CN111670196A

CN111670196A - 人源化和去免疫化抗体

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Publication number: CN111670196A
Application number: CN201980011104.3A
Authority: CN
Inventors: J-U·拉费尔德; S·吉利斯; T·赫特曼; S·席林; M·克莱因施密特
Original assignee: Vivoyon Treatment Co Ltd
Current assignee: Vivoyon Treatment Co Ltd
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2019-01-29
Publication date: 2020-09-15
Also published as: EA202091629A1; ZA202004784B; EP3521308B1; US20210032315A1; BR112020015194A2; AU2019214280A1; CA3088606A1; EP3521308C0; KR20200116095A; JP7337077B2; EP3521308A1; SG11202006378PA; IL276101A; MX2020007986A; JP2021512100A; WO2019149689A1

Abstract

本发明涉及人源化和去免疫化抗体，所述抗体与焦谷氨酸化的淀粉样蛋白β(AβN3pE)肽的N‑末端的表位结合，还涉及疾病和病症的预防性和治疗性治疗，所述疾病和病症与淀粉样蛋白肽的积累和沉积有关，诸如淀粉样变性，其是一组与焦谷氨酸化淀粉样蛋白肽相关的障碍和异常，如阿尔茨海默病、唐氏综合征、大脑淀粉样血管病以及其他相关方面。再具体地，其涉及本发明的单克隆抗体在血浆、脑和脑脊液中结合焦谷氨酸化淀粉样蛋白β肽以防止AβN3pE在脑内和周围各种组织中积累或逆转其沉积的用途并涉及减轻淀粉样变性的用途。本发明还涉及使用本发明的抗体诊断淀粉样变性的诊断检测。

Description

人源化和去免疫化抗体

技术领域

本发明涉及人源化和去免疫化(de-immunized)抗体，所述抗体与焦谷氨酸化(pyroglutamated)淀粉样蛋白β(AβN3pE)肽的N-末端的表位结合，还涉及疾病和病症的预防性和治疗性治疗，所述疾病和病症与淀粉样蛋白肽的积累和沉积有关，诸如淀粉样变性(一组与焦谷氨酸化淀粉样蛋白肽相关的障碍(disorder)和异常，如阿尔茨海默病、唐氏综合征、大脑淀粉样血管病以及其他相关方面)。更具体地，其涉及本发明的单克隆抗体在血浆、脑和脑脊液中结合焦谷氨酸化淀粉样蛋白β肽以防止AβN3pE在脑内和周围各种组织中积累或逆转其沉积的用途以及减轻淀粉样变性的用途。本发明还涉及使用本发明的抗体诊断淀粉样变性的诊断检测。

背景技术

淀粉样变性不是单一疾病实体，而是一组不同的进行性疾病过程，其特征在于称为淀粉样蛋白的蜡状、淀粉样蛋白质(starch-like protein)的细胞外组织沉积物，其在一个或多个器官或身体系统中积累。随着淀粉样蛋白沉积物的积累，其开始干扰器官或身体系统的正常功能。至少有15种不同类型的淀粉样变性。主要形式是无已知先例的原发性淀粉样变性，一些其他病症后的继发性淀粉样变性，以及遗传性淀粉样变性。

继发性淀粉样变性发生于慢性感染或炎性疾病期间，诸如结核病、称为家族性地中海热的细菌感染、骨骼感染(骨髓炎)、类风湿性关节炎、小肠炎症(肉芽肿性回肠炎)、霍奇金病和麻风病。

淀粉样蛋白沉积物包括淀粉样蛋白P(五角形)成分(AP)、与正常血清淀粉样蛋白P相关的糖蛋白(SAP)和硫酸化糖胺聚糖(GAG)、结缔组织的复杂碳水化合物。约占淀粉样蛋白物质的90％的淀粉样蛋白原纤维包含几种不同类型蛋白质之一。这些蛋白质能够折叠成所谓的“β-折叠”片状原纤维，这是一种独特的蛋白质构型，其表现出刚果红的结合位点，从而导致淀粉样蛋白的独特染色特性。

许多老化疾病基于淀粉样蛋白质或与淀粉样蛋白质相关，并且其部分特征在于淀粉样蛋白或淀粉样蛋白物质的细胞外沉积物的积聚，其参与发病机理以及疾病的进展。这些疾病包括但不限于神经障碍诸如有轻度认知损害(MCI)、阿尔茨海默病(AD)、例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默痴呆症(FAD)例如家族性英国型痴呆症(FBD)和家族性丹麦型痴呆症(FDD)、唐氏综合症中的神经变性、路易体痴呆(Lewy body dementia)、遗传性脑出血伴淀粉样变性(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆复征(Guam Parkinson-Dementiacomplex)。基于淀粉样蛋白质或与淀粉样蛋白质相关的其他疾病为进行性核上性麻痹、多发性硬化；克雅氏病、帕金森氏病、HIV相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、成年发病型糖尿病；老年性心脏淀粉样变性；内分泌肿瘤以及其他疾病，包括黄斑变性。

尽管这些疾病的发病机理可能是多样的，但其特征性沉积物通常含有许多共有的分子成分。在很大程度上，这可能归因于促炎途径的局部活化，从而导致活化的补体成分、急性期反应物、免疫调节剂和其他炎性介质的同时沉积(McGeer et al.,Tohoku J ExpMed.174(3):269-277(1994))。

最近，越来越多的证据表明N-末端修饰的Aβ肽变体参与阿尔茨海默病。针对活组织检查显示Aβ1-40和Aβ1-42不仅存在于阿尔茨海默病患者的大脑中，而且还存在于未患病个体的老年斑中。但是，N-末端截短的和焦谷氨酸修饰的AβN3pE-40/AβN3pE-42几乎仅存在于阿尔茨海默病患者的斑块内，使得这种Aβ变体成为合格的诊断标志物和药物开发的潜在靶标。

目前，一些商业制造商提供了ELISA试剂盒，其可在低皮克(pg)范围内检测Aβ1-40/1-42和AβN3pE-40/AβN3pE-42。

阿尔茨海默病(AD)患者的大脑的形态学特征在于存在神经原纤维缠结和Aβ肽在新皮层大脑结构中的沉积(Selkoe,D.J.&Schenk,D.Alzheimer's disease:molecularunderstanding predicts amyloid-based therapeutics.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.43,545-584(2003))。在依次被β-分泌酶和γ-分泌酶切割后，从淀粉样蛋白前体蛋白(APP)中释放出Aβ肽。γ-分泌酶切割导致生成Aβ1-40和Aβ1-42肽，它们的C末端不同并且表现出不同的聚集、原纤维形成和神经毒性潜能(Shin,R.W.et al.Amyloid beta-protein(Abeta)1-40but not Abeta 1-42contributes to the experimental formation ofAlzheimer disease amyloid fibrils in rat brain.J.Neurosci.17,8187-8193(1997)；Iwatsubo,T.et al.Visualization of Abeta 42(43)and Abeta 40in senile plaqueswith end-specific Abeta monoclonals:evidence that an initially depositedspecies is Abeta 42(43).Neuron 13,45-53(1994)；Iwatsubo,T.,Mann,D.M.,Odaka,A.,Suzuki,N.&Ihara,Y.Amyloid beta protein(Abeta)deposition:Abeta 42(43)precedesAbeta 40in Down syndrome.Ann.Neurol.37,294-299(1995)；Hardy,J.A.&Higgins,G.A.Alzheimer's disease:the amyloid cascadehypothesis.Science 256,184-185(1992)；Roβner,S.,Ueberham,U.,Schliebs,R.,Perez-Polo,J.R.&Bigl,V.Theregulation of amyloid precursor protein metabolism by cholinergic mechanismsand neurotrophin receptor signaling.Prog.Neurobiol.56,541-569(1998))。

沉积在弥散性斑块中的大多数Aβ肽被N-末端截短或修饰。Piccini和Saido的研究表明，老年斑和血管沉积物的核心结构由50％焦谷氨酸(pyroGlu)修饰的肽组成(Picciniet al.,J Biol Chem.2005Oct 7；280(40):34186-92；Saido et al.,Neuron.1995Feb；14(2):457-66)。焦谷氨酸修饰的肽具有比其他Aβ种类更强的细胞毒性，并且对氨基肽酶稳定(Russo et al.,J Neurochem.2002Sep；82(6):1480-9)。因此，焦谷氨酸Aβ种类具有更长的半衰期，从而有助于这些种类的积累以及神经毒性寡聚体和聚集体的形成(Saido,Neurobiol Aging.1998Jan-Feb；19(1Suppl):S69-75)。由于谷氨酸环化为焦谷氨酸，带电荷的氨基酸将丢失，这会大大降低所述肽的溶解度并导致聚集趋势增加。体外研究已表明，与未修饰的肽相比，例如Aβ3(pE)的初始寡聚化要快得多(Schilling et al.,Biochemistry.2006Oct 17；45(41):12393-9)。AβN3pE-42肽与Aβ1-40/1-42肽共存(Saido,T.C.et al.Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloidpeptide species,Abeta N3pE,in senile plaques.Neuron 14,457-466(1995)；Saido,T.C.,Yamao,H.,Iwatsubo,T.&Kawashima,S.Amino-and carboxyl-terminalheterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in humanbrain.Neurosci.Lett.215,173-176(1996))，并且，基于大量观察，其可以在AD的发病机理中起重要作用。例如，已概述了AβN3pE-42肽的特定神经毒性(Russo,C.etal.Pyroglutamate-modified amyloid beta-peptides--AbetaN3(pE)--strongly affectcultured neuron and astrocyte survival.J.Neurochem.82,1480-1489(2002)，并且N-截短的Aβ肽的pE修饰赋予对大多数氨基肽酶和Aβ降解内肽酶降解的抗性(Russo,C.etal.Pyroglutamate-modified amyloid beta-peptides--AbetaN3(pE)--strongly affectcultured neuron and astrocyte survival.J.Neurochem.82,1480-1489(2002)；Saido,T.C.Alzheimer's disease as proteolytic disorders:anabolism and catabolism ofbeta-amyloid.Neurobiol.Aging19,S69-S75(1998))。谷氨酸环化成pE会导致N-末端电荷的丢失，与未修饰的Aβ肽相比，AβN3pE的聚集加速(He,W.&Barrow,C.J.The Abeta 3-pyroglutamyl and11-pyroglutamyl peptides found in senile plaque have greaterbeta-sheet forming and aggregation propensities in vitro than full-length Abeta.Biochemistry 38,10871-10877(1999)；Schilling,S.et al.On the seeding andoligomerization of pGlu-amyloid peptides(in vitro).Biochemistry 45,12393-12399(2006))。因此，AβN3pE-42形成的减少将使肽更易于降解，从而使肽不稳定，以及进而阻止更高分子量Aβ聚集物的形成并提高神经元存活率。

然而，很长一段时间以来，还不清楚Aβ肽的pE修饰是如何发生的。最近，发现谷氨酰胺酰基环化酶(QC)能够在弱酸性条件下催化AβN3pE-42形成并且特异性QC抑制剂可在体外阻止AβN3pE-42产生(Schilling,S.,Hoffmann,T.,Manhart,S.,Hoffmann,M.&Demuth,H.-U.Glutaminyl cyclases unfold glutamyl cyclase activity under mild acidconditions.FEBS Lett.563,191-196(2004)；Cynis,H.et al.Inhibition of glutaminylcyclase alters pyroglutamate formation in mammaliancells.Biochim.Biophys.Acta 1764,1618-1625(2006))。

