，在优选的实施方式中，抗TTR抗体结合不包括氨基酸Val122和/或Val30的TTR表位，或者抗TTR抗体结合包括氨基酸Val122和/或Val30的表位，但是Met和Ile的氨基酸置换各自并不影响抗体的结合。替代地，抗体结合具有不同突变的vTTR，但特别地结合具有Val122Ile和/或Val30Met突变的vTTR。
此外，在10-15％的65岁以上的个体中发现了由于wtATTR引起的心脏TTR沉积。因此，在进一步的实施方式中，抗TTR抗体结合聚集的wtTTR。优选地，抗TTR抗体结合wtTTR和vTTR，优选以相同的程度。
如上所述，实施例中所示的实验已经用WO 2015/092077 A1中公开的抗体NI-301.37F1进行，并且该抗体结合包含WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：51中所示的氨基酸序列TTR41-45的TTR表位。因此，谨慎地预期结合包含所述氨基酸序列的表位的其他抗体也是本发明药物产品的合适组分，例如，在WO 2015/092077 A1中也公开的抗体NI-301.28B3和NI-301.12D3。
因此，在本发明的特别优选的实施方式中，抗TTR抗体来源于人抗体NI-301.37F1、NI-301.28B3或NI-301.12D3，其特征在于，在其可变区即结合结构域中包括具有在WO2015/092077 A1的图1C[NI-301.37F1]、1E[NI-301.28B3]或1L[NI-301.12D3]中描述的氨基酸序列的可变重(VH)和可变轻(VL)链的互补性决定区(CDR)，或者其中CDR的一个或多个在它们的氨基酸序列上可能与在WO 2015/092077 A1的图1C、1E或1L中所示的那些不同，在CDR2和CDR3的情况下，一个、两个、三个或甚至更多个氨基酸不同，并且其中抗体表现出与在WO 2015/092077 A1的实施例中所示的抗TTR抗体NI-301.37F1、NI-301.28B3或NI-301.12D3基本相同或相同的特征。CDR的位置如图1C、1E或1L所示，并在WO 2015/092077 A1的图1的图例说明中进行了解释。相应的核苷酸序列示出为，在WO 2015/092077 A1中，NI-301.37F1在第70页的表II、NI-301.28B3在第70至71页和NI-301.12D3在第73页。此外或替代地，框架区或完整的VH和/或VL链与WO 2015/092077 A1的图1C或1M[NI-301.37F1]、1E[NI-301.28B3]或1L[NI-301.12D3]中描述的框架区80％相同，优选与在WO 2015/092077A1的图1C或1M、1E或1L中分别描述的框架区以及VH和/或VL链85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。此外，抗体NI-301.37F1、NI-301.28B3和NI-301.12D3的克隆和表达已经如在WO 2015/092077 A1的第110至112页的实施例1和2中所述进行，这些方法通过援引并入本文。
因此，在一种实施方式中，抗TTR抗体的特征在于VH和VL链的CDR以及在于整个VH和VL链，分别在WO 2015/092077 A1的图1C和1M中描述。因此，抗体优选包括
(i)包括以下VH互补决定区(CDR)1、2和3的可变重(VH)链，和/或包括以下VLCDR1、2和3的可变轻(VL)链：
(a)VH-CDR1：WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：10的位置31-35或其变体，其中该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(b)VH-CDR2：WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：10的位置52-67或其变体，其中该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(c)VH-CDR3：WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：10的位置100-109或其变体，其中该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(d)VL-CDR1：WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：12的位置24-34或其变体，其中该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(e)VL-CDR2：WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：12的位置50-56或其变体，其中该变体包括一个或两个氨基酸置换，以及
(f)VL-CDR3：WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：12的位置89-97或其变体，其中该变体包括一个或两个氨基酸置换；和/或
(ii)VH链和/或VL链，其中
(a)VH链包括在SEQ ID NO：10或53中描述的氨基酸序列，或其变体，其中该变体包括一个或多个氨基酸置换；和
(b)VL链包括在SEQ ID NO：12中描述的氨基酸序列，或其变体，其中该变体包括一个或多个氨基酸置换；
优选地，其中VH和VL链氨基酸序列分别与SEQ ID NO：10或53和12至少90％相同。
该优选实施方式，即在实施例中使用抗体NI-301.37F1及其等效物与权利要求4所示的实施方式相对应，其中参照本序列表中描述的氨基酸序列。
在一种实施方式中，抗TTR抗体的特征在于VH和/或VL链的CDR以及在于整个VH和VL链，分别在WO 2015/092077 A1的图1E中描述。因此，抗体优选包括
(i)包括以下VH互补决定区(CDR)1、2和3的可变重(VH)链，和/或包括以下VLCDR1、2和3的可变轻(VL)链：
(a)VH-CDR1：WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：18的位置31-37或其变体，其中该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(b)VH-CDR2：WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：18的位置52-67或其变体，其中该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(c)VH-CDR3：WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：18的位置100-116或其变体，其中该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(d)VL-CDR1：WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：20的位置24-34或其变体，其中该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(e)VL-CDR2：WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：20的位置50-56或其变体，其中该变体包括一个或两个氨基酸置换，以及
(f)VL-CDR3：WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：20的位置89-98或其变体，其中该变体包括一个或两个氨基酸置换；和/或
(ii)VH链和/或VL链，其中
(a)VH链包括在SEQ ID NO：18中描述的氨基酸序列，或其变体，其中该变体包括一个或多个氨基酸置换；和
(b)VL链包括在SEQ ID NO：20中描述的氨基酸序列，或其变体，其中该变体包括一个或多个氨基酸置换；
优选地，其中VH和VL链氨基酸序列分别与SEQ ID NO：18和20至少90％相同。
在一种实施方式中，抗TTR抗体的特征在于VH和/或VL链的CDR以及在于整个VH和VL链，分别在WO 2015/092077 A1的图1E中描述。因此，抗体优选包括
