KR20200116095A - 인간화 및 탈-면역화된 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피로글루타메이트화 아밀로이드 베타 (Aβ N3pE) 펩타이드의 N-말단에서 에피토프에 결합하는 인간화 및 탈-면역화된 항체, 및 아밀로이드증과 같은 아밀로이드 펩타이드의 축적 및 침착과 관련된 질환 및 병태, 알츠하이머병, 다운 증후군, 대뇌 아밀로이드 혈관병증 및 기타 관련 양상과 같은 피로글루타메이트화 아밀로이드 펩타이드와 관련된 장애 및 비정상 그룹의 예방적 및 치료적 치료에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 혈장, 뇌 및 뇌척수액에서 피로글루타메이트화 아밀로이드 베타 펩타이드에 결합하여 뇌 내에서 및 주변의 다양한 조직에서 Aβ N3pE의 축적을 방지하거나 침착을 역전시키고 아밀로이드증을 완화시키기 위한 본 발명의 단클론 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 항체를 사용한 아밀로이드증의 진단을 위한 진단 분석에 관한 것이다.

Description

인간화 및 탈-면역화된 항체
본 발명은 피로글루타메이트화 아밀로이드 베타 (Aβ N3pE) 펩타이드의 N-말단에서 에피토프에 결합하는 인간화 및 탈-면역화된 항체, 및 아밀로이드증과 같은 아밀로이드 펩타이드의 축적 및 침착과 관련된 질환 및 병태, 알츠하이머병, 다운 증후군, 대뇌 아밀로이드 혈관병증 및 기타 관련 양상과 같은 피로글루타메이트화 아밀로이드 펩타이드와 관련된 장애 및 비정상 그룹의 예방적 및 치료적 치료에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 혈장, 뇌 및 뇌척수액에서 피로글루타메이트화 아밀로이드 베타 펩타이드에 결합하여 뇌 내에서 및 주변의 다양한 조직에서 Aβ N3pE의 축적을 방지하거나 침착을 역전시키고 아밀로이드증을 완화시키기 위한 본 발명의 단클론 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 항체를 사용한 아밀로이드증의 진단을 위한 진단 분석에 관한 것이다.
아밀로이드증 (amyloidosis)은 단일 질환 실체라기 보다는 하나 이상의 장기 또는 신체 시스템에 축적되는 아밀로이드라고 불리는 왁스상의 전분-유사 단백질의 세포외 조직 침착물을 특징으로 하는 다양한 그룹의 진행성 질환 과정이다. 아밀로이드 침착물이 축적됨에 따라, 장기 또는 신체 시스템의 정상적인 기능을 방해하기 시작한다. 아밀로이드증에는 적어도 15가지의 상이한 유형이 있다. 주요 형태는 알려진 전조가 없는 원발성 아밀로이드증, 몇몇 다른 병태에 따른 이차성 아밀로이드증, 및 유전성 아밀로이드증이다.
이차성 아밀로이드증은 결핵 (tuberculosis), 가족성 지중해 열 (familial Mediterranean fever)이라고 하는 세균성 감염, 골 감염 (골수염(osteomyelitis)), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 소장의 염증 (육아종성 회장염(granulomatous ileitis)), 호지킨병 (Hodgkin's disease) 및 나병 (leprosy)과 같은 만성 감염 또는 염증성 질환 중에 발생한다.
아밀로이드 침착물은 아밀로이드 P (펜타고날) 성분 (AP), 정상 혈청 아밀로이드 P (SAP: serum amyloid P)와 관련된 당단백질, 및 설페이트화 글리코사미노글리칸 (GAG: sulpated glycosaminoglycans), 결합 조직의 복합 탄수화물을 포함한다. 아밀로이드 물질의 약 90%를 차지하는 아밀로이드 단백질 피브릴은 몇몇 상이한 유형의 단백질 중 하나를 포함한다. 이들 단백질은 콩고 레드 (Congo red)에 대한 결합 부위를 나타내어 아밀로이드 단백질의 독특한 염색 특성을 야기하는 독특한 단백질 구성인 소위 "베타-주름진" 시트 피브릴로 접힐 수 있다.
노화의 많은 질환은 아밀로이드-유사 단백질을 기반으로 하거나 이와 연관되며, 부분적으로는 질환의 발병 및 진행에 기여하는 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 물질의 세포외 침착물의 축적을 특징으로 한다. 이러한 질환은 경증 인지 장애 (MCI), 예를 들어, 산발성 알츠하이머병 (SAD: sporadic Alzheimer's disease) 같은 알츠하이머병 (AD), 또는 가족성 영국 치매 (FBD: Familial British Dementia) 및 가족성 덴마크 치매 (FDD: Familial Danish Dementia) 같은 가족성 알츠하이머 치매 (FAD), 다운 증후군에서의 신경퇴행, 루이 소체 치매 (Lewy body dementia), 아밀로이드증을 가진 유전성 뇌일혈 (hereditary cerebral hemorrhage) (네덜란드 형)과 같은 신경성 장애; 괌 파킨슨-치매 복합증 (Guam Parkinson-Dementia complex)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 아밀로이드-유사 단백질을 기반으로 하거나 이와 연관된 다른 질환은 진행성 핵상 마비 (progressive supranuclear palsy), 다발성 경화증 (multiple sclerosis); 크로이츠펠트-야콥병 (Creutzfeld Jacob disease), 파킨슨병 (Parkinson's disease), HIV-관련 치매, ALS (근위축성 측삭 경화증 (amyotropic lateral sclerosis)), 성인 발병성 당뇨병 (Adult Onset Diabetes); 노인성 심장 아밀로이드증 (senile cardiac amyloidosis); 내분비 종양 (endocrine tumor), 및 황반 변성 (macular degeneration)을 포함한 기타 질환이다.
이들 질환의 발병기전은 다양할 수 있지만, 이들의 특징적인 침착물은 종종 많은 공유 분자 구성분을 함유한다. 상당한 정도로, 이것은 전염증 경로의 국소 활성화에 기인하여 활성화된 보체 성분, 급성기 반응물, 면역 조절제, 및 다른 염증 매개체의 동시 침착을 야기할 수 있다 (McGeer et al., Tohoku J Exp Med. 174(3): 269-277 (1994)).
최근에, 축적된 증거는 알츠하이머병에서 N-말단 변형된 Aβ 펩타이드 변이체의 연관성을 입증한다. 생검 조준은 알츠하이머 환자의 뇌 뿐만 아니라 영향을 받지 않은 개체의 노인성 플라크에서도 Aβ 1-40 및 Aβ 1-42의 존재를 나타낸다. 그러나, N-말단 절단(truncation)되고 pyroGlu 변형된 Aβ N3pE-40/Aβ N3pE-42는 알츠하이머병 환자의 플라크 내에 거의 독점적으로 포함되어 있어, 이러한 Aβ 변이체를 적합한 진단 마커 및 약물 개발의 잠재적 표적으로 만든다.
현재, 몇몇 상업적 제조업자는 Aβ 1-40/1-42 및 Aβ N3pE-40/Aβ N3pE-42를 낮은 피코그램 (pg) 범위로 검출할 수 있는 ELISA 키트를 제공한다.
알츠하이머병 (AD) 환자의 뇌는 신경섬유 매듭의 존재 및 신피질 뇌 구조에서 Aβ 펩타이드의 침착에 의해 형태학적으로 특성화된다 (Selkoe, D.J. & Schenk, D. Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 545-584 (2003)). Aβ 펩타이드는 β- 및 γ-세크레타제에 의한 순차적 절단 후 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)로부터 유리된다. γ-세크레타제 절단은 Aβ 1-40 및 Aβ 1-42 펩타이드의 생성을 초래하며, 이들 펩타이드는 이들의 C-말단이 다르고 상이한 역가의 응집, 피브릴 형성 및 신경독성을 나타낸다 (Shin, R.W. et al. Amyloid beta-protein (Abeta) 1-40 but not Abeta 1-42 contributes to the experimental formation of Alzheimer disease amyloid fibrils in rat brain. J. Neurosci. 17, 8187-8193 (1997); Iwatsubo, T. et al. Visualization of Abeta 42(43) and Abeta 40 in senile plaques with end-specific Abeta monoclonals: evidence that an initially deposited species is Abeta 42(43). Neuron 13, 45-53 (1994); Iwatsubo, T., Mann, D.M., Odaka, A., Suzuki, N. & Ihara, Y. Amyloid beta protein (Abeta) deposition: Abeta 42(43) precedes Abeta 40 in Down syndrome. Ann. Neurol. 37, 294-299 (1995); Hardy, J.A. & Higgins, G.A. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science 256, 184-185 (1992); Roßner, S., Ueberham, U., Schliebs, R., Perez-Polo, J.R. & Bigl, V. The regulation of amyloid precursor protein metabolism by cholinergic mechanisms and neurotrophin receptor signaling. Prog. Neurobiol. 56, 541-569 (1998)).
확산 플라크에 침착된 Aβ 펩타이드의 대부분은 N-말단이 절단 또는 변형된다. Piccini 및 Saido의 연구에서는 노인성 플라크 및 혈관 침착물의 핵심 구조가 50% 피로글루타메이트 (pyroGlu) 변형된 펩타이드로 구성되는 것으로 밝혀졌다 (Piccini et al., J Biol Chem. 2005 Oct 7;280(40):34186-92; Saido et al., Neuron. 1995 Feb; 14(2): 457-66). pyroGlu 변형된 펩타이드는 다른 Aβ 종보다 세포 독성이 더 강하며 아미노펩티다제에 대해 안정하다 (Russo et al., J Neurochem. 2002 Sep;82(6):1480-9). 따라서, pyroGlu Aβ 종은 보다 긴 반감기를 가지며, 이에 의해 이러한 종의 축적 및 신경독성 올리고머 뿐만 아니라 응집체의 형성이 유리하다 (Saido, Neurobiol Aging. 1998 Jan-Feb;19(1 Suppl):S69-75). pyroGlu로의 글루타메이트의 폐환으로 인해, 하전된 아미노산이 상실되어 펩타이드의 용해도를 강하게 감소시키고 증가된 응집 경향을 야기한다. 시험관내 연구에서는, 예를 들어, Aβ3(pE)의 초기 올리고머화가 비-변형된 펩타이드에 비해 훨씬 빠른 것으로 나타났다 (Schilling et al., Biochemistry. 2006 Oct 17;45(41):12393-9). Aβ N3pE-42 펩타이드는 Aβ 1-40/1-42 펩타이드와 공존하며 (Saido, T.C. et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, Abeta N3pE, in senile plaques. Neuron 14, 457-466 (1995); Saido, T.C., Yamao, H., Iwatsubo, T. & Kawashima, S. Amino- and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain. Neurosci . Lett. 215, 173-176 (1996)), 다수의 관찰에 기초하여, AD의 발병기전에서 현저한 역할을 할 수 있다. 예를 들면, Aβ N3pE-42 펩타이드의 특정 신경독성이 개략적으로 설명되어 있으며(Russo, C. et al. Pyroglutamate-modified amyloid beta-peptides--AbetaN3(pE)--strongly affect cultured neuron and astrocyte survival. J. Neurochem. 82, 1480-1489 (2002)), N-절단된 Aβ 펩타이드의 pE-변형은 대부분의 아미노펩티다제 뿐만 아니라 Aβ-분해 엔도펩티다제에 의한 분해에 대한 내성을 부여한다 (Russo, C. et al. Pyroglutamate-modified amyloid beta-peptides--AbetaN3(pE)--strongly affect cultured neuron and astrocyte survival. J. Neurochem . 82, 1480-1489 (2002); Saido, T.C. Alzheimer's disease as proteolytic disorders: anabolism and catabolism of beta-amyloid. Neurobiol. Aging 19, S69-S75 (1998)). pE로의 글루탐산의 폐환은 N-말단 전하의 상실을 초래하여 변형되지 않은 Aβ 펩타이드와 비교하여 Aβ N3pE의 응집을 가속화시킨다 (He, W. & Barrow, C.J. The Abeta 3-pyroglutamyl and 11-pyroglutamyl peptides found in senile plaque have greater beta-sheet forming and aggregation propensities in vitro than full-length A beta. Biochemistry 38, 10871-10877 (1999); Schilling, S. et al. On the seeding and oligomerization of pGlu-amyloid peptides (in vitro). Biochemistry 45, 12393-12399 (2006)). 따라서, Aβ N3pE-42 형성의 감소는 펩타이드가 보다 분해되기 쉽게 함으로써 펩타이드를 불안정화시키고, 결과적으로 더 높은 분자량의 Aβ 응집체의 형성을 방지하고 뉴런 생존을 향상시킬 것이다.
그러나, 오랫동안 Aβ 펩타이드의 pE-변형이 어떻게 일어나는지는 알려지지 않았다. 최근에, 글루타미닐 사이클라제 (QC)가 약산성 조건하에서 Aβ N3pE-42 형성을 촉매할 수 있고 특정 QC 억제제가 시험관내에서 Aβ N3pE-42 생성을 방지하는 것으로 밝혀졌다 (Schilling, S., Hoffmann, T., Manhart, S., Hoffmann, M. & Demuth, H.-U. Glutaminyl cyclases unfold glutamyl cyclase activity under mild acid conditions. FEBS Lett . 563, 191-196 (2004); Cynis, H. et al. Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells. Biochim. Biophys. Acta 1764, 1618-1625 (2006)).
모든 사실은 pyroGlu Aβ가 피브릴 형성의 초기화를 위한 기원의 일종이라는 것을 시사한다. 추가 연구 (Piccini et al., 2005, 전게서)에서 플라크 침착이 있지만 AD 특이 병리가 없는 지원자를 특징적인 양의 Aβ-종으로 인해 AD 환자와 구별할 수 있었다. 이에 의해 N-말단 절단된 pyroGlu 변형된 펩타이드의 양이 AD 환자의 뇌에서 유의하게 더 높았다.
Aβ-펩타이드의 위치 3 또는 11에서의 pyroGlu의 번역후 형성은 N-말단 글루타메이트 잔기의 폐환을 의미한다. 글루타미닐 사이클라제 (QC)는 pyroGlu 펩타이드의 생성에 중요한 역할을 한다. QC는 식물- 및 동물계에 널리 퍼져 있으며 특히 펩타이드 호르몬의 성숙에 관여한다. 암모니아 방출에 의한 글루타민의 및 물의 방출에 의한 글루타메이트의 pyroGlu로의 폐환 둘 다는 QC에 의해 수행된다. 글루타민 폐환과는 달리, 글루타메이트 폐환은 자발적으로 일어나지 않는다. QC는 글루타메이트에서 pyroGlu로의 효율적인 (원치 않는) 부반응을 촉매한다. 생성된 pyroGlu 잔기는 단백질가수분해에 의한 분해로부터 단백질을 보호한다. QC가 pyroGlu Aβ의 생성에서 중요한 역할을 한다는 것을 보여주는 몇 가지 참고문헌이 있다:
1. 여러 연구에서 QC는 Aβ의 N-말단에서 글루타메이트로부터의 pyroGlu 잔기의 형성을 촉매하는 것으로 나타났다 (Cynis et al., Biochim Biophys Acta. 2006 Oct;1764(10):1618-25, Schilling et al., FEBS Lett. 2004 Apr 9;563(1-3):191-6);
2. Aβ 펩타이드 및 QC 둘 다는 해마 및 피질에서 대량으로 발현된다. 이러한 뇌 영역은 AD에서 특히 위험하다 (Pohl et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Nov 15;88(22):10059-63, Selkoe, Physiol Rev. 2001 Apr;81(2):741-66);
3. APP는 원형질 막으로의 수송 동안 β-세크레타제에 의해 절단되어 유리 글루타메이트 잔기를 갖는 Aβ의 N-말단이 생성될 수 있다 (Greenfield et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Jan 19;96(2):742-7). 분비 소포에서 가공된 APP 및 QC의 공동-국재화가 결정되었다. 따라서 소포의 약한 산 환경에서 피로글루타메이트로의 글루타메이트 잔기의 가속화된 변형이 일어날 수 있다.
4. 또한 다른 신경퇴행성 질환 (가족성 덴마크 (FDD) 또는 영국 치매 (FBD))은 N-말단 pyroGlu 변형된 펩타이드, 예를 들어, Bri2와 관련이 있지만 대조적으로 이들은 1차 구조의 관점에서 Aβ와는 관련이 없다 (Vidal R. et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 4920-4925).
가능하게는 pyroGlu Aβ의 QC-촉매된 형성이 신경퇴행성 질환의 발달 및 진행에 관여한다. N-말단 변형된 아밀로이드 펩타이드의 형성은 확실히 Aβ 응집 과정의 근본 요인을 나타내며 질환의 개시일 수 있다. QC의 억제에 의한 pyroGlu Aβ 형성의 저해가 치료적 접근법을 나타낼 수 있다. QC 억제제는 pyroGlu Aβ의 형성을 방지하고, 뇌에서 피로글루타메이트 Aβ의 농도를 감소시키고, 따라서 Aβ-펩타이드의 올리고머화를 지연시킬 수 있다. Schilling 등은 QC 발현이 AD 환자의 피질에서 상향조절되었고 pyroGlu-변형된 Aβ-펩타이드의 출현과 상관관계가 있었음을 보여준다. QC 억제제의 경구 적용은 AD의 두 가지 상이한 유전자이식 마우스 모델에서 및 새로운 초파리 (Drosophila) 모델에서 피로글루타메이트 변형된 AβpE(3-42) 수준 감소를 야기하였다 (Schilling et al., 2008 Biol. Chem. (389), 983-991).
루이 소체 치매 (LBD: Lewy body dementia)는 65세 이상인 사람에서 발생할 수 있는 신경퇴행성 장애이며, 전형적으로 인지 (사고) 장애 및 비정상적인 행동 변화의 증상을 야기한다. 증상은 인지 장애, 신경학적 징후, 수면 장애, 및 자율 장애 (autonomic failure)를 포함할 수 있다. 인지 장애는 대부분의 경우 LBD의 표출된 특징이다. 환자는 점진적으로 악화되는 혼동의 재발성 에피소드를 갖는다. 인지 능력의 변동은 종종 주의 및 각성의 변화하는 정도와 관련이 있다. 인지 장애와 사고의 변동은 수 분, 수 시간 또는 수 일에 걸쳐 달라질 수 있다. 루이 소체는 인산화된 및 비인산화된 신경필라멘트 단백질로부터 형성되고; 이들은 시냅스 단백질 알파-시누클레인 및 유비퀴틴을 함유하며, 이것은 손상되거나 비정상적인 단백질의 제거에 관여한다. 루이 소체 외에도, 신경 세포의 세포 과정의 봉입체인 루이 신경돌기가 또한 존재할 수 있다. 아밀로이드 플라크는 DLB를 앓고 있는 환자의 뇌에서 형성될 수 있지만, 이들은 알츠하이머병을 가진 환자에서 보이는 수보다 적은 경향이 있다. AD의 또 다른 미세병리학적 특징인 신경섬유 매듭은 LBD의 주요 특징이 아니라 아밀로이드 플라크에 더하여 종종 존재한다.
