BR112020015194A2

BR112020015194A2 - Anticorpos humanizados e desimunizados

Info

Publication number: BR112020015194A2
Application number: BR112020015194-7A
Authority: BR
Inventors: Jens-Ulrich Rahfeld; Stephen Gillies; Thore Hettmann; Stephan Schilling; Martin Kleinschmidt
Original assignee: Vivoryon Therapeutics Ag
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2019-01-29
Publication date: 2020-12-29
Also published as: MX2020007986A; IL276101A; EA202091629A1; KR20200116095A; EP3521308A1; EP3521308C0; JP7337077B2; CN111670196A; CA3088606A1; US20210032315A1; JP2021512100A; AU2019214280A1; ZA202004784B; SG11202006378PA; WO2019149689A1; EP3521308B1

Abstract

a invenção refere-se a anticorpos humanizados e desimunizados que se ligam a um epitopo no terminal n do peptídeo beta amiloide piroglutamado (a¿ n3pe) e ao tratamento preventivo e terapêutico de doenças e condições que estão relacionadas ao acúmulo e à deposição de peptídeos amiloides, tal como amiloidose, um grupo de distúrbios e anormalidades associadas ao peptídeo amiloide piroglutamado, como mal de alzheimer, síndrome de down, angiopatia amiloide cerebral e outros aspectos relacionados. mais especificamente, ela se refere ao uso dos anticorpos monoclonais da invenção para ligar o peptídeo beta amiloide piroglutamado no plasma, no cérebro, e no fluido cerebroespinhal para evitar o acúmulo ou para reverter a deposição de a¿ n3pe no cérebro e em vários tecidos na periferia, e para aliviar a amiloidose. a presente invenção está voltada ainda para ensaios diagnósticos para o diagnóstico de amiloidose usando os anticorpos da invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPOS HUMANIZADOS E DESIMUNIZADOS". Campo da Invenção

[001] A invenção refere-se a anticorpos humanizados e desimu- nizados que se ligam a um epitopo no terminal N do peptídeo beta amiloide piroglutamado (A N3pE) e ao tratamento preventivo e tera- pêutico de doenças e condições que estão relacionadas com o acúmu- lo e a deposição de peptídeos amiloides, tal como amiloidose, um gru- po de distúrbios e anormalidades associadas ao peptídeo amiloide pi- roglutamado, como mal de Alzheimer, síndrome de Down, angiopatia amioloide cerebral e outros aspectos relacionados. Mais especifica- mente, ela diz respeito ao uso dos anticorpos monoclonais da inven- ção para ligar o peptídeo beta amiloide piroglutamado no plasma, no cérebro, e no fluido cerebroespinhal para prevenir o acúmulo ou para reverter a deposição de A N3pE no cérebro e em vários tecidos na periferia, e para aliviar a amiloidose. A presente invenção diz respeito ainda a ensaios diagnósticos para o diagnóstico de amiloidose usando os anticorpos da invenção. Antecedentes da Técnica

[002] Amiloidose não é uma única entidade de doenças, mas sim um grupo diverso de processos de doenças progressivas caracteriza- dos por depósitos de tecido extracelular de uma proteína cérea seme- lhante a amido chamada amiloide, que se acumula em um ou mais ór- gãos ou sistemas do corpo. À medida que os depósitos de amiloides se acumulam, eles passam a interferir na função normal do órgão ou sistema do corpo. Existem pelo menos 15 tipos diferentes de amiloido- se. As principais formas são amiloidose primária sem antecedente co- nhecido, amiloidose secundária subsequente a alguma outra condição, e amiloidose hereditária.

[003] A amiloidose hereditária ocorre durante uma infecção crôni-

ca ou uma doença inflamatória, tal como tuberculose, uma infecção bacteriana chamada febre familiar do Mediterrâneo, infecções ósseas (osteomielite), artrite reumatoide, inflamação do intestino delgado (ileí- te granulomatosa), doença de Hodgkin e lepra.

[004] Depósitos de amiloides incluem o componente P (pentago- nal) amiloide (AP), uma glicoproteína relacionada ao amiloide sérico P (SAP) normal, e glicosaminoglicanos sulfatado (GAG), carboidratos complexos do tecido conjunto. As fibrilas das proteínas amiloides, que respondem por cerca de 90% do material amiloide, compreendem um de diversos tipos diferentes de proteínas. Estas proteínas são capazes de se enrolar nas chamadas fibrilas de folhas "plissadas beta", uma configuração de proteína única que apresenta sítios de ligação para vermelho do Congo resultando nas proteínas de coloração únicas da proteína amiloide.

[005] Muitas doenças da idade baseiam-se ou estão associadas a proteínas semelhantes a amiloides e caracterizam-se, em parte, pelo acúmulo de depósitos extracelulares de material amiloide ou seme- lhante ao amiloide que contribuem para a patogênese, assim como para evolução da doença. Estas doenças incluem,, porém sem limita- ção, distúrbios neurológicos tais como enfraquecimento cognitivo leve (MCI), mal de Alzheimer (AD), como, por exemplo, mal de Alzheimer esporádico (SAD) ou demências familiares de Alzheimer (FAD) como demência familiar britânica (FBD) e demência familiar dinamarquesa (FDD), neurodegeneração na síndrome de Down, demência com cor- pos de Lewy, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo ho- landês); o complexo parkinsonismo-demência de Guam. Outras doen- ças que se baseiam ou associadas a proteínas semelhantes a amiloi- des são paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld, mal de Parkinson, demência relacionada ao HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), diabetes de início na vida adulta; ami-

loidose cardíaca senil; tumores endócrinos, entre outras, incluindo de- generação macular.

[006] Embora a patogênese dessas doenças possa ser diversa, seus depósitos característicos geralmente contêm muitos constituintes moleculares compartilhados. Até um grau significativo, isto pode ser atribuível à ativação local de vias pró-inflamatórias levando assim à deposição simultânea de componentes do complemento ativado, rea- gentes da fase aguda, moduladores imunes, e outros mediadores in- flamatórios (McGeer et al., Tohoku J Exp Med. 174(3): 269-277 (1994)).

[007] Recentemente, inúmeras evidências demonstram o envol- vimento de peptídeos Aβ N-terminais modificados variantes no mal de Alzheimer. As biópsias visadas exibem a presença de Aβ 1-40 e de Aβ 1-42 não só no cérebro de pacientes com Alzheimer, mas também em placas senis de indivíduos não afetados. No entanto, o Aβ N3pE- 40/Aβ N3pE-42 pyroGlu-modificado N-terminal truncado fica quase ex- clusivamente enraizado nas placas de pacientes com mal de Alzhei- mer, fazendo deste Aβ variante um marcador diagnóstico aceitável e um alvo em potencial para o desenvolvimento de drogas.

[008] Atualmente, vários fabricantes comerciais oferecem kits ELISA que permitem a detecção de Aβ 1-40 / 1-42 e de Aβ N3pE- 40/Aβ N3pE-42 na faixa de picogramas (pg).

[009] O cérebro de pacientes com mal de Alzheimer (AD) carac- teriza-se morfologicamente pela presença de emaranhados neurofibri- lares e por depósitos de peptídeos A nas estruturas neocorticais do cérebro (Selkoe, D.J. & Schenk, D. Alzheimer’s disease: molecular un- derstanding predicts amyloid-based therapeutics. Annu. Rev. Pharma- col. Toxicol. 43, 545-584 (2003)). Peptídeos A são liberados da prote- ína precursora amiloide (APP) depois da clivagem sequencial por - e -secretase. A clivagem por -secretase resulta na produção dos pep-

tídeos A 1-40 e A 1-42, que diferem em seus terminais C e apresen- tam potências de agregação, formação de fibrilas e neurotoxicidade diferentes (Shin, R.W. et al. Amyloid beta-protein (Abeta) 1-40 but not Abeta 1-42 contributes to the experimental formation of Alzheimer di- sease amyloid fibrils in rat brain. J. Neurosci. 17, 8187-8193 (1997); Iwatsubo, T. et al. Visualization of Abeta 42(43) and Abeta 40 in senile plaques with end-specific Abeta monoclonals: evidence that an initially deposited species is Abeta 42(43). Neuron 13, 45-53 (1994); Iwatsubo, T., Mann, D.M., Odaka, A., Suzuki, N. & Ihara, Y. Amyloid beta protein (Abeta) deposition: Abeta 42(43) precedes Abeta 40 in Down syndro- me. Ann. Neurol. 37, 294-299 (1995); Hardy, J.A. & Higgins, G.A. Al- zheimer’s disease: the amyloid cascade hypothesis. Science 256, 184- 185 (1992); Roßner, S., Ueberham, U., Schliebs, R., Perez-Polo, J.R. & Bigl, V. The regulation of amyloid precursor protein metabolism by cholinergic mechanisms and neurotrophin receptor signaling. Prog. Neurobiol. 56, 541-569 (1998)).

[0010] A maioria dos peptídeos Aβ depositados em placas difusas é truncada ou modificada no terminal N. Estudos de Piccini e Saido mostraram que a estrutura do núcleo de placas senis e depósitos vas- culares consistem em 50 % de peptídeos modificados com pirogluta- mato (pyroGlu) (Piccini et al., J Biol Chem. 2005 Oct 7;280(40):34186- 92; Saido et al., Neuron. 1995 Feb; 14(2): 457-66). Os peptídeos modi- ficados com PyroGlu são bastante mais citotóxicos do que outras es- pécies de A e adequados contra aminopeptidases (Russo et al., J Neurochem. 2002 Sep;82(6):1480-9). Assim sendo, espécies de pyro- Glu A têm uma meia-vida mais longa sendo que o acúmulo dessas espécies e a formação de oligômeros neurotóxicos bem como de agregados são vantajoss (Saido, Neurobiol Aging. 1998 Jan-Feb;19(1 Suppl):S69-75). Devido à ciclização de glutamato para pyroGlu, ami- noácidos carregados serão perdidos o que reduz bastante a solubili-

dade do peptídeo e causa tendência a uma maior agregação.

Estudos in vitro já mostraram que a oligomerização inicial de, por exemplo, A3(pE) é muito mais rápida comparada à dos peptídeos não modifi- cados (Schilling et al., Biochemistry. 2006 Oct 17;45(41):12393-9). Os peptídeos A N3pE-42 coexistem com os peptídeos A 1-40/1-42 (Saido, T.C. et al.

Dominant and differential deposition of distinct beta- amyloid peptide species, Abeta N3pE, in senile plaques.

Neuron 14, 457-466 (1995) ; Saido, T.C., Yamao, H., Iwatsubo, T. & Kawashima, S.

Amino- and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid pepti- des deposited in human brain.

Neurosci.

Lett. 215, 173-176 (1996)), e, com base em inúmeras observações, poderiam desempenha um papel prominente na patogênese de AD.

Por exemplo, já foi apresentada uma neurotoxicidade particular dos peptídeos A N3pE-42 (Russo, C. et al.

Pyroglutamate-modified amyloid beta-peptides--AbetaN3(pE)-- strongly affect cultured neuron and astrocyte survival.

J.

Neurochem. 82, 1480-1489 (2002) e a modificação pE dos peptídeos A N- truncados confere resistência à degradação pela maioria das amino- peptidases assim como endopeptidases degradadoras de A (Russo, C. et al.

J.

Neurochem. 82, 1480-1489 (2002); Saido, T.C.

Alzheimer’s disease as proteolytic disorders: anabolism and catabolism of beta-amyloid.

Neurobiol.

Aging 19, S69-S75 (1998)). A ciclização do ácido glutâmico para pE leva a uma perda da carga N-terminal resultando em agregação aceleração do A N3pE em relação aos peptídeos A não modificados (He, W. & Barrow, C.J.

The Abeta 3-pyroglutamyl and 11-pyroglutamyl peptides found in senile plaque have greater beta-sheet forming and aggregati- on propensities in vitro than full-length A beta.

Biochemistry 38, 10871- 10877 (1999); Schilling, S. et al.

On the seeding and oligomerization of pGlu-amyloid peptides (in vitro). Biochemistry 45, 12393-12399

(2006)). Assim sendo, a redução da formação de A N3pE-42 deveria desestabilizar os peptídeos deixando-os mais acessíveis à degradação e, por sua vez, impediria a formação de agregados de A de peso mo- lecular mais alto e aumentaria a sobrevivência dos neurônios.

[0011] No entanto, durante muito tempo não se sabia como ocorria a modificação dos peptídeos A Recentemente, foi descoberto que a glutaminil ciclase (QC) é capaz de catalisar a formação de A N3pE-42 em condições levemente ácidas e que inibidores específicos de QC previnem a geração de A N3pE-42 in vitro (Schilling, S., Hoffmann, T., Manhart, S., Hoffmann, M. & Demuth, H.-U. As glutaminil ciclases de- senvolvem atividade de glutamil ciclase em condições ácidas leves. FEBS Lett. 563, 191-196 (2004) ; Cynis, H. et al. Inhibition of gluta- minyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells. Bio- chim. Biophys. Acta 1764, 1618-1625 (2006)).

[0012] Todos os fatores sugerem que pyroGlu A é um tipo de germe para iniciar a formação de fibrilas. Em um outro estudo (Piccini et al., 2005, supra), voluntários com deposições de placas, porém sem patologia específica de AD puderam ser distinguidos de pacientes com AD devido à quantidade característica de espécies de AAssim sen- do, a quantidade de peptídeos modificados com pyroGlu N-terminais truncados foi significativamente mais alta no cérebro de pacientes com AD.

[0013] A formação pós-translacional de pyroGlu na posição 3 ou 11 do peptídeo Aβ implica a ciclização de um resíduo glutamato N- terminal. A glutaminil ciclase (QC) desempenha um papel importante na produção de peptídeos pyroGlu. A QC é bastante comum no reino vegetal e animal e, inter alia, está envolvida na maturação de hormô- nios peptídicos. Tanto a ciclização da glutamina pela liberação de amônia como a ciclização do glutamato pela liberação de água for- mando pyroGlu é realizada pela QC. Ao contrário da ciclização da glu-

tamina, a ciclização do glutamato não ocorre espontaneamente. A QC catalisa a reação secundária (indesejada) eficiente de glutamato em pyroGlu. O resíduo pyroGlu gerado protege a proteína contra degrada- ção proteolítica. Existem várias referências que descrevem que a QC desempenha um papel importante na geração de pyroGlu Aβ:

1. Em diversos estudos foi demonstrado que a QC catalisa a formação de resíduo pyroGlu a partir do glutamato no terminal N de Aβ (Cynis et al., Biochim Biophys Acta. 2006 Oct;1764(10):1618-25, Schilling et al., FEBS Lett. 2004 Apr 9;563(1-3):191-6);

2. Tanto peptídeos Aβ quanto QC são expressos em gran- des quantidades no hipocampo e no córtex. Estas áreas do cérebro são de particular risco em AD (Pohl et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Nov 15;88(22):10059-63, Selkoe, Physiol Rev. 2001 Apr;81(2):741-66);

3. A APP é clivada pela β-secretase durante o transporte para a membrana plasmética e com isso o terminal N de Aβ com o re- síduo glutamato livre pode ser produzido (Greenfield et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Jan 19;96(2):742-7). Nas vesículas secretoras foi determinada uma co-localização da APP processada e da QC. As- sim sendo, no meio ácido leve das vesículas é possível ocorrer uma modificação acelerada do resíduo glutamato para piroglutamato.

4. Também outras doenças neurodegenerativas (demência familiar dinamarquesa (FDD) ou britânica (FBD)) estão relacionadas com os peptídeos N-terminais modificados com pyroGlu, por exemplo, Bri2, mas, em contraste, elas não estão relacionadas com Aβ em ter- mos de sua estrutura primária (Vidal R. et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 4920-4925).

[0014] Possivelmente a formação de pyroGlu Acatalisada pela QC está envolvida no desenvolvimento e na evolução de doenças neu- rodegenerativas. A formação de peptídeos amiloides N-terminais modi-

ficados certamente representa um fator fundamental no processo de agregação de Aβ e poderia ser o início de uma doença. A supressão da formação de pyroGlu Aβ por meio da inibição da QC poderia repre- sentar uma abordagem terapêutica. Inibidores de QC seriam capazes de prevenir a formação de pyroGlu Aβ, reduzir a concentração de Aβ piroglutamado no cérebro e assim retardar a oligomerização dos pep- tídeos Aβ. Schilling et al. mostram que a expressão de QC foi supra- regulada no córtex de pacientes com AD e correlacionada com o apa- recimento do peptídeo Aβ pyroGlu-modificado. A aplicação oral de um inibidor de QC resultado em nível reduzido de AβpE(3-42) modificado com piroglutamato em dois modelos de camundongo transgênico dife- rentes de AD e em um novo modelo de Drosophila (Schilling et al., 2008 Biol. Chem. (389), 983-991).

[0015] Demência com corpos de Lewy (LBD) é um distúrbio neu- rodegenerativo que pode ocorrer em pessoas com mais de 65 anos de idade, e tipicamente causa sintomas de enfraquecimento cognitivo (ra- ciocínio) e mudanças comportamentais anormais. Os sintomas podem incluir enfraquecimento cognitivo, sinais neurológicos, distúrbio do so- no, e insuficiência autonômica. Enfraquecimento cognitivo é a caracte- rística indicativa de LBD na maioria dos casos. Os pacientes apresen- tam episódios recorrentes de confusão que pioram progressivamente. A flutuação na capacidade in cognitiva frequentemente é associada a graus variáveis de atenção e vigília. O enfraquecimento cognitivo e as flutuações de raciocínio podem variar durante minutos, horas ou dias. Os corpos de Lewy são formados a partir de proteínas fosforiladas e não fosforiladas dos neurofilamentos; eles contêm a proteína sináptica alfa-sinucleína e também a ubiquitina, que está envolvida na elimina- ção de proteínas danificadas ou anormais. Além dos corpos de Lewy, neurites de Lewy, que são corpos de inclusão nos processos celulares das células nervosas, também podem estar presentes. As placas ami-

loides podem se formar no cérebro de pacientes que sofrem de DLB, no entanto, elas tendem a ser em quantidade menor que aquela ob- servada em paciente com mal de Alzheimer. Emaranhados neurofibri- lares, o outro sinal micropatológico do AD, não são uma característica principal de LBD, mas frequentemente estão presentes além das pla- cas amiloides.

[0016] Esclerose lateral amiotrófica (ALS) caracteriza-se pela de- generação dos nurônios motores superiores e inferiores. Em alguns pacientes com ALS, demência ou afasia podem estar presentes (ALS- D). A demência é mais comumente uma demência frontotemporal (FTD), e muitos desses casos apresentam inclusões ubiquitina- positivas e tau-negativas nos neurônios do giro dentado e nas cama- das superficiais dos lobos frontal e temporal.

[0017] Miosite com corpos de inclusão (IBM) é uma doença inca- pacitante normalmente encontrada em pessoas com mais de 50 anos de idade, na qual as fibras musculares desenvolvem inflamação e co- meçam a atrofiar - mas qual o cérebro é poupado e os pacientes con- servam seu todo o seu intelecto. Foi constatado que duas enzimas en- volvidas na produção da proteína β amiloide se encontram aumenta- das nas células musculares dos pacientes com esta doença muscular progressiva mais comum de pessoas idosas, na qual o β amiloide também está aumentado.