(i)包括以下VH互补决定区(CDR)1、2和3的可变重(VH)链，和/或包括以下VLCDR1、2和3的可变轻(VL)链：
(a)VH-CDR1：WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：46的位置31-35或其变体，其中该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(b)VH-CDR2：WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：46的位置50-66或其变体，其中该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(c)VH-CDR3：WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：46的位置99-108或其变体，其中该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(d)VL-CDR1：WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：48的位置23-36或其变体，其中该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(e)VL-CDR2：WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：48的位置52-58或其变体，其中该变体包括一个或两个氨基酸置换，以及
(f)VL-CDR3：WO 2015/092077 A1的SEQ ID NO：48的位置91-100或其变体，其中该变体包括一个或两个氨基酸置换；和/或
(ii)VH链和/或VL链，其中
(a)VH链包括在SEQ ID NO：46中描述的氨基酸序列，或其变体，其中该变体包括一个或多个氨基酸置换；和
(b)VL链包括在SEQ ID NO：48中描述的氨基酸序列，或其变体，其中该变体包括一个或多个氨基酸置换；
优选地，其中VH和VL链氨基酸序列分别与SEQ ID NO：46和48至少90％相同。
然而，优选抗体NI-301.37F1在本发明的联合疗法中用作一种组分。
如前所述，抗TTR抗体包括具有活性Fc结构域的人恒定结构域，并且具有IgG形式，即，是完全的IgG抗体，优选IgG1抗体或同种型。具有人恒定结构域的完整人IgG1抗体的重组表达可以基本上按照，例如，在Harlow and Lane"Antibodies,A Laboratory Manual",CSH Press,Cold Spring Harbor(1988)First edition；Second edition by EdwardA.Greenfield,Dana-Farber Cancer Institute
Figure BDA0003938612130000141
2014,ISBN 978-1-936113-81-1和WO2012/080518Al的实施例中的描述进行。
如上所述，ATTR可以是wtATTR或vATTR，并且因此，两种变体的治疗方法是优选的。由于如上所述，抗TTR抗体结合聚集的wtTTR和vTTR两者，因此本发明的联合疗法中的第二组分优选将两种形式的TTR稳定为生理功能的四聚体。
目前市场上可用于治疗ATTR的大多数药物已被批准用于vATTR-多神经病，例如伊诺特生和帕替西兰，但只有他法米迪和二氟尼柳已显示对vATTR和wtATTR的治疗有效；参见Müller et al.(2020)，上文，其中他法米迪已被欧洲药品管理局(EMA)和美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗ATTR-多神经病和ATTR-心肌病。此外，AG10是一种新型的、有效的和选择性的口服TTR四聚体稳定剂，正在被开发用于治疗wtATTR和vATTR；参见Fox etal.,Clinical Pharmacology in Drug Development 9(2020),115-129。因此，只有TTR四聚体稳定剂在临床上被批准用于治疗vATTR和wtATTR，并且在AG10的情况下其各自批准具有很高的效力。
因此，在一种实施方式中，本发明的联合疗法进一步包括一种或两种TTR四聚体稳定剂，优选一种TTR四聚体稳定剂，其能够稳定wtTTR四聚体和vTTR四聚体。
如上所述，TTR四聚体稳定剂在淀粉样原性发生过程中阻断四聚体解离，为限速步骤并减少淀粉样的从头沉积。1996年首次表明，配体与在TTR上的甲状腺素或视黄醇结合蛋白的两个结合位点的任何一个的结合稳定了它的四聚体结构并且可靠地防止TTR解离。因此，本发明的联合疗法包括TTR四聚体稳定剂，该稳定剂与TTR四聚体的甲状腺素或视黄醇结合蛋白的两个结合位点的任一个结合。
在优选的实施方式中，TTR四聚体稳定剂是他法米迪(Cas登记号：594839-88-0)。他法米迪是1,3-苯并噁唑类的成员，即1,3-苯并噁唑唑-6-羧酸，其中位置2处的氢被3,5-二氯苯基基团取代。他法米迪在结构上与二氟尼柳相似，但不是NSAID，这与二氟尼柳形成对比。
在其他的实施方式中，本发明的联合疗法包括靠近抗TTR抗体的TTR四聚体稳定剂AG10。AG10是一种3-(3-(3,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)丙氧基)-4-氟苯甲酸(Cas登记号：1446711-81-4)，并且例如在美国专利9,169,214B2中公开，其中它被指定为化合物VIIc。AG10是一种有效的、高选择性的小分子TTR四聚体稳定剂。它通过简单的合成路线制造，并且它的药学特性包括良好的口服生物利用度、高结合选择性和稳定TTR的能力。AG10设计为模拟保护性TTR突变T119M的结构影响。与其他已知的稳定剂相比，AG10的独特之处在于它的与在位置117处的相同丝氨酸残基形成稳定T119M变体的氢键的能力。已经进行了第一次临床试验，并显示AG10有可能成为患有vATTR或wtATTR的患者的安全和有效的治疗(Fox etal.,Clinical Pharmacology in Drug Development 9(2020),115-129)。特别地，II期临床试验显示其对ATTR-心肌病患者的治疗效力(Judge et al.,J Am Coll Cardiol 74(2019),285-295)。然而，谨慎地预期它也适用于具有ATTR-多神经病患者。
在其他的实施方式中，本发明的联合疗法包括靠近抗TTR抗体的TTR四聚体稳定剂二氟尼柳。二氟尼柳是非甾体抗炎药(NSAID)以及在Müller et al.,European Journal ofHeart Failure 22(2020),pages 39-53中进行了描述。
抗TTR抗体作为本发明的联合疗法的一部分，可以根据本领域公知的方法配制；参见例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy(2000)by the Universityof Sciences in Philadelphia,ISBN 0-683-306472。合适的药物载体的实例是本领域公知的，以及包括磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液，诸如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包含这种载体的组合物可以通过公知的常规方法配制。这些药物组合物可以以合适的剂量向受试者给药。合适的组合物的给药可以通过不同的方式起作用，例如，通过静脉内、腹腔内、皮下、肌内、鼻内、局部或真皮内给药或脊髓或脑递送。气溶胶制剂诸如鼻喷雾制剂包括具有防腐剂和等渗剂的活性剂的纯化的水性溶液或其他溶液。这样的制剂优选调节至与鼻黏膜相容的pH和等渗状态。用于直肠或阴道给药的制剂可以作为具有合适载体的栓剂呈现。在优选的实施方式中，将抗TTR抗体配制成液体制剂，并且设计为静脉内(i.v.)或皮下(s.c)给药。