근위축성 측삭 경화증 (ALS)은 상부 및 하부 운동 뉴런의 변성을 특징으로 한다. 일부 ALS 환자에서, 치매 또는 실어증이 존재할 수 있다 (ALS-D). 치매는 가장 흔히 전측두엽 치매 (frontotemporal dementia; FTD)이며, 이 경우의 다수는 치아 이랑의 뉴런 및 전두엽과 측두엽의 표피층에 유비퀴틴-양성, 타우-음성 봉입물을 갖는다.
봉입체 근염 (IBM)은 50세 이상의 사람들에서 흔히 발견되는 심각한 손상을 주는 질환이며, 여기서 근섬유가 염증을 발달시켜 위축되기 시작하지만 - 뇌는 해를 입지 않아서 환자가 이들의 완전한 지적 능력을 유지한다. 아밀로이드-β 단백질의 생성에 관여하는 두 가지 효소는 아밀로이드-β가 또한 증가되는 노인의 가장 흔한 진행성 근육 질환을 가진 환자의 근육 세포 내에서 증가되는 것으로 밝혀졌다.
아밀로이드-유사 단백질의 축적 및 침착에 기반하거나 이와 연관된 또 다른 질환은 황반 변성이다. 황반 변성은 망막 (광-민감성 세포가 뇌에 시각 신호를 보내는 눈 뒤쪽의 종이처럼 얇은 조직)의 중심 영역인 황반의 퇴화를 유발하는 흔한 안과 질환이다. 선명하고 명확한 "똑바로 앞에 있는" 시야가 황반에 의해 처리된다. 황반의 손상은 맹점 (blind spot)의 발생 및 흐릿하거나 왜곡된 시야를 야기한다. 연령-관련 황반 변성 (AMD)은 미국에서 시각 장애의 주요 원인이며 65세 이상의 사람들에 대해 백인들 사이에서 법적맹 (legal blindness)의 주요 원인이다. 40세 이상의 미국인 약 180만 명이 진행성 AMD를 가지며, 중등도 AMD를 가진 다른 730만 명이 상당한 시력 상실 위험에 처해 있다. 정부는 2020년까지 진행성 AMD를 가진 사람이 290만 명에 이를 것으로 추정하고 있다. AMD의 희생자들은 종종 이러한 실명 상태의 원인과 치료에 대해 알려진 바가 거의 없다는 것을 알고 놀라고 좌절한다.
황반 변성의 두 가지 형태가 있다: 건성 황반 변성 및 습성 황반 변성. 황반의 세포가 서서히 분해되기 시작하는 건성 형태는 황반 변성 사례의 85%에서 진단된다. 양안이 통상적으로 건성 AMD에 의해 영향을 받지만 한쪽 눈은 시력을 잃을 수 있는 반면 다른 쪽 눈은 영향을 받지 않는다. 망막 아래의 노란색 침전물인 드루젠 (drusen)이 건성 AMD의 일반적인 초기 징후이다. 드루젠의 수 또는 크기가 증가함에 따라 진행성 건성 AMD 또는 습성 AMD의 발병 위험이 증가한다. 건성 AMD가 진행되어 습성 형태의 질환으로 변하지 않고 시력 상실을 유발하는 것이 가능하다; 그러나, 초기 단계의 건성 AMD가 갑자기 습성 형태로 변하는 것도 가능하다.
습성 형태는, 사례의 15% 만을 차지하지만, 실명의 90%를 초래하며, 진행성 AMD로 간주된다 (습성 AMD의 초기 또는 중간 단계는 없다). 습성 AMD에는 항상 건성 형태의 질환이 선행한다. 건성 형태가 악화됨에 따라, 일부 사람들은 황반 뒤에 비정상적인 혈관이 자라기 시작한다. 이 혈관은 매우 손상되기 쉬우며 체액과 혈액이 누출되어 (따라서 '습성' 황반 변성), 황반에 빠른 손상을 야기한다.
건성 형태의 AMD는 초기에 종종 약간 흐릿한 시력을 야기할 것이다. 특히 시력 중심이 그후 흐려질 수 있으며 질환이 진행됨에 따라 이 영역이 더 크게 자란다. 한쪽 눈만 영향을 받는 경우 증상이 의식되지 않을 수 있다. 습성 AMD에서는, 직선이 물결 모양으로 보일 수 있고 중심 시력 손실이 빠르게 발생할 수 있다.
황반 변성의 진단은 전형적으로 확장된 안구 검사, 시력 검사, 및 AMD 진단에 도움을 주는 안저 검사 (fundoscopy)라고 불리는 절차를 사용한 안구 후방의 관찰을 포함하며 - 습성 AMD가 의심된다면 - 플루오레세인 혈관 조영술이 또한 수행될 수 있다. 건성 AMD가 진행 단계에 도달한 경우, 시력 상실을 예방하기 위한 현재 치료법이 없다. 그러나, 산화방지제와 아연의 특정 고용량 포뮬러가 중등도 AMD가 진행 단계로 진행되는 것을 지연시키거나 방지할 수 있다. Macugen® (페갑타닙 나트륨 주사), 레이저 광응고 및 광역학 치료법이 황반의 비정상적인 혈관 성장 및 출혈을 조절할 수 있으며, 이것은 습성 AMD를 가진 일부 사람들에게 도움이 된다; 그러나, 이미 상실한 시력은 이러한 기술로 복원되지 않을 것이다. 시력이 이미 상실된 경우, 삶의 질을 개선시키는데 도움이 될 수 있는 저시력 보조기 (low vision aid)가 존재한다.
연령-관련 황반 변성 (AMD)의 가장 초기 징후 중 하나는 망막 색소 상피 (RPE)의 기저판과 브루프 막 (BM) 사이에 드루젠으로 알려진 세포외 침착물의 축적이다. Anderson 등에 의해 수행된 최근 연구에서는 드루젠이 아밀로이드 베타를 함유함을 확인하였다. (Experimental Eye Research 78 (2004) 243 - 256).
피로글루타메이트화된 Aβ 펩타이드는 알츠하이머병에서 Aβ 펩타이드의 축적 및 플라크 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 이들의 소수성 전위로 인해, 이들 펩타이드는 응집 및 플라크 형성을 촉진하는 것으로 나타났다. 뉴런에서 Aβ N3pE-42를 발현하는 유전자이식 마우스 모델에서 이 펩타이드는 생체내 신경독성이며 뉴런의 상실을 초래하는 것으로 추가로 나타났다 (Wirths et al. (2009) Acta Neuropatho/118, 487-496).
Aβ 펩타이드의 N-말단 피로글루타메이트에 대한 특이성을 갖는 항체는 N-말단에 피로글루타메이트를 지니지만 APP를 검출하지 않는 Aβ의 병원성 종 또는 N-말단 피로글루타메이트가 없는 다른 Aβ 종 만에 대한 이들의 특이성 때문에 유리한 것으로 믿어진다. 따라서, 조절할 수 없는 뇌 염증과 같은 잠재적 부작용의 위험은 피로글루타메이트화 변이체인 다른 Aβ 종에 대한 항체와 비교하여 본 발명의 항체의 사용에 의해 감소될 것으로 믿어진다.
Aβ N3pE 펩타이드를 표적으로 하는 항체가 알려져 있다 (Acero et al (2009) J Neuroimmunol 213, 39-46; Saido et al. (1996) Neuron 14, 457-466; US 7,122,374 및 WO 2012/136552).
그러나, 인간 치료에 사용될 수 있고 아밀로이드증, 특히 임상 또는 전임상 알츠하이머병, 다운 증후군, 및 임상 또는 전임상 대뇌 아밀로이드 혈관병증과 같이 Aβ N3pE가 관여할 수 있는 질환 및 병태에서의 인지에 긍정적으로 영향을 미치는, Aβ N3pE 펩타이드에 대해 특이성을 갖는 인간화 및 탈-면역화된(de-immunized) 항체가 필요하다.
본 발명의 항체의 모 항체는 제WO 2017/009459호에 개시된 클론#6 변이체이며, 이것은 하기의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖고:
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK (서열 번호 1), 이것은 제WO 2017/009459호에 서열 번호 14로서 개시됨;
하기의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖는다:
QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS (서열 번호 49), 이것은 제WO 2017/009459호에 서열 번호 27로서 개시됨.
그러나, 제WO 2017/009459호에 개시된 바와 같은 이러한 클론#6 변이체를 사용하여, CMC 제조를 확립하는 것은 불가능하였다. 특히, 수 회의 시도에도 불구하고, CHO-DG44 세포에서 안정한 세포 클론이 확립될 수 없었으며, 이러한 클론#6 변이체의 약한 일시적 발현 (불충분한 항체 양을 산출함) 만이 관찰되었고, CMC 제조를 위한 전제 조건으로서 안정한 발현이 확립될 수 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 선행 기술의 항체의 단점을 극복하기 위해 개선된 특성을 갖는 인간화 및 탈-면역화된 항체를 제공하는 것이다.
일반적으로, 본 발명은 단량체, 이량체, 삼량체 등 또는 중합체 형태로, 응집체, 섬유, 필라멘트 형태로 또는 플라크의 축합된 형태로 항체에 제시될 수 있는 광범위한 β-아밀로이드 항원, 특히 Aβ N3pE 펩타이드로부터의 특정 에피토프를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는, 부분 또는 완전 인간화된 항체 및 이의 단편을 포함한 키메라 항체 및 이의 단편을 포함하는 고도로 특이적이고 매우 효과적인 항체를 포함하는 신규한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명의 목적은 특히 항체 또는 이의 기능적 변이체에 의해 해결되며, 여기서 상기 항체의 경쇄의 가변 부분은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성되고:
Figure pct00001
여기서 상기 항체의 중쇄의 가변 부분은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다:
Figure pct00002
중쇄의 가변 부분 (서열 번호 2)은 제WO 2017/009459호에 개시된 모 항체와 비교하여 위치 K12V, S14P 및 N55D에 3개의 돌연변이를 함유한다.
놀랍게도, 이러한 세 개의 점 돌연변이의 도입이 높은 수율로 CMC를 제조할 수 있는 인간화 및 탈-면역화된 항체를 야기하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 세 개의 점 돌연변이를 포함하는 본 발명의 항체로 CHO-DG44 세포에서 항체 생산 세포주를 확립하는 것이 가능하였다. CHO-DG44에서 개선된 일시적 발현을 확립하여, 항체의 유리한 결합 특성을 유지하면서 모 항체와 비교하여 K12V, S14P 및 N55D 돌연변이를 포함하는 본 발명의 항체의 더 높은 수율을 초래하는 것이 추가로 가능하였다. 마지막으로, 높은 발현 수준을 갖는 K12V, S14P 및 N55D 돌연변이를 포함하는 본 발명의 항체로 안정한 발현을 확립하여 CMC 생산을 가능하게 할 수 있다.
본 발명은 Aβ N3pE가 관여될 수 있는 아밀로이드증의 질환 및 병태에 긍정적으로 영향을 미치는 인간화 및 탈-면역화된 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 순환 및 조직에서, 특히 뇌에서 Aβ N3pE 펩타이드에 결합하는 항체 및 이의 단편을 제공한다. 본 발명의 항체는 유리 Aβ N3pE 펩타이드 분자 또는 심지어 결합된 형태의 Aβ N3pE 펩타이드에 결합할 수 있다.
따라서, 본 발명은 뇌와 같은 중추 신경계 및 혈장과 같은 순환계에서 가용성 및 결합된 형태의 Aβ N3pE 펩타이드의 제거를 변경시키는 항체를 추가로 제공한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 Aβ N3pE의 N-말단을 보유하는 피로글루타메이트에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 단편을 제공한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 Aβ 펩타이드의 올리고머 및/또는 피브릴에 대한 증가된 선택성을 나타내는 항체 및 이의 단편을 제공한다. 본 발명의 항체는 선행 기술에 공지된 필적하는 단클론 항체보다, 특히 제WO 2017/009459호에 개시된 모 항체에 비해, Aβ (1-42)의 올리고머 및/또는 피브릴에 결합하기 위해 다수, 예를 들어 10배, 25배, 50배, 100배, 150배, 200배, 250배 또는 250배 이상 낮은 결합 상수 (KD 값)를 나타낸다. 따라서, Aβ N3pE 펩타이드에 선택적으로 결합하도록 확립된 본 발명의 항체는 Aβ N3pE 펩타이드에 대해 보다 특이적이고 Aβ N3pE 이외의 Aβ 펩타이드에 대해 감소된 교차-반응성을 나타낸다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 또한 벡터로 형질전환되거나 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 발현하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체 및 이의 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 인간에서 Aβ N3pE에 결합하고 이를 소거 또는 제거하며, 이에 의해 아밀로이드증 또는 Aβ N3pE 독성을 특징으로 하는 질환 및 병태를 진단, 예방 및 치료하는데 유용한 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 용도에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 생물학적 유체 및 조직에서 Aβ N3pE 펩타이드에 결합하고 이를 소거하거나 제거할 수 있는 본 발명의 항체는 뇌에서 확산 플라크, 신경 플라크 및 뇌혈관 플라크와 같은 Aβ N3pE-함유 플라크의 형성과 관련된 병태의 예방 및/또는 치료에 유용하다.
면역학적 반응성 단편을 포함한 본 발명의 항체의 투여는 상기한 플라크 또는 다른 생물학적 복합체로부터의 Aβ N3pE의 소거 또는 제거를 초래할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 순환에서, 다른 체액에서 및 상기한 플라크 및/또는 다른 생물학적 복합체가 형성되는 부위 또는 달리 Aβ N3pE가 손상 효과를 나타내는 부위로 쉽게 수송될 것이다.
또한, 본 발명의 항체에 의한 플라크 또는 다른 생물학적 복합체로부터의 Aβ N3pE의 제거는 불용성 형태의 플라크의 가용화를 초래할 수 있고, 따라서 뇌 조직과 같은 영향을 받은 조직으로부터 완전한 플라크의 제거를 초래할 수 있다. 이것은 결국 경증 인지 장애 (MCI), 예를 들어 산발성 알츠하이머병 (SAD) 같은 알츠하이머병 (AD), 또는 가족성 영국 치매 (Familial British Dementia; FBD) 및 가족성 덴마크 치매 (Familial Danish Dementia; FDD) 같은 가족성 알츠하이머 치매 (FAD) 등, 다운 증후군에서의 신경퇴행, 루이 소체 치매 (Lewy body dementia), 아밀로이드증을 가진 유전성 뇌일혈 (hereditary cerebral hemorrhage) (네덜란드 형); 괌 파킨슨-치매 복합증 (Guam Parkinson-Dementia complex)과 같은 신경퇴행성 질환으로 진단된 환자에서 인지의 개선을 야기할 수 있다. 특히, 본 발명은 전구 AD, 경증 AD, 중등도 AD 및 중증 AD로부터 선택된 병태의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 임상 또는 전임상 알츠하이머병, 다운 증후군, 및 임상 또는 전임상 대뇌 아밀로이드 혈관병증으로부터 선택된 병태로 진단된 환자에서 인지 저하를 늦추는데 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다.
순환 또는 다른 체액에서 Aβ N3pE에의 본 발명의 항체의 결합은 추가로 순환 또는 가용성 형태의 Aβ N3pE의 제거를 초래할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, Aβ N3pE는 높은 소수성을 나타내며 기타, 예를 들어 비피로글루타메이트화된 Aβ 펩타이드에 대해 높은 친화성을 가지고 있어 아밀로이드 플라크와 같은 올리고머성 및 초분자 구조의 형성을 초래한다. 특히 이러한 올리고머성 구조는 매우 신경독성인 것으로 나타났다. 올리고머성 구조의 형성은 세포 손상 및 뉴런 세포의 사멸로 이어진다. 따라서, 순환 또는 가용성 형태의 Aβ N3pE 또는 심지어 Aβ N3pE를 포함하는 올리고머의 제거는 세포 손상 및/또는 신경독성의 예방을 야기한다. 따라서, 본 발명은 또한 경증 인지 장애 (MCI), 예를 들어 산발성 알츠하이머병 (SAD) 같은 알츠하이머병 (AD), 또는 가족성 영국 치매 (Familial British Dementia; FBD) 및 가족성 덴마크 치매 (Familial Danish Dementia; FDD) 같은 가족성 알츠하이머 치매 (FAD) 등, 다운 증후군에서의 신경퇴행, 루이 소체 치매 (Lewy body dementia), 아밀로이드증을 가진 유전성 뇌일혈 (hereditary cerebral hemorrhage) (네덜란드 형), 괌 파킨슨-치매 복합증 (Guam Parkinson-Dementia complex)과 같은 신경퇴행성 질환의 예방 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 전구 AD, 경증 AD, 중등도 AD 및 중증 AD로부터 선택된 병태의 치료 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 임상 또는 전임상 알츠하이머병, 다운 증후군, 및 임상 또는 전임상 대뇌 아밀로이드 혈관병증으로부터 선택된 병태로 진단된 환자에서 인지 저하를 늦추는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 진행성 핵상 마비 (progressive supranuclear palsy), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 크로이츠펠트 야콥병 (Creutzfeld Jacob disease), 파킨슨병 (Parkinson's disease), HIV-관련 치매, ALS (근위축성 측삭 경화증 (amyotropic lateral sclerosis)), 성인 발병성 당뇨병 (Adult Onset Diabetes)과 관련된 치매; 노인성 심장 아밀로이드증 (senile cardiac amyloidosis), 및 황반 변성 (macular degeneration)을 포함한 기타와 같은 아밀로이드-유사 단백질, 특히 Aβ N3pE를 기반으로 하거나 이와 연관된 다른 질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 생물학적 샘플, 예를 들어 액체 (liquor) 또는 혈청 샘플, 바람직하게는 혈청 샘플, 또는 조직 샘플에서 Aβ 변이체, 특히 Aβ N3pE의 정량적 결정을 가능하게 하는 매우 민감하고 동시에 강력한 검출 기술을 제공한다. 혈액 중의 이러한 Aβ N3pE 펩타이드의 낮은 풍부도를 고려하면 이것은 엄청난 도전이다. 그러나, 이러한 검출 기술을 이용 가능하게 하는 것이 약물 스크리닝 및 약물 개발 프로그램에서 소분자 억제제의 효능을 연구하기 위한 전제 조건이다.