所有事实均表明，焦谷氨酸Aβ是一种用于原纤维形成初始化的种子(germ)。在进一步的研究中(Piccini et al.,2005，同上)，基于Aβ种类的特征量，具有斑块沉积但无AD特异性病理的志愿者可与AD患者区分开。其中，在AD患者的脑中，N-末端截短的焦谷氨酸修饰的肽的量显著较高。

在Aβ-肽的3或11位的焦谷氨酸的翻译后形成暗示了N-末端谷氨酸残基的环化。谷氨酰胺酰基环化酶(QC)在焦谷氨酸肽的产生中起重要作用。QC广泛应分布于动植物界，并且尤其参与肽激素的成熟。QC既可以通过释放氨来使谷氨酰胺环化为焦谷氨酸，也可以通过释放水使谷氨酸环化为焦谷氨酸。与谷氨酰胺环化相反，谷氨酸环化不是自发发生的。QC催化从谷氨酸到焦谷氨酸的有效(不需要的)副反应。产生的焦谷氨酸残基保护蛋白质免受蛋白水解降解。有若干参考文献表明，QC在焦谷氨酸Aβ的产生中起着重要作用：

1.多项研究表明，QC催化从Aβ的N-末端的谷氨酸形成焦谷氨酸残基(Cynis etal.,Biochim Biophys Acta.2006Oct；1764(10):1618-25,Schilling et al.,FEBSLett.2004Apr9；563(1-3):191-6)；

2.Aβ肽和QC均在海马和皮层中大量表达。这些大脑区域在AD中尤其危险(Pohl etal.,Proc Natl Acad Sci U S A.1991Nov 15；88(22):10059-63,Selkoe,PhysiolRev.2001Apr；81(2):741-66)；

3.在运输到质膜的过程中，APP被β分泌酶切割，从而可以产生带有游离谷氨酸残基的Aβ的N-末端(Greenfield et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.1999Jan 19；96(2):742-7)。在分泌囊泡中，确定了加工的APP和QC的共定位。因此，在囊泡的弱酸性环境中，可以发生谷氨酸残基向焦谷氨酸的加速修饰。

4.还有其他神经变性疾病(家族性丹麦型(FDD)或英国型痴呆(FBD))也与N-末端焦谷氨酸修饰的肽例如Bri2有关，但相反，它们的一级结构与Aβ不相关(Vidal R.et al.,1999Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97,4920-4925)。

可能QC催化的焦谷氨酸Aβ的形成参与神经变性疾病的发生和发展。N-末端修饰的淀粉样蛋白肽的形成无疑代表了Aβ聚集过程中的基本因素，并且可能是疾病的开始。通过抑制QC抑制焦谷氨酸Aβ形成可能代表了一种治疗方法。QC抑制剂将能够阻止焦谷氨酸Aβ的形成，降低大脑中焦谷氨酸Aβ的浓度，从而延迟Aβ肽的寡聚化。Schilling et al.表明，AD患者皮层的QC表达上调，并与焦谷氨酸修饰的Aβ肽的出现相关。在两种不同的AD转基因小鼠模型和新的果蝇模型中，口服应用QC抑制剂导致焦谷氨酸修饰的AβpE(3-42)水平降低(Schilling et al.,2008Biol.Chem.(389),983-991)。

路易体痴呆(LBD)是一种神经变性疾病，其可发生于65岁以上的人群中，并且通常会导致认知(思维)障碍和异常行为改变的症状。症状可以包括认知损害、神经学指征、睡眠障碍和自主神经衰竭。在大多数情况下，认知损害是LBD的表现特征。患者有逐渐恶化的反复发作的意识混乱。认知能力的波动通常与注意力和警觉性的变化程度相关。认知损害和思维波动可能会在几分钟、几小时或几天内发生变化。路易体由磷酸化和非磷酸化的神经丝蛋白形成；它们含有突触蛋白α-突触核蛋白和泛素，其参与消除受损或异常蛋白。除路易体外，还可存在路易神经突，其是神经细胞的细胞过程中的包涵体。淀粉样蛋白斑块可在患有DLB的患者的大脑中形成，但数量往往比阿尔茨海默病患者中观察到的少。神经原纤维缠结，AD的另一微病理特征，不是LBD的主要特征，但除淀粉样蛋白斑块外，其经常存在。

肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的特征是上和下运动神经元变性。在一些ALS患者中，可能存在痴呆或失语症(ALS-D)。痴呆最常见的是额颞叶痴呆(FTD)，其中许多病例在齿状回以及额叶和颞叶的浅层的神经元中都有泛素-阳性、tau-阴性包涵体。

包涵体肌炎(IBM)是一种通常在50岁以上的人群中发现的致残疾病，其中肌纤维发炎并开始萎缩——但大脑幸免，且患者保留其全部智力。发现患有这种最常见的、老年人进行性肌肉疾病的患者的肌肉细胞内，参与淀粉样β蛋白产生的两种酶增加，其中淀粉样蛋白-β也增加。

基于淀粉样蛋白质的积累和沉积或与之相关的另一种疾病为黄斑变性。黄斑变性是引起黄斑恶化的常见眼病，黄斑是视网膜的中央区域(在眼后部的纸状薄组织，在这里光敏细胞向大脑发送视觉信号)。黄斑处理清晰、明亮、“笔直向前(straight ahead)”的视力。对黄斑的损伤导致盲点的发展以及视力模糊或扭曲。年龄相关性黄斑变性(AMD)是美国视力损害的主要原因，并且对于65岁以上的人来说，其为高加索人(Caucasians)法定失明的主要原因。大约有180万名40岁以上的美国人患有晚期AMD，且另有730万患有中度AMD的人有视力丧失的巨大风险。政府估计，到2020年，将有290万人患有晚期AMD。AMD的受害者经常惊讶和沮丧地发现，对这种致盲性病症的病因和治疗知之甚少。

黄斑变性有两种形式：干性黄斑变性和湿性黄斑变性。在85％的黄斑变性病例中，诊断为黄斑细胞逐渐开始分解的干性形式。两只眼睛通常都受干性AMD的影响，尽管一只眼睛可失去视力，而另一只眼睛不受影响。玻璃疣是视网膜下的黄色沉积物，其为干性AMD的常见早期体征。随着玻璃疣数量或大小的增加，发展成晚期干性AMD或湿性AMD的风险增加。干性AMD可能会发展并引起视力丧失，而不会转变为疾病的湿性形式；但是，早期干性AMD也可能突然变为湿性形式。

湿性形式虽然仅占病例的15％，但会导致90％的失明，并且被认为是晚期AMD(没有湿性AMD的早期或中期)。湿性AMD之前通常是疾病的干性形式。随着干性形式恶化，一些人开始在黄斑后部具有异常血管生长。这些血管非常脆弱，并且会渗漏液体和血液(因此是“湿性”黄斑变性)，对黄斑造成快速损伤。

AMD的干性形式最初通常引起轻微视力模糊。尤其是视力中心可能会变得模糊，并且随着疾病进展，这个区域会变大。如果仅一只眼睛受到影响，则可能不会出现任何症状。在湿性AMD中，直线可能会看起来是波浪状的，并且中心视力丧失会迅速发生。

黄斑变性的诊断通常包括散瞳检查、视觉敏感度测试以及使用称作眼底检查的程序对眼后进行观察以帮助诊断AMD，并且——如果怀疑是湿性AMD——也可以进行荧光素血管造影术。如果干性AMD达到晚期，目前没有预防视力丧失的治疗方法。但是，抗氧化剂和锌的特定高剂量配方可延迟或阻止中期AMD发展为晚期阶段。

(哌加他尼钠注射液)、激光光凝和光动力疗法可以控制黄斑中异常血管生长和出血，这对某些患有湿性AMD的患者有帮助；但是，这些技术无法恢复已丧失的视力。如果视力已丧失，则存在可以帮助改善生活质量的低视力辅助设备。

年龄相关性黄斑变性(AMD)的最早表现之一是在视网膜色素上皮(RPE)的基底层和布鲁赫膜(BM)之间积累了称为玻璃疣的细胞外沉积物。由Anderson et al.进行的最近研究已证实玻璃疣含有淀粉样蛋白β。(Experimental Eye Research 78(2004)243-256)。

焦谷氨酸化的Aβ肽已被证明在阿尔茨海默病中Aβ肽的积累和斑块形成中起关键作用。由于它们的疏水势，已表明这些肽促进聚集和斑块形成。在神经元中表达AβN3pE-42的转基因小鼠模型中进一步表明，这种肽在体内具有神经毒性并导致神经元的丧失(Wirths et al.(2009)Acta Neuropatho/118,487-496)。

对Aβ肽的N-末端焦谷氨酸具有特异性的抗体被认为是有利的，因为它们仅对在N-末端携带焦谷氨酸的Aβ致病种类具有特异性，但不检测不带有N-末端焦谷氨酸的APP或其他Aβ种类。因此认为，与针对焦谷氨酸化变体的其他Aβ种类的抗体相比，通过使用本发明的抗体，会降低潜在的副作用诸如不可控制的脑部炎症的风险。

靶向AβN3pE肽的抗体是已知的(Acero et al(2009)J Neuroimmunol 213,39-46；Saido et al.(1996)Neuron 14,457-466；US 7,122,374以及WO 2012/136552)。

但是，需要对AβN3pE肽具有特异性的人源化和去免疫化抗体，所述抗体可以用于人类治疗并正面影响淀粉样变性，特别是在AβN3pE可能参与的疾病和病症中的认知，所述疾病和病症诸如临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征以及临床或临床前大脑淀粉样血管病。

本发明的抗体的亲本抗体为WO 2017/009459中公开的克隆#6变体，其具有轻链可变区，所述轻链可变区具有如下氨基酸序列：

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:1)，其在WO 2017/009459中作为SEQ ID NO：14公开；

并且

所述亲本抗体具有重链可变区，所述重链可变区具有如下氨基酸序列：

QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:49)；其在WO2017/009459中作为SEQ ID NO：27公开。

然而，利用如WO 2017/009459中所公开的所述克隆#6变体，不可能建立CMC生产。特别是，尽管进行了多次尝试，但在CHO-DG44细胞中仍无法建立稳定的细胞克隆，仅观察到所述克隆#6变体的弱瞬时表达(产生抗体量不足)，并且不能建立作为CMC生产的前提的稳定表达。

发明内容

因此，本发明的目的是提供具有改善的特性以克服现有技术抗体缺点的人源化和去免疫化抗体。

一般而言，本发明提供了新的方法和组合物，其包含高特异性且高效的抗体，包括嵌合抗体及其片段，包括部分或完全人源化抗体及其片段，具有特异性识别并结合多种β-淀粉样蛋白抗原(特别是AβN3pE肽)的特异性表位的能力，所述抗原可以以单聚体、二聚体、三聚体等或聚合体形式，以聚集体、纤维、纤丝的形式或以斑块的浓缩形式呈递至抗体。

本发明的目的特别是通过一种抗体或其功能变体解决，其中所述抗体的轻链的可变部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:1)，

并且

其中所述抗体的重链的可变部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：

QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSDGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:2)。

与WO 2017/009459中所公开的亲本抗体相比，重链的可变部分(SEQ ID NO：2)在位置K12V、S14P和N55D处含有三个突变。

出人意料的是，发现这三个点突变的引入产生人源化和去免疫化抗体，所述抗体能够以高产率进行CMC生产。用包含这三个点突变的本发明的抗体可在CHO-DG44细胞中建立抗体生产细胞系。与亲本抗体相比，进一步可在CHO-DG44中建立改善的瞬时表达，导致更高产率的包含K12V、S14P和N55D突变的本发明抗体，同时保持抗体的有利结合特性。最后，可以用包含K12V、S14P和N55D突变的本发明抗体建立具有高表达水平的稳定表达，从而能够进行CMC生产。