剂量方案将由主治医师和临床因素决定。正如在医学领域中众所周知的那样，任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者的大小、体表面积、年龄、要给药的特定化合物、性别、给药时间和途径、一般健康状况以及并行给药的其他药物。一般来说，剂量的范围可以是宿主体重的例如约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内、优选至少1mg/kg。上述范围内的中间剂量也旨在本发明的范围内。可以向受试者每日、隔日、每周或根据经验分析确定的任何其他计划给药这种剂量。示例性的治疗需要在很长一段时间，例如，至少六个月内以多剂量给药。其他示例性治疗方案需要每两周或每月一次或每3至6个月一次给药。示例性剂量计划包括连续几天1-10mg/kg或15mg/kg，隔天30mg/kg或每周60mg/kg。可以通过定期评估来监测进展。
根据本发明使用的抗TTR抗体是否是治疗有效量，可以通过使用WO2020/094883A1的实施例4中描述的PDAX动物模型来确定。优选地，抗TTR抗体在以至少0.5mg/kg的剂量，优选在5或50mg/kg或介于两者之间的任何剂量给药时是有效的。更优选地，抗体以约3、10、30或60mg/kg的剂量或介于两者之间的任何剂量每两至四周给药。
关于TTR四聚体稳定剂，优选他法米迪、二氟尼柳和/或AG10用于本发明的联合疗法。目前，有两种制剂，即他法米迪葡甲胺和他法米迪是可用的，它们都具有相同的活性部分，即他法米迪。TTR四聚体稳定剂优选以临床活性浓度给药。
他法米迪葡甲胺以每日一次80mg的剂量(4×20mg胶囊)给药，在美国、日本、加拿大和巴西被批准用于治疗成人wtATTR-心肌病和vATTR-心肌病。为方便患者，开发并引入了替代的单一固体口服剂型制剂(他法米迪61mg游离酸胶囊)(在美国、阿拉伯联合酋长国和欧盟获得批准)；参见Lockwood et al.,Clin.Pharmacol.Drug Dev.,2020Mar 20.doi:10.1002/cpdd.789以及FDA提供的有关
Figure BDA0003938612130000171
(他法米迪葡甲胺)和VYNDAMAXTM(他法米迪)的产品信息。此外，以每日一次20mg的剂量(相当于12.2mg他法米迪)给药的他法米迪葡甲胺在全世界40多个国家被批准用于治疗患有早期症状性wtATTR-多神经病和vATTR-多神经病的成人；参见Lockwood et al.2002和EMA关于
Figure BDA0003938612130000172
的产品信息。
因此，在一种实施方式中，他法米迪被设计成作为他法米迪葡甲胺以每日一次20mg的剂量给药或作为他法米迪以每日一次12.2mg的剂量给药，优选其中该剂量向具有症状性wtATTR-多神经病和vATTR-多神经病的患者给药。
在一种实施方式中，他法米迪被设计成作为他法米迪葡甲胺以每日一次80mg的剂量给药或作为他法米迪以每日一次61mg的剂量给药，优选其中该剂量向具有症状性wtATTR-心肌病和vATTR-心肌病的患者给药。
在本发明的其他实施方式中，他法米迪或他法米迪葡甲胺被设计成以1、5、15或30mg/kg/天的剂量或介于两者之间的任何剂量给药。
在本发明的其他实施方式中，二氟尼柳以高达250mg的剂量每日一次或两次给药。
AG10尚未得到监管机构的批准，但首次临床试验表明，AG10在以50、150、300、400或800mg的单剂量给药时已经有效。优选地，使用300mg或800mg的单剂量；参见Fox etal.2020和Judge et al.2019)。在本发明的一种实施方式中，AG10以50、150、300、400或800mg的剂量给药，优选400mg或800mg，优选每日两次。当然，这些量之间的剂量也包括在本发明中。
在本发明的联合疗法的一种实施方式中，抗TTR抗体和TTR四聚体稳定剂在药物产品中提供，其中它们通常存在于单独的容器中。如上所述，抗TTR抗体优选设计为用于静脉内给药的液体制剂。因此，在抗TTR抗体的情况下，容器优选为预填充注射器、注射笔、安瓿、瓶子、自动注射器或输液袋。在其他优选实施方式中，所述容器为输液瓶或输液袋。
相反，TTR四聚体稳定剂优选配制用于口服给药，并且优选如上所述存在于片剂或胶囊中。
因此，在本发明的其他方面涉及包括抗TTR抗体和TTR四聚体稳定剂的药物产品，如前文所提及的优选的限定，特别是其中抗体能够由于活性Fc结构域而促进淀粉样原性TTR的去除并且能够诱导抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)并且稳定剂基本上没有抗炎特性。
在本发明的一种实施方式中，本发明的药物产品的单独组分，即至少抗TTR抗体和TTR四聚体稳定剂都存在于一种组合物中，其中制剂和剂量方案必须适应于这两种组分均保持稳定并且具有药学活性。该实施方式可用于临床情况如心搏骤停，其中，作为急救可以考虑同时给药两种药物。
本发明还提供药物包或试剂盒，其包括装有上述至少两种成分即抗TTR抗体和TTR四聚体稳定剂的一个或多个容器。伴随此类一个或多个容器的可以是由政府机构管理药物或生物制品的制造、使用或销售的规定形式的备注，该备注反映了制造、使用或销售机构对用于人的给药的批准。本发明的药物产品，优选试剂盒的形式当然特别适合于治疗伴随突变、错误折叠、错误组装和/或聚集的TTR的存在的疾病或疾患，并且特别适用于治疗通常以ATTR为特征的疾患，其将在下文进一步概述。替代地，本发明的药物产品、药物包或试剂盒可以缺少两种组分中的其中之一，但是仅包括抗TTR抗体和TTR四聚体稳定剂，而不是本发明的联合疗法中在药物产品、药物包或试剂盒中使用的详细说明的另一个组分。
在一种实施方式中，本发明的联合疗法或药物产品可以不仅包含一种TTR四聚体稳定剂，而且可以包含一种以上，例如两种TTR四聚体稳定剂。在一种实施方式中，所述药物产品包括他法米迪和AG10。
本发明的药物产品可以用于治疗受试者的ATTR的方法，即联合疗法。因此，本发明提供了联合疗法，其包括向有此需要的受试者给药治疗有效量的本发明药物产品。
在一种实施方式中，在给药本发明的抗TTR抗体和TTR四聚体稳定剂和药物产品之前，分别确定淀粉样原性TTR的存在和水平。在一种优选的实施方式中，可以使用任何合适的抗TTR抗体，其优先结合聚集的TTR而不是生理性TTR。例如，在WO 2015/092077 A1中公开的抗体可用于诊断，优选抗体NI-301.37F1、NI-301.28B3或NI-301.12D3，最优选NI-301.37F1。此外，可以使用上述的抗体，即14G8、18C5、9D5、5A1、6C1、XY、371M或313M。优选在来自待治疗受试者的样品(体液)中测定淀粉样原性TTR量。
如上所述，在一种实施方式中，药物产品存在于单个药物组合物中。因此，在本发明的一种实施方式中，两种组分，即抗TTR抗体和TTR四聚体稳定剂同时给药。这对于抗TTR抗体与AG10的联合特别相关，因为这两种组分优选为单剂量给药。
优选地，所述药物产品以部件试剂盒的形式存在于单独的容器中。因此，在本发明的联合疗法的一种实施方式中，治疗ATTR的方法包括或者向受试者给药治疗有效量的抗TTR抗体，以及并行或随后向受试者给药治疗有效量的TTR四聚体稳定剂，或者向受试者给药治疗有效量的TTR四聚体稳定剂，以及并行或随后向受试者给药治疗有效量的抗TTR抗体。优选地，只要第一种药物仍存在于人体内，例如以显著浓度存在血浆中，例如考虑药物的半衰期，就可以进行共存或随后的治疗。
如在实施例2中所示，上述限定的抗TTR抗体诱导体内TTR原纤维的清除。因此，患有ATTR并且已经接受具有一种或多种TTR四聚体稳定剂的治疗以防止生成更多易聚集的TTR单体的患者，可以进一步用抗TTR抗体治疗。这具有有益的效果，除了防止TTR单体的生成外，已经存在的TTR原纤维将被清除。如上所述，TTR四聚体稳定剂在治疗早期疾病方面最有效，因为这些药物并不去除已经存在的TTR原纤维，而是仅仅防止易聚集的TTR单体的生成。例如，他法米迪被EMA批准用于治疗1期ATTR-多神经病。因此，当已经用TTR四聚体稳定剂治疗的患者进一步用抗TTR抗体治疗时，谨慎地预期这在治疗患有后期ATTR的患者时甚至是有效的。反之亦然，患有ATTR并且已经接受用抗TTR抗体治疗的患者，该抗体诱导TTR原纤维的清除，可以进一步用上述特征的TTR四聚体稳定剂进行治疗，以防止倾向于聚集的新的TTR单体生成。