[0018] Uma outra doença que se baseia ou está associada ao acúmulo e ao depósito de proteína semelhante à amiloide é a degene- ração macular. Degeneração macular é uma doença ocular comum que causa deterioração da mácula, que é a área central da retina (o tecido fino como papel na parte posterior do olho onde as células sen- síveis à luz enviam sinais visuais para o cérebro). Uma visão nítida, clara e "direta" é processada pela mácula. Lesões na mácula resultam no desenvolvimento de pontos cegos e visão borrada e distorcida. De-

generação macular relacionada com a idade (AMD) é uma causa im- portante de deficiência visual nos Estados Unidos e para pessoas aci- ma de 65 anos é a causa principal de cegueira legal entre os caucasi- anos. Aproximadamente 1,8 milhão de americanos com 40 anos de idade e mais apresentam AMD avançada, e outras 7,3 milhões de pessoas com AMD intermediária e AMD correm risco significativo de perder a visão. O governo estima que em 2020 haverá 2,9 milhões de pessoas com AMD avançada. As vítimas de AMD geralmente são sur- preendidas e ficam frustradas ao constatar como pouco se sabe acer- ca das causas e do tratamento desta condição de cegueira.

[0019] Existem duas formas de degeneração macular: degenera- ção macular seca e degeneração macular úmida. A forma seca, na qual as células da mácula começam a quebrar-se lentamente, é diag- nosticada em 85 por cento dos casos de degeneração macular. Ge- ralmente os dois olhos são afetados pela AMD seca, embora um olho possa perder a visão e o outro olho continuar não afetado. Drusas, que são depósitos amarelos sob retina, geralmente são os primeiros sinais de AMD seca. O risco de desenvolver AMD seca ou AMD úmida avan- çada aumenta à medida que o número ou o tamanho da drusa aumen- ta. É possível que a AMD seca avance ou cause perda de visão sem passar para a forma úmida da doença; no entanto, também é possível que a AMD seca em estágio inicial repentinamente se transforme na forma úmida.

[0020] A forma úmida, embora responda por apenas 15 por cento dos casos, resulta em 90 por cento da cegueira, e é considerada AMD avançada (não existe estágio inicial ou intermediário de AMD úmida). A AMD úmida também é precedida pela forma seca da doença. À me- dida que a forma seca piora, algumas pessoas começam a apresen- tam vasos sanguíneos anormais crescendo atrás da mácula. Estes vasos são muito frágeis e derramam fluido e sangue (daí degeneração macular "úmida’), causando danos rápidos à mácula.

[0021] A forma seca de AMD com frequência causa inicialmente visão levemente borrada. O centro da visão em particular pode então ficar borrado e esta região aumenta à medida que a doença avança. Talvez nenhum sintoma seja observado se somente um olho for afeta- do. Na AMD úmida, linhas retas podem parecer onduladas e é possí- vel que rapidamente ocorra perda da visão central.

[0022] O diagnóstico de degeneração macular envolve tipicamente um exame com pupiladas dilatadas, um teste de acuidade visual, e uma visão do fundo do olho usando um procedimento chamado fun- doscopia para auxiliar a diagnosticar a AMD, e - em caso de suspeita de AMD úmida - uma angiografia fluoresceínica também pode ser fei- ta. Se a AMD seca chegar aos estágios avançados, não existe atual- mente nenhum tratamento para impedir a perda de visão. Entretanto, uma fórmula específica de altas doses de antioxidantes e zinco pode retardar ou impedir que a AMD intermediária progrida até o estágio avançado. Macugen® (injeção de pegaptanib sódico), fotocoagulação a laser e terapia fotodinâmica podem controlar o crescimento anormal de vasos sanguíneos e seu sangramento na mácula, o que é útil para algumas pessoas que têm AMD úmida; no entanto, a visão que já foi perdida não será recuperada por essas técnicas. Se a visão já tiver sido perdida, existem aparelhos para baixa visão que podem ajudar a melhorar a qualidade de vida.

[0023] Um dos primeiros sinais de degeneração macular relacio- nada com a idade (AMD) é o ácidoacúmulo de depósitos extracelula- res conhecidos como drusas entre a lâmina basal do epitélio pigmen- tado da retina (RPE) e a membrana de Bruch (BM). Estudos recentes realizados por Anderson et al. confirmaram que as drusas contêm beta amiloide. (Experimental Eye Research 78 (2004) 243 - 256).

[0024] Já foi demonstrado que peptídeos A piroglutamados de-

sempenham um papel no acúmulo de petídios A e na formação de placas no mal de Alzheimer. Devido ao seu potencial hidrófobo foi de- monstrado que estes peptídeos estimulam agregação e formação de placas. Foi ainda demonstrado em um modelo de camundongo trans- gênico expressando A N3pE-42 nos neurônios que este peptídeo é neurotóxico in vivo e leva à perda de neurônios (Wirths et al. (2009) Acta Neuropatho/118, 487-496).

[0025] Acredita-se que anticorpos com especificidades contra o piroglutamato N-terminal dos peptídeos A sejam vantajosos por cau- sa de sua especificidade somente para as espécies patogênicas de A, que carregam um piroglutamato no terminal N, mas não detectam APP nem outras espécies de A sem o piroglutamato N-terminal. Acredita-se, portanto, que o risco de potenciais efeitos colaterais, tal como inflamação cerebral descontrolada, será reduzido pelo uso dos anticorpos da invenção em comparação com anticorpos direcionados para outras espécies A diferentes das variantes piroglutamadas.

[0026] Anticorpos visando os peptídeos A N3pE já são conheci- dos (Acero et al (2009) J Neuroimmunol 213, 39-46; Saido et al. (1996) Neuron 14, 457-466; US 7,122,374 e WO 2012/136552).

[0027] No entanto, são necessários anticorpos humanizados e de- simunizados com especificidade para os peptídeos AN3pE que pos- sam ser usados no tratamento humano e que afetem de forma positiva a amiloidose, em particular a cognição em doenças e condições nas quais o A N3pE possa estar envolvido, tal como mal de Alzheimer clínico ou pré-clínico, síndrome de Down, e angiopatia amiloide cere- bral clínica ou pré-clínica.

[0028] O anticorpo parental do anticorpo da presente invenção é a variante clone#6 revelado no documento WO 2017/009459, que tem a região variável da cadeia leve com a sequência de aminoácidos:

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPG

QSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC VQGTHFPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 1), que está apresentado como SEQ ID NO: 14 no documento WO 2017/009459; e que tem a região variável da cadeia pesada com a sequência de ami- noácidos:

QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGL

EWMGLINPSNGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTA TYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 49); que está apresentado como SEQ ID NO: 27 no documento WO 2017/009459.

[0029] No entanto, com esta variante clone #6 revelada no docu- mento WO 2017/009459, não foi possível estabelecer a produção de CMC. Em particular, e apesar das diversas tentativas, não foi possível estabelecer clones de células estáveis nas células CHO-DG44, obser- vou-se apenas uma expressão transitória fraca (produzindo quantida- des insuficientes de anticorpo) desta variante clone #6, e não foi pos- sível estabelecer nenhuma expressão estável, como um pré-requisito para produção de CMC. Sumário da invenção

[0030] Era, portanto, o objetivo da invenção apresentar anticorpos humanizados e desimunizados com propriedades aprimoradas para superar as desvantagens dos anticorpos do estado da técnica.

[0031] Em geral, a invenção apresenta novos métodos e composi- ções compreendendo anticorpos altamente específicos e altamente eficazes, incluindo anticorpos quiméricos e fragmentos dos mesmos, incluindo anticorpos parcialmente ou totalmente humanizados e frag- mentos dos mesmos, com capacidade de reconhecer e se ligar especi- ficamente a epitopos específicos dentre uma gama de antígenos para β-amiloides, em particular peptídeos Aβ N3pE, que podem ser apre- sentados ao anticorpo em uma forma monomérica, dimérica, trimérica etc., ou em uma forma polimérica, na forma de um agregado, fibras, filamentos ou na forma condensada de uma placa.

[0032] O objetivo da invenção é em particular resolvido por um an- ticorpo ou uma variante funcional do mesmo, em que a parte variável da cadeia leve do referido anticorpo compreende, consiste essencial- mente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos de:

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPG

QSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC VQGTHFPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 1), e em que a parte variável da cadeia pesada do referido anticorpo com- preende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos de:

QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGL

EWMGLINPSDGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTA TYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2).

[0033] A parte variável da cadeia pesada (SEQ ID NO: 2) contém três mutações nas posições K12V, S14P e N55D em relação ao anti- corpo parental revelado no documento WO 2017/009459.

[0034] De forma surpreendente, foi descoberto que a introdução dessas três mutações levava a um anticorpo humanizado e desimuni- zado, que é capaz de produzir CMC com altos rendimentos. Foi possí- vel estabelecer linhagens celulares produtoras de anticorpos em célu- las CHO-DG44 com o anticorpo da invenção compreendendo estas três mutações pontuais. Também foi possível ainda estabelecer uma expressão transitória melhorada em CHO-DG44, resultando em ren- dimentos mais altos do anticorpo da invenção compreendendo as mu- tações K12V, S14P e N55D em relação ao anticorpo parental, porém mantendo as características de ligação favoráveis do anticorpo. Por fim, foi possível estabelecer uma expressão estável com o anticorpo da invenção compreendendo as mutações K12V, S14P e N55D com níveis de expressão altos, possibilitando a produção de CMC.

[0035] A invenção apresenta anticorpos humanizados e desimuni- zados, ou fragmentos dos mesmos, que afetam de forma positiva do- enças e condições de amiloidose, onde o A N3pE possa estar envol- vido.

[0036] Em uma outra modalidade, a invenção apresenta anticor- pos e fragmentos dos mesmos que se ligam aos peptídeos A N3pE na circulação e em tecidos, em particular no cérebro. Os anticorpos da invenção são capazes de ligar moléculas de peptídeos A N3pE livre ou ainda formas ligados dos peptídeos A N3pE.

[0037] Assim sendo, a presente invenção apresenta ainda anticor- pos que alteram a depuração das formas solúveis e ligadas dos peptí- deos A N3pE no sistema nervoso central, tal como o cérebro, e a cir- culação, tal como plasma.

[0038] Em uma outra modalidade, a invenção apresenta anticor- pos e fragmentos dos mesmos, em que os anticorpos se ligam especi- ficamente ao piroglutamato carregando o terminal N de A N3pE.

[0039] Em uma outra modalidade, a invenção apresenta anticor- pos e fragmentos dos mesmos, em que os anticorpos apresentam uma seletividade aumentada para oligômeros e/ou fibrilas dos peptídeos AOs anticorpos da presente invenção apresentam uma constante de ligação (valor de KD) múltiplas vezes, tal como 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 250 vezes ou mais de 250 vezes mais baixa para ligação a oligômeros e/ou fibrilas de A (1-42) que os anticorpos monoclonais equiparáveis conhecidos no estado da técnica, em particular comparado ao anticorpo parental revelado no documento WO 2017/009459. Por conseguinte, os anticorpos da pre-

sente invenção, que, conforme estabelecido, se ligam seletivamente aos peptídeos A N3pE, são mais específicos para os peptídeos A N3pE e apresentam uma reatividade cruzada reduzida contra peptí- deos A diferentes de A N3pE.

[0040] Em ainda uma outra modalidade, a presente invenção tam- bém se refere a células hospedeiras transformadas com os vetores ou incorporando as moléculas de ácido nucleico que expressan os anti- corpos da invenção ou fragmentos dos mesmos.

[0041] Além disso, a presente invenção apresenta composições farmacêuticas compreender os anticorpos da invenção e fragmentos dos mesmos.

[0042] A invenção refere-se ainda ao uso dos anticorpos da inven- ção e fragmentos dos mesmos que são úteis para ligação e depuração ou remoção de A N3pE em humanos e, por conseguinte, para o di- agnóstico, a prevenção e o tratamento de doenças e condições carac- terizadas por amiloidose ou toxicidade por A N3pE.

[0043] Em uma modalidade particular, os anticorpos da invenção, que são capazes de se ligar e depurar ou remover peptídeos A N3pE em fluidos e tecidos biológicos, são úteis na prevenção e/ou no trata- mento de condições associadas à formação de placas contendo A N3pE tais como placas difusas, neuríticas, e cerebrovasculares no cé- rebro.

[0044] A administração dos anticorpos da invenção, incluindo seus fragmentos imunologicamente reativos, pode levar à depuração ou remoção de A N3pE das placas mencionadas acima e outros com- plexos biológicos. Assim sendo, o anticorpo da invenção será facil- mente transportado na circulação, em outros fluidos corporais e para sítios onde as placas mencionadas acima e/ou outros complexos bio- lógicos são formados ou qualquer outra parte onde o A N3pE apre- sente efeitos nocivos.

[0045] Além disso, a remoção de A N3pE das placas ou de ou- tros complexos biológicos pelos anticorpos da invenção pode levar à solubilização de formas insolúveis das placas e assim levar à remoção de placas inteiras do tecido afetado, tal como o tecido cerebral. Isto, por sua vez, pode levar à melhora da cognição em pacientes diagnos- ticados com uma doença neurodegenerativa, tal como enfraquecimen- to cognitivo leve (MCI), mal de Alzheimer (AD), como, por exemplo, mal de Alzheimer esporádico (SAD) ou demências familiares de Al- zheimer (FAD) como demência familiar britânica (FBD) e demência familiar dinamarquesa (FDD) entre outras, neurodegeneração na sín- drome de Down, demência com corpos de Lewy, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo parkinsonismo- demência de Guam. Em particular, a presente invenção apresenta um anticorpo da presente invenção para uso no tratamento de uma condi- ção selecionada dentre AD prodromal, AD leve, AD moderado e AD severo. Em uma outra modalidade, a presente invenção apresenta um anticorpo da presente invenção para uso na desaceleração do declínio cognitivo em um paciente diagnosticado com uma condição seleciona- da dentre mal de Alzheimer clínico ou pré-clínico, síndrome de Down, e angiopatia amiloide cerebral clínica ou pré-clínica.

[0046] A ligação dos anticorpos da invenção ao A N3pE na circu- lação ou em outros fluidos corporais pode resultar ainda na remoção das formas circulantes ou solúveis de A N3pE. Como discutido acima, o A N3pE apresenta alta hidrofobicidade e tem alta afinidade para outros peptídeos, por exemplo, A não piroglutamados, o que resulta na forma de estruturas oligoméricas e supermoleculares, tais como placas amiloides. Já foi mostrado que em particular estas estruturas oligoméricas são altamente neurotóxicas. A formação de estruturas oligoméricas leva a danos celulares e à morte de células neuronais. Por conseguinte, a remoção de formas circulantes ou solúveis de A

N3pE ou ainda de oligômeros compreendendo A N3pE leva à pre- venção de danos e/ou neurotoxicidade nas células. Por conseguinte, a invenção também apresenta métodos para a prevenção de doenças neurodegenerativas, tais como enfraquecimento cognitivo leve (MCI), mal de Alzheimer (AD), como, por exemplo, mal de Alzheimer esporá- dico (SAD) ou demências familiares de Alzheimer (FAD) como demên- cia familiar britânica (FBD) e demência familiar dinamarquesa (FDD) entre outras, neurodegeneração na síndrome de Down, demência com corpos de Lewy, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês), o complexo parkinsonismo-demência de Guam. Em particu- lar, a presente invenção apresenta métodos para o tratamento de uma condição selecionada dentre AD prodromal, AD leve, AD moderado e AD severo. Em uma outra modalidade, a presente invenção apresenta um método para a desaceleração do declínio cognitivo em um pacien- te diagnosticado com uma condição selecionada dentre mal de Al- zheimer clínico ou pré-clínico, síndrome de Down, e angiopatia amiloi- de cerebral clínica ou pré-clínica.

[0047] A invenção apresenta ainda métodos para a prevenção e/ou o tratamento de outras doenças que são baseadas ou associadas a proteínas semelhantes a amiloides, em particular A N3pE, tais co- mo paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla, doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada com HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), demência relacionada com diabe- tes com início na vida adulta; amiloidose cardíaca senil, e outras, inclu- indo degeneração macular.

[0048] A invenção apresenta ainda uma técnica de detecção alta- mente sensível e concomitantemente robusta que possibilita a deter- minação quantitativa de variantes de Aβ, em particular A N3pE, em amostras biológicas, por exemplo, amostras de licor ou soro, de prefe- rência amostras de soro, ou amostras de tecido. Este é um desafio tremendo, considerando-se a pouca abundância desses peptídeos A N3pE no sangue. Ter esta técnica de detecção disponível é, no entan- to, um pré-requisito para o estudo da eficácia de inibidores de molécu- las pequenas em programas de rastreamento de drogas e de desen- volvimento de drogas.

[0049] Os anticorpos possibilitados pelos ensinamentos da presen- te invenção são particularmente úteis para o diagnóstico de amiloido- se, um grupo de doenças e distúrbios com formação de placas amiloi- des incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade, incluindo, porém sem limitação, distúrbios neurológicos tais co- mo mal de Alzheimer (AD), demência com corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holan- dês), o complexo parkinsonismo-demência de Guam, assim como ou- tras doenças que são baseadas ou associadas a proteínas semelhan- tes a amiloides tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla, doença de Creutzfeld Jacob, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose tipo holandês, mal de Parkinson, demência relaciona- da com HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), demência relacionada com diabetes com início na vida adulta; amiloidose cardíaca senil, e outras, incluindo degeneração macular, para mencionar apenas algu- mas. Descrição das Figuras

[0050] A Figura 1 mostra a influência das mutações pontuais na cadeia pesada na expressão transitória (A) e na ligação alvo (B) de variantes individuais do anticorpo da invenção. Todos os anticorpos testados contêm a parte variável da cadeia leve de SEQ ID NO. 1 e a mutação K324A na cadeia pesada.

[0051] Ab 1: contém as duas mutações K12V e S14P na parte va- riável da cadeia pesada em relação à sequência parental SEQ ID NO: 49;

[0052] Ab 2: contém a mutação N55D na parte variável da cadeia pesada em relação à sequência parental SEQ ID NO: 49;

[0053] Ab 3: representa a sequência parental SEQ ID NO: 49 da parte variável da cadeia pesada sem mutações.

[0054] A Figura 2 mostra a influência das mutações pontuais na cadeia pesada na expressão transitória (A) e na ligação alvo (B) de variantes individuais do anticorpo da invenção. Todos os anticorpos testados contêm a parte variável da cadeia leve de SEQ ID NO. 1 e a mutação K324A na cadeia pesada.

[0055] Ab 1: contém as duas mutações K12V e S14P na parte va- riável da cadeia pesada em relação à sequência parental SEQ ID NO: 49;

[0056] Ab 2: contém a mutação N55D na parte variável da cadeia pesada em relação à sequência parental SEQ ID NO: 49;

[0057] Ab 3: contém as três mutações K12V, S14P and N55D in a parte variável da cadeia pesada em relação à sequência parental SEQ ID NO: 49

[0058] A Figura 3 mostra clones CHO-DG44 expressando o anti- corpo com a parte variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 1 e a parte variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 2, sete, dez e 13 dias de- pois da semeadura de poços de uma placa de 24 poços a partir de co- lônias coletadas de uma placa de 96 poços.

[0059] A Figura 4 mostra títulos da expressão de CHO-DG44 de- pois de amplificação genética através de exposição a MTX (dia 7). Descrição Detalhada da Invenção Definições

[0060] O termo "anticorpo" é usado em seu sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais intatos, anticorpos poli- clonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecí- ficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intatos, frag-

mentos de anticorpos desde que apresentem a atividade biológica de- sejada. O anticorpo pode ser uma IgM, IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4), IgD, IgA ou IgE, por exemplo. Preferivelmente, no en- tanto, o anticorpo não é um anticorpo IgM.