本发明提供了人源化和去免疫化抗体或其片段，其对AβN3pE可能参与的淀粉样变性的疾病和病症具有正面影响。

在另一实施方案中，本发明提供了与循环和组织中特别是大脑中的AβN3pE肽结合的抗体及其片段。本发明的抗体能够结合游离AβN3pE肽分子或甚至结合形式的AβN3pE肽。

因此，本发明进一步提供了改变在中枢神经系统诸如大脑和循环诸如血浆中的可溶性和结合形式的AβN3pE肽的清除的抗体。

在另一实施方案中，本发明提供了抗体及其片段，其中所述抗体与携带焦谷氨酸的AβN3pE的N-末端特异性结合。

在另一实施方案中，本发明提供了抗体及其片段，其中所述抗体显示出对Aβ肽的寡聚物和/或原纤维的选择性增加。与现有技术中已知的可比单克隆抗体相比，特别是与WO2017/009459中所公开的亲本抗体相比，本发明的抗体显示出与Aβ(1-42)的寡聚物和/或原纤维的结合低了非常多如低10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、250倍或超过250倍的结合常数(K_D值)。因此，本发明的抗体，被建立以选择性结合AβN3pE肽，对AβN3pE肽更具特异性，并显示出与除AβN3pE以外的Aβ肽的降低的交叉反应性。

在另一实施方案中，本发明还涉及用载体转化或整合了表达本发明抗体或其片段的核酸分子的宿主细胞。

此外，本发明提供了包含本发明的抗体及其片段的药物组合物。

本发明进一步涉及本发明的抗体及其片段用于结合和清除或去除人中AβN3pE，从而用于诊断、预防和治疗特征在于淀粉样变性或AβN3pE毒性的疾病和病症的用途。

在一具体实施方案中，本发明的能够结合并清除或去除生物液体和组织中的AβN3pE肽的抗体可用于预防和/或治疗与含AβN3pE的斑块形成相关的病症，诸如脑中的弥散性、神经炎性和脑血管斑块。

施用本发明的抗体，包括其免疫学反应性片段，可导致从上述斑块或其他生物复合物中清除或去除AβN3pE。因此，本发明的抗体将很容易在循环中、其他体液中运输，并运输至形成上述斑块和/或其他生物复合物的位点或AβN3pE表现出破坏作用的其他位点。

另外，通过用本发明的抗体从斑块或其他生物复合物中去除AβN3pE，可导致不溶形式斑块溶解，并因此使得从受影响组织诸如脑组织中去除完整斑块。反过来，这可使诊断患有神经变性疾病的患者的认知改善，所述神经变性疾病诸如轻度认知损害(MCI)、阿尔茨海默病(AD)例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默痴呆症(FAD)如家族性英国型痴呆症(FBD)和家族性丹麦型痴呆症(FDD)、唐氏综合症中的神经变性、路易体痴呆、遗传性脑出血伴淀粉样变性(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆复征。特别是，本发明提供了用于治疗选自前驱期AD、轻度AD、中度AD和重度AD的病症的本发明的抗体。在另一实施方案中，本发明提供了本发明的抗体用于减缓诊断为患有选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合症、以及临床或临床前脑淀粉样血管病的病症的患者的认知衰退。

本发明的抗体与循环或其他体液中AβN3pE的结合可进一步去除循环或可溶形式的AβN3pE。如上所讨论的，AβN3pE表现出高疏水性，并且对其他例如非焦谷氨酸化的Aβ肽具有高亲和力，这导致寡聚和超分子结构诸如淀粉样蛋白斑块的形成。已显示出特别是这些寡聚结构是高度神经毒性的。寡聚结构的形成导致细胞损伤和神经元细胞死亡。因此，去除循环或可溶形式的AβN3pE或甚至包含AβN3pE的寡聚物可防止细胞损伤和/或神经毒性。因此，本发明还提供了预防神经变性疾病的方法，所述神经变性疾病诸如轻度认知损害(MCI)、阿尔茨海默病(AD)例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默痴呆症(FAD)如家族性英国型痴呆症(FBD)和家族性丹麦型痴呆症(FDD)或其它、唐氏综合症中的神经变性、路易体痴呆、遗传性脑出血伴淀粉样变性(荷兰型)、关岛帕金森-痴呆复征。特别是，本发明提供了用于治疗选自前驱期AD、轻度AD、中度AD和重度AD的病症的方法。在另一实施方案中，本发明提供了一种减缓诊断患有选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征以及临床或临床前大脑淀粉样血管病的病症的患者的认知衰退的方法。

本发明进一步提供了预防和/或治疗基于淀粉样蛋白特别是AβN3pE或与之相关的其他疾病的方法，所述疾病诸如进行性核上性麻痹、多发性硬化、克雅氏病、帕金森氏病、HIV相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、与成年型糖尿病相关的痴呆；老年性心脏淀粉样变性等，包括黄斑变性。

本发明还提供了一种高度灵敏且同时稳健的检测技术，其允许定量测定生物样品例如液体或血清样品优选血清样品或组织样品中的Aβ变体，特别是AβN3pE。考虑到血液中这些AβN3pE肽的丰度低，这是一个巨大的挑战。但是，拥有这种检测技术是在药物筛选和药物开发程序中研究小分子抑制剂的功效的先决条件。

通过本发明的教导而得到的抗体特别适用于淀粉样变性的诊断，淀粉样变性为一组与淀粉样斑块形成相关的疾病和病症，包括继发性淀粉样变性和年龄有关淀粉样变性，包括但不限于，神经性疾病诸如阿尔茨海默病(AD)、路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉样变性(荷兰型)、关岛帕金森-痴呆复征、以及其他基于淀粉样蛋白或与之相关的疾病，诸如进行性核上性麻痹、多发性硬化；克雅氏病、遗传性脑出血伴淀粉样变性荷兰型、帕金森氏病、HIV相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、与成年型糖尿病相关的痴呆、老年性心脏淀粉样变性等，包括黄斑变性，等等。

附图说明

图1显示了重链中的点突变对本发明抗体的各个变体的瞬时表达(A)和靶标结合(B)的影响。所有测试的抗体均含有SEQ ID NO.1的轻链可变部分和重链中的K324A突变。

Ab 1：与亲本序列SEQ ID NO：49相比，在重链的可变部分中含有两个突变K12V和S14P；

Ab 2：与亲本序列SEQ ID NO：49相比，重链的可变部分中含有突变N55D；

Ab 3：代表没有任何突变的重链可变部分的亲本序列SEQ ID NO：49。

图2显示了重链中的点突变对本发明抗体的各个变体的瞬时表达(A)和靶标结合(B)的影响。所有测试的抗体均包含SEQ ID NO.1的轻链可变部分和重链中的K324A突变。

Ab 2：与亲本序列SEQ ID NO：49相比，在重链的可变部分中含有突变N55D；

Ab 3：与亲本序列SEQ ID NO：49相比，在重链的可变部分中含有三个突变K12V、S14P和N55D。

图3显示了在从96孔板挑取的菌落中接种24孔板的孔后7、10和13天，表达抗体的CHO-DG44克隆，所述抗体具有SEQ ID NO：1的轻链可变部分和SEQ ID NO：2的重链可变部分。

图4显示通过MTX暴露(7天)进行基因扩增后CHO-DG44表达效价。

具体实施方式

定义

术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性即可。例如，抗体可为IgM、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgD、IgA或IgE。然而，优选地，抗体不是IgM抗体。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段：双特异抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可少量存在的可能地天然发生的突变以外，包含所述群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高特异性的，针对单一抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的“多克隆抗体”制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体通常可以是有利的，因为它们是由杂交瘤培养物合成的，不受其他免疫球蛋白污染。“单克隆”表示抗体的特性从基本上均质的抗体群体获得的，而不应解释为要求通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过首先由

et al.,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过众所周知的重组DNA方法来制备。“单克隆抗体”还可例如使用Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中所述的技术从噬菌体抗体文库中分离。

本文的单克隆抗体具体包括嵌合抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们表现出所需的生物学活性即可。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合亚序列)，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。对于最大部分，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者的互补决定区(CDR)中的残基被来自非人类物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的具有所需特异性、亲和力和能力的CDR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人类残基置换。此外，人源化抗体可包含既不在受者抗体又不在输入的CDR或框架序列中发现的残基。

进行这些修饰是为了进一步完善和优化抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、通常两个可变域，其中全部或基本上全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些区，而全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。关于进一步的细节，参见Jones et al.,Nature,321:522-525(1986),Reichmann et al,Nature.332:323-329(1988):和Presta,Curr.Op.Struct.Biel.,2:593-596(1992)。

除“人源化”外，“去免疫化”包括其他变化，诸如去除T细胞表位。

如本文和所附权利要求书中所用，术语“治疗有效量”是指所施用的抗体的量足以实现预期目的，例如，在这种情况下，至少去除循环或可溶形式的焦谷氨酸化淀粉样蛋白β(AβN3pE)肽及其变体，但优选从斑块或其他生物复合物中清除或去除AβN3pE肽。或更优选地，减少斑块负荷和/或从受影响的组织诸如脑组织中去除完整的斑块。

“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，其使sFv能够形成抗原结合所需的结构。有关sFv的综述参见Plückthun in The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。

术语“双特异抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含重链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域与同一条多肽链(V_H–V_D)中的轻链可变结构域(VD)连接。通过使用太短以至于不允许同一条链上两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。双特异抗体更全面地描述于Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sol.USA,90:6444-6448(1993)。

“分离的”抗体是已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染物成分是会干扰抗体诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素和其他蛋白质的或非蛋白质的溶质。在优选的实施方案中，抗体将被纯化(1)至如通过Lowry方法测定的，大于以抗体的95重量％，并且最优选大于99重量％，(2)至使用旋转杯测序仪足以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)达到在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染的SDS-PAGE的均质。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为不会存在所述抗体天然环境的至少一种组分。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。

如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类名称均包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞以及由其衍生的培养物，而不考虑转移次数。还应理解，由于故意或无意的突变，所有后代的DNA含量可能不完全相同。包括具有与原始转化的细胞中筛选的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变后代。当意图区分命名时，从上下文可以清楚地看出。

如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可相互替换，并且定义为表示由通过肽键连接的氨基酸组成的生物分子。

如果在本文中提及肽或氨基酸序列，则根据以下常规列表，每个氨基酸残基均由对应于所述氨基酸俗名的单字母或三字母标号表示：

除非上下文不适当，否则本文所使用的术语“一个”、“一种”和“所述”被定义为表示“一或多”并且包括复数。

语言“由淀粉样蛋白或淀粉样蛋白质引起或与之相关的疾病和病症”包括但不限于由处于单体状态、原纤维状态或聚合状态或这三者的任意组合的淀粉样蛋白质的存在或活性所引起的疾病和病症。此类疾病和病症包括但不限于淀粉样变性、内分泌肿瘤和黄斑变性。

术语“淀粉样变性”是指一组与淀粉样斑块形成相关的疾病和障碍，包括但不限于，继发性淀粉样变性和年龄有关淀粉样变性诸如包括但不限于以下的疾病：神经疾病诸如阿尔茨海默病(AD)，包括以认知记忆能力丧失为特征的疾病或病症，诸如例如轻度认知损害(MCI)、散发性阿尔茨海默病、路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉样变性(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆复征，家族形式的阿尔茨海默病如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)；以及其他基于淀粉样蛋白质或与之相关的疾病，诸如进行性核上性麻痹、多发性硬化；克雅氏病、帕金森氏病、HIV相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、包涵体肌炎(IBM)、成年型糖尿病和老年性心脏淀粉样变性；以及各种眼病，包括黄斑变性，玻璃疣相关视神经病变和β-淀粉样蛋白沉积引起的白内障。