본 발명의 교시에 의해 가능해진 항체는 아밀로이드증, 몇 가지만 예로 들자면, 알츠하이머병 (AD), 루이 소체 치매 (Lewy body dementia), 다운 증후군 (Down's syndrome), 아밀로이드증을 가진 유전성 뇌일혈 (hereditary cerebral hemorrhage) (네덜란드 형), 괌 파킨슨-치매 복합증 (Guam Parkinson-Dementia complex)과 같은 신경성 장애 뿐만 아니라 진행성 핵상 마비 (progressive supranuclear palsy), 다발성 경화증 (multiple sclerosis); 크로이츠펠트 야콥병 (Creutzfeld Jacob disease), 네델란드형 아밀로이드증을 가진 유전성 뇌일혈, 파킨슨병 (Parkinson's disease), HIV-관련 치매, ALS (근위축성 측삭 경화증 (amyotropic lateral sclerosis)), 성인 발병성 당뇨병 (Adult Onset Diabetes)과 관련된 치매; 노인성 심장 아밀로이드증 (senile cardiac amyloidosis), 및 황반 변성 (macular degeneration)을 포함한 기타와 같은 아밀로이드-유사 단백질을 기반으로 하거나 이와 연관된 다른 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는 이차 아밀로이드증 및 연령-관련 아밀로이드증을 포함하는 아밀로이드 플라크 형성과 관련된 질환 및 장애의 그룹의 진단에 특히 유용하다.
도 1은 본 발명의 항체의 개별 변이체의 일시적 발현 (A) 및 표적 결합 (B)에 대한 중쇄에서의 점 돌연변이의 영향을 보여준다. 시험된 모든 항체는 서열 번호 1의 경쇄의 가변 부분 및 중쇄의 K324A 돌연변이를 함유한다.
Ab 1: 모 서열인 서열 번호 49와 비교하여 중쇄의 가변 부분에 2개의 돌연변이 K12V 및 S14P를 함유하고;
Ab 2: 모 서열인 서열 번호 49와 비교하여 중쇄의 가변 부분에 돌연변이 N55D를 함유하고;
Ab 3: 돌연변이가 없는 중쇄의 가변 부분의 모 서열인 서열 번호 49를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 항체의 개별 변이체의 일시적 발현 (A) 및 표적 결합 (B)에 대한 중쇄에서의 점 돌연변이의 영향을 보여준다. 시험된 모든 항체는 서열 번호 1의 경쇄의 가변 부분 및 중쇄의 K324A 돌연변이를 함유한다.
Ab 1: 모 서열인 서열 번호 49와 비교하여 중쇄의 가변 부분에 2개의 돌연변이 K12V 및 S14P를 함유하고;
Ab 2: 모 서열인 서열 번호 49와 비교하여 중쇄의 가변 부분에 돌연변이 N55D를 함유하고;
Ab 3: 모 서열인 서열 번호 49와 비교하여 중쇄의 가변 부분에 3개의 돌연변이 K12V, S14P 및 N55D를 함유한다.
도 3은 96-웰 플레이트에서 골라낸 콜로니로부터 24-웰 플레이트의 웰을 접종한지 7, 10 및 13일 후 서열 번호 1의 경쇄의 가변 부분 및 서열 번호 2의 중쇄의 가변 부분을 갖는 항체를 발현하는 CHO-DG44 클론을 보여준다.
도 4는 MTX 노출 (7일)을 통한 유전자 증폭 후의 CHO-DG44 발현 역가를 보여준다.
정의
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로, 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 무손상 단클론 항체, 다클론 항체, 적어도 두 개의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이 항체 (예를 들어, 이중특이 항체), 및 항체 단편을 포함한다. 항체는, 예를 들면, IgM, IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), IgD, IgA 또는 IgE일 수 있다. 그러나, 바람직하게는 항체는 IgM 항체가 아니다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 일반적으로 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편: 디아바디; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이 항체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 가리키며, 즉 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 또한, 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 "다클론 항체" 제제와 대조적으로, 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이들의 특이성에 더하여, 단클론 항체는 이들이 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양에 의해 합성된다는 점에서 종종 유리할 수 있다. "단클론"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득되는 것과 같은 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 Kohler 등[Kohler et al., Nature, 256 : 495 (1975)]에 의해 처음 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 일반적으로 잘 알려진 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. "단클론 항체"는 또한, 예를 들면, 문헌[Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991), 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기술된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
단클론 항체는 본원에서 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 키메라 항체 (면역글로불린) 뿐만 아니라, 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이러한 항체의 단편을 포함한다.
비인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 면역글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 외래의 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다.
이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선하고 최적화하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로는 두 개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비인간 면역글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 최적으로 또한 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌[Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986), Reichmann et al, Nature. 332:323-329 (1988): and Presta, Curr. Op. Struct. Biel., 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
"인간화"에 더하여, "탈-면역화"는 T 세포 에피토프 제거와 같은 다른 변화를 포함한다.
본원 및 첨부된 청구항에서 사용되는 용어 "치료적 유효량"은 투여되는 항체의 양이, 예를 들어, 이 경우, 적어도 순환성 또는 가용성 형태의 피로글루타메이트화 아밀로이드 베타 (Aß N3pE) 펩타이드 및 이의 변이체의 제거, 바람직하게는 플라크 또는 다른 생물학적 복합체로부터의 Aβ N3pE 펩타이드의 소거 또는 제거, 또는 보다 바람직하게는 뇌 조직과 같은 영향을 받은 조직으로부터의 플라크 부하 감소 및/또는 완전한 플라크 제거와 같은 의도된 목적을 달성하기에 충분한 양이라는 것을 의미한다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함하며, 이것은 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다. sFv의 검토를 위해 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 두 개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 가리키며, 이 단편은 동일한 폴리펩타이드 쇄 (VH - VD)에서 경쇄 가변 도메인 (VD)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 쇄 상의 두 개의 도메인 사이에 쌍을 형성하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 이루고 두 개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sol. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 충분히 기술되어 있다.
"단리된" 항체는 이의 자연 환경의 성분으로부터 동정되고 분리되고/되거나 회수된 것이다. 이의 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단적 또는 치료적 사용을 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로리법(Lowry method)에 의해 결정된 바와 같이 항체의 95중량% 초과, 가장 바람직하게는 99중량% 초과로, (2) 스피닝 컵 서열분석기의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 (Coomassie blue) 또는, 바람직하게는, 은 염색 (silver stain)을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 균질화도로 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함한다. 그러나, 대개, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에서 사용되는 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환 가능하게 사용되며 이러한 모든 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 전이 횟수에 관계없이 일차 대상체 세포 및 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 고의적이거나 부주의한 돌연변이로 인해 모든 자손이 DNA 함량에서 정확하게 동일하지 않을 수도 있는 것으로 또한 이해된다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다. 별개의 명칭이 의도된 경우, 이것은 문맥으로부터 명백할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 상호교환 가능하며 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산으로 구성된 생체분자를 의미하는 것으로 정의된다.
펩타이드 또는 아미노산 서열이 본원에 언급된 경우, 각각의 아미노산 잔기는 하기 통상적인 목록에 따라 아미노산의 통속명에 상응하는 1문자 또는 3문자 명칭으로 표시된다:
Figure pct00003
본원에서 사용되는 용어 "a", "an" 및 "the"는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 정의되며 문맥이 부적절하지 않은 한 복수를 포함한다.
언어 "아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질에 의해 유발되거나 이와 관련된 질환 및 장애"는 단량체, 피브릴, 또는 중합체 상태, 또는 세 가지의 임의의 조합에서 아밀로이드-유사 단백질의 존재 또는 활성에 의해 야기되는 질환 및 장애를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 질환 및 장애는 아밀로이드증, 내분비 종양, 및 황반 변성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "아밀로이드증"은, 예를 들면, 경증 인지 장애 (MCI), 산발성 알츠하이머병 (SAD), 루이 소체 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증을 가진 유전성 뇌일혈 (네덜란드 형)과 같은 인지 기억 능력의 상실을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 포함하는 알츠하이머병 (AD)과 같은 신경성 장애; 괌 파킨슨-치매 복합증, 가족성 영국 치매 (FBD) 및 가족성 덴마크 치매 (FDD) 같은 가족 형태의 알츠하이머병; 뿐만 아니라 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증과 같은 아밀로이드-유사 단백질을 기반으로 하거나 이와 관련된 다른 질환; 크로이츠펠트-야콥병, 파킨슨병, HIV-관련 치매, ALS (근위축성 측삭 경화증), 봉입체 근염 (IBM), 성인 발병성 당뇨병, 및 노인성 심장 아밀로이드증; 및 황반 변성, 드루젠-관련 시각 신경병증, 및 베타-아밀로이드 침착으로 인한 백내장을 포함한 다양한 안과 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는 질환과 같은 이차 아밀로이드증 및 연령-관련 아밀로이드증을 포함하지만 이에 제한되지 않는 아밀로이드 플라크 형성과 관련된 질환 및 장애의 그룹을 지칭한다.
"아밀로이드 β, Aβ 또는 /β-아밀로이드"는 당업계에서 인지되는 용어이며 아밀로이드 β 단백질 및 펩타이드, 아밀로이드 β 전구체 단백질 (APP), 및 이의 변형, 단편 및 임의의 기능적 등가물을 가리킨다. 특히, 본원에 사용되는 아밀로이드 β란 APP의 단백질분해 절단에 의해 생성된 임의의 단편, 특히 Aβ1 -38, Aβ1 -40, Aβ1 -42를 포함하지만 이에 제한되지 않는 아밀로이드 병리에 관여되거나 이와 관련된 단편을 의미한다. 이들 Aβ 펩타이드의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
"pGlu-Aβ" 또는 "Aβ N3pE"는 Aβ의 아미노산 서열에서 위치 3의 글루탐산 잔기에서 시작하는 N-말단 절단 형태의 Aβ를 가리키며, 여기서 상기 글루탐산 잔기는 폐환되어 피로글루탐산 잔기를 형성한다. 특히, 본원에서 사용되는 pGlu-Aβ 또는 Aβ N3pE란 pGlu-Aβ3 -38, pGlu-Aβ3 -40, p-Glu-Aβ3 -42를 포함하지만 이에 제한되지 않는 아밀로이드 병리에 관여되거나 이와 관련된 단편을 의미한다.
N-말단 절단 형태의 Aβ, Aβ3 -38, Aβ3 -40, Aβ3 -42의 서열은 다음과 같다:
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
본 발명은 N-말단의 아미노산 번호 1 및 2를 절단하거나 상실함으로써 N-말단 절단되고 이렇게 덮히지 않은 N-말단 아미노산 번호 3은 피로글루타메이트 형성에 의해 변형되고 이에 따라 N-말단의 위치 3에 피로글루타메이트 잔기를 보유하는 인간 Aβ 펩타이드에 특이적인 항체에 관한 것이다 (Aβ N3pE 펩타이드 또는 N3pE-Aβ 펩타이드 또는 피로글루타메이트화 Aβ 펩타이드라고도 함).
제1 측면에서, 본 발명은 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 항체의 경쇄의 가변 부분은 하기 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성되고:
Figure pct00010
여기서 상기 항체의 중쇄의 가변 부분은 하기 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다:
Figure pct00011
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된, 상기 항체의 경쇄의 가변 부분을 갖는 항체는 경쇄에 하기의 CDR 영역을 포함한다:
VLCDR1: SSQSLLYSDGKTYLN (서열 번호 3);
VLCDR2: LVSKLDS (서열 번호 4); 및
VLCDR3: VQGTHFP (서열 번호 5).
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된, 상기 항체의 중쇄의 가변 부분을 갖는 항체는 중쇄에 하기의 CDR 영역을 포함한다:
VHCDR1: GYSFTGHTMN (서열 번호 6);
VHCDR2: LINPSDGVTRYNQKFQG (서열 번호 7); 및
VHCDR3: EAKREWDETY (서열 번호 8).
본 발명은 추가로 본 발명의 항체의 경쇄 및 중쇄를 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 경쇄를 가지며, 여기서 경쇄는 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다:
Figure pct00012
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 중쇄를 가지며, 여기서 중쇄는 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다:
Figure pct00013
C1q 및 두 개의 세린 프로테아제, C1r 및 C1s는 보체 의존적 세포독성 (CDC) 경로의 첫 번째 성분인 복합체 C1을 형성한다. C1q는 대략 460,000의 분자량과 6개의 콜라겐성 "줄기"가 6개의 구상 머리 영역에 연결된 튤립 꽃다발과 유사한 구조를 갖는 6가 분자이다 (Burton and Woof, Advances in Immunol 51:1-84; 1992). C1q에의 IgG1 분자의 결합은 보체 활성화를 개시하고, 후속적으로 보체-매개된 세포 용해를 초래한다. 본 발명의 항체는 염증성 질환 및 병태의 치료에 사용될 수 있으며, 즉 본 발명의 항체는 항염증 특성을 가질 것이다.
본 발명의 항체의 이펙터 기능은 또한 항체의 Fc 영역과 조혈 세포 상의 특수한 세포 표면 수용체인 Fc 수용체 (FcR)와의 상호작용에 의해 매개될 수 있다. Fc 수용체는 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하며, 면역 복합체의 식세포 작용에 의한 항체-코팅된 병원체의 제거, 및 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC)을 통한 적혈구 및 상응하는 항체로 코팅된 다양한 다른 세포 표적 (예를 들어, 종양 세포)의 용해 둘 다를 매개하는 것으로 나타났다 (Van de Winkel and Anderson, J. Leuk. Bioi. 49:511-24; 1991).
따라서, 본 발명은 추가로 이들의 이펙터 기능을 달성하기 위해 Fc 수용체에 여전히 결합하는 항체를 제공한다. 그러나, 바람직하게는 본 발명의 항체는 보체 의존적 세포독성을 보이지 않는다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체는 보체 시스템을 활성화시키지 않고, 오히려 보체-매개된 세포 용해를 억제한다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 아미노산 치환, 바람직하게는 3개 또는 2개 아미노산의 치환, 가장 바람직하게는 하나의 아미노산의 치환을 포함하는 인간 IgG Fc 영역을 갖는다. 아미노산 치환은 본 발명의 항체의 인간 IgG1 Fc 영역의 부위-지정 돌연변이 유발과 같은 통상적인 방법에 의해 달성될 수 있다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 18에 나타낸 바와 같이 위치 324에 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG Fc 영역을 갖는다 [위치 324는 EU 넘버링 방식에 따라 위치 322에 해당한다, Kabat et al., Sequences of Proteins of lmmunological lnterest, 5th Ed., US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991); Edelman et al., PNAS USA 63:78-85 (1969)]. 아미노산 치환은 바람직하게는 K324A이다.
가장 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된 중쇄를 갖는다:
Figure pct00014
추가로 본 발명에 따르면, 경쇄 및 중쇄의 가변 부분 및 경쇄 및 중쇄의 하기 조합을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된 항체가 바람직하다:
A) 경쇄 가변 부분: 서열 번호 1
중쇄 가변 부분: 서열 번호 2
경쇄: 서열 번호 17
중쇄: 서열 번호 19
B) 경쇄 가변 부분: 서열 번호 1
중쇄 가변 부분: 서열 번호 2
경쇄: 서열 번호 17
중쇄: 서열 번호 18
B)에 따른 항체가 가장 바람직하다. 중쇄는 K324A 아미노산 교환을 함유한다.
본 발명에 따른 바람직한 항체는 하이브리도마 세포주 Aβ 6-1-6에 의해 생성된 단클론 마우스 항체의 인간화 형태 (기탁 번호 DSM ACC 2924)이며, 이것은 제WO 2010/009987호에 기술되어 있다.
본 발명의 항체에 대한 경쇄 및 중쇄의 서열은 변할 수 있다. 면역글로불린은 2개 쌍의 경쇄/중쇄 복합체를 가질 수 있으며, 적어도 하나의 쇄는 인간 프레임워크 영역 세그먼트에 기능적으로 연결된 하나 이상의 마우스 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 두 개의 경쇄와 두 개의 중쇄를 포함하며, 여기서 각 경쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 17이고, 각 중쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 18 또는 서열 번호 19이다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 항체는 두 개의 경쇄와 두 개의 중쇄를 포함하며, 여기서 각 경쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 17이고, 각 중쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 19이다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 항체는 두 개의 경쇄와 두 개의 중쇄를 포함하며, 여기서 각 경쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 17이고, 각 중쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 18이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 제시된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 CDR을 포함하는 본 발명의 항체를 암호화하는 재조합 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 항체의 인간 프레임워크 영역은 CDR-제공 비인간 면역글로불린의 프레임워크 또는 가변 영역 아미노산 서열을 인간 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 서열 수집에서의 상응하는 서열과 비교함으로써 결정된다. 높은 퍼센트의 동일 아미노산을 갖는 서열이 선택된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 서열 번호 1에 따른 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 가변 부분은 하기 핵산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된 핵산 분자에 의해 암호화된다:
Figure pct00015
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 서열 번호 2에 따른 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 가변 부분은 하기 핵산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된 핵산 분자에 의해 암호화된다:
Figure pct00016
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체의 경쇄의 CDR 영역은 하기 핵산 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 암호화된다:
VLCDR1: tcaagtcagagcctcctgcactccgacggcaagacctacttgaac (서열 번호 11);
VLCDR2: ctggtgtctaagctggactct (서열 번호 12); 및
VLCDR3: gtgcaaggtacacacttccca (서열 번호 13).
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체의 중쇄의 CDR 영역은 하기 핵산 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 암호화된다:
VHCDR1: ggttactcattcactggtcacaccatgaac (서열 번호 14);
VHCDR2: ctcatcaatccttccgatggtgttactaggtacaaccagaagttcc
Agggc (서열 번호 15); 및
VHCDR3: gaggcgaaacgggagtgggacgagacttac (서열 번호 16).
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 경쇄는 하기 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된 핵산 서열에 의해 암호화된다:
Figure pct00017
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 중쇄는 하기 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된 핵산 분자에 의해 암호화된다:
Figure pct00018
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 중쇄는 하기 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된 핵산 분자에 의해 암호화된다:
Figure pct00019
추가로 본 발명에 따르면, 하기의 것을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된 핵산 분자의 조합에 의해 암호화된 항체가 바람직하다:
C) 경쇄 가변 부분: 서열 번호 9
중쇄 가변 부분: 서열 번호 10
경쇄: 서열 번호 20
중쇄: 서열 번호 22
D) 경쇄 가변 부분: 서열 번호 9
중쇄 가변 부분: 서열 번호 10
경쇄: 서열 번호 20
중쇄: 서열 번호 21
조합 D)는 중쇄에 K324A 아미노산 교환을 함유하는 인간화 및 탈-면역화된 항체를 암호화하기 때문에 가장 바람직하다.
상기한 핵산 분자는 당업계에 잘 알려진 발현 벡터에 통합될 수 있다. 적절한 숙주에서의 이들 발현 벡터의 형질감염, 숙주의 선택 뿐만 아니라 경쇄, 중쇄, 경쇄/중쇄 이량체 또는 무손상 항체, 결합 단편 또는 다른 면역글로불린 형태의 발현 수집 및 정제는 당업계에 잘 알려져 있는 절차이다.