[0061] "Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção de um anticorpo intato, geralmente a região de ligação a antígeno ou a região variável do anticorpo intato. Exemplos de fragmentos de anti- corpos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; diacorpos; molé- culas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

[0062] O termo "anticorpo monoclonal" conforme usado neste pe- dido refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de an- ticorpos substancialmente homogêneos, i.e., os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto por possíveis muta- ções de ocorrência natural que possam estar presentes em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Além disso, ao contrário de preparações de "anticorpo policlonal" que tipicamente in- cluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinan- tes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. Além de sua especificidade, os anti- corpos monoclonais geralmente podem ser vantajosos pelo fato de eles serem sintetizados pela cultura de hibridomas, não contaminada por outras imunoglobulinas. "Monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente ho- mogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método do hibridoma descrito pela primeira vez por Köhler et al., Nature, 256:495 (1975), ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante bastante conhecidos. Os "anticorpos monoclonais" também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos de fagos por meio das técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581- 597 (1991), por exemplo.

[0063] Os anticorpos monoclonais desta invenção incluem especi- ficamente anticorpos quiméricos (imunoglobulinas) nos quais uma por- ção da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse particular de an- ticorpos, enquanto que o restante das cadeias é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma outra espécie ou pertencentes a uma outra classe ou subclasse de anticor- pos, assim como fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles apresentem a atividade biológica desejada.

[0064] Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são imunoglobulinas, cadeias de imunoglobulinas ou fragmentos das mesmas (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação a antígeno dos anticorpos) que contêm uma sequência mínima derivada uma imunoglobulina não humana. Em sua maioria, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anti- corpo receptor) nas quais resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato ou coelho apresentando a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região de es- queleto (FR) Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resí- duos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos huma- nizados podem compreender resíduos que não são encontrados nem nas sequências do anticorpo receptor nem nas sequências de CDR ou de esqueleto importadas.

[0065] Estas modificações são feitas para refinar e otimizar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá todos ou pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compre- enderá, de forma ideal, pelo menos uma porção de uma região cons- tante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobu- lina humana. Para maiores detalhes, vide Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986), Reichmann et al, Nature. 332:323-329 (1988): e Presta, Curr. Op. Struct. Biel., 2:593-596 (1992).

[0066] Além de "humanização", "desimunização" inclui outras alte- rações tal como a remoção de epitopos de células T.

[0067] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" conforme usado neste pedido e nas reivindicações anexas significa que a quan- tidade de anticorpo administrada é de quantidade suficiente para atin- gir a finalidade desejada tal como, neste caso, pelo menos a remoção de formas circulantes ou solúveis do peptídeo beta amiloide pirogluta- mado (Aß N3pE) e variantes do mesmo, mas preferivelmente a depu- ração ou remoção do peptídeo A N3pE de placas ou de outros com- plexos biológicos. Ou mais preferivelmente a redução da carga de pla- cas e/ou a remoção completa das placas do tecido afetado, tal como tecido cerebral.

[0068] "Fv de cadeia única" ou fragmentos de anticorpo "sFv" compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que estes domí- nios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipeptídeo Fv compreende ainda um ligador de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permite que o sFv forme a estrutura deseja-

da para ligação a antígenos. Para recapitulação de sFv vide Plückthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

[0069] O termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação a antígeno, fragmentos estes que compreendem um domínio variável da cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável da cadeia leve (VD) na mesma cadeia polipep- tídica (VH – VD). O uso de um ligador que é curto demais permite o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios sendo forçados a parear com os domínios de complementaridade de uma outra cadeia e criar dois sítios de ligação a antígeno. Diacorpos estão descritos de forma mais completa em Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sol. USA, 90:6444-6448 (1993). Um anticorpo "isolado" é um anticorpo que fora identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Compo- nentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que inter- feririam nos usos diagnósticos ou terapêuticos do anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não pro- teináceos. Em modalidades preferidas, o anticorpo será purificado (1) até atingir mais de 95% em peso de anticorpo segundo determinado pelo método de Lowry, e mais preferivelmente mais de 99% em peso, (2) até atingir um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácidos N-terminal ou interna com o uso de um "sequenator" de copo giratório, ou (3) até atingir a homogeneidade por SDS-PAGE em condições redutoras ou não redutoras usando azul de Coomassie ou, de preferência, coloração pela prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células recombinantes desde que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, no entanto, o anticorpo isolado será prepara- do por pelo menos uma etapa de purificação.

[0070] Conforme usado neste pedido, as expressões "célula", "li- nhagem celular", e "cultura de células" são usadas intercambiavelmen- te e todas estas designações incluem progênies. Assim sendo, as pa- lavras "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula pri- mária em questão e cultura derivada da mesma independente do nú- mero de transferências. Também fica entendido que todas as progê- nies podem não ser exatamente idênticas em termos de teor de DNA, devido a mutações intencionais ou não intencionais. Progênies mutan- tes que têm a mesma função ou atividade biológica que aquela verifi- cada para a célula originalmente transformada estão incluídas. Onde forem desejadas designações distintas, estas estarão claras a partir do contexto.

[0071] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína", conforme usado neste pedido, são intercambiáveis e são definidos como uma biomolécula composta de aminoácidos ligados por uma ligação peptí- dica.

[0072] Se sequências de peptídeos ou de aminoácidos forem mencionados neste pedido, cada resíduo aminoacídico estará repre- sentado por uma designação de uma letra ou de três letras, corres- pondente ao nome trivial do aminoácido, de acordo com a seguinte lista convencional; Aminoácido Símbolo de uma letra Símbolo de três letras Alanina A Ala Arginina R Arg Asparagina N Asn Ácido aspártico D Asp Cisteína C Cys Glutamina Q Gln Ácido glutâmico E Glu Glicina G Gly

Histidina H His Isoleucina I Ile Leucina L Leu Lisina K Lys Metionina M Met Fenilalanina F Phe Prolina P Pro Serina S Ser Treonina T Thr Triptofano W Trp Tirosina Y Tyr Valina V Val

[0067] Os termos "um", "uma" e "o/a" conforme usado neste pedi- do são definidos como "um ou mais" e incluem o plural, a menos que inadequado no contexto.

[0068] A linguagem "doenças e distúrbios que são causados ou associados a proteínas amiloides ou semelhantes a amiloides" inclui, porém sem limitação, doenças e distúrbios causados pela presença ou atividade de proteínas semelhantes a amiloides na forma monomérica, na forma de fibrilas, ou na forma polimérica, ou qualquer combinação das três. Tais doenças e distúrbios incluem, porém sem limitação, ami- loidose, tumores endócrinos, e degeneração macular.

[0069] O termo "amiloidose" refere-se a um grupo de doenças e distúrbios associados à formação de placas amiloides incluindo, porém sem limitação, amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade tal como doenças incluindo, porém sem limitação, distúrbios neurológicos tal como mal de Alzheimer (AD), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda da capacidade de memória cognitiva, tal como, por exemplo, enfraquecimento cognitivo leve (MCI), mal de Alzheimer esporádico, demência com corpos de Lewy,

síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo parkinsonismo-demência de Guam, for- mas familiares do mal de Alzheimer como demência familiar britânica (FBD) e demência familiar dinamarquesa (FDD); assim como outras doenças baseadas ou associadas a proteínas semelhantes a amiloi- des tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla, doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada ao HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), miosite com corpos de in- clusão (IBM), diabetes de início na vida adulta, e amiloidose cardíaca senil; e várias doenças oculares incluindo degeneração macular, neu- ropatia ótica relacionada com as drusas, e catarata devido à deposição beta-amiloide.

[0070] "Amiloide β, Aβ ou /β-amiloide" é um termo reconhecido na literatura e refere-se a proteínas e peptídeos β amiloides, proteína pre- cursora de β amiloide (APP), assim como modificações, fragmentos e quaisquer equivalentes funcionais das mesmas. Em particular, por β amiloide conforme usado neste pedido entende-se qualquer fragmento produzido por clivagem proteolítica da APP, mas especialmente aque- les fragmentos que estão envolvidos ou associados a patologias ami- loides incluindo, porém sem limitação, Aβ1-38, Aβ1-40, Aβ1-42. As se- quências de aminoácidos destes peptídeos Aβ são as seguintes: Aβ 1-42 (SEQ ID NO. 37): Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys- Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly- Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala Aβ 1-40 (SEQ ID NO. 38): Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys- Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly- Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val Aβ 1-38 (SEQ ID NO. 39):

Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys- Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly- Leu-Met-Val-Gly-Gly

[0071] "pGlu-Aβ" ou "Aβ N3pE" refere-se a formas truncadas no terminal N de Aβ, que começam no resíduo ácido glutâmico na posi- ção 3 na sequência de aminoácidos de Aβ, e em que o referido resí- duo ácido glutâmico é ciclizado para formar um resíduo ácido piro- glutâmico. Em particular, por pGlu-Aβ ou Aβ N3pE conforme usado neste pedido entende-se aqueles fragmentos que estão envolvidos ou associados a patologias amiloides incluindo, porém sem limitação, pGlu-Aβ3-38, pGlu-Aβ3-40, p-Glu-Aβ3-42.

[0072] As sequências das formas truncadas no terminal N de Aβ, Aβ3-38, Aβ3-40, Aβ3-42 são as seguintes: Aβ 3-42 (SEQ ID NO. 40): Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val- Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met- Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala Aβ 3-40 (SEQ ID NO. 41): Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val- Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met- Val-Gly-Gly-Val-Val Aβ 3-38 (SEQ ID NO. 42): Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val- Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met- Val-Gly-Gly

[0073] A presente invenção diz respeito a anticorpos específicos para peptídeos Aβ humanos que são truncados no terminal N por cli- vagem ou liberação dos aminoácidos n° 1 e 2 do terminal N e nos quais o aminoácido N-terminal n° assim descoberto é modificado pela formação de piroglutamato e que dessa forma contém um resíduo pi-

roglutamato na posição 3 do terminal N (também denominados peptí- deos Aβ N3pE ou peptídeos N3pE-Aβ ou peptídeos Aβ piroglutama- dos).

[0074] Em um primeiro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo, no qual a parte variável da cadeia leve do referido anti- corpo compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos de:

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPG

QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGL

EWMGLINPSDGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTA TYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2)

[0081] Em uma modalidade preferida da presente invenção, o an- ticorpo tendo a parte variável da cadeia leve do referido anticorpo, que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, compreende as seguintes regiões CDR na cadeia leve: VL CDR1: SSQSLLYSDGKTYLN (SEQ ID NO: 3); VL CDR2: LVSKLDS (SEQ ID NO: 4); e VL CDR3: VQGTHFP (SEQ ID NO: 5).

[0082] Em uma outra modalidade preferida da presente invenção, o anticorpo tendo a parte variável da cadeia pesada do referido anti- corpo, que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, compreende as seguin- tes regiões CDR na cadeia pesada:

VH CDR1: GYSFTGHTMN (SEQ ID NO: 6); VH CDR2: LINPSDGVTRYNQKFQG (SEQ ID NO: 7); e VH CDR3: EAKREWDETY (SEQ ID NO: 8).

[0083] A invenção apresenta ainda as cadeias leves e as cadeias pesadas do anticorpo da invenção.

[0084] Em uma modalidade preferida, o anticorpo da invenção tem uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende, consiste essen- cialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de:

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPG QSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC VQGTHFPFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL

NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 17).

[0085] Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo da inven- ção tem uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de:

QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGL EWMGLINPSDGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTA TYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV

KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 19).

[0086] C1q e duas serina proteases, C1r e C1s, formam o comple- xo C1, o primeiro componente da via da citotoxicidade dependente do complemento (CDC). C1q é uma molécula hexavalente com um peso molecular de aproximadamente 460.000 e uma estrutura comparável a um buquê de tulipas no qual seis "talos" colagenosos estão conecta- dos a seis regiões de cabeça globulares (Burton and Woof, Advances in Immunol 51:1-84; 1992). A ligação de moléculas de IgG1 à C1q dá início à ativação do complemento e subsequentemente leve à lise ce- lular mediada pelo complemento. Os anticorpos da presente invenção devem ser usados no tratamento de doenças e condições inflamató- rias, i.e., os anticorpos da presente invenção devem ter propriedades anti-inflamatórias.

[0087] As funções efetoras dos anticorpos da invenção também podem ser mediadas pela interação da região Fc de um anticorpo com receptores de Fc (FcRs), que são receptores de superfícies celulares especializadas em células hematopoiéticas. Os receptores de Fc per- tencem à superfamília de imunoglobulinas, e já foi mostrado que eles medeiam tanto a remoção de patógenos revestidos com anticorpos por fagocitose de complexos imunes, quanto a lise de eritrócitos e vários outros alvos celulares (por exemplo, células tumorais) revestidos com o anticorpo correspondentes, via citoxicidade mediada por células de- pendentes do anticorpo (ADCC) (Van de Winkel and Anderson, J. Leuk. Bioi. 49:511-24; 1991).

[0088] Por conseguinte, a presente invenção apresenta ainda anti- corpos que ainda se ligam aos receptores de Fc para efetuar suas fun- ções efetoras. Porém, preferivelmente os anticorpos da invenção não apresentam uma citotoxicidade dependente do complemento. Mais preferivelmente, os anticorpos da invenção não ativa o sistema do complemento, ao contrário, eles inibem a lise celular mediada pelo complemento.

[0089] Assim sendo, em uma modalidade preferida, os anticorpos da presente invenção possuem uma região Fc da IgG humana, que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos, de preferên-

cia a substituição de 3 ou 2 aminoácidos, mais preferivelmente a subs- tituição de um aminoácido. As substituições de aminoácidos podem ser obtidas por métodos convencionais, tais como mutagênese sítio- direcionada da região Fc da IgG1 humana dos anticorpos da presente invenção.

[0090] Em uma modalidade mais preferida, os anticorpos da pre- sente invenção possuem uma região Fc da IgG humana que compre- ende uma substituição de aminoácido na posição 324 como mostrado na SEQ ID NO: 18 [a posição 324 corresponde à posição 322 de acor- do com o esquema de numeração EU, Kabat et al., Sequences of Pro- teins of lmmunological lnterest, 5th Ed., US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991 ); Edelman et al., PNAS USA 63:78-85 (1969)]. A substituição de aminoácido é de preferência K324A.

[0091] Em uma modalidade mais preferida, o anticorpo da presen- te invenção tem uma cadeia pesada, que compreende, consiste es- sencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos:

QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGL EWMGLINPSDGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTA TYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC AVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV

KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 18).

[0092] Ainda de acordo com a invenção, os anticorpos compreen- dendo, consistindo essencialmente em ou consistindo nas seguintes combinações das partes variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada e a cadeia leve e a cadeia pesada são preferidos: A) Parte variável da cadeia leve: SEQ ID NO: 1 Parte variável da cadeia pesada: SEQ ID NO: 2 Cadeia leve: SEQ ID NO: 17 Cadeia pesada: SEQ ID NO: 19 B) Parte variável da cadeia leve: SEQ ID NO: 1 Parte variável da cadeia pesada: SEQ ID NO: 2 Cadeia leve: SEQ ID NO: 17 Cadeia pesada: SEQ ID NO: 18

[0093] O anticorpo de acordo com o item B) é o mais preferido. A cadeia pesada contém a alteração aminoacídica K324A.

[0094] Os anticorpos preferidos de acordo com a invenção são formas humanizadas de anticorpos monoclonais de camundongo que são produzidos pela linhagem celular de hibridoma A 6-1-6 (Depósito N° DSM ACC 2924), que está descrita no documento WO 2010/009987.

[0095] As sequências das cadeias leves e pesadas para os anti- corpos da presente invenção podem variar. As imunoglobulinas podem ter dois pares de complexos de cadeia leve/cadeia pesada, pelo me- nos uma cadeia compreendendo uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de camundongo unidas de forma fun- cional a segmentos da região de esqueleto humana.

[0096] Em uma modalidade preferida, o anticorpo da invenção compreende duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, em que a sequência de aminoácidos de cada cadeia leve é SEQ ID NO:17, e a sequência de aminoácidos de cada cadeia pesada é SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19.

[0097] Mais preferivelmente, o anticorpo da invenção compreende duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, em que a sequência de aminoácidos de cada cadeia leve é SEQ ID NO:17, e a sequência de aminoácidos de cada cadeia pesada é SEQ ID NO: 19.

[0098] Ainda mais preferivelmente, o anticorpo da invenção com- preende duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, em que a se- quência de aminoácidos de cada cadeia leve é SEQ ID NO:17, e a se- quência de aminoácidos de cada cadeia pesada é SEQ ID NO: 18.

[0099] Em uma outra modalidade, a presente invenção está volta- da para moléculas de ácido nucleico recombinante codificando os anti- corpos da invenção compreende as CDRs das cadeias pesadas e le- ves como apresentado neste pedido.

[00100] A região de esqueleto humana dos anticorpos da invenção é determinada por comparação de uma sequência de aminoácidos da região de esqueleto ou da região variável de uma imunoglobulina não humana apresentadora de CDR com sequências correspondentes em uma coleção de sequências compreendendo regiões variáveis da imu- noglobulina humana. Uma sequência tendo uma alta percentagem de aminoácidos idênticos é selecionada.

[00101] Em uma modalidade preferida da invenção, a parte variável da cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1 é codificada por uma molécula de ácido nucleico que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de ácidos nucleicos de: gacgtggtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccttggacagccggcctccatctcct gcaagtcaagtcagagcctcctgcactccgacggcaagacctacttgaactggttccagcagag gccaggccagtctccaaggcgcctgacctatctggtgtctaagctggactctggggtcccagaca gattcagcggcagtgggtcaggcactgacttcacactgaagatcagcagggtggaggctgagg atgtcggagtctactactgcgtgcaaggtacacacttcccattcacgttcggcggagggaccaag gtggaaatcaaa (SEQ ID NO: 9).

[00102] Em uma outra modalidade preferida da invenção, a parte variável da cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de acor- do com a SEQ ID NO: 2 é codificada por uma molécula de ácido nu-

cleico que compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de ácidos nucleicos de: caggtgcagctcgtgcagtctggggctgaggtggtgaagccaggtgcctcagtgaaggtctcctg caaggcatctggttactcattcactggtcacaccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaag ggcttgagtggatgggactcatcaatccttccgatggtgttactaggtacaaccagaagttccagg gcagagtcaccatcaccagggacacgtccacgaccaccgttcacatggagctgaccagcctga catctgaggacacggccacctactactgtacgagagaggcgaaacgggagtgggacgagact tactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca (SEQ ID NO: 10).

[00103] Em uma outra modalidade preferida da invenção, as regi- ões CDR da cadeia leve do anticorpo da invenção são codificadas por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nuclei- cos: VL CDR1: tcaagtcagagcctcctgcactccgacggcaagacctacttgaac (SEQ ID NO: 11); VL CDR2: ctggtgtctaagctggactct (SEQ ID NO: 12); e VL CDR3: gtgcaaggtacacacttccca (SEQ ID NO: 13).

[00104] Em uma outra modalidade preferida da invenção, as regi- ões CDR da cadeia pesada do anticorpo da invenção são codificadas por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nu- cleicos: VH CDR1: ggttactcattcactggtcacaccatgaac (SEQ ID NO: 14); VH CDR2: ctcatcaatccttccgatggtgttactaggtacaaccagaagttcc Agggc (SEQ ID NO: 15); e VH CDR3: gaggcgaaacgggagtgggacgagacttac (SEQ ID NO: 16).

[00105] Em uma outra modalidade preferida da invenção, a cadeia leve é codificada por uma molécula de ácido nucleico que compreen- de, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoá- cidos de: Gacgtggtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccttggacagccggcctccatctcct gcaagtcaagtcagagcctcctgcactccgacggcaagacctacttgaactggttccagcagag gccaggccagtctccaaggcgcctgacctatctggtgtctaagctggactctggggtcccagaca gattcagcggcagtgggtcaggcactgacttcacactgaagatcagcagggtggaggctgagg atgtcggagtctactactgcgtgcaaggtacacacttcccattcacgttcggcggagggaccaag gtggaaatcaaaaggaccgtggccgcaccctctgtgttcatcttcccccccagcgacgagcagct gaagagcggcactgcatctgtcgtgtgtctgctgaacaacttctacccaagggaggcgaaagtg cagtggaaggtagacaacgccttgcaatccggcaactcccaggagagcgtgaccgagcagga cagcaaagactcaacctacagcctgagcagtactttgaccctgtctaaggccgattacgagaag cacaaggtgtacgcctgcgaggtaacccaccagggactgagctctcccgtgaccaagagcttc aacaggggcgagtgc (SEQ ID NO: 20).