“淀粉样蛋白β、Aβ或β-淀粉样蛋白”是本领域公认的术语，并且是指淀粉样β蛋白和肽、淀粉样蛋白β前体蛋白(APP)及其修饰、片段和任何其功能等价物。特别地，本文所用的淀粉样蛋白β是指通过APP的蛋白水解切割产生的任何片段，但尤其是涉及淀粉样蛋白病理学或与之相关的那些片段，包括但不限于Aβ_1-38、Aβ_1-40、Aβ_1-42。这些Aβ肽的氨基酸序列如下：

Aβ1-42(SEQ ID NO.37)：

Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala

Aβ1-40(SEQ ID NO.38)：

Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val

Aβ1-38(SEQ ID NO.39)：

Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly

“pGlu-Aβ”或“AβN3pE”是指Aβ的N-末端截短形式，其始于Aβ氨基酸序列中第3位的谷氨酸残基，并且其中所述谷氨酸残基被环化形成焦谷氨酸残基。特别地，本文所用的pGlu-Aβ或AβN3pE是指涉及淀粉样蛋白病理学或与之相关的那些片段，包括但不限于pGlu-Aβ_3-38、pGlu-Aβ_3-40、p-Glu-Aβ_3-42。

Aβ的N-末端截短形式Aβ_3-38、Aβ_3-40、Aβ_3-42的序列如下：

Aβ_3-42(SEQ ID NO.40)：

Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala

Aβ3-40(SEQ ID NO.41)：

Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val

Aβ3-38(SEQ ID NO.42)：

Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly

本发明涉及对人Aβ肽具有特异性的抗体，所述Aβ肽通过切割或释放N-末端的1和2位氨基酸而在N-末端被截短，并且其中如此暴露的N-末端3位氨基酸通过焦谷氨酸形成而修饰，因此在N-末端的3位携带焦谷氨酸残基(进一步称为AβN3pE肽或N3pE-Aβ肽或焦谷氨酸化Aβ肽)。

在第一方面，本发明涉及一种抗体，其中所述抗体的轻链的可变部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：

并且

QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSDGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:2)

在本发明的一个优选实施方案中，具有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的所述抗体的轻链可变部分的抗体包含轻链中的以下CDR区：

V_L CDR1：SSQSLLYSDGKTYLN(SEQ ID NO:3)；

V_L CDR2：LVSKLDS(SEQ ID NO:4)；以及

V_L CDR3：VQGTHFP(SEQ ID NO:5)。

在本发明另一优选实施方案中，具有包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的所述抗体的重链的可变部分的抗体包含重链中的以下CDR区：

V_H CDR1：GYSFTGHTMN(SEQ ID NO:6)；

V_H CDR2：LINPSDGVTRYNQKFQG(SEQ ID NO:7)；以及

V_H CDR3：EAKREWDETY(SEQ ID NO:8)。

本发明进一步提供了本发明的抗体的轻链和重链。

在一个优选实施方案中，本发明的抗体具有轻链，其中所述轻链包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:17)。

在进一步的优选实施方案中，本发明的抗体具有重链，其中所述重链包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：

QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSDGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:19)。

C1q和两个丝氨酸蛋白酶C1r和C1s形成复合物C1，其为补体依赖性细胞毒性(CDC)途径的第一组分。C1q是六价分子，分子量约为460000，且结构类似于郁金香花束，其中六个胶原蛋白“茎”连接到六个球状头部区域(Burton and Woof,Advances in Immunol 51:1-84；1992)。IgG1分子与C1q的结合启动补体激活，随后导致补体介导的细胞裂解。本发明的抗体应用于治疗炎性疾病和病症，即本发明的抗体将具有抗炎性质。

本发明的抗体的效应子功能也可以通过抗体的Fc区与Fc受体(FcR，其为造血细胞上的特化细胞表面受体)的相互作用来介导。Fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且已显示其介导以下二者：通过免疫复合物的吞噬作用去除抗体包被的病原体，及通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)裂解相应抗体包被的红细胞和多种其他细胞靶标(例如肿瘤细胞)(Van de Winkel and Anderson,J.Leuk.Bioi.49:511-24；1991)。

因此，本发明进一步提供了仍与Fc受体结合以实现其效应子功能的抗体。但是，优选地，本发明的抗体不显示补体依赖的细胞毒性。更优选地，本发明的抗体不激活补体系统，而是抑制补体介导的细胞裂解。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明的抗体具有人IgG Fc区，其包含一个或多个氨基酸取代，优选3或2个氨基酸的取代，最优选1个氨基酸的取代。氨基酸取代可以通过常规方法实现，例如本发明抗体的人IgG1 Fc区的定点诱变。

在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体具有人IgG Fc区，其在SEQ ID NO：18所示的324位包含一个氨基酸取代[324位对应于根据EU编号方案的322位，Kabat et al.,Sequences of Proteins of lmmunological lnterest,5th Ed.,US Department ofHealth and Human Services,NIH Publication No.91-3242,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)；Edelman et al.,PNAS USA 63:78-85(1969)]。所述氨基酸取代优选为K324A。

在最优选的实施方案中，本发明的抗体具有重链，其包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：

QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSDGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:18)。

进一步根据本发明，优选包含以下轻链和重链的可变部分以及轻链和重链的组合、基本上由以下轻链和重链的可变部分以及轻链和重链的组合组成或由以下轻链和重链的可变部分以及轻链和重链的组合组成的抗体：

A)轻链可变部分：SEQ ID NO：1

重链可变部分：SEQ ID NO：2

轻链：SEQ ID NO：17

重链：SEQ ID NO: 19

B)轻链可变部分：SEQ ID NO：1

重链可变部分：SEQ ID NO：2

轻链：SEQ ID NO：17

重链：SEQ ID NO: 18

根据B)的抗体是最优选的。所述重链含有K324A氨基酸交换。

根据本发明的优选抗体是由描述于WO 2010/009987的杂交瘤细胞系Aβ6-1-6(保藏号DSM ACC 2924)产生的单克隆小鼠抗体的人源化形式。

本发明抗体的轻链和重链的序列可以变化。免疫球蛋白可以具有两对轻链/重链复合物，至少一条链包含一个或多个功能上连接至人框架区区段的小鼠互补决定区(CDR)。

在一个优选实施方案中，本发明的抗体包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：17，并且每条重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19。

更优选地，本发明的抗体包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：17，并且每条重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：19。

最优选地，本发明的抗体包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：17，并且每条重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：18。

在另一个实施方案中，本发明涉及重组核酸分子，其编码本发明的包含本文所述的重链CDR和轻链CDR的抗体。

通过将提供CDR的非人免疫球蛋白的框架或可变区氨基酸序列与包含人免疫球蛋白可变区的序列组合中的相应序列进行对比来确定本发明抗体的人框架区。选择具有高百分比的相同氨基酸的序列。

在本发明的一个优选实施方案中，具有根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的轻链的可变部分由包含以下核酸序列、基本上由以下核酸序列组成或由以下核酸序列组成的核酸分子编码：

gacgtggtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccttggacagccggcctccatctcctgcaagtcaagtcagagcctcctgcactccgacggcaagacctacttgaactggttccagcagaggccaggccagtctccaaggcgcctgacctatctggtgtctaagctggactctggggtcccagacagattcagcggcagtgggtcaggcactgacttcacactgaagatcagcagggtggaggctgaggatgtcggagtctactactgcgtgcaaggtacacacttcccattcacgttcggcggagggaccaaggtggaaatcaaa(SEQ ID NO:9)。

在本发明的进一步优选实施方案中，具有根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链的可变部分由包含以下核酸序列、基本上由以下核酸序列组成或由以下核酸序列组成的核酸分子编码：

caggtgcagctcgtgcagtctggggctgaggtggtgaagccaggtgcctcagtgaaggtctcctgcaaggcatctggttactcattcactggtcacaccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggactcatcaatccttccgatggtgttactaggtacaaccagaagttccagggcagagtcaccatcaccagggacacgtccacgaccaccgttcacatggagctgaccagcctgacatctgaggacacggccacctactactgtacgagagaggcgaaacgggagtgggacgagacttactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca(SEQ ID NO:10)。

在本发明的进一步优选实施方案中，本发明的抗体的轻链的CDR区由具有以下核酸序列的核酸分子编码：

V_L CDR1：tcaagtcagagcctcctgcactccgacggcaagacctacttgaac(SEQ ID NO:11)；

V_L CDR2：ctggtgtctaagctggactct(SEQ ID NO:12)；以及

V_L CDR3：gtgcaaggtacacacttccca(SEQ ID NO:13)。

在本发明的进一步优选实施方案中，本发明的抗体的重链的CDR区由具有以下核酸序列的核酸分子编码：

V_H CDR1：ggttactcattcactggtcacaccatgaac(SEQ ID NO:14)；

V_H CDR2：ctcatcaatccttccgatggtgttactaggtacaaccagaagttccagggc(SEQ IDNO:15)；以及

V_H CDR3：gaggcgaaacgggagtgggacgagacttac(SEQ ID NO:16)。

在本发明的进一步优选实施方案中，轻链由包含以下核酸序列、基本上由以下核酸序列组成或由以下核酸序列组成的核酸分子编码：

gacgtggtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccttggacagccggcctccatctcctgcaagtcaagtcagagcctcctgcactccgacggcaagacctacttgaactggttccagcagaggccaggccagtctccaaggcgcctgacctatctggtgtctaagctggactctggggtcccagacagattcagcggcagtgggtcaggcactgacttcacactgaagatcagcagggtggaggctgaggatgtcggagtctactactgcgtgcaaggtacacacttcccattcacgttcggcggagggaccaaggtggaaatcaaaaggaccgtggccgcaccctctgtgttcatcttcccccccagcgacgagcagctgaagagcggcactgcatctgtcgtgtgtctgctgaacaacttctacccaagggaggcgaaagtgcagtggaaggtagacaacgccttgcaatccggcaactcccaggagagcgtgaccgagcaggacagcaaagactcaacctacagcctgagcagtactttgaccctgtctaaggccgattacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaggtaacccaccagggactgagctctcccgtgaccaagagcttcaacaggggcgagtgc(SEQ ID NO:20)。