당업계의 숙련가는, 예를 들면, 포유동물 세포 또는 박테리아 세포와 같은 특정 세포에서의 벡터 생산을 위해 원하는 특성에 기반하여 벡터를 선택할 수 있다.
임의의 다양한 유도성 프로모터 또는 인핸서가 조절될 수 있는 본 발명의 항체 또는 핵산의 발현을 위한 벡터에 포함될 수 있다. 이러한 유도성 시스템은, 예를 들면, 테트라사이클린 유도성 시스템 (Gossen & Bizard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992); Gossen et al., Science, 268:17664769 (1995); Clontech, Palo Alto, Calif.); 중금속에 의해 유도된 메탈로티오네인 프로모터; 엑디손 또는 관련 스테로이드, 예를 들어 뮤리스테론에 반응하는 곤충 스테로이드 호르몬 (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996); Yao et al., Nature, 366:476-479 (1993); Invitrogen, Carlsbad, Calif.); 글루코코르티코이드 및 에스트로겐과 같은 스테로이드에 의해 유도된 마우스 유선 종양 바이러스 (MMTV) (Lee et al., Nature, 294:228-232 (1981); 및 온도 변화에 의해 유도될 수 있는 열 충격 프로모터; 래트 뉴런 특이 에놀라제 유전자 프로모터 (Forss-Petter, et al., Neuron 5; 197-197 (1990)); 인간 β-액틴 유전자 프로모터 (Ray, et al., Genes and Development (1991) 5:2265-2273); 인간 혈소판 유래 성장 인자 B (PDGF-B) 쇄 유전자 프로모터 (Sasahara, et al., Cell (1991) 64:217-227); 래트 나트륨 터널 유전자 프로모터 (Maue, et al., Neuron (1990) 4:223-231); 인간 구리-아연 수퍼옥사이드 디스뮤타제 유전자 프로모터 (Ceballos-Picot, et al., Brain Res. (1991) 552:198-214); 및 포유동물 POU-도메인 조절 유전자 패밀리의 구성원을 위한 프로모터 (Xi et al., (1989) Nature 340:35-42)를 포함한다.
프로모터 또는 인핸서를 포함하는 조절 요소는 구성적이거나 조절의 특성에 따라 조절될 수 있다. 조절 서열 또는 조절 요소는 핵산 분자 서열과 조절 서열 사이의 물리적 및 기능적 관계가 핵산 분자 서열의 전사를 가능하게 하도록 본 발명의 핵산 분자 서열 중 하나에 작동 가능하게 연결된다. 진핵 세포에서의 발현에 유용한 벡터는, 예를 들면, CAG 프로모터, SV40 초기 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 스테로이드-유도성 프로모터, Pgtf, 몰로니 해양 백혈병 바이러스 (MMLV) 프로모터, thy-1 프로모터 등을 포함한 조절 요소를 포함할 수 있다.
경우에 따라, 벡터는 선택 가능한 마커를 함유할 수 있다. 본원에서 사용되는 "선택 가능한 마커"는 선택 가능한 마커가 도입된 세포에 선택 가능한 표현형을 제공하는 유전자 요소를 가리킨다. 선택 가능한 마커는 일반적으로 유전자 산물이 세포 성장을 억제하거나 세포를 사멸시키는 작용제에 내성을 제공하는 유전자이다. 예를 들면, Ausubel 등 (Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999)) 및 미국 특허 제5,981,830호에 기술된 바와 같이, 예를 들면, Neo, Hyg, hisD, Gpt 및 Ble 유전자를 포함하는 각종 선택 가능한 마커가 본 발명의 DNA 작제물에 사용될 수 있다. 선택 가능한 마커의 존재를 위해 선택하는데 유용한 약물은, 예를 들면, Neo의 경우 G418, Hyg의 경우 히그로마이신, hisD의 경우 히스티디놀, Gpt의 경우 크산틴, 및 Ble의 경우 블레오마이신을 포함한다 (Ausubel et al, supra, (1999); 미국 특허 제5,981,830호 참조). 본 발명의 DNA 작제물은 양성 선택 가능한 마커, 음성 선택 가능한 마커, 또는 둘 다를 포함할 수 있다 (예를 들면, 미국 특허 제5,981,830호 참조).
다양한 포유동물 세포 배양 시스템이 또한 재조합 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 포유동물 발현 시스템의 예는 문헌 [Gluzman, Cell, 23: 175 (1981)]에 기술된 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 계통을 포함한다. 상용성 벡터를 발현할 수 있는 다른 세포주는, 예를 들면, C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주를 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 일반적으로 복제 기점, 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 또한 임의의 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여자 및 수용자 부위, 전사 종결 서열, 및 5' 측면 비전사 서열을 포함할 것이다. SV40 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위로부터 유래된 DNA 서열은 필요한 비전사 유전자 요소를 제공하는데 사용될 수 있다.
폴리펩타이드는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 폴리펩타이드가 세포의 표면에서 발현된다면 회수가 촉진될 수 있지만, 이것이 전제 조건은 아니다. 더 긴 형태의 폴리펩타이드의 발현 후 절단되는 절단 생성물의 회수가 또한 바람직할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같은 단백질 리폴딩 단계는, 필요에 따라, 성숙 단백질의 구성을 완료하는데 사용될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)가 최종 정제 단계에 사용될 수 있다.
인간 불변 영역 DNA 서열은 다양한 인간 세포로부터 공지된 절차에 따라 단리될 수 있다.
본 발명은 특히 높은 친화도로 Aβ N3pE 펩타이드에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 Aβ N3pE 펩타이드 또는 이의 면역학적 활성 단편에 높은 친화도로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체에 관한 것이다. 상기 높은 친화도는 본 발명의 맥락에서 10-5 M, 10-6 M 또는 10-7 M 또는 그 이상의 KD 값, 바람직하게는 10-8 M 또는 그 이상의 KD 값, 훨씬 더 바람직하게는 10-9 M - 10-12 M의 KD 값의 친화도를 의미한다. 이에 의해, 본 발명의 항체는 이전에 공지된 항체보다 높은 친화도로 단량체성 Aβ N3pE에 결합한다.
바람직하게는, Aβ N3pE 결합에서 본 발명의 항체의 결합 에피토프는 N-말단에 피로글루타메이트를 지니는 에피토프이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체의 결합 에피토프는 하기의 것으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
pEFRHDSGYEVHHQKLV (서열 번호 23),
pEFRHDSGYEVHHQKL (서열 번호 24),
pEFRHDSGYEVHHQK (서열 번호 25),
pEFRHDSGYEVHHQ (서열 번호 26),
pEFRHDSGYEVHH (서열 번호 27),
pEFRHDSGYEVH (서열 번호 28),
pEFRHDSGYEV (서열 번호 29),
pEFRHDSGYE (서열 번호 30),
pEFRHDSGY (서열 번호 31),
pEFRHDSG (서열 번호 32),
pEFRHDS (서열 번호 33),
pEFRHD (서열 번호 34)
pEFRH (서열 번호 35), 및
pEFR (서열 번호 36).
가장 바람직하게는, 본 발명의 항체는 N-말단에 피로글루타메이트를 지니지 않는 결합 에피토프에 결합하지 않는다.
더욱 가장 바람직하게는, 상기 언급되고 후속적으로 언급된 결합 에피토프에 결합할 때, 본 발명의 항체는 항상 N-말단에 피로글루타메이트를 함유하는 서열 또는 서열의 일부에 결합한다. 본 발명의 항체는 N-말단에 피로글루타메이트를 함유하지 않는 서열 또는 서열의 일부에 결합하지 않는다.
추가로, 본 발명의 항체는 또한 Aβ N3pE 변이체에 결합할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, Aβ N3pE 변이체는 특히
pE-Aβ3 -38,
pE-Aβ3 -40,
pE-Aβ3 -42이다.
Aβ N3pE 펩타이드의 추가 변이체는 모두 Aβ N3pE 변이체이며, 이것은 알츠하이머병 또는 선행 알츠하이머병의 결과로서 뇌에 축적되는 것으로 나타났다. 이들은 pE-Aβ3 -X 펩타이드이며, 여기서 x는 19와 42 사이의 정수로 정의되고, 예를 들어, 상기 pE-Aβ3 -42에서, "42"가 "x"에 대한 정수일 것이다.
본 발명의 맥락에서 본 발명의 항체의 "기능적 변이체"는 결합 능력, 특히 pE-Aβ3-x 펩타이드에 대해 높은 친화도를 갖는 결합 능력을 보유하는 항체이다. 이러한 기능적 변이체의 제공은 당업계에 공지되어 있으며 상기한 가능성을 포함하며, 이것은 항체 및 이의 단편의 정의하에 나타내어져 있다.
추가의 실시양태에서, 항체는 상기 정의된 바와 같은 항체 단편이다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 상기 정의된 항체의 상보성-결정 영역 (CDR)을 갖는 인간화 및 탈-면역화 항체이다. 바람직하게는, 항체는 표지될 수 있으며; 가능한 표지는 상기 언급된 바와 같은 것 및 특히 항체의 진단적 용도의 당업계의 숙련가에게 공지된 모든 것이다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 고체상에 고정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 및 이전에 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 단편은 Aβ N3pE 단량체에 대한 결합 친화도보다 적어도 2배, 특히 적어도 4배, 특히 적어도 10배, 특히 적어도 15배, 보다 특히 적어도 20배, 특히 적어도 25배 더 높은 Aβ N3pE 올리고머, 섬유, 피브릴 또는 필라멘트에 대한 결합 친화도를 나타낸다.
여전히 또 다른 실시양태에서, 포유동물, 특히 인간 뇌에서 Aβ N3pE를 함유하는 Aβ 플라크를 포함한 응집된 Aβ에 실질적으로 결합하지만, 바람직하게는, 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)과 어떠한 유의한 교차-반응성을 보이지 않는 항체 또는 이의 단편이 이전에 본원에 기술된 바와 같이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 포유동물, 특히 인간 뇌에서 Aβ N3pE, 특히 아밀로이드 β (Aβ)를 함유하는 올리고머성 또는 중합체성 아밀로이드에 실질적으로 결합하지만, 바람직하게는, 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)과 어떠한 유의한 교차-반응성을 보이지 않는 항체 또는 이의 단편이 이전에 본원에 기술된 바와 같이 제공된다.
본 발명은 또한 상기 항체를 포함하는 조성물 및 아밀로이드증의 치료, 특히 포유 동물, 특히 인간에서 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 상기 조성물의 용도에 관한 것이다. 상기 신경퇴행성 질환은 특히 경증 인지 장애 (MCI), 예를 들어 산발성 알츠하이머병 (SAD)과 같은 알츠하이머병 (AD), 또는 가족성 영국 치매 (FBD) 및 가족성 덴마크 치매 (FDD)와 같은 가족성 알츠하이머 치매 (FAD), 다운 증후군의 신경퇴행으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병이다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 Aβ N3pE를 포함하는 플라크의 형성을 특징으로 하는 병태를 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 치료적 또는 예방적 유효량의 본 발명의 단클론 항체 또는 이의 면역학적 반응성 단편을 이러한 치료를 필요로 하는 인간에게, 바람직하게는 말초로, 투여함을 포함하며, 상기 항체는 N-말단에 피로글루타메이트를 지니는 Aβ N3pE 펩타이드의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 아밀로이드 플라크의 형성을 억제하고 아밀로이드 플라크를 소거 또는 제거하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 순환계, 체액 또는 조직, 특히 뇌에서 Aβ N3pE에 결합하고 추가로 바람직하게는 혈장 및 뇌에서 Aβ N3pE의 소거를 야기하는 유효량의 항체를 이러한 억제를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여함을 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 항체를 대상체에게 투여함을 포함하여, 경증 인지 장애 (MCI), 예를 들어 산발성 알츠하이머병 (SAD)과 같은 알츠하이머병 (AD), 또는 가족성 영국 치매 (FBD) 및 가족성 덴마크 치매 (FDD)와 같은 가족성 알츠하이머 치매 (FAD), 다운 증후군의 신경퇴행 및 임상 또는 전임상 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 바람직하게는 알츠하이머병으로 진단된 대상체에서 인지 저하를 역전시키고, 인지력을 개선시키고, 인지 저하를 치료하고, 인지 저하를 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 경증 인지 장애 (MCI), 예를 들어 산발성 알츠하이머병 (SAD)과 같은 알츠하이머병 (AD), 또는 가족성 영국 치매 (FBD) 및 가족성 덴마크 치매 (FDD)와 같은 가족성 알츠하이머 치매 (FAD), 다운 증후군의 신경퇴행 및 임상 또는 전임상 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 바람직하게는 알츠하이머병을 치료, 예방, 또는 역전시키거나; 또는 경증 인지 장애 (MCI), 예를 들어 산발성 알츠하이머병 (SAD)과 같은 알츠하이머병 (AD), 또는 가족성 영국 치매 (FBD) 및 가족성 덴마크 치매 (FDD)와 같은 가족성 알츠하이머 치매 (FAD), 다운 증후군의 신경퇴행 및 임상 또는 전임상 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 바람직하게는 알츠하이머병으로 진단된 대상체에서 인지 저하를 역전시키고, 인지력을 개선시키고, 인지 저하를 치료하고, 인지 저하를 예방하기 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 항체의 용도를 제공한다.
본 발명은 추가로 경증 인지 장애 (MCI), 예를 들어 산발성 알츠하이머병 (SAD)과 같은 알츠하이머병 (AD), 또는 가족성 영국 치매 (FBD) 및 가족성 덴마크 치매 (FDD)와 같은 가족성 알츠하이머 치매 (FAD), 다운 증후군의 신경퇴행 및 임상 또는 전임상 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 바람직하게는 알츠하이머병의 예방, 치료, 또는 역전; 경증 인지 장애 (MCI), 예를 들어 산발성 알츠하이머병 (SAD)과 같은 알츠하이머병 (AD), 또는 가족성 영국 치매 (FBD) 및 가족성 덴마크 치매 (FDD)와 같은 가족성 알츠하이머 치매 (FAD), 다운 증후군의 신경퇴행 및 임상 또는 전임상 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 바람직하게는 알츠하이머병로 진단된 대상체에서 인지 저하의 치료, 예방 또는 역전, 인지력의 개선, 인지 저하의 치료, 및 인지 저하의 예방; 또는 포유동물, 바람직하게는 인간에서 아밀로이드 플라크의 형성 또는 Aβ N3pE의 효과의 억제에 사용하기 위한 본원에 개시된 항체를 제공한다.
특정 실시양태에서 본 발명은 본 발명의 항체, 또는 본 발명에 따른 항체를 포함하는 이전에 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물을 동물, 특히 포유동물 또는 인간에게 투여함으로써 기억 장애를 겪고 있는 포유동물, 특히 인간의 인지 기억 능력을 유지 또는 증가시키고, 특히 인지 기억 능력을 회복하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로
a) 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 대상체에게 투여하는 단계; 및
b) 대상체로부터 채취한 생물학적 샘플에서 Aβ N3pE의 농도를 측정하는 단계를 포함하여, Aβ N3pE 또는 이의 변이체에 결합하는 항체로의 치료에 대한 인간 대상체의 반응을 평가하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한
a) 제1 양의 항체 또는 이의 단편을 대상체에게 투여하는 단계;
b) 제1 용량을 투여한 후 3시간 내지 2주 내에, 대상체로부터 채취한 생물학적 샘플에서 Aβ N3pE의 농도를 측정하는 단계;
c) 필요한 경우, 단계 b)의 결과에 기초하여 제2 양의 항체 또는 이의 단편을 계산하는 단계(여기서, 제2 양은 제1 양과 동일하거나 상이하다); 및
d) 제2 양의 항체 또는 단편을 투여하는 단계를 포함하여, Aβ N3pE에 결합하는 항체 또는 이의 변이체로 인간 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한
a) 대상체로부터 제1 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
b) 제1 샘플에서 Aβ N3pE의 베이스라인 농도를 측정하는 단계;
c) 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 대상체에게 투여하는 단계;
d) 항체 또는 이의 단편을 투여한 후 3시간 내지 2주 내에, 대상체로부터 제2 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및
e) 제2 생물학적 샘플에서 Aβ N3pE의 농도를 측정하는 단계를 포함하여, Aβ N3pE 관련 아밀로이드 플라크 형성을 억제 또는 예방하거나, Aβ N3pE 함유 플라크의 부하를 감소시키거나, 독성 Aβ N3pE 및 이의 변이체의 효과를 감소시키거나, Aβ N3pE를 함유하는 플라크와 관련된 병태 또는 질환을 치료하기 위해 포유동물, 바람직하게는 인간 대상체에서 Aβ N3pE에 결합하는 항체, 또는 이의 단편의 효능을 평가하는 방법을 제공하며, 여기서, 효능은 혈액에서 항체에 결합된 Aβ N3pE의 양 및 제1 생물학적 샘플과 비교하여 제2 생물학적 샘플에서 Aβ N3pE의 농도, 특히 이의 농도의 감소와 관련이 있다.
생물학적 샘플은, 예를 들면, 인간으로부터의 임의의 샘플일 수 있다. 하나의 특정 예에서, 샘플은 조직 샘플, 체액 샘플 또는 세포 샘플이다. 하나의 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 뇨, 뇌척수액 (CSF), 혈장, 림프, 타액, 땀, 흉막액, 활액, 누액, 담즙 및 췌장 분비물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가의 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈장이다. 바람직한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 CSF이다.
생물학적 샘플은 당업계의 숙련가에게 잘 알려진 방식으로 대상체로부터 수득될 수 있다. 특히, 혈액 샘플이 대상체로부터 수득될 수 있고 혈액 샘플은 통상의 방법에 의해 혈청 및 혈장으로 분리될 수 있다. 이로부터 생물학적 샘플이 수득되는 대상체는 바람직하게는 아밀로이드증의 질환 또는 병태, 바람직하게는 알츠하이머병에 걸린 것으로 의심되는 대상체, 알츠하이머병이 발병할 위험이 있고/있거나 다른 종류의 치매를 가질 위험이 있거나 가지고 있는 대상체이다. 특히, 샘플은 경증 인지 장애 (MCI)가 의심되고/되거나 알츠하이머병의 초기 단계에 있는 것으로 의심되는 대상체로부터 수득된다.
경증 인지 장애, 알츠하이머병, 가족성 영국 치매 또는 가족성 덴마크 치매 및 예를 들어 다운 증후군의 신경퇴행과 같은 아밀로이드증의 진단, 예방 및/또는 치료에서의 본 발명의 항체의 효능은 알츠하이머병의 기존 동물 모델에서 시험할 수 있다.