因此，在本发明的一种实施方式中，抗TTR抗体用于治疗接受使用TTR四聚体稳定剂治疗的受试者的ATTR的方法。在另一种实施方式中，TTR四聚体稳定剂用于治疗接受使用抗TTR抗体治疗的受试者的ATTR的方法。换言之，本发明涉及通过抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)诱导或促进ATTR原纤维清除来治疗ATTR的方法，包括向有此需要的受试者即患者给药抗TTR抗体和TTR四聚体稳定剂。在一种实施方式中，抗TTR抗体是本文上面限定的抗体和/或TTR四聚体稳定剂是本文上面限定的稳定剂。抗体和稳定剂可以同时、顺序或随后给药。
在此上下文中，术语“接受治疗的受试者”用TTR稳定剂或抗TTR抗体包括共存治疗以及顺序治疗，只要第一种药物仍然以显著浓度存在存在于人体内例如血浆，例如考虑药物的半衰期。例如，由于他法米迪的平均半衰期约为49小时，因此在最后一剂他法米迪后48小时给药抗TTR抗体将被视为本发明的实施方式。另一方面，如果受试者在第一药物例如他法米迪降解或分泌并且在体内不再存在有效的或可检测量的第一药物之后用第二药物例如抗TTR抗体治疗，则这种治疗可能不是本发明的实施方式。
在优选的实施方式中，抗TTR抗体通过静脉内输注给药并且TTR四聚体稳定剂口服给药。
如上所述，该联合疗法适用于wtATTR和vATTR的治疗，因为TTR四聚体稳定剂和抗TTR抗体两者分别结合wtTTR和vTTR以及相应的聚集形式的TTR。在此上下文中，应该提到的是，vATTR以前被称为遗传性/突变性ATTR。ATTR是常染色体显性疾患，并且与各种疾病或病症相关，这些疾病或病症选自由以下组成的组：ATTR-心肌病，家族性淀粉样多神经病(FAP)(也称为TTR-多神经病)，老年系统性淀粉样变性(SSA)，系统性家族淀粉样变性，包括阿尔茨海默病的软脑膜/中枢神经系统(CNS)淀粉样变性，TTR相关性眼部淀粉样变性，TTR相关性肾淀粉样变性，TTR相关性高甲状腺素血症，包括腕管综合征的TTR相关性韧带淀粉样变性、肩袖撕裂和腰椎管狭窄症以及先兆子痫。
因此，在本发明的一种实施方式中，本发明的药物产品和联合疗法，以及向已经接受治疗的患者给药抗TTR抗体和TTR四聚体稳定剂，分别用于治疗上述疾病中的任何一种。
在优选实施方式中，所述疾病是ATTR-心肌病。ATTR-心肌病是一种与年龄相关的心脏疾病，其特征在于心肌内沉积错误折叠和聚集的TTR。心脏中的致病淀粉样沉积可能由wtTTR或vTTR组成，后者与TTR基因中的许多突变相关。淀粉样的积累导致心室壁厚度增加，并严重影响心脏功能和生存。该疾病主要表现在年龄≥60岁的男性中，可以使用超声心动图、闪烁显像和活检进行诊断。尽管事实上诊断工具广泛可用，但该疾病的患病率目前尚不清楚。据估计，当今只有1％或更少的患者被诊断出来。
ATTR有不同的疾病阶段，即早期、晚期或迟发性疾病。谨慎地预期，本发明的药物产品，即联合疗法可用于治疗早期疾病状态下患有ATTR的患者以及晚期或后期患有ATTR的患者。特别地，如上所述，抗TTR抗体有效地从患病组织中去除TTR原纤维，并且因此，即使在疾病后期，也可以预期患病组织和相应的器官，其在ATTR-心肌病的情况下是心脏，在用抗TTR抗体治疗后恢复。同时，TTR四聚体稳定剂防止新的聚集TTR物的形成，因此极有可能对患者的健康产生有益影响。
当然，任何抵抗错误折叠的TTR的抗TTR抗体，其能够促进淀粉样原性TTR的去除并且任何TTR四聚体稳定剂都可以组合到本发明的药物产品中，但以下组合是优选的：
·抗体NI-301.37F1与他法米迪
·抗体NI-301.28B3与他法米迪
·抗体NI-301.12D3与他法米迪
·抗体14G8与他法米迪
·抗体18C5与他法米迪
·抗体9D5与他法米迪
·抗体5A1与他法米迪
·抗体6C1与他法米迪
·抗体XY与他法米迪
·抗体371M与他法米迪
·抗体313M与他法米迪
·抗体NI-301.37F1与AG10
·抗体NI-301.28B3与AG10
·抗体NI-301.12D3与AG10
·抗体14G8与AG10
·抗体18C5与AG10
·抗体9D5与AG10
·抗体5A1与AG10
·抗体6C1与AG10
·抗体XY与AG10
·抗体371M与AG10
·抗体313M与AG10
·抗体NI-301.37F1与二氟尼柳
·抗体NI-301.37F1与二氟尼柳
·抗体NI-301.28B3与二氟尼柳
·抗体NI-301.12D3与二氟尼柳
·抗体14G8与二氟尼柳
·抗体18C5与二氟尼柳
·抗体9D5与二氟尼柳
·抗体5A1与二氟尼柳
·抗体6C1与二氟尼柳
·抗体XY与二氟尼柳
·抗体371M与二氟尼柳
·抗体313M与二氟尼柳
·抗体NI-301.37F1与他法米迪和AG10
·抗体NI-301.28B3与他法米迪和AG10
·抗体NI-301.12D3与他法米迪和AG10
·抗体14G8与他法米迪和AG10
·抗体18C5与他法米迪和AG10
·抗体9D5与他法米迪和AG10
·抗体5A1与他法米迪和AG10
·抗体6C1与他法米迪和AG10
·抗体XY与他法米迪和AG10
·抗体371M与他法米迪和AG10
·抗体313M与他法米迪和AG10
本发明的特别优选的实施方式是抗体NI-301.37F1与他法米迪的组合。
当然，尽管每种组合一般都可以用于ATTR的治疗，但每种组合都可以用于ATTR-心肌病和/或ATTR-多神经病的治疗：
·抗体NI-301.37F1与他法米迪用于治疗ATTR-心肌病
·抗体NI-301.37F1与他法米迪用于治疗ATTR-多神经病
·抗体NI-301.28B3与他法米迪用于治疗ATTR-心肌病
·抗体NI-301.28B3与他法米迪用于治疗ATT-R多神经病
·抗体NI-301.12D3与他法米迪用于治疗ATTR-心肌病
·抗体NI-301.12D3与他法米迪用于治疗ATTR-多神经病
·抗体14G8与他法米迪用于治疗ATTR-心肌病
·抗体14G8与他法米迪用于治疗ATTR-多神经病
·抗体18C5与他法米迪用于治疗ATTR-心肌病
·抗体18C5与他法米迪用于治疗ATTR-多神经病
·抗体9D5与他法米迪用于治疗ATTR-心肌病
·抗体9D5与他法米迪用于治疗ATTR-多神经病
·抗体5A1与他法米迪用于治疗ATTR-心肌病
·抗体5A1与他法米迪用于治疗ATTR-多神经病
·抗体6C1与他法米迪用于治疗ATTR-心肌病
·抗体6C1与他法米迪用于治疗ATTR-多神经病
·抗体XY与他法米迪用于治疗ATTR-心肌病
·抗体XY与他法米迪用于治疗ATTR-多神经病
·抗体371M与他法米迪用于治疗ATTR-心肌病
·抗体371M与他法米迪用于治疗ATTR-多神经病
·抗体313M与他法米迪用于治疗ATTR-心肌病
·抗体313M与他法米迪用于治疗ATTR-多神经病
·抗体NI-301.37F1与AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体NI-301.37F1与AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体NI-301.28B3与AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体NI-301.28B3与AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体NI-301.12D3与AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体NI-301.12D3与AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体14G8与AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体14G8与AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体18C5与AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体18C5与AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体9D5与AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体9D5与AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体5A1与AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体5A1与AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体6C1与AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体6C1与AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体XY与AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体XY与AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体371M与AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体371M与AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体313M与AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体313M与AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体NI-301.37F1与二氟尼柳用于治疗ATTR-心肌病
·抗体NI-301.37F1与二氟尼柳用于治疗ATTR-多神经病
·抗体NI-301.28B3与二氟尼柳用于治疗ATTR-心肌病
·抗体NI-301.28B3与二氟尼柳用于治疗ATTR-多神经病
·抗体NI-301.12D3与二氟尼柳用于治疗ATTR-心肌病
·抗体NI-301.12D3与二氟尼柳用于治疗ATTR-多神经病
·抗体14G8与二氟尼柳用于治疗ATTR-心肌病
·抗体14G8与二氟尼柳用于治疗ATTR-多神经病
·抗体18C5与二氟尼柳用于治疗ATTR-心肌病
·抗体18C5与二氟尼柳用于治疗ATTR-多神经病
·抗体9D5与二氟尼柳用于治疗ATTR-心肌病
·抗体9D5与二氟尼柳用于治疗ATTR-多神经病
·抗体5A1与二氟尼柳用于治疗ATTR-心肌病
·抗体5A1与二氟尼柳用于治疗ATTR-多神经病
·抗体6C1与二氟尼柳用于治疗ATTR-心肌病
·抗体6C1与二氟尼柳用于治疗ATTR-多神经病
·抗体XY与二氟尼柳用于治疗ATTR-心肌病
·抗体XY与二氟尼柳用于治疗ATTR-多神经病
·抗体371M与二氟尼柳用于治疗ATTR-心肌病
·抗体371M与二氟尼柳用于治疗ATTR-多神经病
·抗体313M与二氟尼柳用于治疗ATTR-心肌病
·抗体313M与二氟尼柳用于治疗ATTR-多神经病
·抗体NI-301.37F1与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体NI-301.37F1与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体NI-301.28B3与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体NI-301.28B3与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体NI-301.12D3与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体NI-301.12D3与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体14G8与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体14G8与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体18C5与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体18C5与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体9D5与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体9D5与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体5A1与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体5A1与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体6C1与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体6C1与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体XY与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体XY与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体371M与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体371M与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-多神经病
·抗体313M与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-心肌病
·抗体313M与他法米迪和AG10用于治疗ATTR-多神经病
本发明的特别优选的实施方式是抗体NI-301.37F1与他法米迪的组合用于治疗ATTR-心肌病中的用途。
当然，当提到上述抗体时，它们的完全人或人源化版本分别意味着包括相应的人、人源化和类人抗体，这些抗体与所述参考抗体竞争结合人错误折叠/聚集的TTR。
本说明书全文中引用了若干文献。特此明确援引加入所有引用的参考文献(包括文献参考、已出版的专利、本申请全文中引用的已公布专利申请包括背景部分、和制造商的说明书和说明等)的内容；然而，不承认所引用的任何文献是关于本发明的现有技术。
通过参考本文以下的具体实施例可以获得更完整的理解，其在本文提供仅用于说明目的，并不旨于限制本发明的范围。
实施例
材料和方法
TTR蛋白聚集体
通过从人血浆中纯化获得的人野生型TTR蛋白，以及通过重组表达获得的野生型和突变TTR蛋白用于天然和错误折叠聚集构象以鉴定TTR靶向抗体。错误折叠的聚集构象是在酸性条件下在体外产生的，使用类似于Colon W.et al,Biochemistry,31(1992),8654-8660中描述的程序，略有修改。在PBS缓冲液中以2mg/mL浓度的溶液形式提供血浆纯化的wtTTR。
抗TTR抗体
基于在国际申请WO 2015/092077 A1中公开的人源性单克隆抗体NI-301.37F1生成小鼠的嵌合抗体ch.NI-301.37F1。将小鼠嵌合变体设计为在小鼠恒定结构域骨架中含有NI-301.37F1的人可变结构域。特别地，人源性单克隆抗体NI-301.37F1的可变重(VH)和轻(VL)链的氨基酸序列在WO 2015/092077 A1的图1中公开，其中SEQ ID NO：10和53分别对应于本序列表的VH链的SEQ ID NO：2和6，以及SEQ ID NO:12对应于本序列表的VL链的SEQ IDNO：4，而小鼠重链恒定结构域对应于Uniprot条目P01863，以及小鼠轻链恒定结构域对应于Uniprot条目P01837。简而言之，基因合成用于产生包含编码NI-301.37F1的人可变重链的序列随后编码小鼠IgG2a恒定重链的序列(参见序列mur.37F1 H)的合成重链基因，以及产生包含编码NI-301.37F1的人可变链的序列随后编码小鼠恒定κ轻链的序列(参见mur.37F1L)的合成轻链基因。然后将这2个基因亚克隆到合适的表达载体中，将其用于CHO细胞的转染。使用在WO 2015/092077 A1中描述的标准工艺从细胞培养基中纯化Ch.NI-301.37F1抗体，包括在蛋白A柱上层析纯化抗体。
TTR四聚体稳定剂
在pH7.4的10％ EtOH、10％ PS80和80％ PBS中以100μg/mL(325μM)制备他法米迪(Mw：308.1g/mol)。