[00106] Em uma outra modalidade preferida da invenção, a cadeia pesada é codificada por uma molécula de ácido nucleico que compre- ende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de ami- noácidos de: caggtgcagctcgtgcagtctggggctgaggtggtgaagccaggtgcctcagtgaaggtctcctg caaggcatctggttactcattcactggtcacaccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaag ggcttgagtggatgggactcatcaatccttccgatggtgttactaggtacaaccagaagttccagg gcagagtcaccatcaccagggacacgtccacgaccaccgttcacatggagctgaccagcctga catctgaggacacggccacctactactgtacgagagaggcgaaacgggagtgggacgagact tactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagccagcactaagggcccgagcgtgttcc ccctcgcccctagcagtaagagcaccagcggtggcacggcggcacttggctgcttggttaagga ctacttcccagagcccgtgaccgtgtcctggaactctggggcacttaccagtggcgtgcacacctt ccccgctgtactgcagagcagcggcttgtacagcttgtcttccgtcgtaacggtgcccagcagcag cttgggaacccagacctacatctgcaacgtaaaccacaagccatccaacaccaaggtagaca aaaaggtcgaacccaagtcctgcgacaagacccacacctgtccaccctgtcctgcacccgagc tcctgggaggtcccagcgttttcctgttccctccaaagccaaaggataccctgatgatcagcagga cccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactg gtacgttgatggggtggaggtacacaatgccaagaccaaacctcgagaggagcaatacaaca gcacctaccgagttgtgagcgtgcttaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggagta caagtgcgctgtgagcaacaaggctctgccggctcccatcgagaagaccatcagcaaggcca agggccagcccagggagccacaggtttacacgttgcccccctcaagggacgagttgaccaag aaccaggtttccctcacgtgccttgtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggaatggga gagcaacgggcagcccgagaacaactacaagacgaccccccctgttctggacagcgacggct ctttcttcctgtattcaaagctcaccgtggacaaaagcaggtggcagcagggtaatgtgttctcctgc agcgtgatgcacgaggccctgcataaccactacacccaaaagagcttgagcctctcccccggta ag (SEQ ID NO: 21).

[00107] Em uma outra modalidade preferida da invenção, a cadeia pesada é codificada por uma molécula de ácido nucleico que compre- ende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de ami- noácidos de: caggtgcagctcgtgcagtctggggctgaggtggtgaagccaggtgcctcagtgaaggtctcctg caaggcatctggttactcattcactggtcacaccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaag ggcttgagtggatgggactcatcaatccttccgatggtgttactaggtacaaccagaagttccagg gcagagtcaccatcaccagggacacgtccacgaccaccgttcacatggagctgaccagcctga catctgaggacacggccacctactactgtacgagagaggcgaaacgggagtgggacgagact tactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagccagcactaagggcccgagcgtgttcc ccctcgcccctagcagtaagagcaccagcggtggcacggcggcacttggctgcttggttaagga ctacttcccagagcccgtgaccgtgtcctggaactctggggcacttaccagtggcgtgcacacctt ccccgctgtactgcagagcagcggcttgtacagcttgtcttccgtcgtaacggtgcccagcagcag cttgggaacccagacctacatctgcaacgtaaaccacaagccatccaacaccaaggtagaca aaaaggtcgaacccaagtcctgcgacaagacccacacctgtccaccctgtcctgcacccgagc tcctgggaggtcccagcgttttcctgttccctccaaagccaaaggataccctgatgatcagcagga cccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactg gtacgttgatggggtggaggtacacaatgccaagaccaaacctcgagaggagcaatacaaca gcacctaccgagttgtgagcgtgcttaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggagta caagtgcaaggtgagcaacaaggctctgccggctcccatcgagaagaccatcagcaaggcca agggccagcccagggagccacaggtttacacgttgcccccctcaagggacgagttgaccaag aaccaggtttccctcacgtgccttgtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggaatggga gagcaacgggcagcccgagaacaactacaagacgaccccccctgttctggacagcgacggct ctttcttcctgtattcaaagctcaccgtggacaaaagcaggtggcagcagggtaatgtgttctcctgc agcgtgatgcacgaggccctgcataaccactacacccaaaagagcttgagcctctcccccggta ag (SEQ ID NO: 22)

[00108] Ainda de acordo com a invenção, são preferidos anticorpos que são codificados por uma combinação de moléculas de ácido nu- cleico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em: C) Parte variável da cadeia leve: SEQ ID NO: 9 Parte variável da cadeia pesada: SEQ ID NO: 10 Cadeia leve: SEQ ID NO: 20 Cadeia pesada: SEQ ID NO: 22 D) Parte variável da cadeia leve: SEQ ID NO: 9 Parte variável da cadeia pesada: SEQ ID NO: 10 Cadeia leve: SEQ ID NO: 20 Cadeia pesada: SEQ ID NO: 21

[00109] A combinação D) é a mais preferida uma vez que ela codifi- ca um anticorpo humanizado e desimunizado que contém a alteração aminoacídica K324A na cadeia pesada.

[00110] As moléculas de ácido nucleico mencionadas acima podem ser integradas em vetores de expressão bastante conhecidos na litera- tura. A transfecção destes vetores de expressão em um hospedeiro apropriado, a seleção do hospedeiro bem como a compilação de ex- pressão e a purificação das cadeias leves, das cadeias pesadas, dos dímeros das cadeias leves/pesadas ou dos anticorpos inativos, frag- mentos de ligação e outras formas de imunoglobulina são procedimen- tos bastante conhecidos no estado da técnica.

[00111] O especialista na técnica consegue selecionar um vetor com base nas propriedades desejadas, por exemplo, para produção de um vetor em uma célula particular tal como uma célula de mamífero ou uma célula bacteriana.

[00112] Qualquer um de uma variedade de promotores ou potencia- lizadores induzíveis pode ser incluído no vetor para expressão de um anticorpo da invenção ou ácido nucleico que pode ser regulado. Tais sistemas induzíveis incluem, por exemplo, o sistema induzível de te- traciclina (Gossen & Bizard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992); Gossen et al., Science, 268:17664769 (1995); Clontech, Palo Alto, Calif.); o promotor de metalotioneína induzido por metais pesa- dos; o hormônio esteroide de insetos sensível à ecdisona ou esteroi- des relacionados tal como muristerona (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996); Yao et al., Nature, 366:476-479 (1993); Invitrogen, Carlsbad, Calif.); o vírus do tumor de mama de camundon- go (MMTV) induzido por esteroides tais como glucocorticoide e estro- gênio (Lee et al., Nature, 294:228-232 (1981); e promotores do choque térmico induzíveis por variações na temperatura; o promotor do gene da enolase específico de neurônios (Forss-Petter, et al., Neuron 5; 197-197 (1990)); o promotor do gene da β-actina humana (Ray, et al., Genes and Development (1991) 5:2265-2273); o promotor do gene da cadeia B do fator de crescimento de derivados plaquetários humanos (PDGF-B) (Sasahara, et al., Cell (1991) 64:217-227); o promotor do gene do canal de sório de rato (Maue, et al., Neuron (1990) 4:223- 231); o promotor do gene da cobre-zinco superóxido dismutase huma- na (Ceballos-Picot, et al., Brain Res. (1991) 552:198-214); e promoto- res para membros da família do gene regulador do domínio POU de mamífero (Xi et al., (1989) Nature 340:35-42).

[00113] Os elementos reguladores, incluindo promotores ou poten- cializadores, podem ser constitutivos ou regulados, dependendo da natureza da regulação. As sequências reguladoras ou elementos regu- ladores são operacionalmente ligados a uma das sequências da molé- cula de ácido nucleico da invenção de modo que a relação física e funcional entre a sequência da molécula de ácido nucleico e a se- quência reguladora permite a transcrição da sequência da molécula de ácido nucleico. Vetores úteis para expressão em células eucarióticas podem incluir, por exemplo, elementos reguladores que incluem o promotor de CAG promoter, o promotor precoce de SV40, o promotor de citomegalovírus (CMV), o promotor induzível por esteroides do ví- rus do tumor de mama de camundongo (MMTV), Pgtf, o promotor do vírus da leucemia murina de Moloney (MMLV), o promotor thy-1, entre outros.

[00114] Se desejado, o vetor pode conter um marcador selecioná- vel. Conforme usado neste pedido, um "marcador selecionável" refere- se a um elemento genético que apresenta um fenótipo selecionável a uma célula na qual o marcador selecionável fora introduzido. Um mar- cador selecionável geralmente é um gene cujo produto genético ofere- ce resistência a um agente que inibe o crescimento celular ou elimina uma célula. Uma variedade de marcadores selecionáveis pode ser usada nos construtos de DNA da invenção, incluindo, por exemplo, os genes Neo, Hyg, hisD, Gpt e Ble, como descrito, por exemplo, em Au- subel et al. (Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999)) e na Patente US N° 5,981,830. Drogas úteis para selecionar a presença de um marcador selecionável incluem, por exemplo, G418 para Neo, higromicina para Hyg, histidinol para hisD, xantina para Gpt, e bleomicina para Ble (vide Ausubel et al, supra, (1999); Patente US N° 5,981,830). Os construtos de DNA da invenção podem incorporar um marcador selecionável positivo, um marcador selecionável negativo, ou ambos (vide, por exemplo, Patente US N° 5,981,830).

[00115] Vários sistemas de cultura de células de mamífero também podem ser empregados parar expressar uma proteína recombinante. Exemplos de sistemas de expressão de mamíferos incluem as linha- gens COS-7 de fibroblastos de rim de macaco, descrito por Gluzman, Cell, 23: 175 (1981). Outras linhagens celulares capazes de expressar um vetor compatível incluem, por exemplo, as linhagens celulares

C127, 3T3, CHO, HeLa e BHK. Os vetores de expressão de mamífero geralmente compreenderão uma origem de replicação, um promotor e um potencializador adequados, e também quaisquer sítios de ligação a ribossoma necessários, sítio de poliadenilação, sítios doadores e aceptores de emenda, sequências de término de transcrição, e se- quências não trasncritas flanqueadoras 5'. Sequências de DNA deriva- das da emenda de SV40, e sítios de poliadenilação podem ser usados para proporcionar elementos genéticos não transcritos necessários.

[00116] Os polipeptídeos podem ser recuperados e purificados de culturas de células recombinantes por métodos que incluem precipita- ção em sulfato de amônio ou etanol, extração com ácido, cromatogra- fia de troca aniônica ou catiônica, cromatografia em fosfocelulose, cromatografia por interação hidrófoba, cromatografia por afinidade, cromatografia em hidroxilapatita e cromatografia em lectina. A recupe- ração pode ser facilitada se o polipeptídeo for expresso na superfície das células, mas isto não é um pré-requisito. Também pode ser dese- jável a recuperação de produtos de clivagem que são clivados depois da expressão de uma forma mais comprida do polipeptídeo. Etapas de reenrolamento de proteínas conhecidas no estado da técnica podem ser usadas, conforme necessário, para configuração completa da pro- teína madura. Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) pode ser empregada para as etapas finais de purificação.

[00117] Sequências de DNA da região constante humana podem ser isoladas de uma variedade de células humanas de acordo com procedimentos bastante conhecidos.

[00118] A presente invenção diz respeito em particular a anticorpos que são caracterizados pelo fato de se ligarem a peptídeos Aβ N3pE com alta afinidade. A presente invenção também diz respeito a anti- corpos que são caracterizados pelo fato de se ligarem a peptídeos Aβ N3pE ou a fragmentos imunologicamente dos mesmos com uma alta afinidade. A referida alta afinidade significa, no contexto da presente invenção, uma afinidade com um valor KD igual 10-5 M, 10-6 M ou 10- 7 M ou melhor, de preferência um valor KD igual a 10-8 M ou melhor, e ainda mais preferivelmente um valor KD igual a 10-9 M – 10-12 M. Dessa forma, os anticorpos inventivos ligam-se a Aβ N3pE monoméri- cos com afinidade mais alta do que os anticorpos conhecidos anteri- ormente.

[00119] De preferência, os epitopos de ligação dos anticorpos da presente invenção ao qual Aβ N3pE se liga é um epitopo que carrega um piroglutamato no terminal N. Mais preferivelmente, o epitopo de ligação do anticorpo da invenção é selecionado do grupo que consiste em pEFRHDSGYEVHHQKLV (SEQ ID NO: 23), pEFRHDSGYEVHHQKL (SEQ ID NO: 24), pEFRHDSGYEVHHQK (SEQ ID NO: 25), pEFRHDSGYEVHHQ (SEQ ID NO: 26), pEFRHDSGYEVHH (SEQ ID NO: 27), pEFRHDSGYEVH (SEQ ID NO: 28), pEFRHDSGYEV (SEQ ID NO: 29), pEFRHDSGYE (SEQ ID NO: 30), pEFRHDSGY (SEQ ID NO: 31), pEFRHDSG (SEQ ID NO: 32), pEFRHDS (SEQ ID NO: 33), pEFRHD (SEQ ID NO: 34) pEFRH (SEQ ID NO: 35), e pEFR (SEQ ID NO: 36).

[00120] Mais preferivelmente, os anticorpos da invenção não se li- gam a epitopos de ligação que não carregam um piroglutamato no terminal N.

[00121] Ainda mais preferivelmente, ao se ligarem aos epitopos de ligação mencionados mais acima e mais adiante, os anticorpos da in- venção sempre se ligam a sequências ou partes de sequências que contêm o piroglutamato no terminal N. Os anticorpos da invenção não se ligam a sequências ou partes de sequências que não contêm o pi- roglutamato no terminal N.

[00122] Ainda, o anticorpo da invenção também pode se ligar a uma variante de Aβ N3pE.

[00123] No contexto da presente invenção, uma variante de Aβ N3pE é em particular pE-A3-38, pE-A3-40, pE-A3-42

[00124] Outras variantes dos peptídeos Aβ N3pE são todas as vari- antes de Aβ N3pE que mostraram se acumular no cérebro em conse- quência do mal de Alzheimer ou anterior ao mal de Alzheimer. Estas são os peptídeos pE-A3-X, onde x é definido como um inteiro entre 19 e 42, por exemplo, no pE-Aβ3-42 acima, "42" seria o inteiro para "x".

[00125] No contexto da presente invenção uma "variante funcional" do anticorpo inventivo é um anticorpo que conserva as capacidades de ligação, em particular capacidades de ligação com alta afinidade para um peptídeo pE-A3-x. A apresentação de tais variantes funcionais é conhecida no estado da técnica e abrange as possibilidades mencio- nadas acima, que foram indicadas na definição de anticorpos e frag- mentos dos mesmos.

[00126] Em uma outra modalidade, o anticorpo é um fragmento de anticorpo, como definido acima.

[00127] Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo da inven- ção é um anticorpo humanizado e desimunizado que possui as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) dos anticorpos definidos acima. De preferência, o anticorpo pode ser marcado; marcadores possíveis são aqueles mencionados acima e todos aqueles conheci- dos pelo especialista na técnica de usos diagnósticos de anticorpos em particular.

[00128] Em uma outra modalidade, os anticorpos podem ser imobi- lizados sobre uma fase sólida.

[00129] Em uma outra modalidade, os anticorpos de acordo com a invenção e e descritos acima ou fragmentos dos mesmos possuem afinidade de ligação para um oligômero, fibra, fibrila ou filamento de Aβ N3pE, que é pelo menos 2 vezes, particularmente pelo menos 4 ve- zes, particularmente pelo menos 10 vezes, particularmente pelo me- nos 15 vezes, mais particularmente pelo menos 20 vezes, porém es- pecialmente pelo menos 25 vezes mais alta que a afinidade de ligação a um monômero de Aβ N3pE.

[00130] Em ainda uma outra modalidade, são apresentados anti- corpos ou fragmentos dos mesmos descritos acima, que se ligam substancialmente a um Aβ agregado, incluindo placas de A, que con- têm Aβ N3pE, no cérebro de mamíferos, particularmente no cérebro humano, mas que, preferivelmente, não apresentam qualquer reativi- dade cruzada significativa com a proteína amiloide precursora (APP).

[00131] Em um outro aspecto da invenção, são apresentados anti- corpos ou fragmentos dos mesmos descritos acima, sendo que estes anticorpos ligam-se substancialmente ao amiloide oligomérico ou poli- mérico, que contém Aβ N3pE, particularmente  amiloide (A) no cé- rebro de mamíferos, particularmente no cérebro humano, mas que, preferivelmente, não apresentam qualquer reatividade cruzada signifi- cativa com a proteína amiloide precursora (APP).

[00132] A presente invenção também se refere a composições compreendendo os referidos anticorpos e ao uso das referidas compo- sições para o tratamento de amiloidose, especialmente para o trata- mento de doenças neurodegenerativas em um mamífero, em particular em um ser humano. A referida doença neurodegenerativa é em parti- cular selecionada do grupo que consiste em enfraquecimento cognitivo leve (MCI), mal de Alzheimer (AD), como, por exemplo, mal de Al- zheimer esporádico (SAD) ou demências familiares de Alzheimer (FAD) como demência familiar britânica (FBD) e demência familiar di- namarquesa (FDD), neurodegeneração na síndrome de Down. De pre- ferência, a referida doença neurodegenerativa é mal de Alzheimer.

[00133] Assim sendo, em uma modalidade preferida, a presente invenção está voltada para um método de tratamento e/ou prevenção de condições caracterizadas pela formação de placas compreendendo A N3pE em mamíferos, de preferência em humanos, método este que compreende administrar, de preferência perifericamente, a um humano com necessidade de tal tratamento uma quantidade terapeuti- camente ou profilaticamente eficaz de um anticorpo monoclonal da in- venção ou de um fragmento imunologicamente reativo do mesmo, sendo que o anticorpo se liga especificamente a um epitopo do peptí- deo A N3pE que carrega piroglutamato no terminal N.

[00134] Em uma outra modalidade, a invenção está voltada para um método para inibir a formação de placas amiloides e depurar ou remover placas amiloides em mamíferos, de preferência em humanos, método este que compreende administrar a um humano com necessi- dade de tal inibição uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga ao A N3pE na circulação, fluidos corporais ou tecidos, especialmente no cérebro e mais preferivelmente leva à depuração de A N3pE no plasma e no cérebro.

[00135] Por conseguinte, a invenção também apresenta métodos de reversão do declínio cognitivo, melhora da cognição, tratamento do declínio cognitivo, e prevenção do declínio cognitivo em um indivíduo diagnosticado com enfraquecimento cognitivo leve (MCI), mal de Al- zheimer (AD), como, por exemplo, mal de Alzheimer esporádico (SAD)

ou demências familiares de Alzheimer (FAD) como demência familiar britânica (FBD) e demência familiar dinamarquesa (FDD), neurodege- neração na síndrome de Down e angiopatia amiloide cerebral clínica ou pré-clínica, de preferência mal de Alzheimer, compreendendo ad- ministrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo da in- venção.