알츠하이머병의 적합한 동물 모델은 문헌[McGowan et al. TRENDS in Genetics, Vol. 22, No. May 2006, pp 281-289]에 검토되어 있으며, 아래 기술된 바와 같이 PDAPP, Tg2576, APP23, TgCRND8, PSEN1M146V 또는 PSEN1M146L, PSAPP, APPDutch, BRI-Aß40 및 BRI-Aß42, JNPL3, TauP301S, TauV337M, TauR406W, rTg4510, Htau, TAPP, 3xTgAD로부터 선택된다.
PDAPP: 강력한 플라크 병리를 가진 최초의 돌연변이 APP 유전자이식 모델. 마우스는 인디아나 돌연변이 (APPV717F)를 갖는 인간 APP cDNA를 발현한다. 플라크 병리는 반접합 PDAPP 마우스에서 6-9개월 사이에 시작된다. 시냅스 손실이 있지만 명백한 세포 소실은 없고 NFT 병리가 관찰되지 않는다. 이 모델은 백신화 치료 전략에 광범위하게 사용되어 왔다.
Tg2576 : 마우스는 햄스터 프리온 프로모터의 조절하에 돌연변이 APPSWE를 발현한다. 9개월령부터 플라크 병리가 관찰된다. 이들 마우스는 인지 결손을 갖지만 세포 소실 또는 NFT 병리가 없다. 이 모델은 알츠하이머병 분야에서 가장 널리 사용되는 유전자이식 모델 중 하나이다.
APP23 : 마우스는 Thy1 프로모터의 조절하에서 돌연변이 APPSWE를 발현한다. 현저한 뇌혈관 아밀로이드, 아밀로이드 침착물이 6주령부터 관찰되며 일부 해마 뉴런 소실은 아밀로이드 플라크 형성과 관련된다.
TgCRND8 : 마우스는 다수의 APP 돌연변이 (스웨덴 및 인디애나)를 발현한다. 인지 결손은 ~3개월령에서 빠른 세포외 플라크 발달과 일치한다. 인지 결손은 Aß 백신화 요법에 의해 역전될 수 있다.
PSEN 1M146V 또는 PSEN 1M146L (각각 계통 6.2 및 8.9): 돌연변이 PSEN1이 Aß42를 선택적으로 상승시킨다는 것을 생체내에서 최초로 입증한 모델. 명백한 플라크 병리는 관찰되지 않는다.
PSAPP (Tg2576 x PSEN1M146L, PSEN1-A246E + APPSWE): Aβ42의 PSEN1-유도된 상승이 플라크 병리를 향상시킴을 입증하는, 단일 유전자이식 돌연변이 APP 마우스와 비교하여 아밀로이드 병리를 현저하게 가속화시킨 돌연변이 PSEN1 이식유전자를 부가한 이원성 (bigenic) 유전자이식 마우스.
APP Dutch : 마우스는 인간에서 아밀로이드증-네덜란드 유형을 갖는 유전성 뇌일혈을 야기하는 네덜란드 돌연변이를 갖는 APP를 발현한다. APPDutch 마우스는 중증 콩고 레드 친화성 아밀로이드 혈관병증 (congophilic amyloid angiopathy)을 발병한다. PSEN1 이식유전자의 부가는 아밀로이드 병리를 실질에 재분포하여 혈관 및 실질 아밀로이드 병리에서 Aβ40 및 Aβ42의 상이한 역할을 나타낸다.
BRI-Aß40 및 BRI-Aß42: 마우스는 APP 과발현없이 개별 Aβ 이소형을 발현한다. Aβ42를 발현하는 마우스 만이 노인성 플라크 및 CAA를 발달시키는 반면 BRI-Aβ40 마우스는 플라크를 발달시키지 않으며, 이것은 Aβ42가 플라크 형성에 필수적임을 시사한다.
JNPL3 : 마우스는 P301L 돌연변이를 갖는 4R0N MAPT를 발현한다. 이것은 현저한 탱글 병리 (tangle pathology)와 세포 소실을 갖는 최초의 유전자이식 모델이며, 이것은 MAPT만으로 세포 손상과 소실을 유발할 수 있음을 입증한다. JNPL3 마우스는 척수에서의 심각한 병리 및 운동 뉴런 손실로 인해 연령에 따른 운동 장애를 발병한다.
Tau P301S : P301S 돌연변이를 갖는 4R MAPT의 가장 짧은 이소형을 발현하는 유전자이식 마우스. 동형접합 마우스는 뇌 및 척수에서의 광범위한 신경섬유 병리 및 척수에서의 뉴런 손실로 5-6개월령에서 심한 대부전마비를 발병한다.
Tau V337M : 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF)의 프로모터에 의해 구동되는 V337M 돌연변이를 갖는 4R MAPT (1/10 내인성 MAPT)의 저수준 합성. 이들 마우스에서의 신경섬유 병리의 발병은 절대 MAPT 세포내 농도보다는 MAPT의 성질이 병리를 유발한다는 것을 시사한다.
Tau R406W : CAMKII 프로모터의 조절하에 R406W 돌연변이를 갖는 4R 인간 MAPT를 발현하는 마우스. 마우스는 18개월령부터 전뇌에 MAPT 봉입을 발병하며 연상 기억력 장애를 갖는다.
rTg4510 : TET-오프 시스템을 사용한 유도성 MAPT 유전자이식 마우스. 비정상적인 MAPT 병리는 1개월령부터 발생한다. 마우스는 진행성 NFT 병리 및 심각한 세포 소실을 갖는다. 인지 결손은 2.5개월령부터 자명하다. 이식유전자를 상실하면 인지 능력은 향상되지만 NT 병리는 악화된다.
H tau : 인간 게놈 MAPT 만을 발현하는 유전자이식 마우스 (마우스 MAPT 녹아웃). Htau 마우스는 6개월부터 과인산화된 MAPT를 축적하고 15개월령이 되는 시점까지 Thio-S-양성 NFT를 발달시킨다.
TAPP (Tg2576 x JNPL3): 돌연변이 APP 및/또는 Aβ가 하류 MAPT 병리에 영향을 줄 수 있음을 시사하는, JNPL3과 비교하여 TAPP 마우스에서의 증가된 MAPT 전뇌 병리.
3xTgAD : PSEN1M146V '녹-인' 배경 (PSNE1-KI)에 돌연변이 APPSWE, MAPTP301L을 발현하는 삼중 유전자이식 모델. 마우스는 6개월부터 플라크를 발생하고, 12개월령이 되는 시점부터 MAPT 병리를 발병하며, 이것은 APP 또는 Aβ가 신경섬유 병리에 직접적으로 영향을 줄 수 있다는 가설을 강화시킨다.
또한, 제WO 2009/034158호는 비인간 유전자이식 동물 모델을 개시하며, 여기서 이식유전자는 AβN3E-42, AβN3Q-42, AβN3E-40 및 AβN3Q-40으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 아밀로이드 베타 (Aβ) 펩타이드를 암호화한다. 이러한 Aβ 펩타이드가 QC 및 QPCTL의 기질이며, N-말단 글루타민 (Q) 또는 글루타메이트 (N)를 피로글루타메이트 (pGlu)로 폐환시킨다. 따라서, 이러한 유전자이식 동물 모델은 신경퇴행의 발달 과정에서 pGlu-Aβ 펩타이드의 효과를 조사하기 위한 모델 시스템을 제공한다.
항-Aβ pN3pE 항체는 또한 Aβ pN3pE에 대한 진단 분석에, 예를 들어 특정 세포, 조직 또는 혈청에서의 이의 발생을 검출하는데 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 항체는 아밀로이드증, 특히 경증 인지 장애 (MCI), 예를 들어 산발성 알츠하이머병 (SAD)과 같은 알츠하이머병 (AD), 또는 가족성 영국 치매 (FBD) 및 가족성 덴마크 치매 (FDD)와 같은 가족성 알츠하이머 치매 (FAD), 다운 증후군의 신경퇴행으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 신경퇴행성 질환; 바람직하게는 알츠하이머병을 검출하기 위한 진단 방법에서 특히 유용하다.
진단 용도를 위해, 항체는 전형적으로 검출 가능한 모이어티로 표지될 것이다. 일반적으로 다음 카테고리로 그룹화할 수 있는 수많은 표지가 이용 가능하다:
(a) 방사성 동위원소, 예를 들어 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I. 항체는, 예를 들면, 문헌[Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Gutigen et al., Ed., Wiley-Interscience. New York, New York. Pubs., (1991)]에 기술된 기법을 사용하여 방사성 동위원소로 표지될 수 있으며 방사능은 섬광 계수를 사용하여 측정할 수 있다.
(b) 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 리사민 (Lissamine), 피코에리트린 및 텍사스 레드 (Texas Red)와 같은 형광 표지가 이용 가능하다. 형광 표지는 예를 들면 문헌[Current Protocols in Immunology, supra]에 개시된 기술을 사용하여 항체에 접합될 수 있다. 형광은 형광계를 사용하여 정량할 수 있다.
(c) 다양한 효소-기질 표지가 이용 가능하다. 효소는 일반적으로 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있는 발색 기질의 화학적 변화를 촉매한다. 예를 들면, 효소는 기질의 색 변화를 촉매할 수 있으며, 이것은 분광 광도계로 측정될 수 있다. 대안적으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경할 수 있다. 형광의 변화를 정량화하는 기술은 위에 기술되어 있다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기된 다음 (예를 들면, 화학발광계를 사용하여) 측정될 수 있거나 형광 수용기에 에너지를 제공할 수 있는 광을 방출할 수 있다. 효소 표지의 예는 루시퍼라제 (예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아 루시페라제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 데하이드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 서양 고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼리 포스파타제, 0-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 옥시게나제 (예를 들어, 글루코스 옥시게나제, 갈락토스 옥시게나제 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시게나제 (예를 들어, 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 접합시키기 위한 기술은 문헌[O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym (ed Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73: 147-166 (1981)]에 기술되어 있다.
효소-기질 조합의 예는, 예를 들면, 하기의 것을 포함한다:
(i) 기질로서 하이드로겐 퍼옥시다제를 갖는 서양 고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 여기서 하이드로겐 퍼옥시다제는 염료 전구체 (예를 들어, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 하이드로클로라이드 (TMB))를 산화시킨다;
(ii) 발색 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트를 갖는 알칼리 포스파타제 (AP); 및
(iii) 발색 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광발생성 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제를 갖는 β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal).
수많은 다른 효소-기질 조합이 당업계의 숙련가들에게 이용 가능하다.
때때로, 표지는 항체와 간접적으로 접합된다. 숙련가는 이를 달성하기 위한 다양한 기술을 알고 있을 것이다. 예를 들면, 항체는 비오틴과 접합될 수 있고 상기 언급된 3가지 광범위한 카테고리의 표지 중 어느 하나가 아비딘과 접합될 수 있으며, 그 반대도 가능하다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하며, 따라서 표지는 이러한 간접적인 방식으로 항체와 접합될 수 있다. 대안적으로, 표지와 항체의 간접 접합을 달성하기 위해, 항체는 작은 합텐 (예를 들어, 디곡신)과 접합되고 상기 언급된 상이한 유형의 표지 중 하나는 항-합텐 항체 (예를 들어, 항-디곡신 항체)와 접합된다. 따라서, 표지와 항체의 간접 접합이 달성될 수 있다.
본 발명의 항체는 경쟁 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석과 같은 임의의 공지된 분석법에 사용될 수 있다 [Zola, Monoclonal Antibodies A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press. Inc., 1987)].
경쟁 결합 분석은 제한된 양의 항체와 결합하기 위해 시험 샘플 분석물과 경쟁할 수 있는 표지된 표준물의 능력에 의존한다. 시험 샘플 중의 Aβ N3pE의 양은 항체에 결합되는 표준물의 양에 반비례한다. 결합되는 표준물의 양을 결정하는 것을 용이하게 하기 위해, 항체는 일반적으로 경쟁 전 또는 후에 불용화되어, 항체에 결합된 표준물 및 분석물은 결합되지 않고 남은 표준물 및 분석물로부터 편리하게 분리될 수 있다.
샌드위치 분석은 검출하고자 하는 단백질의 상이한 면역원성 부분 또는 에피토프에 각각 결합할 수 있는 2개의 항체의 사용을 포함한다. 샌드위치 분석에서, 시험 샘플 분석물은 고체 지지체 상에 고정된 제1 항체에 의해 결합되며, 그후 제 2 항체가 분석물에 결합하여 불용성 3-부분 복합체를 형성한다. 제2 항체 자체는 검출 가능한 모이어티로 표지될 수 있거나 (직접 샌드위치 분석) 검출 가능한 모이어티로 표지된 항-면역글로불린 항체를 사용하여 측정될 수 있다 (간접 샌드위치 분석). 예를 들면, 하나의 바람직한 유형의 샌드위치 분석은 ELISA 분석이며, 이 경우 검출 가능한 모이어티는 효소이다.
면역조직화학의 경우, 조직 샘플은 신선하거나 동결될 수 있거나 파라핀에 매봉되고 예를 들면 포르말린과 같은 보존제로 고정될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 조성물은 특히 생물학적 샘플에서 Aβ N3pE 또는 이의 변이체의 검출에 의한 진단 용도를 위한, 특히 경증 인지 장애 (MCI), 예를 들어 산발성 알츠하이머병 (SAD)과 같은 알츠하이머병 (AD), 또는 가족성 영국 치매 (FBD) 및 가족성 덴마크 치매 (FDD)와 같은 가족성 알츠하이머 치매 (FAD), 다운 증후군의 신경퇴행으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 신경퇴행성 질환; 바람직하게는 알츠하이머병의 진단을 위한 조성물이다.
진단 키트
편의상, 본 발명의 항체는 키트, 즉 미리 결정된 양의 시약과 진단 분석을 수행하기 위한 설명서의 패키징된 조합으로 제공될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우, 키트는 효소에 의해 요구되는 기질 및 보조인자 (예를 들어, 검출 가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 안정화제, 완충제 (예를 들어, 블록 완충제 또는 용해 완충제) 등과 같은 다른 첨가제가 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적인 양은 분석의 감도를 실질적으로 최적화하는 시약의 용액 중의 농도를 제공하기 위해 광범위하게 변할 수 있다. 특히, 시약은 용해시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 부형제를 포함하여 통상적으로 동결건조된 건조 분말로서 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 진단 키트는 아래 기술된 바와 같은 추가의 생물학적 활성 물질을 함유할 수 있다. 상기 추가의 생물학적 활성 물질로서 진단 키트에 사용하기에 특히 바람직한 것은 글루타미닐 사이클라제의 억제제이다.
본 발명의 진단 키트는 아밀로이드-관련 질환 및 병태, 특히 경증 인지 장애 (MCI), 예를 들어 산발성 알츠하이머병 (SAD)과 같은 알츠하이머병 (AD), 또는 가족성 영국 치매 (FBD) 및 가족성 덴마크 치매 (FDD)와 같은 가족성 알츠하이머 치매 (FAD), 다운 증후군의 신경퇴행으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 신경퇴행성 질환; 바람직하게는 알츠하이머병의 검출 및 진단에 특히 유용하다.
본 발명은 또한 시험관내 진단 방법에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 또는 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특히, 이러한 진단 방법은 특히 생물학적 샘플에서 Aβ N3pE 또는 이의 변이체를 검출함으로써, 경증 인지 장애 (MCI), 예를 들어 산발성 알츠하이머병 (SAD)과 같은 알츠하이머병 (AD), 또는 가족성 영국 치매 (FBD) 및 가족성 덴마크 치매 (FDD)와 같은 가족성 알츠하이머 치매 (FAD), 다운 증후군의 신경퇴행으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 신경퇴행성 질환; 바람직하게는 알츠하이머병의 진단에 관한 것이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하기의 방법에 관한 것이다:
하기의 단계들을 포함하는, 아밀로이드-관련 질환 또는 병태, 바람직하게는 알츠하이머병의 진단을 위한 시험관내 또는 발생부위 진단 방법:
본 발명에 따른 항체를 바람직하게는 혈청, 액 또는 CSF 샘플로부터 선택되는 샘플, 가장 바람직하게는 혈청 샘플; 또는 상기 병태 또는 질환에 걸린 것으로 의심되는 대상체의 특정 신체 부위 또는 신체 영역과 접촉시키는 단계, 및
샘플로부터 Aβ N3pE에 대한 항체의 결합을 검출하는 단계.
보다 특히, 본 발명은
(a) 아밀로이드 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 또는 특정 신체 부위 또는 신체 영역을 본 발명의 항체 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계;
(b) 항체 및/또는 이의 기능적 부분이 Aβ N3pE에 결합하게 하여 면역학적 복합체를 형성하는 단계;
(c) 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 단계; 및
(d) 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 샘플 또는 특정 신체 부위 또는 영역에서의 Aβ N3pE의 존재 또는 부재와 상관시키는 단계를 포함하는, 샘플 또는 발생부위에서 Aβ N3pE에 대한 본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편의 면역특이 결합을 검출함을 포함하는 아밀로이드-관련 질환 또는 병태, 바람직하게는 알츠하이머병의 진단 방법에 관한 것이다.
(a) 조사 중인 조직 및/또는 체액을 대표하는 샘플을 수득하는 단계;
(b) 본 발명에 따른 항체, 또는 키메라 항체 또는 이의 단편으로 아밀로이드 단백질의 존재에 대해 상기 샘플을 시험하는 단계;
(c) 단백질에 결합된 항체의 양을 결정하는 단계; 및
(d) 조직 및/또는 체액에서 플라크 부담을 계산하는 단계를 포함하여, 조직 및/또는 체액에서 아밀로이드발생성 플라크 부담의 정도를 결정하는 방법이 또한 포함된다.
특히, 본 발명은 조직 및/또는 체액에서 아밀로이드발생성 플라크 부담의 정도를 결정하는 방법에 관한 것이며, 여기서 단계 c)에서 면역학적 복합체의 형성은 면역학적 복합체의 존재 또는 부재가 아밀로이드 단백질, 특히 Aβ N3pE의 존재 또는 부재와 상관되도록 결정된다.
여전히 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체, 또는 키메라 항체 또는 이의 단편을 포함하고, 이전에 본원에 기술된 바와 같이 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 유도체 또는 기능적 부분을 포함하는 조성물, 특히 임의로 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물인 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 치료적 유효량의 본 발명의 항체를 포함한다.
본 발명의 항체, 또는 키메라 항체 또는 이의 단편을 포함하고, 이전에 본원에 기술된 바와 같이 치료적 유효량으로 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 유도체 또는 기능적 부분, 및 임의로, 추가의 생물학적 활성 물질 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 혼합물이 본 발명에 의해 추가로 포함된다.