在本发明的进一步优选实施方案中，重链由包含以下核酸序列、基本上由以下核酸序列组成或由以下核酸序列组成的核酸分子编码：

caggtgcagctcgtgcagtctggggctgaggtggtgaagccaggtgcctcagtgaaggtctcctgcaaggcatctggttactcattcactggtcacaccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggactcatcaatccttccgatggtgttactaggtacaaccagaagttccagggcagagtcaccatcaccagggacacgtccacgaccaccgttcacatggagctgaccagcctgacatctgaggacacggccacctactactgtacgagagaggcgaaacgggagtgggacgagacttactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagccagcactaagggcccgagcgtgttccccctcgcccctagcagtaagagcaccagcggtggcacggcggcacttggctgcttggttaaggactacttcccagagcccgtgaccgtgtcctggaactctggggcacttaccagtggcgtgcacaccttccccgctgtactgcagagcagcggcttgtacagcttgtcttccgtcgtaacggtgcccagcagcagcttgggaacccagacctacatctgcaacgtaaaccacaagccatccaacaccaaggtagacaaaaaggtcgaacccaagtcctgcgacaagacccacacctgtccaccctgtcctgcacccgagctcctgggaggtcccagcgttttcctgttccctccaaagccaaaggataccctgatgatcagcaggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgttgatggggtggaggtacacaatgccaagaccaaacctcgagaggagcaatacaacagcacctaccgagttgtgagcgtgcttaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcgctgtgagcaacaaggctctgccggctcccatcgagaagaccatcagcaaggccaagggccagcccagggagccacaggtttacacgttgcccccctcaagggacgagttgaccaagaaccaggtttccctcacgtgccttgtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggaatgggagagcaacgggcagcccgagaacaactacaagacgaccccccctgttctggacagcgacggctctttcttcctgtattcaaagctcaccgtggacaaaagcaggtggcagcagggtaatgtgttctcctgcagcgtgatgcacgaggccctgcataaccactacacccaaaagagcttgagcctctcccccggtaag(SEQ ID NO:21)。

caggtgcagctcgtgcagtctggggctgaggtggtgaagccaggtgcctcagtgaaggtctcctgcaaggcatctggttactcattcactggtcacaccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggactcatcaatccttccgatggtgttactaggtacaaccagaagttccagggcagagtcaccatcaccagggacacgtccacgaccaccgttcacatggagctgaccagcctgacatctgaggacacggccacctactactgtacgagagaggcgaaacgggagtgggacgagacttactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagccagcactaagggcccgagcgtgttccccctcgcccctagcagtaagagcaccagcggtggcacggcggcacttggctgcttggttaaggactacttcccagagcccgtgaccgtgtcctggaactctggggcacttaccagtggcgtgcacaccttccccgctgtactgcagagcagcggcttgtacagcttgtcttccgtcgtaacggtgcccagcagcagcttgggaacccagacctacatctgcaacgtaaaccacaagccatccaacaccaaggtagacaaaaaggtcgaacccaagtcctgcgacaagacccacacctgtccaccctgtcctgcacccgagctcctgggaggtcccagcgttttcctgttccctccaaagccaaaggataccctgatgatcagcaggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgttgatggggtggaggtacacaatgccaagaccaaacctcgagaggagcaatacaacagcacctaccgagttgtgagcgtgcttaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtgagcaacaaggctctgccggctcccatcgagaagaccatcagcaaggccaagggccagcccagggagccacaggtttacacgttgcccccctcaagggacgagttgaccaagaaccaggtttccctcacgtgccttgtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggaatgggagagcaacgggcagcccgagaacaactacaagacgaccccccctgttctggacagcgacggctctttcttcctgtattcaaagctcaccgtggacaaaagcaggtggcagcagggtaatgtgttctcctgcagcgtgatgcacgaggccctgcataaccactacacccaaaagagcttgagcctctcccccggtaag(SEQ ID NO:22)。

进一步根据本发明，抗体是优选的，其由核酸分子的组合编码，所述核酸分子包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：

C)轻链可变部分：SEQ ID NO：9

重链可变部分：SEQ ID NO:10

轻链：SEQ ID NO: 20

重链：SEQ ID NO: 22

D)轻链可变部分：SEQ ID NO：9

重链可变部分：SEQ ID NO:10

轻链：SEQ ID NO: 20

重链：SEQ ID NO: 21

组合D)是最优选的，因为其编码人源化和去免疫化抗体，所述抗体在重链中含有K324A氨基酸交换。

可以将上述核酸分子整合到本领域熟知的表达载体中。这些表达载体在合适宿主中的转染、宿主的选择以及轻链、重链、轻/重链二聚体或完整抗体、结合片段或其它免疫球蛋白形式的表达选择和纯化为本领域所熟知的方法。

本领域技术人员可以基于所需特性选择载体，例如，用于在特定细胞诸如哺乳动物细胞或细菌细胞中生产载体。

载体中可以包括多种诱导型启动子或增强子中的任一种，以表达本发明的抗体或可调节的核酸。这种诱导系统包括例如四环素诱导系统(Gossen&Bizard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992)；Gossen et al.,Science,268:17664769(1995)；Clontech,Palo Alto,Calif.)；重金属诱导的金属硫蛋白启动子；应答蜕皮激素或相关类固醇诸如幕黎甾酮(muristerone)的昆虫类固醇激素(No et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996)；Yao et al.,Nature,366:476-479(1993)；Invitrogen,Carlsbad,Calif.)；由类固醇诸如糖皮质激素和雌激素诱导的小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)(Lee et al.,Nature,294:228-232(1981)；以及温度变化诱导的热激启动子；大鼠神经元特异性烯醇化酶基因启动子(Forss-Petter,et al.,Neuron 5；197-197(1990))；人β-肌动蛋白基因启动子(Ray,et al.,Genes and Development(1991)5:2265-2273)；人血小板衍生生长因子B(PDGF-B)链基因启动子(Sasahara,et al.,Cell(1991)64:217-227)；大鼠钠通道基因启动子(Maue,et al.,Neuron(1990)4:223-231)；人铜-锌超氧化物歧化酶基因启动子(Ceballos-Picot,et al.,Brain Res.(1991)552:198-214)；以及哺乳动物POU-结构域调节基因家族成员的启动子(Xi et al.,(1989)Nature 340:35-42)。

调节元件，包括启动子或增强子，可以是组成型或受调节的，这取决于调节的性质。调节序列或调节元件可操作地连接至本发明的核酸分子序列之一，使得核酸分子序列与调节序列之间的物理和功能关系允许所述核酸分子序列转录。可用于在真核细胞中表达的载体可以包括，例如，调节元件，包括CAG启动子、SV40早期启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)类固醇诱导型启动子、Pgtf、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymarine leukemia virus，MMLV)启动子、thy-1启动子等。

如果需要，载体可以含有选择标记。如本文所用，“选择标记”是指为选择标记已经被引入其中的细胞提供可选择表型的遗传元件。选择标记通常是其基因产物提供对抑制细胞生长或杀死细胞的药剂的抗性的基因。多种选择标记可以用于本发明的DNA构建体，包括例如Neo、Hyg、hisD、Gpt和Ble基因，如例如在Ausubel et al.(Current Protocols inMolecular Biology(Supplement 47),John Wiley&Sons,New York(1999))和美国专利号5,981,830中所述。用于针对选择标记的存在进行选择的药物包括，例如用于Neo的G418、用于Hyg的潮霉素、用于hisD的组氨醇、用于Gpt的黄嘌呤以及用于Ble的博来霉素(参见Ausubel et al，同上，(1999)；美国专利号5,981,830)。本发明的DNA构建体可以整合阳性选择标记、阴性选择标记或两者(参见例如美国专利号5,981,830)。

也可以使用各种哺乳动物细胞培养系统来表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的实例包括猴肾成纤维细胞的COS-7系，如Gluzman,Cell,23:175(1981)所述。能够表达相容载体的其他细胞系包括，例如，C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体通常将包含复制起点，合适的启动子和增强子，以及任何必需的核糖体结合位点，聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列和5'侧翼非转录序列。衍生自SV40剪接和聚腺苷酸化位点的DNA序列可用于提供所需的非转录遗传元件。

多肽可以通过包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法和凝集素色谱法的方法从重组细胞培养物中回收和纯化。如果多肽在细胞表面表达，则可以促进回收，但这不是前提条件。也可能需要回收较长形式的多肽表达后被切割的切割产物。必要时，可以使用本领域已知的蛋白质重折叠步骤来完成成熟蛋白质的构型。高效液相色谱法(HPLC)可用于最终纯化步骤。

可以根据熟知的方法从多种人细胞中分离人恒定区DNA序列。

本发明特别涉及抗体，其特征在于它们以高亲和力结合AβN3pE肽。本发明还涉及抗体，其特征在于它们以高亲和力结合AβN3pE肽或其免疫活性片段。在本发明的上下文中，所述高亲和力是指KD值为10-5M、10-6M或10-7M或更佳，优选KD值为10-8M或更佳，甚至更优选KD值为10-9M–10-12M的亲和力。因此，本发明的抗体以比先前已知的抗体以更高的亲和力结合单体AβN3pE。

优选地，本发明的抗体在AβN3pE结合中的结合表位是在N-末端携带焦谷氨酸的表位。更优选地，本发明抗体的结合表位选自以下：

pEFRHDSGYEVHHQKLV(SEQ ID NO:23)，

pEFRHDSGYEVHHQKL(SEQ ID NO:24)，

pEFRHDSGYEVHHQK(SEQ ID NO:25)，

pEFRHDSGYEVHHQ(SEQ ID NO:26)，

pEFRHDSGYEVHH(SEQ ID NO:27)，

pEFRHDSGYEVH(SEQ ID NO:28)，

pEFRHDSGYEV(SEQ ID NO:29)，

pEFRHDSGYE(SEQ ID NO:30)，

pEFRHDSGY(SEQ ID NO:31)，

pEFRHDSG(SEQ ID NO:32)，

pEFRHDS(SEQ ID NO:33)，

pEFRHD(SEQ ID NO:34)

pEFRH(SEQ ID NO:35)以及

pEFR(SEQ ID NO:36)。

最优选地，本发明的抗体不与在N-末端不携带焦谷氨酸的结合表位结合。

甚至最优选地，当与前述和随后提及的结合表位结合时，本发明的抗体总是与在N-末端含有焦谷氨酸的序列或序列的一部分结合。本发明的抗体不与在N-末端不含有焦谷氨酸的序列或序列的一部分结合。

此外，本发明的抗体还可以结合AβN3pE变体。

在本发明的上下文中，AβN3pE变体特别为

pE-Aβ_3-38、

pE-Aβ_3-40、

pE-Aβ_3-42。

AβN3pE肽的其他变体为已显示由于阿尔茨海默病或先于阿尔茨海默病在大脑中积累的所有AβN3pE变体。这些是pE-Aβ_3-X肽，其中x定义为19至42之间的整数，例如在上述pE-Aβ_3-42中，“42”是“x”的整数。

在本发明的上下文中，本发明抗体的“功能变体”是保留结合能力，特别是与pE-Aβ_3-x肽具有高亲和力的结合能力的抗体。这种功能变体的提供在本领域中是已知的，并且涵盖上面所述的可能性，其在抗体及其片段的定义下指明。

在进一步的实施方案中，抗体是如上文所定义的抗体片段。

在进一步优选实施方案中，本发明的抗体是人源化和去免疫化抗体，其具有上述抗体的互补决定区(CDR)。优选地，抗体可以被标记；可能的标记是如上所述的那些，尤其是抗体的诊断用途领域技术人员已知的所有标记。

在另一实施方案中，抗体可以固定在固相上。

在另一实施方案中，根据本发明的和如前所述的抗体或其片段显示出对AβN3pE寡聚物、纤维、原纤维或纤丝的结合亲和力，其比对AβN3pE单体的结合亲和力高至少为2倍，特别地至少4倍，特别地至少10倍，特别地至少15倍，更特别地至少20倍，但尤其至少25倍。

在又一实施方案中，如前所述，提供了抗体或其片段，其在哺乳动物特别是人脑中基本上结合含有AβN3pE的聚集的Aβ(包括Aβ斑块)，但是，优选地，不显示与淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的任何明显的交叉反应性。

在本发明的另一方面，如前所述，提供了抗体或其片段，其在哺乳动物特别是人脑中基本上结合寡聚和多聚淀粉样蛋白(其含有AβN3pE)，特别是淀粉样蛋白β(Aβ)，但是，优选地，不显示与淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的任何明显的交叉反应性。