[00136] A invenção também apresenta o uso de um anticorpo da invenção para a produção de um medicamento, para o tratamento, a prevenção ou a reversão de enfraquecimento cognitivo leve (MCI), mal de Alzheimer (AD), como, por exemplo, mal de Alzheimer esporádico (SAD) ou demências familiares de Alzheimer (FAD) como demência familiar britânica (FBD) e demência familiar dinamarquesa (FDD), neu- rodegeneração na síndrome de Down e angiopatia amiloide cerebral clínica ou pré-clínica, de preferência mal de Alzheimer; ou para rever- ter o declínio cognitivo, melhorar a cognição, tratar o declínio cognitivo, e prevenir o declínio cognitivo em um indivíduo diagnosticado com en- fraquecimento cognitivo leve (MCI), mal de Alzheimer (AD), como, por exemplo, mal de Alzheimer esporádico (SAD) ou demências familiares de Alzheimer (FAD) como demência familiar britânica (FBD) e demên- cia familiar dinamarquesa (FDD), neurodegeneração na síndrome de Down e angiopatia amiloide cerebral clínica ou pré-clínica, de prefe- rência mal de Alzheimer.

[00137] A invenção apresenta ainda os anticorpos revelados neste pedido para uso na prevenção, no tratamento ou na reversão de en- fraquecimento cognitivo leve (MCI), mal de Alzheimer (AD), como, por exemplo, mal de Alzheimer esporádico (SAD) ou demências familiares de Alzheimer (FAD) como demência familiar britânica (FBD) e demên- cia familiar dinamarquesa (FDD), neurodegeneração na síndrome de Down e angiopatia amiloide cerebral clínica ou pré-clínica, de prefe- rência mal de Alzheimer; para o tratamento, a prevenção ou a rever-

são do declínio cognitivo, para a melhora da cognição, para o trata- mento do declínio cognitivo, e para a prevenção do declínio cognitivo em um indivíduo diagnosticado com enfraquecimento cognitivo leve (MCI), mal de Alzheimer (AD), como, por exemplo, mal de Alzheimer esporádico (SAD) ou demências familiares de Alzheimer (FAD) como demência familiar britânica (FBD) e demência familiar dinamarquesa (FDD), neurodegeneração na síndrome de Down e angiopatia amiloide cerebral clínica ou pré-clínica, de preferência mal de Alzheimer; ou pa- ra a inibição da formação de placas amiloides ou dos efeitos de A N3pE em mamíferos, de preferência em seres humanos.

[00138] Em uma modalidade específica, a invenção apresenta um método para reter ou aumentar a capacidade de memória cognitiva, mas, particularmente, para restaurar a capacidade de memória cogni- tiva de um mamífero, particularmente de um humano, que sofre de en- fraquecimento da memória por administração a um animal, particular- mente um mamífero ou um ser humano, de um anticorpo da invenção, ou de uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de acordo com a invenção e descrito mais acima.

[00139] A invenção apresenta ainda métodos para avaliação da resposta de um indivíduo humano ao tratamento com um anticorpo que se liga ao A N3pE ou a uma variante do mesmo, compreenden- do: a) administrar um anticorpo da invenção ou um fragmento do mesmo ao indivíduo; e b) medir a concentração de A N3pE em uma amostra bio- lógica coletada do indivíduo.

[00140] A invenção também apresenta um método para tratar um indivíduo humano com um anticorpo que se liga ao A N3pE ou a uma variante do mesmo, compreendendo: a) administrar uma primeira quantidade do anticorpo ou fra-

gmento do mesmo ao indivíduo; b) dentro de 3 horas a duas semanas depois da administra- ção da primeira dose, medir a concentração de A N3pE em uma amostra biológica coletada do indivíduo; c) se necessário, calcular uma segunda quantidade de anti- corpo ou fragmento do mesmo com base no resultado da etapa b), es- ta segunda quantidade sendo a mesma quantidade que a primeira quantidade ou diferente da primeira quantidade; e d) administrar a segunda quantidade do anticorpo ou frag- mento.

[00141] A invenção também inclui um método para avaliação em um mamífero, de preferência em um indivíduo humano, da eficácia de um anticorpo que se liga ao A N3pE, ou um fragmento do mesmo, para inibir ou prevenir a formação de placas amiloides relacionadas ao A N3pE, para redução da carga de placas contendo A N3pE, para redução dos efeitos do A N3pE tóxico e variante do mesmo, ou para tratamento de uma condição ou de uma doença associada a placas contendo A N3pE, compreendendo: a) obter uma primeira amostra biológica do indivíduo; b) medir uma concentração basal de A N3pE na primeira amostra; c) administrar um anticorpo da invenção ou fragmento do mesmo ao indivíduo; d) dentro de 3 horas a duas semanas depois da administra- ção do anticorpo ou fragmento do mesmo, obter uma segunda amostra biológica do indivíduo; e e) medir a concentração de A N3pE na segunda amostra biológica; onde a eficácia está relacionada com a quantidade de A N3pE ligada ao anticorpo no sangue e com a concentração de A N3pE, em particular a redução da concentração do mesmo, na segun-

da amostra biológica em relação à primeira amostra biológica.

[00142] A amostra biológica pode ser qualquer amostra, por exem- plo, proveniente de um ser humano. Em um exemplo específico, a amostra é uma amostra de tecido, uma amostra de fluido corporal ou uma amostra de célula. Em uma modalidade, a amostra biológica é selecionada do grupo que consiste em sangue, soro, urina, líquido ce- rebroespinhal (CSF), plasma, linfa, saliva, suor, fluido pleural, fluido sinovial, fluido lacrimal, bile e secreção do pâncreas. Em uma outra modalidade, a amostra biológica é plasma. Em uma modalidade prefe- rida, a amostra biológica é CSF.

[00143] A amostra biológica pode ser obtida de um indivíduo de maneira bastante conhecida pelo especialista na técnica. Em particu- lar, uma amostra de sangue pode ser obtida de um indivíduo e a amostra de sangue pode ser separada em soro e plasma por métodos convencionais. O indivíduo de quem a amostra biológica é obtida é de preferência um indivíduo com suspeita de estar acometido por uma doença ou condição de amiloidose, de preferência mal de Alzheimer, em risco de desenvolver mal de Alzheimer e/ou em risco de desenvol- ver ou ter qualquer outro tipo de demência. Em particular, a amostra é obtida de um indivíduo com suspeita de ter enfraquecimento cognitivo leve (MCI) e/ou de estar nos primeiros estágios do mal de Alzheimer.

[00144] A eficácia dos anticorpos da invenção no diagnóstico, na prevenção e/ou no tratamento de amiloidose, tal como enfraquecimen- to cognitivo leve, mal de Alzheimer, demência familiar britânica ou de- mência familiar dinamarquesa e, por exemplo, neurodegeneração na síndrome de Down pode ser testada em modelos animais existentes de mal de Alzheimer.

[00145] Modelos animais adequados de mal de Alzheimer estão recapitulados em McGowan et al. TRENDS in Genetics, Vol. 22, No. May 2006, pp 281-289, e são selecionados dentre PDAPP, Tg2576,

APP23, TgCRND8, PSEN1M146V ou PSEN1M146L, PSAPP, APPDutch, BRI- Aß40 e BRI-Aß42, JNPL3, TauP301S, TauV337M, TauR406W, rTg4510, Htau, TAPP, 3 x TgAD, como descrito abaixo.

[00146] PDAPP: Primeiro modelo transgênico de APP mutante com patologia de placas robusta. Os camundongos expressam um cDNA de APP humano com a mutação Indiana (APPV717F). A patologia de placas tem início entre 6-9 meses em camundongos PDAPP hemizigó- ticos. Há perda de sinapse, mas nenhuma perda evidente de células e patologia de NFT não é observada. Este modelo vem sendo ampla- mente usado em estratégias de terapia por vacinação.

[00147] Tg2576: Os camundongos expressam APPSWE mutante sob controle do promotor de príon de hamster. Patologia de placas é ob- servada a partir de 9 meses de idade. Estes camundongos apresen- tam deficiências cognitivas, mas não perda de células ou patologia de NFT. Este modelo é um dos modelos transgênicos mais amplamente usados no campo do mal de Alzheimer.

[00148] APP23: Os camundongos expressam APPSWE mutante sob controle do promotor Thy1. Amiloides cerebrovasculares proeminentes e depósitos de amiloides são observados a partir de 6 meses de idade e alguma perda neuronal hipocampal é associada à formação de pla- cas amiloides.

[00149] TgCRND8: Os camundongos expressam múltiplas muta- ções APP (Sueca mais Indiana). As deficiências cognitivas coincidem com o rápido desenvolvimento de placas extracelulares aproximada- mente aos 3 meses de idade. As deficiências cognitivas podem ser revertidas por terapia com vacinação com Aß.

[00150] PSEN1M146V ou PSEN1M146L (linhagens 6.2 e 8.9, respecti- vamente): Estes modelos foram a primeira demonstração in vivo de que PSEN1 mutante aumenta de forma seletiva o Aß42. Não se ob- serva patologia de placas evidente.

[00151] PSAPP (Tg2576 x PSEN1M146L, PSEN1-A246E + APPSWE): Camundongos transgênicos bigênicos, com a adição do transgene PSEN1 mutante que acelerou acentuadamente a patologia amiloide em relação a camundongos transgênicos unigênicos com APP mutan- te, demonstrando que o aumento de A42 induzido por PSEN1 au- menta a patologia de placas.

[00152] APPDutch: Os camundongos expressam APP com mutação dinamarquesa que causa hemorragia cerebral hereditária com amiloi- dose do tipo holandês em humanos. Os camundongos com APPDutch desenvolvem angiopatia amiloide congofílica severa. A adição de um transgene PSEN1 mutante redistribui a patologia amiloide para o pa- rênquima indicando papéis diferentes para A40 e A42 na patologia amiloide vascular e parenquimatosa.

[00153] BRI-Aß40 e BRI-Aß42: Os camundongos expressam iso- formas individuais de Aβ sem super-expressão de APP. Apenas os camundongos expressando Aβ42 desenvolvem placas senis e CAA, enquanto que os camundongos BRI-A40 não desenvolvem placas, sugerindo que A42 é essencial para a formação de placas.

[00154] JNPL3: Os camundongos expressam 4R0N MAPT com a mutação P301L. Este é o primeiro modelo transgênico, com patologia de emaranhado e perda celular acentuadas. Demonstrando que MAPT isolado pode causar danos e perda celulares. Os camundongos com JNPL3 desenvolvem enfraquecimentos motores com a idade devido à patologia severa e perda de neurônios motores no cordão espinhal.

[00155] TauP301S: Camundongos transgênicos expressando a iso- forma mais curta de 4R MAPT com a mutação P301S. Os camundon- gos homozigóticos desenvolvem paraparesia severa aos 5-6 meses de idade com patologia neurofibrilar disseminada no cérebro e no cordão espinhal e perda neuronal no cordão espinhal.

[00156] TauV337M: Síntese em nível baixo de 4R MAPT com a muta-

ção V337M (1/10 MAPT endógeno) induzida pelo promotor de fator de crescimento de derivados plaquetários (PDGF). O desenvolvimento de patologia neurofibrilar nesses camundongos sugere que a natureza do MAPT e não a concentração intracelular absoluta de MAPT induz a patologia.

[00157] TauR406W: Camundongos expressando MAPT 4R humano com a mutação R406W sob controle do promotor CAMKII. Os camun- dongos desenvolvem inclusões de MAPT no prosencéfalo a partir de 18 meses de idade e apresentam memória associativa enfraquecida.

[00158] rTg4510: Camundongos transgênicos com MAPT induzível usando o sistema TET-off. Patologia de MAPT anormal ocorre a partir de um mês de idade. Os camundongos apresentam patologia de NFT progressiva e perda celular severa. As deficiências cognitivas ficam evidentes a partir de 2,5 meses de idade. Desligamento do transgene melhora o desempenho cognitivo, mas a patologia de NT piora.

[00159] Htau: Camundongos transgênicos expressando apenas MAPT genômico humano (camundongo nocauteado para MAPT). Os camundongos com Htau acumulam MAPT hiperfosforilado a partir de 6 meses e desenvolvem NFT Thio-S-positivo até completarem 15 meses de idade.

[00160] TAPP (Tg2576 x JNPL3): Patologia de prosencéfalo com MAPT aumentada nos camundongos expressando TAPP com JNPL3 sugerindo que APP mutante e/ou Aβ podem afetar a patologia de MAPT a jusante.

[00161] 3xTgAD: Modelo triplo transgênico expressando APPSWE mutante, MAPTP301L em um fundo ‘knock-in’ de PSEN1M146V (PSNE1- KI). Os camundongos desenvolvem placas a partir de 6 meses e pato- logia de MAPT a partir de 12 meses de idade, reforçando a hipótese de que APP ou Aβ pode ter influência direta na patologia neurofibrilar.

[00162] Além disso, o documento WO 2009/034158 revela modelos de animais transgênicos não humanos, nos quais o transgene codifica pelo menos um peptídeo beta amiloide (Aβ) selecionado do grupo que consiste em AβN3E-42, AβN3Q-42, AβN3E-40 e AβN3Q-40. Estes peptídeos Aβ são substratos de QC e QPCTL, resultando na ciclização da glutamina (Q) ou glutamato (N) N-terminal para piroglutamato (pGlu). Assim sendo, estes modelos de animais transgênicos proporci- onam um sistema de modelo para investigação do efeito dos peptí- deos pGlu- Aβ durante o desenvolvimento da neurodegeneração.

[00163] Os anticorpos anti-Aβ pN3pE também podem ser úteis em ensaios diagnósticos para Aβ pN3pE, por exemplo, detectando sua ocorrência em células específicas, tecidos, ou soro. Assim sendo, os anticorpos de acordo com a presente invenção são especialmente úteis em um método de diagnóstico para detectar amiloidose, em par- ticular uma doença neurodegenerativa selecionada do grupo que con- siste em enfraquecimento cognitivo leve (MCI), mal de Alzheimer (AD), como, por exemplo, mal de Alzheimer esporádico (SAD) ou demências familiares de Alzheimer (FAD) como demência familiar britânica (FBD) e demência familiar dinamarquesa (FDD), neurodegeneração na sín- drome de Down; de preferência mal de Alzheimer.

[00164] Para aplicações em diagnóstico, o anticorpo será tipica- mente marcado com uma porção detectável. Encontram-se disponíveis numerosos marcadores que geralmente podem ser agrupados nas se- guintes categorias:

[00165] Radioisótopos, tais como 35S, 14C, 125I, 3H, e 131I. O an- ticorpo pode ser marcado com o radioisótopo por meio das técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Güti- gen et al., Ed., Wiley-Interscience. New York, New York. Pubs., (1991), por exemplo, e a radioatividade pode ser medida por contagem de cin- tilação.

[00166] Marcadores fluorescentes tais como quelatos de terras ra-

ras (quelatos de európio) ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, Lissamina, ficoeritrina e vermelho do Texas encontram-se disponíveis. Os marcadores fluorescentes podem ser conjugados ao anticorpo por meio das técnicas reveladas em Current Protocols in Immunology, supra, por exemplo. A fluorescência pode ser quantificada com um fluorímetro.

[00167] Vários marcadores de enzima-substrato encontram-se dis- poníveis. A enzima geralmente catalisa uma alteração química do substrato cromogênico que pode ser medida por meio de várias técni- cas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma mudança de cor em um substrato, que pode ser medida por espectrofotometria. Alternati- vamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou a quimiolumines- cência do substrato. Técnicas para a quantificaçõ de uma mudança na fluorescência estão descritas acima. O substrato quimioluminescente é eletronicamente excitado por uma reação química e pode então emitir luz que pode ser medida (com um quimioluminômetro, por exemplo) ou doar energia para um aceptor fluorescente. Exemplos de marcado- res enzimáticos incluem luciferases (por exemplo, luciferase de vaga- lume e luciferase bacteriana; Patente US N° 4,737,456), luciferina, 2,3- di-hidroftalazinadionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase tal como de peroxidase raiz-forte (HRPO), fosfatase alcalina, 0- galactosidase, glucoamilase, lisozima, oxidases sacarídicas (por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase, e glicose-6-fosfato desi- drogenase), oxidases heterocíclicas (tais como uricase e xantina oxi- dase), lactoperoxidase, microperoxidase, entre outros. Técnicas para conjugação de enzimas a anticorpos estão descritas em O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym (ed Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73: 147-166 (1981).

[00168] Exemplos de combinações de enzima-substrato incluem,

por exemplo: (i) peroxidase de raiz-forte (HRPO) com hidrogênio peroxi- dase como substrato, em que a hidrogênio peroxidase oxidiza um pre- cursor de corante (por exemplo, ortofenileno diamina (OPD) ou clori- drato de 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB)); (ii) fosfatase alcalina (AP) com para-nitrofenil fosfato como substrato cromogênico; e (iii) β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substrato cromo- gênico (por exemplo, p-nitrofenil-β-D-galactosidase) ou o substrato flu- orogênico 4-metilumbeliferil-β-D-galactosidase.

[00169] Numerosas outras combinações de enzima-substrato en- contram-se disponíveis para os especialistas na técnica.

[00170] Às vezes, o marcador é indiretamente conjugado com o an- ticorpo. O especialista na técnica tem conhecimento de várias técnicas para conseguir isto. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado com biotina e qualquer uma das três grandes categorias de marcadores mencionadas acima pode ser conjugada com avidina, ou vice-versa. A biotina liga-se seletivamente à avidina e, assim, o marcador pode ser conjugado com o anticorpo desta maneira. Alternativamente, para ob- ter a conjugação indireta do marcador com o anticorpo, o anticorpo é conjugado com um hapteno pequeno (por exemplo, digoxina) e um dos três tipos diferentes de marcadores acima é conjugado com o um anticorpo anti-hapteno (por exemplo, anticorpo anti-digoxina). Dessa forma, é possível obter a conjugação indireta do marcador com o anti- corpo.

[00171] Os anticorpos da presente invenção podem ser emprega- dos em qualquer método de ensaio conhecido, tal como ensaios de ligação competitiva, ensaios do tipo sanduíche diretos e indiretos, e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press. Inc., 1987)

[00172] Os ensaios de ligação competitiva dependem da capacida- de de um padrão marcado de competir com o analito da amostra de teste pela ligação com uma quantidade limitada de anticorpo. A quan- tidade de Aβ N3pE na amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade de padrão que fica ligada aos anticorpos. Para facilitar a determinação da quantidade de padrão que fica ligada, os anticorpos geralmente são insolubilizados antes ou depois da competição, de modo que o padrão e o analito que são ligados aos anticorpos possam ser convenientemente separados do padrão e do analito que perma- necem não ligados.

[00173] Os ensaios do tipo sanduíche envolvem o uso de dois anti- corpos, cada um deles sendo capaz de se ligar a uma porção imuno- gênica, ou epitopo, diferente da proteína a ser detectada. Em um en- saio do tipo sanduíche, o analito da amostra de teste é ligado por um primeiro anticorpo que é imobilizado sobre um suporte sólido, e depois disso um segundo anticorpo se liga ao analito, formando assim um complexo tripartite insolúvel. O segundo anticorpo pode ser ele próprio marcado com uma porção detectável (ensaios do tipo sanduíche dire- tos) ou pode ser medido por meio de um anticorpo anti-imunoglobulina que é marcado com a porção detectável (ensaios do tipo sanduíche indiretos). Por exemplo, um tipo preferido de ensaio do tipo sanduíche é um ensaio ELISA, em cujo caso a porção detectável é uma enzima.

[00174] Para imuno-histoquímica, a amostra de tecido pode ser fresca ou congelada ou pode ser incrustada em parafina e fixada com um conservante tal como formalina, por exemplo.