在12.5％ EtOH、12.5％ PS80和75％ PBS中以1.875mg/mL制备二氟尼柳(Mw：250.2g/mol)。
按照以下在pH 7.4的10％ EtOH、10％ PS80和80％ PBS中以200μg/mL制备AG10(Mw：292.3g/mol)。将2mg的AG10溶解在1mL纯乙醇中，补充有1mL聚山梨醇酯80并在持续搅拌下用8mL PBS逐渐稀释。
TTR稳定剂溶液：
材料 来源 标识号
他法米迪 Biosynth-Carbosynth FD27988
二氟尼柳 Sigma D3281
AG10 Aquila Pharmatech AN16167
乙醇100％ Sigma 02870
聚山梨醇酯80 Sigma P5188
PBS pH 7.4 1x Gibco 10010-015
ATTR动物模型
如在WO 2020/094883 A1中公开的已经制备并使用患者来源的淀粉样异种移植(PDAX)小鼠。
ELISA
将96孔微孔板在37℃下用在pH7.4的PBS缓冲液中稀释至10μg/mL浓度的mis.WT-TTR聚集体包被1小时。在室温(RT)下用含有2％牛血清白蛋白(BSA)和在PBS缓冲液中0.1％吐温20的封闭缓冲液封闭非特异性结合位点1小时。将人NI-301.37F1抗体一式两份在补充有10μg/mL的他法米迪或二氟尼柳的PBS中或相应浓度的载体缓冲液中稀释至指定浓度，并在4℃下孵育过夜。使用与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人IgG抗体确定结合，然后在标准比色测定中测量HRP的活性。
EC50确定
使用GraphPad的Prism软件对数据进行分析。使用log(激动剂)对比具有可变斜率的响应模型对单个数据点进行非线性回归来估计EC50值。使用最小二乘回归方法进行数据拟合。
EC50 ELISA的试剂和设备：
说明 来源 标识号
1/2面积ELISA板 Corning 3690
磷酸盐缓冲盐水pH 7.4(PBS) Gibco 10010-015
吐温-20 Sigma P1379-500ML
牛血清白蛋白(BSA) Sigma A8022
抗人IgG HRP标记的抗体 Jackson Immunoresearch 709-036-098
TMB Pierce 34021 lot UF284180
终止液 Invitrogen SS04 lot 206369000
VarioScan Lux ThermoFischer Scientific 2016-03-00700
棱镜(Prism) GraphPad v.8
结合动力学测定
在25℃下将在PBS中的抗体NI-301.37F1以5μg/mL加载到抗人捕获传感器上5min。用可溶性WT-TTR淀粉样聚集体和四聚体WT-TTR进行结合测定。在1x动力学缓冲液中进行3min基线，测量缔合10min，并在1x动力学缓冲液中再解离10min，所有步骤在25℃下进行，并在1000rpm下振荡。还包括存在于1x动力学缓冲液中的参考样品。
在ForteBio数据分析8.2软件中分析数据，使用参考扣减和在缔合与解离之间的步间矫正。
用于结合动力学测定的试剂和设备：
说明 来源 标识号
抗人捕获(AHC)传感器 Molecular Devices 18-5060
Octet Red96 Molecular Devices OCTETRED96
动力学缓冲液10x Molecular Devices 18-1092
实施例1：在TTR四聚体稳定剂的存在下保存的NI-301.37F1的靶标结合
用于评估抗TTR抗体在TTR四聚体稳定剂存在下的结合亲和力，直接ELISA和EC50的确定已基本上在WO 2015/092077 Al的实施例3中进行。ELISA板在37℃下用淀粉样wtTTR聚集体包被1h，并在室温下用封闭缓冲液(pH 7.4的PBS、1％ BSA和0.1％聚山梨醇酯20)封闭1h。
将他法米迪和二氟尼柳溶解在载体(pH 7.4的80％ PBS、10％乙醇、10％聚山梨醇酯80)中，并用他法米迪或二氟尼柳制备最终浓度为10μg/mL或相应体积载体的抗体NI-301.37F1的稀释系列。10μg/mL的浓度比每天80mg(～6μg/mL)接受他法米迪治疗的患者的最大峰浓度高40％。将NI-301.37F1的稀释系列在4℃下在ELISA板中孵育过夜，洗涤后使用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗人IgG抗体和标准检测方法检测NI-301.37F1。使用GraphPad的Prism软件对数据进行分析。使用log(激动剂)对比具有可变斜率的响应模型对单个数据点进行非线性回归来估计EC50值。使用最小二乘回归方法进行数据拟合。
结果表明，抗体NI-301.37F1结合淀粉样原性TTR，该结合在TTR稳定剂诸如他法米迪和二氟尼柳的存在下得以维持。
已经制备患者来源的淀粉样异种移植(PDAX)小鼠模型，如在WO 2020/094883 A1中公开的。
实施例2：NI-301.37F1-TTR稳定剂药物组合在体内的活性
淀粉样原性TTR移植小鼠(PDAX小鼠模型)以10mg/kg i.v.(静脉内注射)立即接受小鼠嵌合NI-301.37F1变体(ch.NI-301.37F1)的单次给药或相应的同种型抗体作为阴性对照。将他法米迪和二氟尼柳溶解于载体(pH 7.4的80％ PBS、10％乙醇、10％聚山梨醇酯80)中。以1mg/kg每日i.p.(腹腔内注射)给药他法米迪。该剂量水平对应于最大推荐人体剂量(MRHD)的大鼠当量的33％。二氟尼柳具有对于TTR更快的消除和更低的亲和力，将其每日两次(早晚)以19mg/kg i.p给药。
在原纤维移植和抗体给药后96小时处死动物以收集皮肤组织和附着的淀粉样原性TTR原纤维移植物。对移植物进行切片，并使用六个非连续切片通过免疫组织化学(IHC)定量移植物中淀粉样原性TTR原纤维的剩余量。使用市售TTR抗体Dako A0002进行TTR IHC染色。特别地，免疫染色是根据标准程序以及如在WO 2020/094883 A1中所公开的进行的。使用自动图像分析处理对移植物内的淀粉样原性TTR的量进行定量。使用单因素ANOVA和Sidak检验分析数据，通过参考同种型+载体组进行逐组比较。
结果表明，在体内用他法米迪和二氟尼柳共同治理后，ch.NI-301.37F1原纤维去除的活性得以维持，在他法米迪的存在下效果明显，似乎甚至增强了由抗体诱导的病理性TTR原纤维的体内清除，而与二氟尼柳共同治理导致略微更低但清除率仍然显著；参见图2和实施例3。
实施例3：体内抗体介导的原纤维去除活性需要活性Fc结构域
将淀粉样原性TTR移植小鼠(PDAX小鼠模型)用ch37F1抗体以0.15、0.5、1.5和5mg/kg i.v.进行治疗，或用Fc失活变体ch37F1-LALAPG或同种型对照抗体以5mg/kg进行治疗。在保持抗体稳定性的同时，L234A、L235A和P329G氨基酸置换的组合足以几乎消除与FcgR1、2、3和4的结合以及补体C1q结合(Lo et al.,J.Biol.Chem.292(2017),3900-3908)。5天后，收集ATTR原纤维移植物，并使用IHC对ATTR原纤维剩余量定量，如实施例2中所进行的。如图3中所示，在原纤维移植和治疗给药后5天，ATTR原纤维覆盖同种型治疗的小鼠46％的移植面积、ch.NI-301.37F1治疗的小鼠的23.6％和用ch.NI-301.37F1-LALAPG治疗的小鼠的46.5％。与同种型相比较，用ch.NI-301.37F1观察到的原纤维去除活性具有统计学显著性(p<0.001，1因素ANOVA和Dunnett多重比较检验)。相反，与同种型治疗的小鼠相比，在用ch.NI-301.37F1-LALAPG治疗的小鼠中没有观察到原纤维的去除活性。这些结果表明，吞噬免疫细胞在体内去除抗体介导的原纤维需要活性Fc结构域。
实施例4：抗TTR抗体在TTR稳定剂存在下的结合动力学
4.1使用生物膜干涉(BLI)在他法米迪和二氟尼柳存在下NI-301.37F1的结合选择 性
使用BLI研究了在TTR稳定剂存在和不存在的情况下NI-301.37F1与TTR四聚体没有结合。可溶性ATTR低聚物被纳入本实验中，作为阳性对照。
结果表明，NI-301.37F1在溶液中没有结合TTR四聚体，这与先前的结果一致。此外，结果表明NI-301.37F1没有结合TTR-他法米迪复合体和TTR-二氟尼柳复合体(图4A、图4B)。