本发明还涉及包含所述抗体的组合物，以及所述组合物用于治疗淀粉样变性、特别是用于治疗哺乳动物特别是人的神经变性疾病的用途。所述神经变性疾病特别选自：轻度认知损害(MCI)、阿尔茨海默病(AD)例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默氏痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)、唐氏综合征中的神经变性。优选地，所述神经变性疾病为阿尔茨海默病。

因此，在一个优选实施方案中，本发明涉及一种治疗和/或预防在哺乳动物优选在人类中以形成包含AβN3pE的斑块为特征的病症的方法，所述方法包含向需要这种治疗的人施用、优选外周施用治疗或预防有效量的本发明的单克隆抗体或其免疫性反应片段，所述抗体特异性与在N-末端携带焦谷氨酸的AβN3pE肽的表位结合。

在另一实施方案中，本发明涉及抑制哺乳动物优选人类中淀粉样蛋白斑块形成并清除或去除淀粉样蛋白斑块的方法，所述方法包含向需要这种抑制作用的人类对象施用有效量的抗体，所述抗体结合循环、体液或组织特别是大脑中的AβN3pE，并进一步优选导致血浆和大脑中AβN3pE的清除。

因此，本发明还提供了在对象中逆转认知衰退、改善认知、治疗认知衰退和预防认知衰退的方法，所述对象被诊断患有轻度认知损害(MCI)、阿尔茨海默病(AD)例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默氏痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)、唐氏综合征中的神经变性和临床或临床前大脑淀粉样血管病、优选阿尔茨海默病，所述方法包含向所述对象施用有效量的本发明抗体。

本发明还提供了本发明的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防或逆转轻度认知损害(MCI)、阿尔茨海默病(AD)例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默氏痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)、唐氏综合征中的神经变性和临床或临床前大脑淀粉样血管病，优选阿尔茨海默病；或用于在对象中逆转认知衰退、改善认知、治疗认知衰退和预防认知衰退，所述对象被诊断患有轻度认知损害(MCI)、阿尔茨海默病(AD)例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默氏痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)、唐氏综合征中的神经变性和临床或临床前大脑淀粉样血管病，优选阿尔茨海默病。

本发明进一步提供了本文公开的抗体，用于预防、治疗或逆转轻度认知损害(MCI)，阿尔茨海默病(AD)例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默氏痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性和临床或临床前大脑淀粉样血管病，优选阿尔茨海默病的用途；用于在对象中治疗、预防或逆转认知衰退、改善认知、治疗认知衰退和预防认知衰退，所述对象被诊断患有轻度认知损害(MCI)，阿尔茨海默病(AD)例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默氏痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性和临床或临床前大脑淀粉样血管病，优选阿尔茨海默病；或用于在哺乳动物中优选在人类中抑制淀粉样蛋白斑块的形成或抑制AβN3pE作用。

在一具体实施方案中，本发明提供了一种通过向动物特别是哺乳动物或人类施用如上文所述的本发明的抗体、或包含根据本发明的抗体的药物组合物，用于保持或增加患有记忆障碍的哺乳动物特别是人类的认知记忆能力、但特别是用于恢复认知记忆能力的方法。

本发明进一步提供了评估人类对象对结合AβN3pE或其变体的抗体治疗的应答的方法，包含：

a)向所述对象施用本发明的抗体或其片段；以及

b)测量取自对象的生物样品中AβN3pE的浓度。

本发明还提供了用结合AβN3pE或其变体的抗体治疗人类对象的方法，包含：

a)向所述对象施用第一量的所述抗体或其片段；

b)在施用第一剂后3小时至两周内，测量取自对象的生物样品中AβN3pE的浓度；

c)必要时，基于步骤b)的结果计算抗体或其片段的第二量，所述第二量与第一量相同或不同；以及

d)施用第二量的所述抗体或片段。

本发明还包括一种在哺乳动物优选人类对象中评估与AβN3pE结合的抗体或其片段用于抑制或预防AβN3pE相关淀粉样蛋白斑块形成、用于减少含有AβN3pE的斑块的负荷、用于降低毒性AβN3pE及其变体的影响或用于治疗与含有AβN3pE的斑块相关的病症或疾病的功效的方法，包含：

a)从所述对象获得第一生物样品；

b)测量第一样品中AβN3pE的基线浓度；

c)向所述对象施用本发明的抗体或其片段；

d)在施用抗体或其片段后3小时至两周内，从对象获得第二生物样品；以及

e)测量第二生物样品中AβN3pE的浓度；其中，功效与在血液中与所述抗体结合的AβN3pE的量和与第一生物样品相比，第二生物样品中的AβN3pE的浓度有关，特别是其浓度的降低。

所述生物样品可为任何样品，例如来自人。在一个具体实例中，所述样品为组织样品、体液样品或细胞样品。在一个实施方案中，所述生物样品选自：血液、血清、尿液、脑脊液(CSF)、血浆、淋巴液、唾液、汗液、胸膜液、滑液、泪液、胆汁和胰腺分泌物。在进一步实施方案中，生物样品为血浆。在一优选实施方案中，生物样品为CSF。

生物样品可以以本领域技术人员熟知的方式从对象获得。特别地，可以从对象获得血液样品，并且可以通过常规方法将血液样品分离成血清和血浆。从其获得生物样品的对象优选为疑似患有淀粉样变性的疾病或病症，优选阿尔茨海默病，处于发展为阿尔茨海默病的风险中和/或处于任何其他种类痴呆的风险中或患有任何其他种类痴呆的对象。特别地，样品从疑似患有轻度认知损害(MCI)和/或处于阿尔茨海默病早期阶段的对象获得。

可以在阿尔茨海默病的现有动物模型中测试本发明的抗体在诊断、预防和/或治疗淀粉样变性，诸如轻度认知损害、阿尔茨海默病、家族性英国型痴呆或家族性丹麦型痴呆以及例如唐氏综合征中的神经变性中的功效。

合适的阿尔茨海默病动物模型在McGowan et al.TRENDS in Genetics,Vol.22,No.May 2006,pp 281-289中综述，并选自PDAPP、Tg2576、APP23、TgCRND8、PSEN_1M146V或PSEN_1M146L、PSAPP、APP_Dutch、BRI-Aβ40和BRI-Aβ42、JNPL3、Tau_P301S、Tau_V337M、Tau_R406W、rTg4510、H_tau、TAPP、3 x TgAD，如下所述。

PDAPP：具有强斑块病理(robust plaque pathology)的第一个突变APP转基因模型。小鼠表达具有Indiana突变的人APP cDNA(APP_V717F)。在半合子PDAPP小鼠中，斑块病理开始于6-9个月之间。有突触损失，但无明显的细胞损失，且未观察到NFT病理。所述模型已广泛用于疫苗接种治疗策略。

Tg2576：小鼠在仓鼠朊病毒启动子的控制下表达突变的APP_SWE。从9个月龄开始观察到斑块病理。这些小鼠具有认知缺陷，但无细胞损失或NFT病理。所述模型是阿尔茨海默病领域中使用最广泛的转基因模型之一。

APP23：小鼠在Thy1启动子的控制下表达突变的APP_SWE。从6个月龄开始观察到显著的脑血管淀粉样蛋白、淀粉样蛋白沉积，且一些海马神经元缺失与淀粉样蛋白斑块形成相关。

TgCRND8：小鼠表达多个APP突变(Swedish加Indiana)。认知缺陷与～3个月龄时快速的细胞外斑块发展相吻合。所述认知缺陷可以通过Aβ接种治疗来逆转。

PSEN_1M146V或PSEN_1M146L(分别为6.2和8.9系)：这些模型首次在体内证明了突变的PSEN1选择性升高Aβ42。未观察到明显的斑块病理。

PSAPP(Tg2576 x PSEN_1M146L，PSEN1-A246E+APP_SWE)：双转基因小鼠，与单转基因突变的APP小鼠相比，其添加了可显著加速淀粉样蛋白病理的突变体PSEN1转基因，证实PSEN1驱动的Aβ42升高增强了斑块病理。

APP_Dutch：小鼠表达具有Dutch突变的APP，所述突变会导致人类遗传性脑出血伴淀粉样变性-荷兰型。APP_Dutch小鼠发展为严重嗜刚果红淀粉样血管病。突变的PSEN1转基因的添加将淀粉样蛋白病理重新分布到实质中，表明Aβ40和Aβ42在血管和实质淀粉样蛋白病理中的作用不同。

BRI-Aβ40和BRI-Aβ42：小鼠表达单个Aβ异构体，无APP过表达。仅表达Aβ42的小鼠会形成老年斑和CAA，而BRI-Aβ40小鼠则不会形成斑块，表明Aβ42对于斑块形成至关重要。

JNPL3：小鼠表达具有P301L突变的4R0N MAPT。这是第一个具有明显缠结病理和细胞损失的转基因模型，表明单独的MAPT可以引起细胞损伤和损失。JNPL3小鼠会因脊髓中的严重病理和运动神经元缺失而随着年龄的增长而出现运动障碍。

Tau_P301S：表达具有P301S突变的4R MAPT的最短异构体的转基因小鼠。纯合子小鼠在5-6个月龄时出现严重下肢轻瘫，在大脑和脊髓中普遍存在神经原纤维病理以及脊髓中神经元缺失。

Tau_V337M：由血小板衍生生长因子(PDGF)的启动子驱动的具有V337M突变(1/10内源性MAPT)的4R MAPT的低水平合成。这些小鼠中神经原纤维病理学的发展表明，MAPT的性质而非绝对的MAPT细胞内浓度驱动病理。

Tau_R406W：在CAMKII启动子的控制下表达具有R406W突变的4R人MAPT的小鼠。小鼠从18个月龄开始就在前脑中形成MAPT包涵体，并具有损伤的联想记忆。

rTg4510：使用TET-off系统的可诱导MAPT转基因小鼠。从1个月龄开始发生异常MAPT病理。小鼠具有进行性NFT病理和严重的细胞损失。从2.5个月龄开始，认知缺陷明显。关闭转基因可改善认知能力，但NT病理恶化。

H_tau：仅表达人类基因组MAPT的转基因小鼠(小鼠MAPT敲除)。H_tau小鼠从6个月起就积累了高度磷酸化的MAPT，并在它们15个月龄时出现Thio-S阳性NFT。

TAPP(Tg2576 x JNPL3)：与JNPL3相比，TAPP小鼠的MAPT前脑病理增加，表明突变的APP和/或Aβ可以影响下游MAPT病理。

3xTgAD：在PSEN1_M146V“敲入”背景(PSNE1-KI)上表达突变APP_SWE、MAPT_P301L的三转基因模型。小鼠从6个月起出现斑块，从12个月大时开始发展MAPT病理，加强了APP或Aβ可以直接影响神经原纤维病理的假设。

此外，WO 2009/034158公开了非人转基因动物模型，其中转基因编码选自AβN3E-42、AβN3Q-42、AβN3E-40和AβN3Q-40的至少一种淀粉样蛋白β(Aβ)肽。这些Aβ肽是QC和QPCTL的底物，导致N-末端谷氨酰胺(Q)或谷氨酸(N)环化为焦谷氨酸(pGlu)。因此，这些转基因动物模型为研究pGlu-Aβ肽对神经变性发展过程的影响提供了模型系统。

抗AβpN3pE抗体还可用于AβpN3pE的诊断测定，例如，检测其在特定细胞、组织或血清中的存在。因此，根据本发明的抗体特别可用于检测淀粉样变性特别是神经变性疾病的诊断方法，所述神经变性疾病选自：轻度认知损害(MCI)、阿尔茨海默病(AD)例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默氏痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)、唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔茨海默病。