[00175] A presente invenção também se refere a uma composição que compreende os anticorpos definidos acima, em que a referida composição é uma composição para uso em diagnóstico, especial- mente para o diagnóstico de uma doença neurodegenerativa selecio- nada do grupo que consiste em enfraquecimento cognitivo leve (MCI),

mal de Alzheimer (AD), como, por exemplo, mal de Alzheimer esporá- dico (SAD) ou demências familiares de Alzheimer (FAD) como demên- cia familiar britânica (FBD) e demência familiar dinamarquesa (FDD), neurodegeneração na síndrome de Down; de preferência mal de Al- zheimer; em particular por detecção de Aβ N3pE ou variantes do mesmo em uma amostra biológica. Kits de diagnóstico

[00176] A título de conveniência, o anticorpo da presente invenção pode ser apresentado em um kit, i.e., uma combinação de reagentes embalados em quantidades predeterminadas com instruções para a realização de um ensaio diagnóstico. Quando o anticorpo for marcado com uma enzima, o kit incluirá substratos e cofatores requeridos pela enzima (por exemplo, um precursor de substrato que fornece o cromó- foro ou fluoróforo detectável). Além disso, é possível incluir outros adi- tivos tais como estabilizantes, tampões (por exemplo, tampão de blo- queio ou tampão de lise), entre outros. As quantidades relativas dos vários reagentes podem variar amplamente para proporcionar concen- trações em solução dos reagentes que otimizem significativamente a sensibilidade do ensaio. Particularmente, os reagentes podem ser apresentados como pós secos, usualmente liofilizados, incluindo exci- pientes que, ao serem diluídos, fornecerão uma solução do reagente com a concentração apropriada.

[00177] O kit de diagnóstico da invenção pode conter uma outra substância biologicamente ativa, como descrito abaixo. Especialmente preferido para uso no kit de diagnóstico como a referida outra substân- cia biologicamente ativa é um inibidor da glutaminil ciclase.

[00178] O kit de diagnóstico da invenção é especialmente útil para a detecção e o diagnóstico de doenças e condições associadas aos ami- loides, em particular doenças neurodegenerativas selecionadas do grupo que consiste em enfraquecimento cognitivo leve (MCI), mal de

Alzheimer (AD), como, por exemplo, mal de Alzheimer esporádico (SAD) ou demências familiares de Alzheimer (FAD) como demência familiar britânica (FBD) e demência familiar dinamarquesa (FDD), neu- rodegeneração na síndrome de Down; de preferência mal de Alzhei- mer.

[00179] A presente invenção também diz respeito ao anticorpo da invenção ou à composição compreendendo o anticorpo, ambos defini- dos acima, para uso em um método de diagnóstico in vitro. Em parti- cular, este método de diagnóstico está voltado para o diagnóstico de uma doença neurodegenerativa selecionada do grupo que consiste em enfraquecimento cognitivo leve (MCI), mal de Alzheimer (AD), como, por exemplo, mal de Alzheimer esporádico (SAD) ou demências fami- liares de Alzheimer (FAD) como demência familiar britânica (FBD) e demência familiar dinamarquesa (FDD), neurodegeneração na sín- drome de Down; de preferência mal de Alzheimer; especialmente pela detecção de um Aβ N3pE ou variantes do mesmo em uma amostra biológica.

[00180] Em uma modalidade particularmente preferida, a presente invenção diz respeito ao seguinte método:

[00181] Método de diagnóstico in vitro ou in situ para o diagnóstico de uma doença ou condição associada à proteína amiloide, de prefe- rência mal de Alzheimer, compreendendo as seguintes etapas: colocar um anticorpo de acordo com a invenção em contato com uma amostra, de preferência selecionada dentre uma amostra de soro, de licor ou de CSF, mais preferivelmente uma amostra de soro; ou uma parte específica do corpo ou uma área específica do corpo de um indivíduo com suspeita de estar acometido pela referida condição ou doença, e detectar a ligação do anticorpo ao Aβ N3pE, a partir da amostra.

[00182] Mais particularmente, a invenção refere-se a um método de diagnóstico de uma doença ou condição associada à proteína amiloi- de, de preferência mal de Alzheimer, compreendendo a detecção da ligação imunoespecífica de um anticorpo da invenção ou de um frag- mento imunologicamente do mesmo ao Aβ N3pE, em uma amostra ou in situ que inclui as etapas de: (a) colocar a amostra ou uma parte específica do corpo ou uma área específica do corpo com suspeita de conter a proteína ami- loide em contato com um anticorpo da invenção, ou um fragmento do mesmo; (b) permitir que o anticorpo e/ou uma parte funcional do mesmo se ligue ao Aβ N3pE para formar um complexo imunológico; (c) detectar a formação do complexo imunológico; e (d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imu- nológico com a presença ou ausência de Aβ N3pE na amostra ou na parte ou área específica do corpo.

[00183] Também está incluído um método para determinação da extensão da carga de placas amiloidogênicas em um tecido e/ou em fluidos corporais compreendendo: (a) obter uma amostra representativa do tecido e/ou dos fluidos corporais sendo investigados; (b) testar a amostra quanto à presença de proteína amiloide com um anticorpo de acordo com a invenção, ou um anticorpo quimé- rico ou um fragmento do mesmo; (c) determinar a quantidade de anticorpo ligada à proteína; e (d) calcular a carga de placas no tecido e/ou nos fluidos corporais.

[00184] Em particular, a invenção refere-se a um método para de- terminação da extensão da carga de placas amiloidogênicas em um tecido e/ou em fluidos corporais, em que a formação do complexo imunológico na etapa c) é determinada de modo que a presença ou ausência do complexo imunológico está correlacionada com a presen- ça ou ausência de proteína amiloide, em particular Aβ N3pE.

[00185] Em ainda uma outra modalidade, a invenção refere-se a uma composição compreendendo o anticorpo de acordo com a inven- ção, ou um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, e como descrito acima incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalen- te ou qualquer derivado ou partes funcionais do mesmo, em particular uma composição que é uma composição farmacêutica opcionalmente compreendendo ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00186] Em uma outra modalidade da invenção, a referida composi- ção compreende o anticorpo da invenção em uma quantidade terapeu- ticamente eficaz.

[00187] Também compreendida pela invenção encontra-se uma mistura compreendendo um anticorpo da invenção, ou um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, e, como descrito mais acima, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou qualquer derivado ou partes funcionais do mesmo, em uma quantidade terapeu- ticamente eficaz e, opcionalmente, uma outra substância biologica- mente ativa e/ou uma um carreador e/ou um diluente e/ou um excipi- ente farmaceuticamente aceitáveis.

[00188] Em particular, a invenção refere-se a uma mistura, em que a outra substância biologicamente ativa é um composto usado na me- dicação de amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados à proteína amiloide ou semelhante ao amiloide tal como Aβ N3pE en- volvida em doenças neurodegenerativas selecionadas do grupo que consiste em enfraquecimento cognitivo leve (MCI), mal de Alzheimer (AD), como, por exemplo, mal de Alzheimer esporádico (SAD) ou de- mências familiares de Alzheimer (FAD) como demência familiar britâ-

nica (FBD) e demência familiar dinamarquesa (FDD), neurodegenera- ção na síndrome de Down; de preferência mal de Alzheimer.

[00189] Em uma outra modalidade da invenção, a outra substância ou composto biologicamente ativo também pode ser um agente tera- pêutico que pode ser usado no tratamento de amiloidose causada por Aβ N3pE ou pode ser usado na medicação de outros distúrbios neuro- lógicos.

[00190] A outra substância ou composto biologicamente ativo pode exercer seu efeito biológico pelo mesmo mecanismo ou por um meca- nismo similar ao anticorpo de acordo com a invenção ou por um me- canismo de ação não relacionado ou por uma multiplicidade de meca- nismos de ação relacionados e/ou não relacionados.

[00191] Geralmente, o outro composto biologicamente ativo pode incluir potencializadores da neurotransmissão, drogas psicoterapêuti- cas, inibidores da acetilcolina esterase, bloqueadores do canal de cál- cio, aminas biogênicas, tranquilizantes benzodiazepínicos, síntese de acetilcolina, potencializadores do armazenamento ou da liberação, agonistas do receptor pós-sináptico de acetilcolina, inibidores da mo- noamina oxidase-A ou -B, antagonistas do receptor de N-metil-D- aspartato glutamato, drogas anti-inflamatórias não esteroides, antioxi- dantes, e antagonistas do receptor serotonérgico.

[00192] Mais particularmente, a invenção refere-se a uma mistura compreendendo pelo menos um composto selecionado do grupo que consiste em compostos eficazes contra estresse oxidativo, compostos antiapoptóticos, quelantes metálicos, inibidores do reparo de DNA, tais como pirenzepina e metabólitos, ácido 3-amino-1-propanossulfônico (3 APS), 1,3-propanodissulfonato (1,3PDS), ativadores da α-secretase, inibidores da - e γ-secretase, proteínas tau, neurotransmissores, quebradores de folhas atraentes para componentes celulares depu- radores / depletores de beta amiloide, inibidores de beta amiloide trun-

cado N-terminal incluindo beta amiloide 3-42 piroglutamado, tal como inibidores de glutaminil ciclase, moléculas anti-inflamatórias, ou inibi- dores da colinesterase (ChEIs) tais como tacrina, rivastigmina, do- nepezil, e/ou galantamina, agonistas de Ml e outras drogas incluindo quaisquer drogas modificadoras de amiloide ou tau e suplementos nu- tricionais junto com um anticorpo de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitáveis.

[00193] A invenção refere-se ainda a uma mistura, em que o com- posto é um inibidor da colinesterase (ChEIs), particularmente uma mis- tura em que o composto é um composto selecionado do grupo que consiste em tacrina, rivastigmina, donepezil, galantamina, niacine e memantina.

[00194] Em uma outra modalidade, a mistura de acordo com a in- venção pode compreender niacina ou memantina junto com um anti- corpo de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um car- reador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitá- veis.

[00195] Em uma outra modalidade, as misturas de acordo com a invenção podem compreender um inibidor da glutaminil ciclase junto com um anticorpo de acordo com a presente invenção e, opcionalmen- te, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceutica- mente aceitáveis.

[00196] Inibidores de glutaminil ciclase preferidos estão descritos nos documentos WO 2005/075436, WO 2008/055945, WO 2008/055947, WO 2008/055950, WO 2008/065141, WO 2008/110523, WO 2008/128981, WO 2008/128982, WO 2008/128983, WO 2008/128984, WO 2008/128985, WO 2008/128986, WO 2008/128987, WO 2010/026212, WO 2011/131748, WO 2011/029920, WO 2011/107530, WO 2011/110613, WO 2012/123563 e WO

2014/140279, cujas descrições encontram-se aqui incorporadas a títu- lo de referência.

[00197] Em ainda uma outra modalidade da invenção são apresen- tadas misturas que compreendem "antipsicóticos atípicos" tais como, por exemplo, clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazol ou olan- zapina para o tratamento de sintomas psicóticos positivos e negativos incluindo alucinações, delírios, distúrbios do pensamento (manifesta- dos por incoerência acentuada, descarrilhamento, tangentialidade), e comportamento bizarro ou desorganizado, assim como anedonia, afeto aplainado, apatia, e distanciamento social, junto com um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, ou um anticorpo ou um fragmento mesmo de acordo com a invenção e descrito mais acima e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitáveis.

[00198] Em uma modalidade específica da invenção, as composi- ções e as misturas de acordo com a invenção e descritas mais acima compreendem o anticorpo da invenção e a substância biologicamente ativa, respectivamente, em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

[00199] Outros compostos que podem ser adequadamente usados nas misturas em combinação com o anticorpo de acordo com a pre- sente invenção estão escritos no documento WO2008/065141 (vide especialmente páginas 37/38), incluindo inibidores de PEP (págs. 43/44), LiCl, inibidores de dipeptidil aminopeptidases, de preferência inibidores de DP IV ou de enzimas semelnantes ao DP IV (vide págs. 48/49); inibidores da acetilcolinesterase (ACE) (vide pág. 47), poten- cializadores de PIMT, inibidores de beta secretases (vide pág. 41), ini- bidores de gama secretases (vide págs. 41/42), inibidores da endopep- tidase neutra, inibidores da fosfodiesterase-4 (PDE-4) (vide págs. 42/43), inibidores de TNFalfa, antagonistas do receptor de M1 musca-

rínico (vide pág. 46), antagonistas do receptor de NMDA (vide págs. 47/48), inibidores do receptor de sigma-1, antagonistas da histamina H3 (vide pág. 43), agentes imunomoduladores, agentes imunossu- pressores ou um agente selecionado do grupo que consiste em ante- gren (natalizumab), Neurelan (fampridine-SR), campath (alemtuzu- mab), IR 208, NBI 5788/MSP 771 (tiplimotida), paclitaxel, Anergix.MS (AG 284), SH636, Differin (CD 271, adapaleno), BAY 361677 (interleu- cina-4), inibidores da metaloproteinase matricial (por exemplo, BB 76163), interferon-tau (trophoblastin) e SAIK-MS; anticorpos beta- amiloides (vide pág. 44), inibidores da cisteína protease (vide pág. 44); antagonistas de MCP-1 (vide págs. 44/45), inibidores da deposição da proteína amiloide (vide pág. 42) e inibidores da síntese de beta amiloi- de (vide pág. 42), este documento estando aqui incorporado a título de referência.

[00200] Em uma outra modalidade, a invenção refere-se a uma mis- tura compreendendo o anticorpo de acordo com a invenção, ou um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo descrito mais acima e/ou a substância biologicamente ativa em uma quantidade terapeuti- camente eficaz.

[00201] As composições farmacêuticas podem ser formuladas com carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis bem como com quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos de acordo com técnicas convencionais tais como aquelas reveladas em Reming- ton: The Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 2005.

[00202] Os carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis bem como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos de- vem ser adequados para o anticorpo escolhido da presente invenção e para o modo de administração escolhido. A adequabilidade a carrea- dores e outros componentes das composições farmacêuticas é deter-

minada com base na falta de impacto negativo significativo nas propri- edades biológicas desejadas do anticorpo ou da composição farma- cêutica escolhida da presente invenção (por exemplo, menor que um impacto substancial (10% ou menos de inibição relativa, 5% ou menos de inibição relativa, etc.)) na ligação ao antígeno.

[00203] Uma composição farmacêutica da presente invenção tam- bém pode incluir diluentes, cargas, sais, tampões, detergentes (por exemplo, um detergente não iônico, tal como Tween-20 ou Tween- 80), estabilizantes (por exemplo, açúcares ou aminoácidos livres de proteínas), conservantes, fixadores de tecido, solubilizantes, e/ou ou- tros materiais adequados para inclusão em uma composição farma- cêutica.

[00204] Os níveis de dosagem efetivos dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem variar de forma a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz pa- ra atingir a resposta terapêutica desejada para um paciente, uma composição e um modo de administração específicos. O nível de do- sagem selecionado vai depender de uma variedade de fatores farma- cocinéticos que incluem a atividade das composições particulares da presente invenção empregadas, ou da amida das mesmas, da via de administração, do tempo de administração, da taxa de excreção do anticorpo específico sendo empregado, da duração do tratamento, de outras drogas, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, da idade, sexo, peso, con- dição, estado geral de saúde e histórico médico do paciente sendo tra- tado, e de fatores semelhantes bastante conhecido nas artes médicas.

[00205] A composição farmacêutica pode ser administrada por qualquer via e qualquer modo adequados. Vias adequadas para admi- nistração de um anticorpo da presente invenção in vivo e in vitro são bastante conhecidas na técnica e podem ser selecionados pelos espe-

cialistas na técnica.

[00206] Em uma modalidade, uma composição farmacêutica da presente invenção é administrada por via parenteral.

[00207] As expressões "administração parenteral" e "administrado por via parenteral", conforme usadas neste pedido, significam modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, nor- malmente por injeção, e incluem injeção e infusão epidérmica, intrave- nosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, intratendinosa, transtra- queal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subarac- noide, intraespinhal, intracraniana, intratorácica, epidural e intrasternal.

[00208] Em uma modalidade a composição farmacêutica é adminis- trada por injeção ou infusão intravenosa ou subcutânea.

[00209] Carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem todo e qualquer solvente, meio de dispersão, revestimento, agentes antibac- terianos e antifúgicos, agentes isotônicos, antioxidantes e agentes re- tardadores da absorção adequados, entre outros, que sejam fisiologi- camente compatívei com um anticorpo da presente invenção.

[00210] Exemplos de carreadores aquosos e não aquosos adequa- do que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da presente invenção incluem água, solução salina, solução salina tam- ponada com fosfato, etanol, dextrose, polióis (tais como glicerol, propi- leno glicol, polietileno glicol, entre outros), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais tais como óleo de oliva, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de algodão, e óleo de gergelim, soluções coloidais de carboximetil celulose, goma tragacanto e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila, e/ou vários tampões. Outros carreadores são bastante conhecidos no campo farmacêutico.

[00211] Carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem solu- ções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso destes meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido no estado da técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o anticorpo ativo, seu uso nas composições farmacêuticas da presente invenção é con- templado.

[00212] A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos.

[00213] As composições farmacêuticas da presente invenção tam- bém podem compreender antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido as- córbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e similares; (2) antioxidantes solúveis em água, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxi- tolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propila, alfa-tocoferol, e simi- lares; e (3) agentes quelantes metálicos, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fos- fórico e similares.

[00214] As composições farmacêuticas da presente invenção tam- bém podem compreender agentes isotônicos, tais como açúcares, po- liálcoois, tais como manitol, sorbitol, glicerol ou cloreto de sódio nas composições.

[00215] As composições farmacêuticas da presente invenção tam- bém podem conter um ou mais adjuvantes apropriados para a via de administração escolhida tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, agentes dispersantes, conservantes ou tam- pões, que podem aumentar a vida de prateleira ou a eficácia das com- posições farmacêuticas. Os anticorpos da presente invenção podem ser preparados com carreadores que vão proteger o anticorpo contra liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos, e sistemas de distribui- ção microencapsulados. Estes carreadores podem incluir gelatina, monoestearato de glicerila, diestearato de glicerila, polímeros biode- gradáveis e biocompatíveis tais como etileno-acetato de vinila, poliani- dridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido poliláctico isolado ou com uma cera, ou outros materiais bastante conhecidos no estado da técnica. Métodos para a preparação de tais formulações são conhecidos em geral conhecidos pelos especialistas na técnica. Vide, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Sys- tems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[00216] Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção podem ser formulados para garantir sua distribuição apropriada in vivo. Carreadores farmaceuticamente aceitáveis para administração paren- teral incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso destes meios e agentes para substâncias farmaceuti- camente ativas é conhecido no estado da técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o anticorpo ativo, seu uso nas composições farmacêuticas da presente invenção é contemplado.

[00217] As composições farmacêuticas para injeção devem ser tipi- camente estéreis e estáveis nas condições de produção e armazena- mento. A composição pode ser formulada como uma solução, microe- mulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração da droga. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão aquoso ou não aquoso contendo, por exemplo, água, etanol, dextrose, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, entre outros), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais tais como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como glicerol, manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetá- veis pode ser ocasionada pela inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelati- na. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incor- poração do anticorpo na quantidade requerida em um solvente apro- priado com um ingrediente ou com uma combinação de ingredientes, por exemplo, como os citados acima, conforme necessário, seguida por microfiltração com esterilização. Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorporação do anticorpo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes neces- sários, por exemplo, dentre aqueles citados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, exemplos de métodos de preparação são secagem a vácuo e secagem por con- gelamento (liofilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução do mesmo previamente filtrada estéril.

[00218] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação do anticorpo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ingrediente ou com uma combinação de ingredien- tes citados acima, conforme necessário, seguida por filtração com es- terilização. Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorpora- ção do anticorpo em um veículo estéril que contém um meio de dis- persão básico e os outros ingredientes necessários, por exemplo, den- tre aqueles citados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, exemplos de métodos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente dese- jado adicional de uma solução do mesmo previamente filtrada estéril.