특히, 본 발명은 추가의 생물학적 활성 물질이 아밀로이드증, 경증 인지 장애 (MCI), 예를 들어 산발성 알츠하이머병 (SAD)과 같은 알츠하이머병 (AD), 또는 가족성 영국 치매 (FBD) 및 가족성 덴마크 치매 (FDD)와 같은 가족성 알츠하이머 치매 (FAD), 다운 증후군의 신경퇴행으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 신경퇴행성 질환; 바람직하게는 알츠하이머병에 관여되는 Aβ N3pE와 같은 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질과 관련된 질환 및 장애의 그룹의 약제에 사용되는 화합물인 혼합물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 다른 생물학적 활성 물질 또는 화합물은 또한 Aβ N3pE에 의해 유발된 아밀로이드증의 치료에 사용될 수 있거나 다른 신경성 장애의 약제에 사용될 수 있는 치료제일 수 있다.
다른 생물학적 활성 물질 또는 화합물은 본 발명에 따른 항체와 동일하거나 유사한 메카니즘에 의해 또는 무관한 작용 메카니즘에 의해 또는 다수의 관련된 및/또는 무관한 작용 메카니즘에 의해 이의 생물학적 효과를 발휘할 수 있다.
일반적으로, 다른 생물학적 활성 화합물은 중성자-전달 향상제, 정신치료 약물, 아세틸콜린 에스테라제 억제제, 칼슘-채널 차단제, 생원성 아민, 벤조디아제핀 진정제, 아세틸콜린 합성, 저장 또는 방출 향상제, 아세틸콜린 시냅스후 수용체 효능제, 모노아민 옥시다제-A 또는 -B 억제제, N-메틸-D-아스파르테이트 글루타메이트 수용체 길항제, 비-스테로이드성 항염증 약물, 항산화제, 및 세로토닌성 수용체 길항제를 포함할 수 있다.
보다 특히, 본 발명은 본 발명에 따른 항체, 및 임의로, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께, 산화 스트레스에 효과적인 화합물, 항-아폽토시스 화합물, 금속 킬레이터, 피렌제핀 및 대사산물과 같은 DNA 수복의 억제제, 3-아미노-1-프로판설폰산 (3 APS), 1,3-프로판디설포네이트 (1,3PDS), α-세크레타제 활성제, β- 및 γ-세크레타제 억제제, 타우 단백질, 신경 전달 물질, β-시트 파괴제, 아밀로이드 베타 제거/고갈 세포 성분에 대한 유인제, 피로글루타메이트화 아밀로이드 베타 3-42를 포함한 N-말단 절단된 아밀로이드 베타의 억제제, 예를 들어 글루타미닐 사이클라제의 억제제, 항염증 분자, 또는 콜린에스테라제 억제제 (ChEI), 예를 들어 타크린, 리바스티그민, 도네페질, 및/또는 갈란타민, M1 효능제, 및 임의의 아밀로이드 또는 타우 변성 약물 및 영양 보충제를 포함한 기타 약물, 및 영양 보충제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함하는 혼합물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 화합물이 콜린에스테라제 억제제 (ChEI)인 혼합물, 특히 화합물이 타크린, 리바스티그민, 도네페질, 갈란타민, 니아신 및 메만틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나인 혼합물에 관한 것이다.
추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 혼합물은 본 발명에 따른 항체, 및 임의로, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께 니아신 또는 메만틴을 포함할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 혼합물은 본 발명에 따른 항체, 및 임의로, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께 글루타미닐 사이클라제 억제제를 포함할 수 있다.
글루타미닐 사이클라제의 바람직한 억제제는 제WO 2005/075436호, 제WO 2008/055945호, 제WO 2008/055947호, 제WO 2008/055950호, 제WO 2008/065141호, 제WO 2008/110523호, 제WO 2008/128981호, 제WO 2008/128982호, 제WO 2008/128983호, 제WO 2008/128984호, 제WO 2008/128985호, 제WO 2008/128986호, 제WO 2008/128987호, 제WO 2010/026212호, 제WO 2011/131748호, 제WO 2011/029920호, 제WO 2011/107530호, 제WO 2011/110613호, 제WO 2012/123563호 및 제WO 2014/140279호에 기술되어 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 여전히 또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체, 특히 단클론 항체, 특히 키메라 항체 또는 이의 단편, 또는 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편, 및 본원에 기술된 바와 같이, 임의로, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께, 예를 들면, 환각, 망상, 사고 장애 (상당한 불일치, 탈선, 접선에 의해 유발됨), 및 기이하거나 무질서한 행동 뿐만 아니라 무쾌감증, 무덤덤한 감정 (flattened affect), 무관심, 및 사회적 위축을 포함한 긍정적 및 부정적 정신병 증상의 치료를 위한 클로자핀, 지프라시돈, 리스페리돈, 아리피프라졸 또는 올란자핀과 같은 "비정형 항정신병 약물"을 포함하는 혼합물이 제공된다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이전에 본원에 기술된 바와 같은 조성물 및 혼합물은 본 발명의 항체 및 생물학적 활성 물질을 각각 치료적 유효량으로 포함한다.
본 발명에 따른 항체와 조합하여 혼합물에 적절하게 사용될 수 있는 또 다른 화합물이 PEP-억제제 (pp. 43/44), LiCl, 디펩티딜 아미노펩티다제의 억제제, 바람직하게는 DP IV 또는 DP IV-유사 효소의 억제제 (pp. 48/49 참조); 아세틸콜린에스테라제 (ACE) 억제제 (p. 47 참조), PIMT 향상제, 베타 세크레타제의 억제제 (p. 41 참조), 감마 세크레타제의 억제제 (pp. 41/42 참조), 중성 엔도펩티다제의 억제제, 포스포디에스테라제-4 (PDE-4)의 억제제 (pp. 42/43 참조), TNF알파 억제제, 무스카린성 M1 수용체 길항제 (p. 46 참조), NMDA 수용체 길항제 (pp. 47/48 참조), 시그마-1 수용체 억제제, 히스타민 H3 길항제 (p. 43 참조), 면역조절제, 면역억제제, 또는 안테그렌 (나탈리주맙), 뉴렐란 (팜프리딘-SR), 캄파트 (알렘투주맙), IR 208, NBI 5788/MSP 771 (티플리모티드), 파클리탁셀, Anergix.MS (AG 284), SH636, 디페린 (CD 271, 아다팔렌), BAY 361677 (인터류킨 -4), 매트릭스-메탈로프로테이나제-억제제 (예를 들어, BB 76163), 인터페론-타우 (트로포블라스틴) 및 SAIK-MS로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제제; 베타-아밀로이드 항체 (p.44 참조), 시스테인 프로테아제 억제제 (p. 44 참조); MCP-1 길항제 (pp. 44/45 참조), 아밀로이드 단백질 침착 억제제 (p. 42 참조) 및 베타 아밀로이드 합성 억제제 (p. 42 참조)를 포함하여 제WO2008/065141호 (특히 제37/38면 참조)에 기술되어 있으며, 상기 문헌은 본원에 참고로 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 이전에 본원에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 항체, 또는 키메라 항체 또는 이의 단편 및/또는 생물학적 활성 물질을 치료적 유효량으로 포함하는 혼합물에 관한 것이다.
약제학적 조성물은 문헌 [Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 2005]에 개시된 것들과 같은 통상적인 기술에 따라 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 뿐만 아니라 임의의 다른 공지된 보조제 및 부형제로 제형화될 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 뿐만 아니라 임의의 다른 공지된 보조제 및 부형제는 본 발명의 선택된 항체 및 선택된 투여 방식에 적합해야 한다. 약제학적 조성물의 담체 및 다른 성분에 대한 적합성은 항원 결합시 본 발명의 선택된 항체 또는 약제학적 조성물의 원하는 생물학적 특성에 대한 현저한 부정적인 영향의 부재에 기초하여 결정된다 (예를 들어, 실질적인 영향보다 적음 (10% 이하의 상대적 억제, 5% 이하의 상대적 억제 등)).
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 희석제, 충전제, 염, 완충제, 세제 (예를 들어, 비이온성 세제, 예를 들어 트윈-20 또는 트윈-80), 안정제 (예를 들어, 당 또는 단백질-비함유 아미노산), 보존제, 조직 고정제, 가용화제, 및/또는 약제학적 조성물에 포함시키기에 적합한 다른 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에서 활성 성분의 실제 투여량 수준은 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 변할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물 또는 이의 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 항체의 배설 속도, 치료 지속시간, 사용된 특정 조성물과 조합하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 병력 등의 의학 분야에서 잘 알려진 인자를 포함한 다양한 약동학적 인자에 따라 좌우될 것이다.
약제학적 조성물은 임의의 적합한 경로 및 방식으로 투여될 수 있다. 생체내 및 시험관내에서 본 발명의 항체를 투여하는 적합한 경로는 당업계에 널리 공지되어 있으며 당업계의 통상의 숙련가들에 의해 선택될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여된다.
본원에서 사용되는 어구 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된"은 통상적으로 주사에 의한 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 표피, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 낭내, 안와내, 심내, 피내, 복강내, 힘줄내, 기관경유, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 두개내, 흉강내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
하나의 실시양태에서 약제학적 조성물은 정맥내 또는 피하 주사 또는 주입에 의해 투여된다.
약제학적으로 허용되는 담체는 본 발명의 항체와 생리학적으로 상용성인 임의의 및 모든 적합한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장화제, 항산화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 에는 물, 염수, 인산염 완충 염수, 에탄올, 덱스트로스, 폴리올 (예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물, 식물유, 예를 들어 올리브유, 옥수수유, 땅콩유, 면실유, 및 호마유, 카복시메틸 셀룰로스 콜로이드성 용액, 트라가칸트 검 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트, 및/또는 다양한 완충제를 포함한다. 다른 담체는 약학 분야에 잘 알려져 있다.
약제학적으로 허용되는 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 항체와 비상용성인 한을 제외하고는, 본 발명의 약제학적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다.
적절한 유동성은, 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 항산화제, 예를 들어 (1) 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등과 같은 수용성 항산화제; (2) 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔 (BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등과 같은 유용성 항산화제; 및 (3) 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등과 같은 금속 킬레이트제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 조성물에 당, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 또는 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 약제학적 조성물의 저장 수명 또는 효과를 향상시킬 수 있는 보존제, 습윤제, 유화제, 분산제, 보존제 또는 완충제와 같은 선택된 투여 경로에 적합한 하나 이상의 보조제를 함유할 수 있다. 본 발명의 항체는 임플란트, 경피 패치 및 미세캡슐화 전달 시스템을 포함한 제어 방출 제형과 같은 급속 방출에 대해 항체를 보호하는 담체로 제조될 수 있다. 이러한 담체는 젤라틴, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 디스테아레이트, 생분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 단독으로 또는 왁스, 또는 당업계에 잘 알려진 다른 물질과 함께 포함할 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 일반적으로 당업계의 숙련가들에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참고한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 생체내에서 적절한 분포를 보장하도록 제형화될 수 있다. 비경구 투여를 위한 약제학적으로 허용되는 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 항체와 비상용성인 한을 제외하고는, 본 발명의 약제학적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다.
주사용 약제학적 조성물은 전형적으로 멸균되고 제조 및 보관 조건하에서 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 질서있는 구조로서 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 올리브유와 같은 식물유, 및 에틸 올레에이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르를 함유하는 수성 또는 비수성 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 다수의 경우에, 등장화제, 예를 들면, 당, 폴리알콜, 예를 들어 글리세롤, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 장기간 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 야기될 수 있다. 멸균 주사 가능한 용액은 필요한 양의 항체를 적절한 용매에 필요에 따라 예를 들어 상기 열거된 바와 같은 성분들 중의 하나 또는 조합과 함께 혼입한 다음, 멸균 미세여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 예를 들어 위에서 열거한 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 항체를 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법의 예는 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조 (동결건조)이다.
멸균 주사 가능한 용액은 필요한 양의 항체를 적절한 용매에 필요에 따라 상기 열거된 성분들 중의 하나 또는 조합과 함께 혼입한 다음, 멸균 미세여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 위에서 열거한 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 항체를 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법의 예는 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조 (동결건조)이다.
상기 치료 방법 및 용도에서 투여량 섭생은 최적의 원하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들면, 단일 농축괴가 투여될 수 있거나, 수 개의 분할 용량이 시간에 따라 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급성에 의해 나타내어지는 바와 같이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물은 투여 용이성 및 투여량 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제형화될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 투여 단위 형태는 치료될 대상체를 위한 단일 투여량으로 적합한 물리적 이산 단위를 가리키며; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 항체를 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 명세는 (a) 항체의 독특한 특징 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과, 및 (b) 개인의 감수성 치료를 위한 이러한 항체의 배합 기술에 내재된 제한에 의해 지시되고 이에 직접적으로 의존한다.
본 발명의 항체에 대한 효과적인 투여량 및 투여 섭생은 치료하고자 하는 질환 또는 병태에 의존하며 당업계의 숙련가들에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 항체의 치료적 유효량에 대한 예시적인 비제한적 범위는 약 0.1-10 mg/kg/체중, 예를 들어 약 0.1-5 mg/kg/체중, 예를 들면 약 0.1-2 mg/kg/체중, 예를 들어 약 0.1-1 mg/kg/체중, 예를 들어 약 0.15, 약 0.2, 약 0.5, 약 1, 약 1.5 or 약 2 mg/kg/체중이다.
당업계의 통상의 기술을 가진 의사 또는 수의사는 필요한 약제학적 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들면, 의사 또는 수의사는 약제학적 조성물에 사용되는 8ηıı-ΑβρΕ3 항체의 용량을 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 것보다 낮은 수준에서 시작하여 원하는 효과가 달성될 때까지 점차적으로 투여량을 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 일일 용량은 치료 효과를 생성하는데 효과적인 최저 용량인 항체의 양일 것이다. 이러한 유효량은 일반적으로 상기한 인자에 따라 좌우질 것이다. 투여는 예를 들어 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하일 수 있고, 예를 들어 표적 부위에 근접하게 투여될 수 있다. 경우에 따라, 약제학적 조성물의 유효 일일 용량은 하루에 걸쳐 적절한 간격으로, 임의로 단위 투여 형태로 별도로 투여되는 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 하위-용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 단독으로 투여하는 것이 가능하지만, 항체를 상기한 바와 같이 약제학적 조성물로서 투여하는 것이 바람직하다.
실시예
1. N3pE-Aβ 특이 항체를 생성하기 위한 인간화 접근법
본 발명에 따른 인간화 및 탈-면역화 항체는 하이브리도마 세포주 Aβ 6-1-6 (기탁 번호 DSM ACC 2924)에 의해 생성되는 인간화 및 탈-면역화된 형태의 단클론 마우스 항체이며, 이것은 제WO 2010/009987호에 기술되어 있다. 인간화는 제WO 2017/009459호에 기술된 바와 같이 수행하였다. 제WO 2017/009459호의 pp. 58-60에 개시된 작용 실시예 1이 본원에 참고로 포함된다.
2. RNA 단리 및 cDNA 합성
불변 서열의 공급원으로서, 인간 B 세포의 RNA를 실온에서 10분 동안 5ml 1x FACS 용해 용액 (Becton Dickinson)을 사용한 500 μl 전혈의 용해에 의해 단리하였다. 용해물을 300g에서 5분 동안 원심분리하고; 펠렛을 PBS로 2회 세척한 다음, Nucleo Spin ® RNA II (Macherey-Nagel)의 RA1 완충액 350 μl에서 분해시키고 3.5μl 0,5M TCEP (SIGMA)를 첨가하였다. RNA를 제조업체의 지침에 의해 단리하였다. 10 μl의 RNA를 먼저 1μl 0.5μg/μl OligodT 프라이머 (Invitrogen) 및 1μl 10mM dNTP와 함께 65℃에서 5분 동안 배양하였다. 그후 4μl의 5x First Strand Buffer (Invitrogen), 2μl의 100mM DTT 및 0.5 μl SuperScript III 역전사 효소 (Invitrogen)를 20μl에 첨가하고 혼합물을 25℃에서 5분, 50℃에서 50분 및 70℃에서 15분 동안 배양하였다. 표 2에 나타낸 프라이머 쌍을 갖는 PCR에 의해, 경쇄 및 중쇄의 불변 영역의 합성된 cDNA를 증폭시킬 수 있었다.
표 2: 불변 영역의 클로닝을 위한 프라이머
Figure pct00020
클론#6의 경쇄의 PCR 산물의 증폭을 위해 하기 정방향 및 역방향 프라이머가 사용되었다:
RT_chim_humKl6f: CAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTG (서열 번호 47);
RT_chim_humKl6r: GTACCTTGCACGCAGTAATAAAC (서열 번호 48).
참조 유전자 마우스의 증폭을 위해 HPRT 프라이머가 사용되었다.
증폭을 수행하기 위해 7.5 μl Sybergreen (Firma), 1 μl 정방향 프라이머 (25 pmol/μl), 1μl 역방향 프라이머 (25 pmol/μl), 5.5 μl ddH2O 및 1 μl cDNA가 사이클러에서 사용되었다.
3. LC와 HC를 두 개의 상이한 발현 플라스미드로 별도로 클로닝하여 CHO 세포에서 재조합 항체의 발현
항체의 경쇄 및 중쇄의 서열을 두 개의 상이한 포유동물 발현 벡터, 각각 pCDNA3.1 및 HC-pOptiVEC로 별도로 클로닝하였다. CHO 세포 배양물에서 재조합 항체를 발현하기 위한 벡터의 최적 조합을 확인하기 위해, 상이한 플라스미드 조합을 사용하여 부착성 CHO 세포에서 일시적 발현을 수행하였다. 두 번째 단계에서, LC 및 HC 플라스미드 사이의 상이한 DNA 비가 발현 수준에 영향을 미치는지 여부를 조사하였다. 3 μg LC-pCDNA3.1 및 1 μg HC-pOptiVEC의 형질감염으로, 증가된 발현 수준이 발견되었다.
항체의 추가의 부착성 CHO 세포 발현을 위해, LC-pCDNA3.1 및 1 μg HC-pOptiVEC의 플라스미드 조합 및 LC 3:1 HC의 플라스미드 DNA 비가 사용되었다.
Freestyle ™ CHO 현탁 세포를 하기 형질감염에 사용하여 재조합 항체를 생성하는 더 많은 양의 일시적 발현 세포를 배양하였다. 먼저 부착성 세포의 경우에서와 같이 과량의 LC 플라스미드가 항체의 발현을 개선할 수 있는지 여부를 시험하였다. 부착성 CHO 세포에서와 같이, 1:1 및 3.1의 LC 대 HC 플라스미드 DNA 비가 사용되었다. 웨스턴 블롯 분석에서는 과량의 LC 플라스미드가 부착성 CHO 세포의 경우에서와 같이 항체의 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 세포 생존력을 측정함으로써, 6일 후에 세포 생존력이 형질감염된 세포의 약 50%로 감소한다는 것이 명백해진다. 6일 후, 상청액에서 항체 수준의 추가 증가는 검출되지 않았다. 따라서, 형질감염 후 6일째에 배양 상청액을 수확하였다.