对于诊断应用，抗体通常标记有可检测部分。许多标记可用，这些标记通常可以分为以下几类：

(a)放射性同位素，诸如³⁵S、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I。抗体可以通过例如CurrentProtocols in Immunology,Volumes 1 and 2,Gütigen et al.,Ed.,Wiley-Interscience.New York,New York.Pubs.,(1991)中所述的技术用放射性同位素标记，并且放射性可以使用闪烁计数来测量。

(b)可以使用荧光标记，诸如稀土螯合物(铕螯合物)或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、丽丝胺、藻红蛋白和德克萨斯红。荧光标记可以通过例如上文的Current Protocols in Immunology中公开的技术与抗体缀合。荧光可以使用荧光计进行定量。

(c)可以使用各种酶-底物标记。酶通常催化显色底物的化学变化，其可以使用各种技术测量。例如，酶可催化底物的颜色变化，其可以用分光光度法测量。或者，酶可改变底物的荧光或化学发光。用于定量荧光变化的技术如上所述。化学发光底物通过化学反应变成被电子激发，然后可以发射可以被测量(例如使用化学发光计)的光或将能量提供给荧光受体。酶标记的实例包括萤光素酶(例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利号4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮类(2,3-dihydrophthalazinediones)、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、0-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。将酶与抗体缀合的技术描述于O'Sullivan et al.,Methods for the Preparation of Enzyme-AntibodyConjugates for use in Enzyme Immunoassay,in Methods in Enzym(ed Langone&H.VanVunakis),Academic Press,New York,73:147-166(1981)。

酶-底物组合的实例包括例如：

(i)辣根过氧化物酶(HRPO)与作为底物的过氧化氢酶，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；

(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为显色底物的对硝基苯磷酸盐；以及

(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与显色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形酮基-β-D-半乳糖苷酶(4-methylumbelliferyl-β-D-galactosidase)。

许多其它酶-底物组合对于本领域技术人员来说是可用的。

有时，标记与抗体间接缀合。本领域技术人员将知晓用于实现这一点的各种技术。例如，抗体可以与生物素缀合，并且上述三大类标记中的任一种可以与亲和素缀合，或反之亦然。生物素选择性地结合亲和素，因此，标记可以以这种间接方式与抗体缀合。或者，为了实现标记与抗体的间接缀合，抗体与小半抗原(例如地高辛)缀合，且上述不同类型标记中的一者与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)缀合。因此，可以实现标记与抗体的间接缀合。

本发明的抗体可用于任何已知的测定法，诸如竞争性结合测定法、直接和间接夹心测定法以及免疫沉淀测定法。Zola,Monoclonal Antibodies A Manual of Techniques,pp.147-158(CRC Press.Inc.,1987)。

竞争性结合测定法依赖于标记的标准物与测试样品分析物竞争结合有限量抗体的能力。测试样品中的AβN3pE的量与结合至抗体的标准物的量成反比。为了便于测定结合的标准物的量，通常在竞争之前或之后使抗体不溶解，使得与抗体结合的标准物和分析物可方便地与保持未结合的标准物和分析物分离。

夹心测定法涉及使用两种抗体，每种抗体能够结合待检测蛋白质的不同免疫原性部分或表位。在夹心测定法中，测试样品分析物与固定在固体支持物上的第一抗体结合，之后第二抗体与分析物结合，从而形成不溶的三部分复合物。第二抗体本身可用可检测部分标记(直接夹心测定法)或可通过用可检测部分标记的抗免疫球蛋白抗体进行测量(间接夹心测定法)。例如，夹心测定法一种优选类型为ELISA测定法，在这种情况下，可检测部分是酶。

对于免疫组织化学，组织样品可为新鲜的或冷冻的，或者可包埋在石蜡中并用例如诸如福尔马林的防腐剂固定。

本发明还涉及一种包含如上定义的抗体的组合物，其中所述组合物为用于诊断用途的组合物，特别是用于诊断选自以下的神经变性疾病；特别是通过检测生物样品中的AβN3pE或其变体进行：轻度认知损害(MCI)、阿尔茨海默病(AD)例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默氏痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)、唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔茨海默病。

诊断试剂盒

为方便起见，本发明的抗体可以在试剂盒中提供，所述试剂盒即预定量的试剂与用于进行诊断测定的说明书的包装组合。当抗体用酶标记时，试剂盒将包括酶所需的底物和辅因子(例如，提供可检测发色团或荧光团的底物前体)。此外，可包括其它添加剂，诸如稳定剂、缓冲剂(例如封闭缓冲剂或裂解缓冲剂)等。各种试剂的相对量可广泛变化以在试剂的溶液中提供一定浓度，所述浓度充分地优化测定的灵敏度。特别地，试剂可作为干粉形式提供，通常是冻干的，其包括在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。

根据本发明的诊断试剂盒可含有如下所述的其他生物活性物质。特别优选用于诊断试剂盒中的所述其他生物活性物质为谷氨酰胺酰基环化酶的抑制剂。

本发明的诊断试剂盒特别可用于淀粉样蛋白相关疾病和病症(特别是神经变性疾病)的检测和诊断，特别是用于诊断选自以下的神经变性疾病：轻度认知损害(MCI)、阿尔茨海默病(AD)例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默氏痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)、唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔茨海默病。

本发明还涉及本发明的抗体或包含所述抗体的组合物，两者均如上文定义，其用于体外诊断方法。特别地，所述诊断方法涉及选自以下的神经变性疾病的诊断：轻度认知损害(MCI)、阿尔茨海默病(AD)例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默氏痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)、唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔茨海默病；特别是通过检测生物样品中的AβN3pE或其变体进行。

在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及以下方法：

用于诊断淀粉样蛋白相关疾病或病症、优选阿尔茨海默病的体外或原位诊断方法，其包含以下步骤：

使根据本发明的抗体与样品接触，所述样品优选选自血清、液体或CSF样品，最优选血清样品；或与疑似患有所述病症或疾病的对象的特定身体部分或身体区域接触，以及

检测抗体与来自所述样品的AβN3pE的结合。

更具体地，本发明涉及一种诊断淀粉样蛋白相关疾病或病症、优选阿尔茨海默病的方法，包含在样品中或原位检测本发明的抗体或其免疫活性片段与AβN3pE的免疫特异性结合，其包括以下步骤：

(a)使疑似含有淀粉样蛋白的样品或特定身体部分或身体区域与本发明的抗体或其片段接触；

(b)使所述抗体和/或其功能部分与AβN3pE结合，形成免疫复合物；

(c)检测免疫复合物的形成；以及

(d)将免疫复合物的存在或不存在与样品或特定身体部分或区域中AβN3pE的存在或不存在相关联。

还包含一种测定组织和/或体液中淀粉样斑块(amyloidogenic plaque)负载的程度的方法，其包含：

(a)获得代表所研究的组织和/或体液的样品；

(b)用根据本发明的抗体或嵌合抗体或其片段来测试所述样品中淀粉样蛋白的存在；

(c)测定与蛋白质结合的抗体的量；以及

(d)计算组织和/或体液中的斑块负载。

特别地，本发明涉及一种测定组织和/或体液中淀粉样斑块负载的程度的方法，其中测定步骤c)中免疫复合物的形成，使得免疫复合物的存在或不存在与淀粉样蛋白特别是AβN3pE的存在或不存在相关。

在另一实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含根据本发明的抗体、或嵌合抗体或其片段，并且如本文之前所述，包括任何功能上等价的抗体或其任何衍生物或功能部分，特别是作为药物组合物的组合物任选地进一步包含药学上可接受的载体。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含治疗有效量的本发明抗体。

本发明还包含一种混合物，其包含治疗有效量的本发明的抗体、或嵌合抗体或其片段，并且如本文之前所述，包括任何功能上等价的抗体或其任何衍生物或功能部分，以及任选地，其他生物活性物质和/或药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。

特别地，本发明涉及一种混合物，其中其他生物活性物质是在淀粉样变性药物治疗中使用的化合物，淀粉样变性是一组与淀粉样蛋白或淀粉样蛋白质相关的疾病和病症，诸如AβN3pE有关的神经变性疾病，所述神经变性疾病选自：轻度认知损害(MCI)、阿尔茨海默病(AD)例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默氏痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔茨海默病。

在本发明的另一实施方案中，其它生物活性物质或化合物还可为可用于治疗由AβN3pE引起的淀粉样变性或可用于药物治疗其它神经障碍的治疗剂。

其它生物活性物质或化合物可通过与根据本发明的抗体相同或相似的机制或通过不相关的作用机制或通过多种相关和/或不相关的作用机制发挥其生物效应。

通常，其它生物活性化合物可包括神经元传递增强剂(neuron-transmissionenhancer)、精神病治疗药物、乙酰胆碱酯酶抑制剂、钙通道阻断剂、生物胺、苯二氮卓类镇静剂、乙酰胆碱合成、储存或释放增强剂、乙酰胆碱突触后受体激动剂、单胺氧化酶-A或-B抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸谷氨酸受体拮抗剂、非甾体抗炎药、抗氧化剂以及5-羟色胺能受体拮抗剂。

更特别地，本发明涉及一种混合物，其包含至少一种选自以下的化合物：有效抗氧化应激的化合物、抗凋亡化合物、金属螯合剂、DNA修复抑制剂如哌仑西平和代谢物、3-氨基-1-丙磺酸(3APS)、1,3-丙二磺酸盐(1,3PDS)、α-分泌酶激活剂、β-和γ-分泌酶抑制剂、tau蛋白、神经递质、β片层断裂剂(breaker)、用于淀粉样蛋白β清除/消耗细胞成分的引诱剂、包括焦谷氨酸化淀粉样蛋白β3-42的N端截短的淀粉样蛋白β的抑制剂例如谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂、抗炎分子或胆碱酯酶抑制剂(ChEI)例如他克林、卡巴拉汀、多奈哌齐和/或加兰他敏、M1激动剂以及其他药物(包括任何淀粉样蛋白或tau修饰药物和营养补充剂)、以及营养补充剂，连同根据本发明的抗体，以及任选地，药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。

本发明还涉及一种混合物，其中化合物为胆碱酯酶抑制剂(ChEI)，特别是一种混合物，其中化合物为选自他克林、卡巴拉汀、多奈哌齐、加兰他敏、烟酸和美金刚中的一种。

在进一步实施方案中，根据本发明的混合物可包含烟酸或美金刚以及根据本发明的抗体和任选地包含药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。

在进一步实施方案中，根据本发明的混合物可包含谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂以及根据本发明的抗体和任选地包含药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。

优选的谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂描述于WO 2005/075436、WO 2008/055945、WO2008/055947、WO 2008/055950、WO 2008/065141、WO 2008/110523、WO 2008/128981、WO2008/128982、WO 2008/128983、WO 2008/128984、WO 2008/128985、WO 2008/128986、WO2008/128987、WO 2010/026212、WO 2011/131748、WO 2011/029920、WO 2011/107530、WO2011/110613、WO 2012/123563和WO 2014/140279中，其公开内容通过引用并入本文。

在本发明的另一实施方案中，提供了混合物，其包含“非典型抗精神病药物”，诸如例如氯氮平、齐拉西酮、利培酮、阿立哌唑或奥氮平，其用于治疗阳性和阴性精神病症状，包括幻觉，妄想，思维障碍(表现为明显的语无伦次(incoherence)、思维脱轨(derailment)、言不及义(tangentiality))和怪异或紊乱的行为，以及兴趣缺失(anhedonia)、情感扁平化(flattened affect)、冷漠(apathy)和社交退缩，以及包含抗体，特别是根据本发明的单克隆抗体，但特别是嵌合抗体或其片段，或根据本发明并如本文所述的抗体或其片段，以及任选地包含药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。