[00219] Os regimes de dosagem nos métodos de tratamento e usos acima são ajustados para proporcionar a resposta desejada ideal (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, pode ser adminis- trado um único bolo, várias doses fracionadas podem ser administra- das ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcional reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêuti- ca. As composições parenterais podem ser formuladas em uma forma unitária de dosagem tendo em vista a facilidade de administração e a uniformidade da dosagem. Forma unitária de dosagem, conforme usa- do neste pedido, refere-se a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de anticorpo calcula- da para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carreador farmacêutico requerido. A especificação das formas unitá- rias de dosagem da presente invenção será ditada e diretamente de- pendente (a) das características únicas do anticorpo e do efeito tera- pêutico particular a ser obtido, e (b) das limitações inerentes na técnica de compoundagem de tal anticorpo para o tratamento de sensibilidade nos indivíduos.

[00220] As dosagens eficazes e os regimes de dosagem para os anticorpos da invenção dependem da doença ou condição a ser trata- da e podem ser determinados pelos especialistas na técnica. Uma fai- xa exemplificativa e não limitativa para uma quantidade terapeutica- mente eficaz de um anticorpo da presente invenção é de cerca de 0,1 - 10 mg/kg/peso corporal, tal como cerca de 0,1-5 mg/kg/peso corporal, por exemplo, cerca de 0,1-2 mg/kg/peso corporal, tal como cerca de

0,1-1 mg/kg/peso corporal, por exemplo, cerca de 0,15, cerca de 0,2, cerca de 0,5, cerca de 1, cerca de 1,5 ou cerca de 2 mg/kg/peso cor- poral.

[00221] Um médico ou veterinário com conhecimento técnico pode facilmente determinar e prescrever a quantidade eficaz da composição farmacêutica necessária. Por exemplo, o médico ou veterinário poderia começar com doses do anticorpo 8ηίί-ΑβρΕ3 empregado na composi- ção farmacêutica em níveis mais baixos que aquele requerido para atingir o efeito terapêutico desejado e aumentar gradativamente a do- sagem até atingir o efeito desejado. Em geral, uma dose diária ade- quada de uma composição da presente invenção será aquela quanti- dade de anticorpo que é a dose mais baixa eficaz para produzir um efeito terapêutico. Esta dose eficaz geralmente vai depender dos fato- res descritos acima. A administração pode ser, por exemplo, intrave- nosa, intramuscular, intraperitoneal, ou subcutânea, e, por exemplo, administrada próximo ao sítio do alvo. Se desejado, a dose diária efi- caz de uma composição farmacêutica pode ser administrada como duas, três, quatro, cinco, seis ou mais subdoses administradas sepa- radamente em intervalos apropriados ao longo do dia, opcionalmente, em formas unitárias de dosagem. Embora seja possível que um anti- corpo da presente invenção seja administrado isoladamente, é preferí- vel que o anticorpo seja administrado como uma composição farma- cêutica como descrito acima.

EXEMPLOS

1. Abordagem de humanização para gerar anticorpos específicos para N3pE-Aβ

[00222] Os anticorpos humanizados e desimunizados de acordo com a invenção são formas humanizadas e desimunizadas de anticor- pos monoclonais de camundongo que são produzidos pela linhagem celular de hibridoma A 6-1-6 (Depósito N° DSM ACC 2924), que está descrito no documento WO 2010/009987. A humanização foi feita da maneira descrita no documento WO 2017/009459. O Exemplo Prático 1 revelado nas págs. 58-60 do documento WO 2017/009459 está aqui incorporado a título de referência.

2. Isolamento de RNA e síntese de cDNA

[00223] Como fonte de sequências constantes, o RNA de células B humanas foi isolado por lise de 500 µl de sangue total com 5 ml de so- lução de lise 1x FACS (Becton Dickinson) por 10 minutos à temperatu- ra ambiente. O lisado foi centrifugado a 300g por 5 minutos; a pelota foi lavada duas vezes com PBS e foi então resolvida em 350 µl de tampão RA1 do Nucleo Spin ® RNA II (Macherey-Nagel) e acrescida de 3,5µl de TCEP 0,5M (SIGMA). O RNA foi isolado de acordo com as instruções do fabricante. 10 µl de RNA foram primeiro incubados com 1µl de OligodT Primer 0,5 µg/µl (Invitrogen) e 1µl de dNTPs 10mM por 5 minutos a 65°C. Em seguida 4 µl de tampão 5x First Strand (Invitro- gen), 2 µl de 100mM DTT e 0,5 µl de SuperScript III Reverse Transcri- ptase (Invitrogen) foi adicionado até completar 20 µl e a mistura foi in- cubada por 5 minutos a 25 °C, 50 minutos a 50°C e 15 minutos a 70°C. Por PCR com os pares de iniciadores mostrados na Tabela 2, foi possível amplificar o cDNA sintetizado da região constante da ca- deia leve e da cadeia pesada. Tabela 2: Iniciador para clonagem da região constante SEQ ID Nome Sequência

NO 43 hkappa5’ ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTC 44 hkappa3’ CTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC 45 hIgG1Hc5’1 AGGGAACCCTGGTCACCGTCTCC 46 hIgG1Hc3’ TCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG

[00224] Para amplificação do produto de PCR da cadeia leve do clone#6 foram usados os seguintes iniciadores diretos e reversos; RT_chim_humKl6f: CAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTG (SEQ ID NO:

47); RT_chim_humKl6r: GTACCTTGCACGCAGTAATAAAC (SEQ ID NO: 48).

[00225] Para amplificação do gene de referência, foi usado o inicia- dor HPRT de camundongo.

[00226] Para realizar a amplificação foram usados no ciclizador 7,5 µl de Sybergreen (Firma), 1 µl de iniciador direto (25 pmol/µl), 1 µl de iniciador reverso (25 pmol/µl), 5,5 µl de ddH2O e 1 µl de cDNA.

3. Expressão de anticorpo recombinante em células CHO por clo- nagem separada de LC e HC em dois plasmídios de expressão diferentes

[00227] As sequências da cadeia leve e da cadeia pesada dos anti- corpos foram clonadas separadamente em dois vetores de expressão de mamífero diferentes, pCDNA3,1 e HC-pOptiVEC respectivamente. Para identificar a combinação de vetores ideal para expressar o anti- corpo recombinante em uma cultura de células CHO, diferentes com- binações de plasmídios foram usadas para realizar expressões transi- tórias em células CHO aderentes. Em uma segunda etapa, foi investi- gado se diferentes proporções de DNA entre o plasmídio LC e o HC influenciam o nível de expressão. Com transfecção de 3 μg de LC- pCDNA33.1 e 1 μg de HC-pOptiVEC, verificou-se um nível de expres- são aumentado.

[00228] Para expressão do anticorpo em células CHO aderentes adicionais, foi usada a combinação de plasmídios LC-pCDNA3.1 e 1 μg de HC-pOptiVEC e uma proporção de DNA plasmídico de LC 3:1 HC.

[00229] Células CHO em suspensão Freestyle™ foram usados nas transfecções seguintes para cultivar uma maior quantidade de células de expressão transitória que geram anticorpos recombinantes. Primei- ro foi testado se um excesso de plasmídio LC poderia melhorar a ex-

pressão do anticorpo como no caso das células aderentes. Como nas células CHO aderentes, foi usada uma proporção de DNA plasmídico LC para HC de 1:1 e 3,1. Análise da mancha ocidental revelou que um excesso de plasmídio LC aumenta a expressão do anticorpo como no caso das células CHO aderentes. Ao se medir a viabilidade celular, fica óbvio que a viabilidade celular cai para cerca de 50% das células transfectadas depois de 6 dias. Depois do sexto dia, não foi detectável novo aumento do nível de anticorpo no sobrenadante. Consequente- mente, os sobrenadantes das culturas foram coletados no sexto dia no caso das transfecções seguintes.

[00230] Para investigar se os anticorpos produzidos são transporta- dos de forma eficiente para o sobrenadante celular, uma amostra do lisado celular foi aplicada a SDS PAGE, e analisada por análise da mancha ocidental. GAPDH, uma proteína citoplasmática zeladora foi usada como referência para comparar as quantidades de carga de proteína no lisado celular com o gel de SDS. No lisado celular do anti- corpo expressando células CHO ocorre uma banda forte de 120 kDa migrando no mesmo tamanho que aquele detectado no sobrenadante celular.

4. Purificação do anticorpo recombinante por cromatografia da Proteína G

[00230] O anticorpo clone#6 foi purificado para investigar a proprie- dade de ligação a antígeno da proteína em comparação com o anti- corpo murino original. Assim sendo, 300 ml de sobrenadante com anti- corpo quimérico e humanizado expresso foram produzidos e purifica- dos por cromatografia da Proteína G. Como a quantidade de anticorpo expresso foi muito baixa, o rendimento foi menor que 0,1 μg/ml, em um total de 25 μg de proteína purificada. O anticorpo eluído foi concentra- do até cerca de 200 μg/ml e 2 μg proteína foram aplicados a SDS- PAGE depois de coloração por azul de Coomassie.

5. Geração de uma linhagem celular estável do anticorpo humani- zado

[00231] O anticorpo parental do anticorpo humanizado da presente invenção é a variante clone#6 revelada no documento WO 2017/009459, que possui a região variável da cadeia leve com a se- quência de aminoácidos:

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPG

QSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC VQGTHFPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 1), que está apresentada como SEQ ID NO: 14 no documento WO 2017/009459; e que possui a região variável da cadeia pesada com a sequência de aminoácidos:

QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGL

EWMGLINPSNGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTA TYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 49); que está apresentada como SEQ ID NO: 27 no documento WO 2017/009459.

[00232] Dois clones, C06.08 e C06.09, da variante clone#6 parental foram escolhido para gerar uma linhagem celular estável. Para a gera- ção de células DG44 de ovário de hamster chinês (CHO) produtoras de C06.08 e C06.09, primeiro foram gerados plasmídios de expressão contendo as sequências dos genes da cadeia pesada e da cadeia leve para os dois anticorpos. Os plasmídios foram linearizados, purificados por precipitação em isopropanol, reconstituídos em Tris 10 mM pH 8,0 e usados em transfecções da seguinte maneira: 1 x 106 células CHO- DG44 foram suspendidas em 100 µL de solução de Nucleofector V (Lonza) e misturadas com 10 µg de DNA de vetor linearizado. A sus- pensão foi pulsada com um eletroporador Amaxa Nucleofector II (Lon- za). Em seguida, 500 µL de meio CD CHO (Invitrogen) foram adicio- nados e as poças de células transfectadas foram cultivadas por 24 ho-

ras.

[00233] Para gerar minipoças estáveis (MPs), as poças de células transfectadas foram combinadas um dia depois da transfecção, trans- feridas para o meio CD CHO e semeadas a 2000 células/poço e 4000 células/poço em placas de 96 poços, respectivamente, ou transferidas para o meio CD CHO com metotrexato (MTX) 2,5 nM e semeadas a 4000 células/poço em placas de 96 poços. Depois de um período de cultivo de 21 (C06.08) ou 27 (C06.09) dias, 20 MPs foram transferidas para placas de 24 poços. No dia 22 ou no dia 28 após a transfecção, as MPs foram transferidas para placas de 12 poços e as MPs foram expandidas para placas de 6 poços no dia 34 ou no dia 48. No dia 34 (C06.08) ou 48 (C06.,09), as poças foram transferidas para um meio seletivo com MTX 30 nM para induzir o processo de amplificação e os títulos de expressão de anticorpo foram determinadas por medidas Oc- tet. Resultados Tabela 2. Análise das minipoças estáveis de C06.08 Dia 1 Dia 21 Dias 34 a 72 MPs selecionadas Amplificação em MTX 2000 células/poço #1-10 Sem crescimento celular; 4000 células/poço #11-15 produção muito baixa ou 4000 células/poço e sem produção de anticorpo #15-20 2,5 nM MTX Tabela 3. Análise das minipoças estáveis de C06.09 Dia 1 Dia 27 Dias 48 a 52 MPs selecionadas Amplificação em MTX 2000 células/poço #1-10 Sem crescimento celular; 4000 células/poço #11-15 produção muito baixa ou 4000 células/poço & #15-20 sem produção de anticorpo 2,5 nM MTX

[00234] Como resumido nas Tabelas 2 e 3, todas as MPs apresen- taram pouco crescimento celular, produção muito baixa de anticorpos a nenhuma produção detectável de anticorpos (<10 pg/célula/dia) e muitas MPs não sobreviveram à amplificação com MTX. Experimen- tos de transfecção repetitiva com um novo conjunto de reagentes leva- ram a resultados semelhantes, ao passo que transfecção com vetores de controle resultou em níveis normais de expressão de proteína. Es- tes resultados sugeriram que as proteínas C06.08 e C06.09 integradas no genoma podem ter efeitos tóxicos inerentes nas células CHO- DG44, por exemplo, estas proteínas podem desencadear morte celular devido à superexpressão das proteínas C06.08 e C06.09 mal enrola- das no núcleo. Outras modificações na sequência primária da C06.08 e da C06.09 são garantidas, o que corrige o mal-enrolamento da prote- ína e elimina a indução de morte das células CHO-DG44. Modificações de PBD-C06 para melhorar o enrolamento e a expressão da proteína

[00235] A análise in silico das sequências de aminoácidos de C06 revelou diversos trechos de aminoácidos (manchas) nas regiões de esqueleto da cadeia pesada que foram propostas para influenciar de forma negativa o enrolamento da proteína. Para examinar se estas manchas poderiam ser trocadas por aminoácidos alternativos que me- lhoram a expressão da proteína, quatro mutações individuais na ca- deia pesada (K12V, S14P, N55D e F64V) primeiro foram sintetizadas e testadas individualmente em transfecções transitórias para expressão da proteína junto com a cadeia leve de SEQ ID NO: 17. Os estudos de ligação alvo revelaram que a modificação F64V impediu a ligação do anticorpo. Em segundo conjunto de experimentos, combinações de cada mutação foram integradas em pares e tripletos em genes indivi- duais da cadeia pesada e testadas em combinação com a cadeia leve de SEQ ID NO: 17 para estudos da expressão e da ligação alvo (Figs.

1 e 2). Resultados

[00236] A combinação das mutações K12V, S14P e N55D resultou nos melhores títulos de expressão de C06 transitória e propriedades ideais de ligação ao alvo (Figs. 1 e 2) e um clone respectivo compre- endendo todas estas três mutações foi selecionado para estudos de transfecção estável de CHO-DG44. Expressão estável do anticorpo humananizado em células CHO-DG44

[00237] As células CHO-DG44 parentais foram originalmente adqui- ridas na Gibco, Life Technologies (FreedomTM DG44 Kit) atualmente controlada pela Thermo Fisher Scientific. A linhagem de células CHO é deficiente em DHFR e cGMP depositado com documentação.

[00238] A transfecção de células CHO-DG44 com vetores expres- sando um anticorpo humanizado compreendendo a cadeia leve de SEQ ID NO: 1 e a cadeia pesada de SEQ ID NO: 2 (que compreende as mutações K12V, S14P e N55D) resultou em um número várias ve- zes maior de clones de CHO-DG44 em relação às tentativas de trans- fecção anteriores (vide acima). Além disso, depois de exposição a MTX, foram identificados vários clones com altos níveis de expressão do anticorpo alvo, revelando que as mutações K12V, S14P e N55D melhoraram o enrolamento e a expressão do anticorpo depois de inte- gração estável no genoma de CHO-DG44. Expressão estável prolon- gada foi confirmada em condições intermitentes durante períodos de cultivo prolongados confirmando que as alterações escolhidas (K12V, S14P e N55D) na cadeia pesada do clone#6 parental facilitaram o en- rolamento e a expressão apropriados em células CHO-DG44.

[00239] Linhagens celulares estáveis adicionais foram obtidas de- pois de nova otimização do vetor e da eletroporação. Os transfectan- tes iniciais, antes da amplificação gênica, expressavam níveis altos de anticorpo logo depois do isolamento e expansão para culturas de 0,5 ml em uma placa de 24 poços (Fig. 3). Os títulos de produção no 7° dia aumentaram ainda mais depois da primeira exposição a MTX (Fig. 4), sugerindo que estes clones, em particular c17, seriam um produtor muito mais eficiente. Sumário

[00240] Quatro mutações da cadeia pesada foram testadas indivi- dualmente para verificar se elas aumentariam a expressão do anticor- po em células HEK293 transfectadas de forma transitória. Três destas mutações aumentaram significativamente a expressão do anticorpo ao passo que quatro delas diminuíram a expressão. Combinações das mutações individuais também foram testadas em pares e a mutação tripla, todas elas sendo bem expressas e purificadas por cromatografia da proteína A. Através da análise Biacore foi constatado que a combi- nação de quatro mutações diminuiu a ligação ao passo que a combi- nações das mutações específicas K12V, S14P e N55D foram bem ex- pressas e apresentaram propriedades de ligação ótimas. Não foram necessárias alterações nas sequências da cadeia leve para que a ex- pressão fosse alta.

[00241] Estudos foram realizados em células CHO DG44 estavel- mente transfectadas e níveis mais altos de expressão do anticorpo fo- ram obtidos depois da seleção inicial e subsequente à amplificação gênica induzida por aumentos escalonados de metotrexato (MTX). Observou-se ainda que níveis mais altos de expressão do anticorpo não impediram crescimento celular satisfatório. Em suma, a campanha de transfecção levou à identificação de diversos novos candidatos pa- ra a produção de CMC.

5. Medição através de ressonância de plasmon de superfície para analisar a ligação do anticorpo humanizado e desimunizado a peptídeos A monoméricos

[00242] A medição através de ressonância de plasmon de superfí-

cie foi usada para investigar a eficácia de ligação do anticorpo, que compreende a parte variável da cadeia leve com SEQ ID NO. 1 e a parte variável da cadeia pesada com SEQ ID NO. 2. Para prevenir os efeitos da transferência de massa e da avidez durante a medição, foi usado o seguinte procedimento.

[00243] Primeiro, um anticorpo humano α policlonal foi acoplado a um SPR-Chip subsequentemente carregado com o anticorpo até que a Unidade de Resposta fosse superior a 1000.

[00244] As medições cinéticas foram feitas a diferentes concentra- ções (de 5 a 1000 nM) do peptídeo Aβ. Os gráficos das séries medidas estão mostrados como um como um gráfico de sobreposição com os sensorgramas, corrigido pelo sensorgrama medindo o tampão de cor- rida, alinhado ao tempo de injeção e a linha basal ajustada em zero antes da injeção. Os resultados foram avaliados de acordo com um modelo de interação 1:1 simples (ajuste de Langmuir), que promove as constantes de taxa koff e kon.