4.2使用BLI在AG10和二氟尼柳存在下NI-301.37F1结合动力学和选择性
在TTR稳定剂AG10和二氟尼柳以5μg/mL的存在下，或在相应的载体缓冲液的存在下，使用BLI评估NI-301.37F1与ATTR低聚物和TTR四聚体的结合。
结果表明，NI-301.37F1与溶液中ATTR低聚物的结合在AG10或二氟尼柳的存在或不存在的情况下几乎相同(图5A、图5B)。
结论
NI-301.37F1与ATTR淀粉样的结合，在TTR稳定剂他法米迪、二氟尼柳和AG10存在或不存在的情况下具有相似的亲和力。
同样，NI-301.37F1的结合选择性的特征在于，在TTR稳定剂存在下它与TTR四聚体维持无结合。
序列表
<110> 生物控股有限公司(Neurimmune AG)
<120> 用于TTR淀粉样变性的联合疗法
<130> PPI22172001DE
<150> EP 20174177.4
<151> 2020-05-12
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<223> NI-301.37F1可变重链(VH)序列
<220>
<221> V区
<222> (91)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V区
<222> (154)..(201)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V区
<222> (298)..(327)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 1
cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
acc ctg tcc ctc acc tgc agt gtc tct ggt ggc tcc atc atc agt agg 96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile Ile Ser Arg
20 25 30
agt tcc tac tgg ggc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag 144
Ser Ser Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
tgg att ggg ggt atc tat cat agt ggg aac act tac gac aac ccg tcc 192
Trp Ile Gly Gly Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Asp Asn Pro Ser
50 55 60
ctc aag agt cga ctc acc atg tcc gta gac acg tcg aag aac cag ttc 240
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
tcc ctg aat ctg agg tct gtg acc gcc gca gac acg gct gtg tat tac 288
Ser Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
tgt gcg agg ata gtg ccg ggg ggt gat gct ttt gat atc tgg ggc caa 336
Cys Ala Arg Ile Val Pro Gly Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
ggg aca atg gtc acc gtc tct tcg 360
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile Ile Ser Arg
20 25 30
Ser Ser Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Gly Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Asp Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Val Pro Gly Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<223> NI-301.37F1可变K-轻链(VK) 序列
<220>
<221> V区
<222> (70)..(102)
<223> 互补决定区 (CDR) VK-CDR1
<220>
<221> V区
<222> (148)..(168)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR2
<220>
<221> V区
<222> (265)..(291)
<223> 互补决定区(CDR) VK-CDR3
<400> 3
gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtc aca atc gct tgc cgg gcc agt cag agc gtt ggc acc tat 96
Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Tyr
20 25 30
tta aat tgg tat cag cag aaa aga ggg aaa gcc cct aaa ctc ctc atc 144
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Arg Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
ttt gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
gaa gac ttt gca act tac tac tgt caa cag agt tac agt tct cct cca 288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Pro
85 90 95
acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa 321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Arg Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<223> 引物诱导突变矫正后的NI-301.37F1-PIMC可变重链(VH)序列
<220>
<221> V区
<222> (91)..(105)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V区
<222> (154)..(201)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V区
<222> (298)..(327)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 5
cag ctg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
acc ctg tcc ctc acc tgc agt gtc tct ggt ggc tcc atc atc agt agg 96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile Ile Ser Arg
20 25 30
agt tcc tac tgg ggc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag 144
Ser Ser Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