생성된 항체가 세포 상청액으로 효율적으로 수송되는지를 조사하기 위해, 세포 용해물 샘플을 SDS PAGE에 적용하고, 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 하우스키핑 세포질 단백질인 GAPDH를 SDS 겔에 필적하는 양의 세포 용해물 단백질을 부하하는 참조물에 사용하였다. 항체 발현 CHO 세포의 세포 용해물에서 120 kDa의 강한 밴드는 세포 상청액에서 검출된 것과 동일한 크기에서 이동을 일으킨다.
4. 단백질 G 크로마토그래피에 의한 재조합 항체의 정제
원래 뮤린 항체와 비교하여 단백질의 항원 결합 특성을 조사하기 위해 항체 클론#6을 정제하였다. 따라서, 발현된 키메라 및 인간화 항체를 갖는 300 ml 상청액을 생성하고 단백질 G 크로마토그래피로 정제하였다. 발현된 항체의 양이 매우 낮기 때문에, 총 25 μg 정제된 단백질에서 수율은 0.1 μg/ml 미만이었다. 용리된 항체를 약 200 μg/ml로 농축시키고 쿠마시 블루 염색 후 2 μg 단백질을 SDS-PAGE에 적용하였다.
5. 인간화 항체의 안정한 세포주 생성
본 발명의 인간화 항체의 모 항체는 제WO 2017/009459호에 개시된 클론#6 변이체이며, 이것은 제WO 2017/009459호에 서열 번호 14로서 개시된 하기의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖고:
Figure pct00021
이것은 제WO 2017/009459호에 서열 번호 27로서 개시된 하기의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖는다:
Figure pct00022
모 클론#6 변이체의 두 개의 클론, C06.08 및 C06.09를 안정한 세포주 생성을 위해 선택하였다. C06.08- 및 C06.09-생성 중국 햄스터 난소 (CHO) DG44 세포의 생성을 위해, 두 항체에 대한 중쇄 및 경쇄 유전자의 서열을 함유하는 발현 플라스미드를 먼저 생성하였다. 플라스미드를 선형화하고, 이소프로판올 침전에 의해 정제하고, 10 mM Tris pH 8.0에서 재구성하고 다음과 같이 형질감염에 사용하였다: 1 x 106 CHO-DG44 세포를 100 μL 뉴클레오펙터 용액 V (Lonza)에 현탁시키고 10 μg 선형화된 벡터 DNA와 혼합하였다. 현탁액을 전기천공기 Amaxa 뉴클레오펙터 II (Lonza)로 펄싱하였다. 후속적으로, 500 μL CD CHO 배지 (Invitrogen)를 첨가하고 형질감염된 세포 풀 (pool)을 24시간 동안 배양하였다.
안정한 미니 풀 (MP)의 생성을 위해, 형질감염된 세포 풀을 형질감염한지 1일 후에 조합하고, CD CHO 배지로 옮기고, 96-웰 플레이트에 각각 2000 세포/웰 및 4000 세포/웰로 접종하거나, 또는 2.5 nM 메토트렉세이트 (MTX)를 함유하는 CD CHO 배지로 옮기고 96-웰 플레이트에 4000 세포/웰로 접종하였다. 21일 (C06.08) 또는 27일 (C06.09)의 배양 기간 후, 20 MP를 24-웰 플레이트로 옮겼다. 형질감염 후 22일 또는 28일째에, MP를 12-웰 플레이트로 옮기고, MP를 34일 또는 48일째에 6-웰 플레이트로 확장시켰다. 34일 (C06.08) 또는 48일 (C06.09)에, 풀을 30 nM MTX를 갖는 선택 배지로 옮겨 증폭 과정을 유도하고 항체 발현 역가를 Octet 측정에 의해 결정하였다.
결과
Figure pct00023
Figure pct00024
표 2 및 3에 요약된 바와 같이, 모든 MP는 불량한 세포 성장을 나타내고, 검출 가능한 항체 생성이 매우 낮거나 없었으며 (<10 pg/세포/일), 많은 MP는 MTX 증폭에서 생존하지 못하였다. 새로운 시약 세트를 사용한 반복 형질감염 실험은 유사한 결과를 초래하는 반면 조절 벡터를 사용한 형질감염은 정상적인 단백질 발현 수준을 초래하였다. 이러한 결과는 게놈-통합된 C06.08 및 C06.09 단백질이 CHO-DG44 세포에 대해 고유한 독성 효과를 가질 수 있으며, 예를 들어 이들 단백질은 핵에서 미스폴딩된 C06.08 및 C06.09 단백질의 과다 발현으로 인해 세포 사멸을 유발할 수 있다. C06.08 및 C06.09의 일차 서열에 대한 추가 변형이 보장되며, 이것은 단백질 미스폴딩을 정정하고 CHO-DG44 세포 사멸의 유도를 제거한다.
단백질 폴딩 및 발현을 개선하기 위한 PBD-C06 변형
C06 아미노산 서열의 인실리코 분석 (In silico analysis)에서는 단백질 폴딩에 부정적인 영향을 주는 것으로 제안된 중쇄의 프레임워크 영역에서의 아미노산의 여러 스트레치 (스팟)가 밝혀졌다. 이러한 스팟이 단백질 발현을 개선시키는 대안적인 아미노산으로 교환될 수 있는지를 조사하기 위해, 4개의 개별 중쇄 돌연변이 (K12V, S14P, N55D 및 F64V)를 먼저 합성하고, 서열 번호 17의 경쇄와 함께 단백질 발현을 위한 일시적인 형질감염에서 개별적으로 시험하였다. 표적 결합 연구에서는 F64V 변형이 항체 결합을 방지하는 것으로 밝혀졌다. 두 번째 실험 세트에서, 각 돌연변이의 조합을 쌍으로 및 삼중으로 개별 중쇄 유전자에 통합시키고 발현 및 표적 결합 연구를 위해 서열 번호 17의 경쇄와 조합하여 시험하였다 (도 1 및 2).
결과
K12V, S14P 및 N55D 돌연변이의 조합은 최상의 일시적인 C06 발현 역가 및 최적의 표적 결합 특성을 야기하였으며 (도 1 및 2), 이들 세 가지 돌연변이 모두를 포함하는 각각의 클론을 CHO-DG44 안정한 형질감염 연구를 위해 선택하였다.
CHO-DG44 세포에서 인간화 항체의 안정한 발현
모 CHO-DG44 세포는 원래 Thermo Fisher Scientific에 의해 현재 관리되는 Gibco, Life Technologies (FreedomTM DG44 Kit)로부터 입수하였다. CHO 세포주는 DHFR-결핍이며 cGMP는 문서화되어 있다.
(K12V, S14P 및 N55D 돌연변이를 포함하는) 서열 번호 1의 경쇄 및 서열 번호 2의 중쇄를 포함하는 인간화 항체를 발현하는 벡터로 CHO-DG44 세포를 형질감염시키면 형질감염 시도 전과 비교하여 CHO-DG44 클론의 수가 수 배 개선되었다 (상기 참조). 또한, MTX 노출 후 높은 표적 항체 발현 역가를 갖는 다수의 클론이 확인되었으며, 이것은 K12V, S14P 및 N55D 돌연변이가 CHO-DG44 게놈으로의 안정한 통합 후 항체 폴딩 및 발현을 개선시켰음을 나타내었다. 연장된 배양 기간에 걸쳐 유가식 (fed-batch) 조건하에서 연장된 안정한 발현이 확인되었으며, 이것은 모 클론#6의 중쇄에서의 선택된 변형 (K12V, S14P 및 N55D)이 CHO-DG44 세포에서 적절한 폴딩 및 발현을 촉진함을 확인시켜 주었다.
추가의 벡터 및 전기천공 최적화 후에 추가의 안정한 세포주를 수득하였다. 유전자 증폭 이전의 초기 형질감염체는 단리 및 24-웰 플레이트에서 0.5 ml 배양물로 확장 후 높은 수준의 항체를 발현하였다 (도 3). 7일째의 생산 역가는 첫 번째 MTX 노출 후에 추가로 증가하였으며 (도 4), 이것은 이들 클론, 특히 c17이 훨씬 더 효율적인 생산자임을 시사한다.
요약
4개의 중쇄 돌연변이를 이들이 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포에서 항체 발현을 증가시키는지 여부를 알아보기 위해 개별적으로 시험하였다. 이들 돌연변이 중 3개는 항체 발현을 유의적으로 증가시킨 반면 4번째는 발현을 감소시켰다. 개별 돌연변이의 조합을 또한 쌍 및 삼중 돌연변이로 시도하였으며, 이들 모두는 잘 발현되고 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제되었다. Biacore 분석시, 4개의 돌연변이의 조합은 결합을 감소시키는 반면 특정 돌연변이 K12V, S14P 및 N55D의 조합은 잘 발현되고 최적의 결합 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 높은 발현을 위해 경쇄 서열의 변화가 필요하지는 않았다.
안정적으로 형질감염된 CHO DG44 세포에서 연구를 수행하였으며, 초기 선택 후 및 메토트렉세이트 (MTX)의 단계적 증가에 의해 유도된 유전자 증폭 이후 더 높은 수준의 항체 발현이 수득되었다. 더 높은 수준의 항체 발현이 양호한 세포 성장을 방지하지 않는 것으로 추가로 관찰되었다. 요약하면, 형질감염 캠페인은 CMC 제조를 위한 몇 가지 새로운 후보를 식별하게 한다.
5. 단량체성 Aβ 펩타이드에 대한 인간화 및 탈-면역화 항체의 결합을 분석하기 위한 표면 플라스몬 공명 측정
표면 플라스몬 공명 측정을 사용하여 서열 번호 1을 갖는 경쇄의 가변 부분 및 서열 번호 2를 갖는 중쇄의 가변 부분을 포함하는 항체의 결합 효능을 조사하였다. 측정 동안 물질 전달 및 항원 항체 결합력 (avidity effect) 영향을 방지하기 위해, 다음 절차를 사용하였다.
먼저 다클론 α-인간 항체를 SPR-칩에 커플링한 다음, 반응 유닛이 1000을 초과할 때까지 항체를 부하하였다.
(5 내지 1000 nM의) 상이한 농도의 Aβ-펩타이드에서 동역학 측정을 수행하였다. 측정된 시리즈의 그래프는 실행 버퍼를 측정하는 센소그램에 의해 보정되고, 주입 시점에 정렬되고, 주입 전에 기준선이 0으로 조정된 센서 그램을 갖는 오버레이 플롯으로 도시된다. 결과는 단순 1:1 상호작용 모델 (Langmuir fit)에 따라 평가하며, 이것은 koff 및 kon 속도 상수를 촉진한다.
1:1 랭뮤어 피팅에 따른 명백한 동역학 상수가 표 4에 열거되어 있다. 항체가 칩 표면에 비공유적으로 결합된다는 사실로 인해, 소량의 항체 분자를 측정 동안 세척하였다. 따라서 Rmax 값은 모든 단일 센소그램에 대해 국소적으로 피팅하였다.
표 4: 인간화 및 탈-면역화 항체 클론#6의 동역학에서 랭뮤어 피트의 통계
Figure pct00025
Aβ(pE3-18)에 대한 결합
기록된 센서그램의 정성 검사 및 육안 검사는 결합 상 및 해리 상에 대해 양호한 형상을 보여준다. 또한, 응답 신호의 농도 의존적 상승 및 결합 상에서 초기 기울기의 증가가 관찰되었다. 최대 SPR 신호는 ~44 RU이며, 이것은 질량 전달 효과가 없거나 무시할 수 있는 정도로 결합 동역학을 측정하는 최적의 범위 내에 있었다. 베이스라인 이동은 관찰되지 않았으며, 따라서 데이터를 Langmuir 1:1 결합 모델을 사용하여 평가하여 이러한 상호작용의 결합 특성 및 적합도를 수득하였다 (표 4).
Aβ(3-18)에 대한 결합
기록된 센서그램의 정성 검사 및 육안 검사는 결합 상 및 해리 상에 대해 양호한 형상을 보여준다. 또한, 응답 신호의 농도 의존적 상승 및 결합 상에서 초기 기울기의 증가가 관찰되었다. 최대 SPR 신호는 ~44 RU이며, 이것은 질량 전달 효과가 없거나 무시할 수 있는 정도로 결합 동역학을 측정하는 최적의 범위 내에 있었다. 베이스라인 이동은 관찰되지 않았으며, 따라서 데이터를 Langmuir 1:1 결합 모델을 사용하여 평가하여 이러한 상호작용의 결합 특성 및 적합도를 수득하였다 (표 4).
Aβ(1-18)에 대한 결합
기록된 센서그램의 정성 검사 및 육안 검사는 사용된 펩타이드 농도에 적합한 약한 결합에 대한 전형적인 형태를 보여준다. 약간의 베이스라인 이동이 관찰되었으며; 따라서, 데이터를 이동하는 베이스라인 모델을 갖는 Langmuir 1:1 결합을 사용하여 피딩하였다. 동역학 데이터의 평가 (표 4)는 23.1 μM의 해리 상수를 산출하였으며, 이것은 측정된 최고 Aβ (1-18) 농도보다 높았다. 또한, 계산된 Rmax 값은 최고 농도의 반응 값보다 상당히 높았다. 이들 사실 둘 다는 수득된 결합 특성이 확실히 KD > 10 μM 범위에 있음을 나타낸다.
Aβ(4-18)에 대한 결합
기록된 센서그램의 정성 검사 및 육안 검사는 사용된 펩타이드 농도에 적합한 매우 약한 결합에 대한 전형적인 형태를 보여준다. 매우 빠른 결합 및 해리로 인해 데이터를 동역학적으로 평가할 수 없으며, 따라서 정상-상태 모델이 사용되었다. 정상 상태에서의 반응 신호의 평가 (표 4)는 28.3 μM의 해리 상수를 산출하였으며, 이것은 측정된 최고 Aβ (4-18) 농도보다 높았다. 또한, 계산된 Rmax 값은 최고 농도의 반응 값보다 상당히 높았다. 이들 사실 둘 다는 수득된 결합 특성이 확실히 KD > 10 μM 범위에 있음을 나타낸다.
6. Aβ 피브릴 및 Aβ 올리고머에 대한 결합
Aβ(1-42) 펩타이드의 피브릴을 pH 8.7 및 37℃에서 표준 프로토콜에 따라 생성하였다. 완전한 피브릴화 후, 구조를 60 μl로 흡인하고, 140 μl 시험 완충액으로 희석시키고, 1 μl/분의 유속으로 포획 항체의 사용에 의해 센서 칩 상에 부하하였다. 그후, 안정한 베이스라인을 얻을 때까지 시스템을 세척하였다. 약 100 RU의 Aβ(1-42)_피브릴을 센서 칩 상에 포획하였다.
Aβ(1-42) 펩타이드의 올리고머를 4℃에서 밤새 Ham's F12 배지에서 ACUMEN 프로토콜에 따라 생성하고 응집된 Aβ로부터 원심분리에 의해 분리하였다. 그후 올리고머를 20 μl로 흡인하고, 60 μl 시험 완충액으로 희석시키고, 1 μl/분의 유속으로 포획 항체의 사용에 의해 센서 칩 상에 부하하였다. 그후, 안정한 베이스라인을 얻을 때까지 시스템을 100μl/min로 밤새 세척하였다. 약 300 RU의 Aβ(1-42)_올리고머를 센서 칩 상에 포획하였다.
Aβ(1-42) 펩타이드의 피브릴의 경우: 안정한 베이스라인을 얻은 후, 30 μl/min, 480 sec 접촉 시간 및 1200 sec 해리 시간으로 하여 제WO 2017/009459호에 개시된 바와 같은 모 항체 클론#6 및 본 발명의 인간화 및 탈-면역화된 항체 클론#6의 11회 연속 주입 (10 pM, 30 pM, 90 pM, 270 pM, 810 pM, 2.43 nM, 7.29 nM, 21.87 nM, 65.61 nM, 196.83 nM 및 590.49 nM)에 의해 상호작용 분석을 수행하였다. 수득된 센서그램을 Rmax 및 베이스라인 이동의 전체 적합도 및 모든 주입의 벌크 효과의 국소 적합도로 5개의 연속 농도 (결합을 보이는 제1 주입으로 시작함) 및 단일 사이클 동역학 모델을 사용하여 평가하였다.
Aβ(1-42) 펩타이드의 올리고머의 경우: 안정한 베이스라인을 얻은 후, 30 μl/min, 480 sec 접촉 시간 및 3600 sec 해리 시간으로 하여 제WO 2017/009459호에 개시된 바와 같은 모 항체 클론#6 및 본 발명의 인간화 및 탈-면역화된 항체 클론#6의 11회 연속 주입 (10 pM, 30 pM, 90 pM, 270 pM, 810 pM, 2.43 nM, 7.29 nM, 21.87 nM, 65.61 nM, 196.83 nM 및 590.49 nM)에 의해 상호작용 분석을 수행하였다. 수득된 센서그램을 Rmax 및 베이스라인 이동의 전체 적합도 및 모든 주입의 벌크 효과의 국소 적합도로 5개의 연속 농도 (결합을 보이는 제1 주입으로 시작함) 및 단일 사이클 동역학 모델을 사용하여 평가하였다.
결과
표 5: 피브릴 Aβ (1-42) 펩타이드 에 대한 결합
Figure pct00026
표 6: Aβ (1-42) 펩타이드의 올리고머에 대한 결합
Figure pct00027
표 5 및 6에서,
A는 서열 번호 1의 경쇄의 가변 영역과 서열 번호 49의 중쇄의 가변 영역을 갖는 제WO 2017/009459호에 개시된 모 항체 클론#6이고;
B는 서열 번호 1의 경쇄의 가변 영역과 서열 번호 2의 중쇄의 가변 영역을 갖는 본 발명의 인간화 및 탈-면역화된 항체 클론#6이다.
이러한 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 항체 및 이의 단편을 제공하며, 여기서 항체는 Aβ 펩타이드의 올리고머 및/또는 피브릴에 대해 증가된 선택성을 나타낸다. 본 발명의 항체는 Aβ (1-42)의 올리고머 및/또는 피브릴에 결합하기 위해 선행 기술에 공지된 필적하는 단클론 항체보다, 특히 제WO 2017/009459호에 개시된 모 항체와 비교하여 다수, 예를 들어 10배, 25배, 50배, 100배, 150배, 200배, 250배 또는 250 배 이상 더 낮은 결합 상수 (KD 값)를 나타낸다. 따라서, Aβ N3pE 펩타이드에 선택적으로 결합하도록 확립된 본 발명의 항체는 Aβ N3pE 펩타이드에 대해 더욱 특이적이고 Aβ N3pE 이외의 Aβ 펩타이드에 대해 감소된 교차-반응성을 나타낸다.