[00245] As constantes cinéticas aparentes de acordo com o ajuste de Langmuir 1:1 estão apresentadas na Tabela 4. Devido ao fato de o anticorpo ser ligado de forma não covalente à superfície do chip, pe- quenas quantidades de moléculas de anticorpo foram eliminadas du- rante a medição. Por conseguinte, os valores de Rmax foram ajusta- dos localmente para cada sensorgrama. Tabela 4: Estatística do ajuste de Langmuir na cinética do anti- corpo clone#6 humanizado e desimunizado Peptídeo KD ka, (s-1M-1) kd, (s-1) Rmax RI Chi2 A A(pE3-18) 8,22 nM 4,79 x 105 3,94 x 10-3 Global local 0,462 (43,9 RU) A(3-18) 1,21 µM 3,09 x 103 3,74 x 10-3 Global local 0,243 (40,8 RU)

Peptídeo KD ka, (s-1M-1) kd, (s-1) Rmax RI Chi2 A A(1-18) 23,1 µM 173 3,99 x 10-3 Global local 0,400 (57,4 RU) A(4-18) 28,3 µM - - 48,9 RU - 0,0815 Ligação ao Aβ(pE3-18)

[00246] A inspeção qualitativa e visual sensorgramas registrados mostra um bom formato para a fase de associação e também para a fase de dissociação. Além disso, foram observados uma elevação concentração-dependente do sinal de resposta e um aumento da incli- nação inicial na fase de associação. Os sinais de SPR máximos foram de ~44 RU, que estava dentro da faixa ideal para medir a cinética de ligação sem ou efeitos de transporte de massa ou com efeitos de transporte de massa desprezíveis. Não se observou desvio da linha basal, assim sendo, os dados foram avaliados com o uso do modelo de ligação 1:1 de Langmuir para obter as propriedades de ligação des- ta interação e a qualidade do ajuste (Tabela 4). Ligação ao Aβ(3-18)

[00247] A inspeção qualitativa e visual sensorgramas registrados mostra um bom formato para a fase de associação e também para a fase de dissociação. Além disso, foram observados uma elevação concentração-dependente do sinal de resposta e um aumento da incli- nação inicial na fase de associação. Os sinais de SPR máximos foram de ~44 RU, que estava dentro da faixa ideal para medir a cinética de ligação sem ou efeitos de transporte de massa ou com efeitos de transporte de massa desprezíveis. Não se observou desvio da linha basal, assim sendo, os dados foram avaliados por meio do modelo de ligação 1:1 de Langmuir para obter as propriedades de ligação desta interação e a qualidade do ajuste (Tabela 4). Ligação ao Aβ(1-18)

[00248] A inspeção qualitativa e visual sensorgramas registrados mostra um formato típico para uma ligação fraca apropriada para as concentrações de peptídeo usadas. Observou-se um leve desvio da linha basal; assim sendo, os dados foram ajustados usando a ligação 1:1 de Langmuir com o modelo de desvio da linha basal. A avaliação dos dados cinéticos (Tabela 4) apresentou uma constante de dissocia- ção de 23,1 µM, que estava acima da concentração mais alta medida de Aβ(1-18). Além disso, o valor de Rmax calculado foi significativa- mente mais alto que os valores de resposta da concentração mais alta. Os dois fatos indicam que as propriedades de ligação obtidas estão definitivamente na faixa de KD > 10 µM. Ligação ao Aβ(4-18)

[00249] A inspeção qualitativa e visual sensorgramas registrados mostra um formato típico para uma ligação muito fraca apropriada para as concentrações de peptídeo usadas. Devido a uma associação e dissociação muito rápidas, os dados não podem ser avaliadas cineti- camente, assim sendo, um modelo de fase estacionária foi usado. A avaliação dos sinais de resposta no estado estacionário (Tabela 4) apresentou uma constante de dissociação de 28,3 µM, que estava acima da concentração mais alta medida de Aβ(4-18). Além disso, o valor de Rmax calculado foi significativamente mais alto que os valores de resposta da concentração mais alta. Os dois fatos indicam que as propriedades de ligação obtidas estão definitivamente na faixa de KD > 10 µM.

6. Ligação fibrilas a de A e oligômeros de A

[00250] Fibrilas dos peptídeos A(1-42) foram geradas de acordo com protocolos tradicional a um pH 8,7 e 37°C. Depois da fibrilação completa, as estruturas foram aspiradas em 60 μl, diluídas em 140 μl de tampão de corrida e carregadas em um chip sensor pelo uso de anticorpos de captura a uma taxa de fluxo de 1 μl/min. Em seguida, o sistema foi lavado até atingir uma linha basal estável. Cerca de 100

RU das fibrilas de A(1-42) foram capturadas pelo chip sensor.

[00251] Oligômeros dos peptídeos A(1-42) foram gerados de acordo com o protocolo ACUMEN no meio F12 de Ham durante uma noite a 4°C e separados dos Aβ agregados por centrifugação. Depois disso os oligômeros foram aspirados em 20 μl, diluídos em 60 μl de tampão de corrida e carregados em um chip sensor pelo uso de anti- corpos de captura a uma taxa de fluxo de 1 μl/min. Em seguida, o sis- tema foi lavado durante uma noite com 100 μl/min até atingir uma linha basal estável. Cerca de 300 RU dos oligômeros de A(1-42) foram capturados pelo chip sensor.

[00252] Para as fibrilas dos peptídeos A(1-42): Depois de atingir uma linha basal estável a análise da interação foi realizada por 11 in- jeções consecutivas (10 pM, 30 pM, 90 pM, 270 pM, 810 pM, 2,43 nM, 7,29 nM, 21,87 nM, 65,61 nM, 196,83 nM e 590,49 nM) do anticorpo parental clone #6 revelado no documento WO 2017/009459 e do clone #6 do anticorpo humanizado e desimunizado da presente invenção com 30 μl/min, tempo de contato de 480 seg e tempo de dissociação de 1200 seg. Os sensorgramas obtidos foram avaliados usando cinco concentrações consecutivas (começando com a primeira injeção mos- trando ligação) e o modelo Single Cycle Kinetics com um ajuste global de Rmax e desvio da linha basal e ajustes locais do efeito geral de ca- da injeção.

[00253] Para os oligômeros dos peptídeos A(1-42): Depois de atingir uma linha basal estável a análise da interação foi realizada por 11 injeções consecutivas (10 pM, 30 pM, 90 pM, 270 pM, 810 pM, 2,43 nM, 7,29 nM, 21,87 nM, 65,61 nM, 196,83 nM e 590,49 nM) do anti- corpo parental clone #6 revelado no documento WO 2017/009459 e do clone #6 do anticorpo humanizado e desimunizado da presente inven- ção com 30 μl/min, tempo de contato de 480 seg e tempo de dissocia- ção de 3600 seg. Os sensorgramas obtidos foram avaliados usando cinco concentrações consecutivas (começando com a primeira injeção mostrando ligação) e o modelo Single Cycle Kinetics com um ajuste global de Rmax e desvio da linha basal e ajustes locais do efeito geral de cada injeção. Resultados Tabela 5: Ligação a fibrilas dos peptídeos A(1-42) Anticorpo KD ka kd Rmax Chi2 M-1s-1 10-5 s-1 A 65,9 pM 9,9·105 6,53· 26 RU 0,336 B 1,67 nM 5,97·104 9,99· 19,2 RU 0,602 Tabela 6: Ligação a oligômeros dos peptídeos A(1-42) Anticorpo KD ka kd Rmax Chi2 M-1s-1 10-4 s-1 A 7,61 nM 1,86·104 1,42· 442 RU 6,31 B 269 nM 868 2,33· 216 RU 0,284

[00254] Nas tabelas 5 e 6, A é o anticorpo parental clone #6 revelado no documento WO 2017/009459 com uma região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 1 e uma região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 49; e B é o clone #6 do anticorpo humanizado e deimunizado da presente invenção com uma região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 1 e uma região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 2.

[00255] Como se pode ver a partir destes resultados, a invenção apresenta anticorpos e fragmentos dos mesmos, em que os anticorpos apresentam seletividade aumentada para oligômeros e/ou fibrilas dos peptídeos A. Os anticorpos da presente invenção apresentam uma constante de ligação (valor de KD) múltiplas vezes, tal como 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 250 vezes ou mais de 250 vezes mais baixa para ligação a oligômeros e/ou fibrilas de A (1-42) que os anticorpos monoclonais equiparáveis conhecidos no estado da técnica, em particular comparado ao anticorpo parental revelado no documento WO 2017/009459. Por conseguinte, os anti- corpos da presente invenção, que, conforme estabelecido, se ligam seletivamente aos peptídeos A N3pE, são mais específicos para os peptídeos A N3pE e apresentam uma reatividade cruzada reduzida contra peptídeos A diferentes de A N3pE.

7. Ligação a receptores Fc-gama

[00256] A ligação de dois anticorpos, que compreendiam a cadeia pesada de SEQ ID NO: 19 ou a variante K324A mutante da mesma (SEQ ID NO: 18), a diferentes receptores Fc-gama (CD16A, CD32A, CD32B, e CD64) foi comparada.

[00257] A K324A mutante foi produzida por mutagênese sítio- direcionada. A ligação foi medida em um bioensaios baseado em FACS para células de ovário de hamster chinês (CHO) expressando estavelmente CD16A, CD32A, CD32B, ou CD64 humano de compri- mento integral. Ambos os anticorpos foram incubados com cada linha- gem celular a 7 concentrações diferentes por uma hora seguido por lavagem. H6 ou H67 ligado ao receptor foi detectado com anti-Fab’ conjugado com fluorocromo. A capacidade de ligação foi medida por FACS e a Kd e a Bmax foram calculadas por regressão não linear.

[00258] Resultados: Ambos os anticorpos mostraram ligação equi- parável a todos os receptores.

8. Ligação a C1q

[00259] A ligação de dois anticorpos, que compreendiam a cadeia pesada de SEQ ID NO: 19 ou a variante K324A mutante da mesma (SEQ ID NO: 18), o C1q foi comparado com a finalidade de melhor ca- racterizar as funções efetoras dos anticorpos.

[00260] Inúmeros formatos de ensaio de ligação dos anticorpos ao C1q foram testados, incluindo: a) ligação direta dos dois anticorpos à placa e então ligação ao C1q em solução; e b) placas revestidas com estreptavidina primeiro incubadas com o peptídeo pE-A biotinilado, ligação aos anticorpos e então ao C1q.

[00261] Em suma, o formato a) produziu resultados melhores. O procedimento está resumido abaixo:

[00262] A placa de ELISA foi revestida com o anticorpo, compreen- dendo a cadeia pesada de SEQ ID NO: 19, a variante K324A mutante da mesma (SEQ ID NO: 18), e um K324A de controle que não ligado o C1q a 10, 8, 6, 4, 3, 2, 1 e 0 μg/ml em triplicata e incubada a 4°C por uma noite. No dia seguinte, a placa foi lavada três vezes com 1x PBS e em seguida bloqueada com BSA 1% em 1x PBS a 50 μl/poço. C1q (Sigma, Cat.# C1740) foi adicionado a cada poço a 2 μg/ml em tampão de bloqueio e incubado por 1 hora à temperatura ambiente. A placa foi então lavada três vezes com 200 μl de 1x PBS. Anti-C1q-HRP (Ther- mo, Cat. # PA1-84324) foi acrescentado à placa para detectar a liga- ção a uma diluição 1:250 em tampão de bloqueio (50 μl/poço) por 1 hora. A placa foi novamente lavada três vezes com 200 μl de 1x PBS. 50 μl de TMB (Invitrogen, Cat.# 002023) foram acrescentados a cada poço para visualizar a interação (Invitrogen, Cat.# 002023) por 2 min. 50 μl de solução de terminação (ácido sulfúrico 1 M) foram acrescen- tados a cada poço antes da leitura da absorvência a 450nm.

[00263] Resultados: O anticorpo, que compreendida a cadeia pesa- da de tipo selvagem de SEQ ID NO: 19 não se ligou ao C1q. A varian- te K324A mutante (compreendendo a cadeia pesada de SEQ ID NO: 18), não se ligou ao C1q.

9. Imuno-histoquímica

[00264] Com IHC o antígeno Aβ N3pE pode ser localizado em se- ções de tecido cerebral. Assim sendo, os anticorpos da invenção fo- ram usados para detecção de Aβ N3pE.

[00265] Para a IHC podem ser usadas seções de tecido cerebral humano do hipocampo e do córtex frontal de pacientes com AD e ain- da seções de tecido cerebral do hipocampo de modelos animais exis- tentes para o mal de Alzheimer descritos neste pedido. Estes modelos de camundongo apresentam níveis aumentados de Aβ no cérebro acompanhado pelo desenvolvimento de placas neuríticas. As seções de tecido foram incrustadas em parafina e cortadas em série. As se- ções foram coloridas com hematoxilina para colorir os núcleos das cé- lulas e em seguida imunocoloridas com os anticorpos anti Aβ N3pE da invenção. A preparação das seções de tecido e a coloração foram fei- tas de acordo com a metodologia tradicional.

10. Tratamento de camundongos com Alzheimer in vivo

[00266] Foi utilizado um total de 62 camundongos machos neste estudo. Antes do início da imunização, quatro camundongos de um modelo de camundongo existente para camundongos com mal de Al- zheimer (média de 5,6 mo ± 0,45) foram sacrificados como controles basais para avaliação da carga de placas A cerebrais no início do tra- tamento. Os demais camundongos foram divididos em quatro grupos e receberam o seguinte tratamento: 250 μl de PBS estéril (n= 12; média 5,89 mo ± 0,13), 200 μg de um anticorpo da invenção. Um grupo da mesma ninhada Wt da mesma idade e sexo compatíveis recebeu uma injeção de 250 μl de PBS (n=12; média 5,80 mo ± 0,12) e serviram de controles comportamentais. Os camundongos foram tratados com um volume total de 250 µl (anticorpo ou PBS) via injeção intraperitoneal durante 28 semanas. Eutanásia e preparação do tecido

[00267] Os camundongos foram abatidos por eutanásia, perfundi- dos, e o plasma foi coletado aos 6 meses (linha basal) ou 13 meses de idade. O cérebro foi extraído e dividido sagittalmente. O hipocampo, o córtex e o cerebelo foram dissecados a partir de um hemisfério e con- gelados instantaneamente para análises bioquímicas. O outro hemisfé-

rio foi fixado em parafomaldeído 4% (Electron Microscopy Sciences) por 24 horas a 4°C, crioprotegidos em soluções de sacarose gradua- das a 4°C e incrustados no composto OCT (Tissue Tek).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo ou uma variante funcional do mesmo, caracte- rizado pelo fato de que a parte variável da cadeia leve do referido anti- corpo compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos de:

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPG

QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGL

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do por compreender as regiões de CDR: VL CDR1: SSQSLLYSDGKTYLN (SEQ ID NO: 3); VL CDR2: LVSKLDS (SEQ ID NO: 4); e VL CDR3: VQGTHFP (SEQ ID NO: 5) na cadeia leve.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do por compreender as regiões de CDR: VH CDR1: GYSFTGHTMN (SEQ ID NO: 6); VH CDR2: LINPSDGVTRYNQKFQG (SEQ ID NO: 7); e VH CDR3: EAKREWDETY (SEQ ID NO: 8) na cadeia pesada.

4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve com- preende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de:

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPG

QSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC

VQGTHFPFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL

5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de:

QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGL

EWMGLINPSDGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTA

TYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS

GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL

SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC

PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN

WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC

AVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV

6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende, consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos de:

QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGL

EWMGLINPSDGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTA

TYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS

GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL

SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC

PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN

WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC

KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV

7. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo humanizado liga-se especificamente ao terminal N transportador de piroglutamato do epitopo N3pE de Aβ.

8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo humanizado liga-se especificamente a um epitopo selecionado do gru- po que consiste em pEFRHDSGYEVHHQKLV (SEQ ID NO: 23), pEFRHDSGYEVHHQKL (SEQ ID NO: 24), pEFRHDSGYEVHHQK (SEQ ID NO: 25), pEFRHDSGYEVHHQ (SEQ ID NO: 26), pEFRHDSGYEVHH (SEQ ID NO: 27), pEFRHDSGYEVH (SEQ ID NO: 28), pEFRHDSGYEV (SEQ ID NO: 29), pEFRHDSGYE (SEQ ID NO: 30), pEFRHDSGY (SEQ ID NO: 31), pEFRHDSG (SEQ ID NO: 32), pEFRHDS (SEQ ID NO: 33), pEFRHD (SEQ ID NO: 34) pEFRH (SEQ ID NO: 35), e pEFR (SEQ ID NO: 36).

9. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo humani- zado da invenção liga-se a uma variante de N3pE de Aβ, em que a variante de N3pE de Aβ é definida como pE-A3-X, em que x é definido como um inteiro entre 19 e 42.

10. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 9, caracteri- zado pelo fato de que a variante de N3pE de Aβ é selecionada dentre: pE-A3-38, pE-A3-40, pE-A3-42.

11. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado por não se ligar a epitopos que não transportam um piroglutamato no terminal N.

12. Composição farmacêutica, caracterizada por compre- ender o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes.

13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 12, caracterizada pelo fato de que compreende uma outra subs- tância biologicamente ativa e/ou um carreador farmaceuticamente aceitável e/ou um diluente e/ou um excipiente.

14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 13, caracterizada pelo fato de que a referida outra substância bio- logicamente ativa é selecionada dentre potencializadores da neuro- transmissão, drogas psicoterapêuticas, inibidores da acetilcolina este- rase, bloqueadores do canal de cálcio, aminas biogênicas, tranquili- zantes benzodiazepínicos, síntese de acetilcolina, protencializadores do armazenamento ou da liberação, agonistas do receptor pós- sináptico de acetilcolina, inibidores da monoamina oxidase-A ou -B, antagonistas do receptor de N-metil-D-aspartato glutamato, drogas an- ti-inflamatórias não esteroides, antioxidantes, e antagonistas do recep- tor serotonérgico.

15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 14, caracterizada pelo fato de que a referida outra substância bio- logicamente ativa é selecionada do grupo que consiste em compostos eficazes contra estresse oxidativo, compostos antiapoptóticos, quelan- tes metálicos, inibidores do reparo de DNA, tais como pirenzepina e metabólitos, ácido 3-amino-1-propanossulfônico (3 APS), 1,3- propanodissulfonato (1,3PDS), ativadores da α-secretase, inibidores da - e γ-secretase, proteínas tau, neurotransmissores, quebrador de folhas atraentes para componentes celulares depuradores / depleto- res de beta amiloide, inibidores de beta amiloide truncado N-terminal incluindo beta amiloide 3-42 piroglutamado, tais como inibidores de glutaminil ciclase, moléculas anti-inflamatórias, ou inibidores da coli- nesterase (ChEIs) tais como tacrina, rivastigmina, donepezil, e/ou ga- lantamina, agonistas de Ml e outras drogas incluindo quaisquer drogas modificadoras de amiloide ou tau e suplementos nutricionais, inibido- res de colinesterase (ChEIs), memantina ou glutaminil ciclase.

16. Anticorpo ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por ser para uso no diagnóstico, no tratamento de amiloidose, especialmente para uso no tratamento de uma doença neurodegenerativa seleciona- da do grupo que consiste em enfraquecimento cognitivo leve (MCI), mal de Alzheimer (AD), como, por exemplo, mal de Alzheimer esporá- dico (SAD) ou demências familiares de Alzheimer (FAD) como demên- cia familiar britânica (FBD) e demência familiar dinamarquesa (FDD), neurodegeneração na síndrome de Down e angiopatia amiloide cere- bral clínica ou pré-clínica; e/ou no tratamento de uma condição seleci- onada dentre AD prodromal, AD leve, AD moderado e AD severo e/ou na desaceleração do declínio cognitivo em um paciente diagnosticado com uma condição selecionada dentre mal de Alzheimer clínico ou pré-clínico, síndrome de Down, e angiopatia amiloide cerebral clínica ou pré-clínica.

17. Anticorpo ou composição farmacêutica para uso, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a admi-

nistração do referido anticorpo ou da referida composição farmacêutica leva à reversão do declínio cognitivo, à melhora da cognição ou à pre- venção do declínio cognitivo em um indivíduo diagnosticado com en- fraquecimento cognitivo leve (MCI), mal de Alzheimer (AD), como, por exemplo, mal de Alzheimer esporádico (SAD) ou demências familiares de Alzheimer (FAD) como demência familiar britânica (FBD) e demên- cia familiar dinamarquesa (FDD), neurodegeneração na síndrome de Down e angiopatia amiloide cerebral clínica ou pré-clínica e/ou de uma condição selecionada dentre AD prodromal, AD leve, AD moderado e AD severo; ou em que a administração do referido anticorpo ou da referida composição farmacêutica leva à depuração ou remoção de A N3pE das placas ou de outros complexos biológicos; ou em que a administração do referido anticorpo ou da referida composição farmacêutica leva à redução da carga nas placas e/ou à remoção de placas completas do tecido afetado, tal como tecido cere- bral.