tgg att ggg ggt atc tat cat agt ggg aac act tac gac aac ccg tcc 192
Trp Ile Gly Gly Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Asp Asn Pro Ser
50 55 60
ctc aag agt cga ctc acc atg tcc gta gac acg tcg aag aac cag ttc 240
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
tcc ctg aat ctg agg tct gtg acc gcc gca gac acg gct gtg tat tac 288
Ser Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
tgt gcg agg ata gtg ccg ggg ggt gat gct ttt gat atc tgg ggc caa 336
Cys Ala Arg Ile Val Pro Gly Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
ggg aca atg gtc acc gtc tct tcg 360
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile Ile Ser Arg
20 25 30
Ser Ser Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Gly Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Asp Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Val Pro Gly Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由NI-301.37F1抗体识别的表位
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(5)
<223> NI-301.37F1抗体的表位，aa 41至aa 45
<400> 7
Trp Glu Pro Phe Ala
1 5

Claims (20)

1.一种用于在治疗甲状腺素转运蛋白淀粉样变性(ATTR)的方法中的用途的联合疗法，所述联合疗法包括抗甲状腺素转运蛋白(TTR)抗体和TTR四聚体稳定剂，其中，所述抗体具有活性Fc结构域并且能够通过抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)诱导ATTR原纤维清除。
2.根据权利要求1所述用途的联合疗法，其中，所述抗体是IgG1类或同种型。
3.根据权利要求1或2中任一项所述用途的联合疗法，其中，所述抗体是人源性抗体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述用途的联合疗法，其中，所述抗体能够结合包括或由氨基酸序列WEPFA(SEQ ID NO：7)组成的TTR表位，并且其中所述抗体包括在其可变区或结合结构域中的：
(i)选自以下的VH和VL可变区的六个CDR：
VH-CDR1：SEQ ID NO：2的位置31-35
VH-CDR2：SEQ ID NO：2的位置52-67
VH-CDR3：SEQ ID NO：2的位置100-109
VL-CDR1：SEQ ID NO：4的位置24-34
VL-CDR2：SEQ ID NO：4的位置50-56
VL-CDR3：SEQ ID NO：4的位置89-97，或其中所述CDR中的一个或多个可包括一个或两个氨基酸置换；
VH-CDR1：SEQ ID NO：6的位置31-35
VH-CDR2：SEQ ID NO：6的位置52-67
VH-CDR3：SEQ ID NO：6的位置100-109
VL-CDR1：SEQ ID NO：4的位置24-34
VL-CDR2：SEQ ID NO：4的位置50-56
VL-CDR3：SEQ ID NO：4的位置89-97，或其中所述CDR中的一个或多个可包括一个或两个氨基酸置换；或
(ii)包括与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6至少90％相同的氨基酸序列的VH链和包括与SEQ ID NO：4至少90％相同的氨基酸序列的VL链区。
5.根据权利要求1至4中任一项所述用途的联合疗法，其中，所述抗体包括在其可变区或结合结构域中的SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：4的VH和VL链的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述用途的联合疗法，其中，所述稳定剂是他法米迪、二氟尼柳、AG10或其组合。
7.根据权利要求1至5中任一项所述用途的联合疗法，其中，所述稳定剂是他法米迪。
8.根据权利要求1至7中任一项所述用途的联合疗法，其中，所述抗TTR抗体设计为每2-4周以1、3、10、30或60mg/kg的剂量或介于两者之间的剂量给药并且所述TTR四聚体稳定剂为临床活性浓度。
9.根据权利要求8所述用途的联合疗法，其中，所述稳定剂是他法米迪或他法米迪葡甲胺，并设计为以1、5、15或30mg/kg/天的剂量或介于两者之间的剂量给药，任选地分别以20或80mg/天的他法米迪葡甲胺的剂量和12.2或61mg/天的他法米迪的剂量给药。
10.根据权利要求8所述用途的联合疗法，其中，所述稳定剂是AG10，并设计为以50、150、300、400或800mg的剂量或介于两者之间的剂量给药，任选地每日两次。
11.根据权利要求8所述用途的联合疗法，其中，所述稳定剂是二氟尼柳并且设计为以250mg的剂量给药，任选地每日两次。
12.根据权利要求1至11中任一项所述用途的联合疗法，其中，所述抗TTR抗体与所述稳定剂并行给药、在所述稳定剂之前或之后给药。
13.根据权利要求1至12中任一项所述用途的联合疗法，其中，所述抗体和所述稳定剂存在于药物产品中或作为部件试剂盒存在于单独的容器中。
14.根据权利要求13所述用途的联合疗法，其中，所述抗体以液体制剂的形式存在于输液瓶或袋中和/或所述稳定剂存在于用于口服给药的片剂或胶囊中。
15.一种如权利要求13或14中限定的药物产品或部件试剂盒。
16.一种如前述权利要求中任一项限定的抗TTR抗体，在用于治疗接受用如前述权利要求中任一项限定的TTR四聚体稳定剂治疗的受试者的ATTR的用途；或一种如前述权利要求中任一项限定的TTR四聚体稳定剂，在用于治疗接受如前述权利要求中任一项限定的抗TTR抗体治疗的受试者的ATTR的用途。
17.一种通过抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)诱导或促进ATTR原纤维清除来治疗ATTR的方法，包括向有此需要的患者给药抗甲状腺素转运蛋白(TTR)抗体和TTR四聚体稳定剂。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述抗TTR抗体是如前述权利要求中任一项限定的抗体和/或所述TTR四聚体稳定剂是如前述权利要求中任一项限定的稳定剂。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中，所述抗体和所述稳定剂同时、顺序或随后给药。
20.根据权利要求1至14中任一项所述用途的联合疗法，或根据权利要求16所述的用途的抗TTR抗体、TTR四聚体稳定剂，或权利要求17至19中任一项所述的方法，其中，ATTR是野生型(wtATTR)或变异型ATTR(vATTR)并且其中所述ATTR与选自由以下组成的组的疾病或病症相关：ATTR多神经病、ATTR心肌病、家族性淀粉样多神经病(FAP)、老年系统性淀粉样变性(SSA)、系统性家族性淀粉样变性、软脑膜/中枢神经系统(CNS)淀粉样变性、TTR相关性眼部淀粉样变性、TTR相关性肾淀粉样变性、TTR相关性高甲状腺素血症、包括腕管综合征的TTR相关性韧带淀粉样变性、肩袖撕裂和腰椎管狭窄症以及先兆子痫。
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