7. Fc 감마 수용체에 대한 결합
상이한 Fc 감마 수용체 (CD16A, CD32A, CD32B 및 CD64)에 대한 서열 번호 19의 중쇄를 포함하는 두 개의 항체 또는 이의 K324A 돌연변이 변이체 (서열 번호 18)의 결합을 비교하였다.
K324A 돌연변이체는 부위-지정 돌연변이유발에 의해 생성하였다. 전장 인간 CD16A, CD32A, CD32B 또는 CD64를 안정적으로 발현하는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에 대한 FACS 기반 생물검정에서 결합을 측정하였다. 항체 둘 다를 각각의 세포주와 1시간 동안 7개의 상이한 농도로 항온처리한 다음, 세척하였다. 수용체-결합된 H6 또는 H67을 형광색소 접합된 항-Fab'로 검출하였다. 결합 능력은 FACS에 의해 측정하였으며 Kd 및 Bmax는 비선형 회귀에 의해 계산하였다.
결과: 항체 둘 다는 모든 수용체에 대해 필적하는 결합을 나타내었다.
8. C1q에 대한 결합
항체의 이펙터 기능을 보다 잘 특성화하기 위해, C1q에 대한 서열 번호 19의 중쇄를 포함하는 두 개의 항체 또는 이의 K324A 돌연변이 변이체 (서열 번호 18)의 결합을 비교하였다.
이하를 포함하여, C1q에 대한 항체의 결합에 대한 다수의 분석 포맷을 시험하였다:
a) 플레이트에 두 항체를 직접 결합시킨 다음, 용액에서 C1q에 결합시킴; 및
b) 스트렙타비딘 코팅된 플레이트를 먼저 비오티닐화된 pE-Aβ 펩타이드와 항온처리하여 항체에 결합시킨 다음, C1q에 결합시킴.
요약하면, 포맷 a)가 최상의 결과를 야기하였다. 절차는 다음과 같다:
ELISA 플레이트를 서열 번호 19의 중쇄를 포함하는 항체, 이의 K324A 돌연변이 변이체 (서열 번호 18), 및 C1q에 결합하지 않는 K324A 대조물로 삼중으로 10, 8, 6, 4, 3, 2, 1 및 0 μg/ml에서 코팅하고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 다음날, 플레이트를 1x PBS로 3회 세척한 다음, 50μl/웰로 1x PBS에서 1% BSA로 차단하였다. C1q (Sigma, Cat. # C1740)를 차단 완충액에서 2μg/ml로 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그후 플레이트를 200μl의 1x PBS로 3회 세척하였다. 항-C1q-HRP (Thermo, Cat. # PA1-84324)를 플레이트에 첨가하여 1시간 동안 차단 완충액 (50μl/웰)에서 1:250 희석도에서의 결합을 검출하였다. 플레이트를 200μl의 1x PBS로 3회 세척하였다. 50 μl의 TMB (Invitrogen, Cat.# 002023)를 각 웰에 첨가하여 2분 동안 상호작용 (Invitrogen, Cat.# 002023)을 가시화하였다. 450nm에서 흡광도를 판독하기 전에 50μl의 정지 용액 ((1M 황산)을 각 웰에 첨가하였다.
결과: 서열 번호 19의 야생형 중쇄를 포함하는 항체는 C1q에 결합하였다. (서열 번호 18의 중쇄를 포함하는) 이의 K324A 돌연변이 변이체는 C1q에 결합하지 않았다.
9. 면역조직화학
IHC를 사용하여 항원 Aβ N3pE를 대뇌 조직 절편에 국재화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체를 Aβ N3pE의 검출에 사용하였다.
IHC를 위해 AD 환자로부터의 해마 및 전두엽 피질의 인간 대뇌 조직 절편 및 또한 본원에 기술된 바와 같은 알츠하이머병에 대한 기존 동물 모델로부터의 해마의 대뇌 조직 절편이 사용될 수 있다. 이러한 마우스 모델은 뇌 Aβ 수준의 증가에 이어 신경성 플라크의 발달을 보인다. 조직 절편을 파라핀-매봉하고 연속 절단하였다. 절편을 헤마톡실린으로 염색하여 세포의 핵을 착색한 다음, 본 발명의 항 Aβ N3pE 항체로 면역염색하였다. 조직 절편 제조 및 염색은 표준 방법론에 따라 수행하였다.
10. 생체내 알츠하이머 마우스의 치료
총 62마리의 수컷 마우스가 이 연구에 사용되었다. 면역화를 시작하기 전에, 알츠하이머병 (평균 5.6 mo ± 0.45) 마우스에 대한 기존 마우스 모델의 4마리 마우스를 베이스라인 대조군으로서 희생시켜 치료 개시시 뇌 Aβ 플라크 부담을 평가하였다. 나머지 마우스를 4개의 그룹으로 나누고 다음의 치료를 제공하였다: 250μl 멸균 PBS (n= 12; avg. 5.89 mo ± 0.13), 200μg의 본 발명의 항체. 연령- 및 성별-일치된 Wt 한배 새끼의 그룹에 250μl PBS (n=12; avg. 5.80 mo ± 0.12)를 주사하고 행동 대조군으로서 작용하였다. 마우스를 28주 동안 복강내 주사를 통해 총 용적 250μl (항체 또는 PBS)로 처리하였다.
안락사 및 조직 준비
마우스를 안락사시키고, 관류시키고, 6개월령 (베이스라인) 또는 13개월형에 혈장을 수확하였다. 뇌를 추출하고 시상으로 나누었다. 해마, 피질 및 소뇌를 하나의 반구로부터 해부하고 생화학적 분석을 위해 급속 냉동시켰다. 다른 반구를 4% 파라포름알데히드 (Electron Microscopy Sciences)에 4℃에서 24시간 동안 적하-고정시키고, 4℃에서 등급화된 수크로스 용액으로 동결보호하고 OCT 화합물 (Tissue Tek)에 매봉시켰다.
SEQUENCE LISTING <110> Probiodrug AG <120> Humanized and de-immunized antibodies <130> PBD135WO <160> 49 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant Polypeptide <400> 1 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Thr Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant Polypeptide <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His 20 25 30 Thr Met 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atctggtgtc taagctggac 180 tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgacttcac actgaagatc 240 agcagggtgg aggctgagga tgtcggagtc tactactgcg tgcaaggtac acacttccca 300 ttcacgttcg gcggagggac caaggtggaa atcaaaagga ccgtggccgc accctctgtg 360 ttcatcttcc cccccagcga cgagcagctg aagagcggca ctgcatctgt cgtgtgtctg 420 ctgaacaact tctacccaag ggaggcgaaa gtgcagtgga aggtagacaa cgccttgcaa 480 tccggcaact cccaggagag cgtgaccgag caggacagca aagactcaac ctacagcctg 540 agcagtactt tgaccctgtc taaggccgat tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgag 600 gtaacccacc agggactgag ctctcccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgc 657 <210> 21 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant nucleic acid <400> 21 caggtgcagc tcgtgcagtc tggggctgag gtggtgaagc caggtgcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg catctggtta ctcattcact ggtcacacca tgaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggactc atcaatcctt ccgatggtgt tactaggtac 180 aaccagaagt tccagggcag agtcaccatc accagggaca cgtccacgac caccgttcac 240 atggagctga ccagcctgac atctgaggac acggccacct actactgtac gagagaggcg 300 aaacgggagt gggacgagac ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagcc 360 agcactaagg gcccgagcgt gttccccctc gcccctagca gtaagagcac cagcggtggc 420 acggcggcac ttggctgctt ggttaaggac tacttcccag agcccgtgac cgtgtcctgg 480 aactctgggg cacttaccag tggcgtgcac accttccccg ctgtactgca gagcagcggc 540 ttgtacagct tgtcttccgt cgtaacggtg cccagcagca gcttgggaac ccagacctac 600 atctgcaacg taaaccacaa gccatccaac accaaggtag acaaaaaggt cgaacccaag 660 tcctgcgaca agacccacac ctgtccaccc tgtcctgcac ccgagctcct gggaggtccc 720 agcgttttcc tgttccctcc aaagccaaag gataccctga tgatcagcag gacccccgag 780 gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840 gttgatgggg tggaggtaca caatgccaag accaaacctc gagaggagca atacaacagc 900 acctaccgag ttgtgagcgt gcttaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960 tacaagtgcg ctgtgagcaa caaggctctg ccggctccca tcgagaagac catcagcaag 1020 gccaagggcc agcccaggga gccacaggtt tacacgttgc ccccctcaag ggacgagttg 1080 accaagaacc aggtttccct cacgtgcctt gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 1140 gtggaatggg agagcaacgg gcagcccgag aacaactaca agacgacccc ccctgttctg 1200 gacagcgacg gctctttctt cctgtattca aagctcaccg tggacaaaag caggtggcag 1260 cagggtaatg tgttctcctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcataacca ctacacccaa 1320 aagagcttga gcctctcccc cggtaag 1347 <210> 22 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant nucleic acid <400> 22 caggtgcagc tcgtgcagtc tggggctgag gtggtgaagc caggtgcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg catctggtta ctcattcact ggtcacacca tgaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggactc atcaatcctt ccgatggtgt tactaggtac 180 aaccagaagt tccagggcag agtcaccatc accagggaca cgtccacgac caccgttcac 240 atggagctga ccagcctgac atctgaggac acggccacct actactgtac gagagaggcg 300 aaacgggagt gggacgagac ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagcc 360 agcactaagg gcccgagcgt gttccccctc gcccctagca gtaagagcac cagcggtggc 420 acggcggcac ttggctgctt ggttaaggac tacttcccag agcccgtgac cgtgtcctgg 480 aactctgggg cacttaccag tggcgtgcac accttccccg ctgtactgca gagcagcggc 540 ttgtacagct tgtcttccgt cgtaacggtg cccagcagca gcttgggaac ccagacctac 600 atctgcaacg taaaccacaa gccatccaac accaaggtag acaaaaaggt cgaacccaag 660 tcctgcgaca agacccacac ctgtccaccc tgtcctgcac ccgagctcct gggaggtccc 720 agcgttttcc tgttccctcc aaagccaaag gataccctga tgatcagcag gacccccgag 780 gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840 gttgatgggg tggaggtaca caatgccaag accaaacctc gagaggagca atacaacagc 900 acctaccgag ttgtgagcgt gcttaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960 tacaagtgca aggtgagcaa caaggctctg ccggctccca tcgagaagac catcagcaag 1020 gccaagggcc agcccaggga gccacaggtt tacacgttgc ccccctcaag ggacgagttg 1080 accaagaacc aggtttccct cacgtgcctt gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 1140 gtggaatggg agagcaacgg gcagcccgag aacaactaca agacgacccc ccctgttctg 1200 gacagcgacg gctctttctt cctgtattca aagctcaccg tggacaaaag caggtggcag 1260 cagggtaatg tgttctcctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcataacca ctacacccaa 1320 aagagcttga gcctctcccc cggtaag 1347 <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 23 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val 1 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 24 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu 1 5 10 15 <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 25 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 26 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln 1 5 10 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 27 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His 1 5 10 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 28 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His 1 5 10 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 29 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val 1 5 10 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 30 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu 1 5 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 31 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 32 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly 1 5 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 33 Glu Phe Arg His Asp Ser 1 5 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 34 Glu Phe Arg His Asp 1 5 <210> 35 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 35 Glu Phe Arg His 1 <210> 36 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 36 Glu Phe Arg 1 <210> 37 <211> 42 <212> PRT <213> Human <400> 37 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 38 <211> 40 <212> PRT <213> Human <400> 38 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 39 <211> 38 <212> PRT <213> Human <400> 39 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly 35 <210> 40 <211> 40 <212> PRT <213> Human <400> 40 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val 1 5 10 15 Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu 20 25 30 Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 41 <211> 38 <212> PRT <213> Human <400> 41 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val 1 5 10 15 Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu 20 25 30 Met Val Gly Gly Val Val 35 <210> 42 <211> 36 <212> PRT <213> Human <400> 42 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val 1 5 10 15 Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu 20 25 30 Met Val Gly Gly 35 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 43 actgtggctg caccatctgt cttc 24 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 44 ctaacactct cccctgttga agctc 25 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 45 agggaaccct ggtcaccgtc tcc 23 <210> 46 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 46 tcatttaccc ggagacaggg agagg 25 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 47 caagtcagag cctcttatat agtg 24 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 48 gtaccttgca cgcagtaata aac 23 <210> 49 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant polypeptide <400> 49 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val His 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115

Claims (17)

  1. 경쇄의 가변 부분은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성되고:
    Figure pct00028
    ,
    경쇄의 가변 부분은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로들 필수적으로 구성되거나, 또는 이로들 구성되는 항체 또는 이의 기능적 변이체:
    Figure pct00029
    .
  2. 제1항에 있어서, 경쇄에 하기의 CDR 영역을 포함하는 항체:
    VL CDR1: SSQSLLYSDGKTYLN (서열 번호 3);
    VL CDR2: LVSKLDS (서열 번호 4); 및
    VL CDR3: VQGTHFP (서열 번호 5).
  3. 제1항에 있어서, 중쇄에 하기의 CDR 영역을 포함하는 항체:
    VH CDR1: GYSFTGHTMN (서열 번호 6);
    VH CDR2: LINPSDGVTRYNQKFQG (서열 번호 7); 및
    VH CDR3: EAKREWDETY (서열 번호 8).
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄가 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성되는 항체:
    Figure pct00030
    .
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄가 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성되는 항체:
    Figure pct00031
    .
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄가 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성되는 항체:
    Figure pct00032
    .
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체가 Aβ N3pE 에피토프의 N-말단을 지니는 피로글루타메이트에 특이적으로 결합하는 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체가 하기한 것으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체:
    pEFRHDSGYEVHHQKLV (서열 번호 23),
    pEFRHDSGYEVHHQKL (서열 번호 24),
    pEFRHDSGYEVHHQK (서열 번호 25),
    pEFRHDSGYEVHHQ (서열 번호 26),
    pEFRHDSGYEVHH (서열 번호 27),
    pEFRHDSGYEVH (서열 번호 28),
    pEFRHDSGYEV (서열 번호 29),
    pEFRHDSGYE (서열 번호 30),
    pEFRHDSGY (서열 번호 31),
    pEFRHDSG (서열 번호 32),
    pEFRHDS (서열 번호 33),
    pEFRHD (서열 번호 34)
    pEFRH (서열 번호 35), 및
    pEFR (서열 번호 36).
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 본 발명의 상기 인간화 항체가 Aβ N3pE 변이체에 결합하고, 여기서 Aβ N3pE 변이체가 pE-Aβ3 -X로 정의되며, 여기서 x는 19 내지 42의 정수로서 정의되는 항체.
  10. 제9항에 있어서, Aβ N3pE 변이체가 하기의 것에서 선택되는 것인 항체:
    pE-Aβ3 -38,
    pE-Aβ3 -40,
    pE-Aβ3 -42.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 N-말단에 피로글루타메이트를 지니지 않는 에피토프에 결합하지 않는 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 약제학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 추가의 생물학적 활성 물질 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 추가의 생물학적 활성 물질이 중성자-전달 향상제, 정신치료 약물, 아세틸콜린 에스테라제 억제제, 칼슘-채널 차단제, 생원성 아민, 벤조디아제핀 진정제, 아세틸콜린 합성, 저장 또는 방출 향상제, 아세틸콜린 시냅스후 수용체 효능제, 모노아민 옥시다제-A 또는 -B 억제제, N-메틸-D-아스파르테이트 글루타메이트 수용체 길항제, 비-스테로이드성 항염증 약물, 항산화제, 및 세로토닌성 수용체 길항제로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 추가의 생물학적 활성 물질이 산화 스트레스에 효과적인 화합물, 항-아폽토시스 화합물, 금속 킬레이터, 피렌제핀 및 대사산물과 같은 DNA 수복의 억제제, 3-아미노-1-프로판설폰산 (3 APS), 1,3-프로판디설포네이트 (1,3PDS), α-세크레타제 활성제, β- 및 γ-세크레타제 억제제, 타우 단백질, 신경 전달 물질, β-시트 파괴제, 아밀로이드 베타 제거/고갈 세포 성분에 대한 유인제, 피로글루타메이트화 아밀로이드 베타 3-42를 포함한 N-말단 절단된 아밀로이드 베타의 억제제, 예를 들어, 글루타미닐 사이클라제의 억제제, 항염증 분자, 또는 콜린에스테라제 억제제 (ChEI), 예를 들어, 타크린, 리바스티그민, 도네페질, 및/또는 갈란타민, M1 효능제, 및 임의의 아밀로이드 또는 타우 변성 약물 및 영양 보충제를 포함한 기타 약물, 콜린에스테라제 억제제 (ChEIs), 메만틴 또는 글루타미닐 사이클라제 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  16. 아밀로이드증의 진단, 치료에 사용하기 위한, 특히 경증 인지 장애 (MCI), 예를 들어, 산발성 알츠하이머병 (SAD)과 같은 알츠하이머병 (AD), 또는 가족성 영국 치매 (FBD) 및 가족성 덴마크 치매 (FDD)와 같은 가족성 알츠하이머 치매 (FAD), 다운 증후군의 신경퇴행 및 임상 또는 전임상 대뇌 아밀로이드 혈관병증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 신경퇴행성 질환의 치료; 및/또는 전구 AD, 경증 AD, 중등도 AD 및 중증 AD로부터 선택된 병태의 치료 및/또는 임상 또는 전임상 알츠하이머병, 다운 증후군, 및 임상 또는 전임상 대뇌 아밀로이드 혈관병증으로부터 선택된 병태로 진단된 환자에서 인지 저하를 늦추는데 사용하기 위한 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 약제학적 조성물.
  17. 상기 항체 또는 상기 약제학적 조성물의 투여가 경증 인지 장애 (MCI), 예를 들어 산발성 알츠하이머병 (SAD)과 같은 알츠하이머병 (AD), 또는 가족성 영국 치매 (FBD) 및 가족성 덴마크 치매 (FDD)와 같은 가족성 알츠하이머 치매 (FAD), 다운 증후군의 신경퇴행 및 임상 또는 전임상 대뇌 아밀로이드 혈관병증으로 진단된 대상체에서 인지 저하의 역전, 인지력의 개선 또는 인지 저하의 예방 및/또는 전구 AD, 경증 AD, 중등도 AD 및 중증 AD로부터 선택된 병태의 치료를 야기하거나;
    상기 항체 또는 상기 약제학적 조성물의 투여가 플라크 또는 다른 생물학적 복합체로부터의 Aβ N3pE의 소거 또는 제거를 야기하거나;
    상기 항체 또는 상기 약제학적 조성물의 투여가 플라크 부하의 감소 및/또는 뇌 조직과 같은 영향을 받은 조직으로부터의 완전한 플라크의 제거를 야기하는, 제24항에 따라 사용하기 위한 항체 또는 약제학적 조성물.
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