在本发明的一个具体实施方案中，根据本发明并如上所述的组合物和混合物分别包含治疗有效量的本发明抗体和生物活性物质。

可以合适地用于与根据本发明的抗体组合的混合物的其它化合物描述于WO2008/065141(尤其参见第37/38页)，包括PEP-抑制剂(第43/44页)、LiCl、二肽基氨基肽酶的抑制剂、优选DP IV或DP IV样酶的抑制剂(参见第48/49页)；乙酰胆碱酯酶(ACE)抑制剂(参见第47页)、PIMT增强剂、β分泌酶的抑制剂(参见第41页)、γ分泌酶的抑制剂(参见第41/42页)、中性内肽酶的抑制剂、磷酸二酯酶-4(PDE-4)的抑制剂(参见第42/43页)、TNFα抑制剂、毒蕈碱M1受体拮抗剂(参见第46页)、NMDA受体拮抗剂(参见第47/48页)、σ-1受体抑制剂、组胺H3拮抗剂(参见第43页)、免疫调节剂、免疫抑制剂或选自以下的药剂：antegren(那他珠单抗)、Neurelan(氨吡啶-SR)、campath(阿仑单抗)、IR 208、NBI 5788/MSP 771(替利莫肽)、紫杉醇、Anergix.MS(AG 284)、SH636、Differin(CD 271，阿达帕林)、BAY 361677(白介素-4)、基质金属蛋白酶抑制剂(例如BB 76163)、干扰素-τ(滋养层素)和SAIK-MS；β-淀粉样蛋白抗体(参见第44页)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(参见第44页)；MCP-1拮抗剂(参见第44/45页)、淀粉样蛋白沉积抑制剂(参见42页)和β淀粉样蛋白合成抑制剂(参见第42页)，所述文件通过引用并入本文。

在另一实施方案中，本发明涉及一种混合物，其包含治疗有效量的根据本发明的抗体，或嵌合抗体或其片段，如本文前述，和/或所述生物活性物质。

药物组合物可与药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂根据常规技术进行配制，所述常规技术诸如Remington:The Science and Practice ofPharmacy,21th Edition,Gennaro,Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,2005中所公开的那些。

药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其它已知的佐剂和赋形剂应当适用于所选择的本发明的抗体和所选择的施用方式。基于在抗原结合上对所选择的本发明的抗体或药物组合物的所需生物学特性无显著负面影响(例如，小于实质性影响(10％以下的相对抑制，5％以下的相对抑制等))来确定药物组合物的载体和其他组分的适合性。

本发明的药物组合物还可包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、洗涤剂(例如，非离子洗涤剂，诸如Tween-20或Tween-80)、稳定剂(例如，糖或不含蛋白质的氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或适于包括在药物组合物中的其他物质。

本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可变化，以获得对于特定患者、组合物和施用方式有效实现所需治疗反应的活性成分的量。所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所使用的本发明的特定组合物或其酰胺的活性，施用途径，施用时间，所使用的特定抗体的排泄速率，治疗持续时间，与所使用的特定组合物联合使用的其它药物、化合物和/或物质，所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和既往病史等医学领域熟知的因素。

药物组合物可通过任何合适的途径和方式施用。体内和体外施用本发明抗体的合适途径是本领域熟知的，并且可由本领域普通技术人员选择。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物通过肠胃外施用。

如本文所用，短语“肠胃外施用”和“通过肠胃外施用”是指除了肠内和局部施用之外的施用方式，通常通过注射，并且包括表皮、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、腱内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、颅内、胸内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

在一个实施方案中，药物组合物通过静脉内或皮下注射或输注施用。

药学上可接受的载体包括与本发明抗体生理学上相容的任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、抗氧化剂和吸收延迟剂等。

可用于本发明的药物组合物的合适的水性和非水性载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇、右旋糖、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油、玉米油、花生油、棉籽油和芝麻油)、羧甲基纤维素胶体溶液、黄蓍胶和可注射的有机酯诸如油酸乙酯、和/或各种缓冲剂。其他载体在制药领域是众所周知的。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或药剂与活性抗体不相容，否则可考虑将其用于本发明的药物组合物中。

例如，通过使用包衣材料诸如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。

本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂，例如(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

本发明的药物组合物还可在组合物中包含等渗剂，诸如糖、多元醇诸如甘露醇、山梨醇、甘油或氯化钠。

本发明的药物组合物还可含有一种或多种适合于所选择的施用途径的佐剂，诸如防腐剂，润湿剂，乳化剂，分散剂，防腐剂或缓冲剂，其可以增加药物组合物的保质期或有效性。本发明的抗体可用保护抗体免于快速释放的载体制备，诸如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。这种载体可包括明胶，单硬脂酸甘油酯，二硬脂酸甘油酯，可生物降解、生物相容性聚合物诸如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，胶原，聚原酸酯以及单独或与蜡一起的聚乳酸，或本领域熟知的其它物质。用于制备这种制剂的方法是本领域技术人员通常已知的。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。

在一个实施方案中，可配制本发明的抗体以确保在体内的适当分布。用于肠胃外施用的药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或药剂与抗体不相容，否则可考虑将其用于本发明的药物组合物中。

用于注射的药物组合物通常在制造和储存条件下必须是无菌且稳定的。组合物可配制成溶液、微乳液、脂质体或其它适于高药物浓度的有序结构。载体可为水性或非水性溶剂或分散介质，其含有例如水，乙醇，多元醇(诸如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油诸如橄榄油以及可注射的有机酯诸如油酸乙酯。例如，可以通过使用包衣诸如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇诸如甘油，甘露醇，山梨醇或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的物质例如单硬脂酸盐和明胶来实现。无菌可注射溶液可通过将所需量的抗体与例如上文列举的成分中的一种或组合根据需要掺入合适的溶剂中，然后灭菌微滤而制备。通常，分散体通过将抗体掺入含有基本分散介质和所需的其它成分例如来自以上列举的那些的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法的实例为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其得到来自其先前无菌过滤溶液的活性成分加上任何额外所需成分的粉末。

无菌可注射溶液可通过将所需量的抗体与上文列举的成分中的一种或组合根据需要掺入合适的溶剂中，然后灭菌微滤而制备。通常，分散体通过将抗体掺入含有基本分散介质和所需的来自以上列举那些的其它成分的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法的实例为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其得到来自其先前无菌过滤溶液的活性成分加上任何额外所需成分的粉末。

调节上述治疗方法和用途中的剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次推注(single bolus)，可以随时间施用几个分剂量，或者可以根据治疗情况的紧急情况按比例减少或增加剂量。肠胃外组合物可配制为剂量单位形式，以便于施用和剂量均匀性。如本文所用的剂量单位形式是指适于作为待治疗对象的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有预定量的抗体，所述预定量的抗体经计算可与所需的药物载体结合产生所需的治疗效果。本发明的剂量单位形式的规格由以下因素决定并直接取决于以下因素：(a)抗体的独特特征和要实现的特定治疗效果，以及(b)配制此类抗体的领域中个体敏感性治疗的固有的局限性。

本发明抗体的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症，并且可由本领域技术人员确定。本发明抗体的治疗有效量的示例性非限制性范围为约0.1-10mg/kg/体重，诸如约0.1-5mg/kg/体重，例如约0.1-2mg/kg/体重，诸如约0.1-1mg/kg/体重，例如约0.15、约0.2、约0.5、约1、约1.5或约2mg/kg/体重。

具有本领域普通技能的医师或兽医可容易地确定并处方所需有效量的药物组合物。例如，医师或兽医可以以低于实现期望的治疗效果所需的水平开始药物组合物中所用

抗体的剂量，并逐渐增加剂量直至实现期望的效果。通常，本发明的组合物的合适的日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的抗体的量。这种有效剂量通常将取决于上述因素。施用可为例如静脉内，肌肉内，腹膜内或皮下施用，并且例如在靶位点附近施用。如果需要，药物组合物的有效日剂量可为在一天中以适当间隔分开施用的两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量施用，任选地，以单位剂型施用。虽然可以单独施用本发明的抗体，但优选将抗体作为如上所述的药物组合物施用。

实施例

1.通过人源化方法以产生N3pE-Aβ特异性抗体

本发明的人源化和去免疫化抗体是杂交瘤细胞系Aβ6-1-6(保藏号DSM ACC 2924)产生的单克隆小鼠抗体的人源化和去免疫化形式，所述杂交瘤细胞系Aβ6-1-6描述于WO2010/009987。如WO 2017/009459中所述进行人源化。WO 2017/009459中第58-60页公开的工作实施例1通过引用并入本文。

2.RNA分离和cDNA合成

作为恒定序列的来源，通过在室温下用5ml 1x FACS裂解液(Becton Dickinson)将500μl全血裂解10分钟来分离人B细胞的RNA。将裂解物在300g离心5分钟；将沉淀用PBS洗涤两次，然后溶于350μl Nucleo

RNA II的RA1缓冲液(Macherey-Nagel)中，并加入3.5μl 0.5M TCEP(SIGMA)。按照制造商的说明书分离RNA。首先将10μl RNA与1μl 0.5μg/μlOligodT引物(Invitrogen)和1μl 10mM dNTP在65℃温育5分钟。然后将4μl 5x FirstStrand Buffer(Invitrogen)、2μl 100mM DTT和0.5μl SuperScript III反转录酶(Invitrogen)加入到20μl中并将混合物在25℃温育5分钟，在50℃温育50分钟，以及在70℃温育15分钟。通过表2所示的引物对的PCR，可以扩增出轻链和重链恒定区的合成cDNA。

表2：用于恒定区克隆的引物

为了扩增克隆#6轻链的PCR产物，使用了以下正向和反向引物：

RT_chim_humKl6f：CAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTG(SEQ ID NO:47)；

RT_chim_humKl6r：GTACCTTGCACGCAGTAATAAAC(SEQ ID NO:48)。

为了扩增内参基因，使用了小鼠HPRT引物。

为了进行扩增，在循环仪中使用7.5μl Sybergreen(Firma)、1μl正向引物(25pmol/μl)、1μl反向引物(25pmol/μl)、5.5μl ddH₂O和1μl cDNA。

3.通过将LC和HC分别克隆至两个不同表达质粒，在CHO细胞中表达重组抗体

将抗体的轻链和重链序列分别克隆至两个不同的哺乳动物表达载体：pCDNA3.1和HC-pOptiVEC中。为了鉴定在CHO细胞培养物中表达重组抗体的载体的最佳组合，使用不同的质粒组合在贴壁CHO细胞中进行瞬时表达。在第二步中，研究了LC和HC质粒之间不同的DNA比例是否影响表达水平。通过转染3μg LC-pCDNA3.1和1μg HC-pOptiVEC，发现表达水平增加。

为了抗体的进一步贴壁CHO细胞表达，使用LC-pCDNA3.1和1μg HC-pOptiVEC的质粒组合以及LC 3:1HC的质粒DNA比例。

Freestyle^TM CHO悬浮细胞用于以下转染中，以培养产生重组抗体的更大量瞬时表达细胞。首先测试过量的LC质粒是否可以像贴壁细胞的情况那样改善抗体的表达。与在贴壁CHO细胞中一样，使用1：1和3：1的LC与HC质粒DNA比例。蛋白质印迹分析表明，与贴壁CHO细胞一样，过量的LC质粒会增加抗体的表达。通过测量细胞存活率，很明显，在6天后，细胞存活率降低至转染细胞的约50％。第六天后，未检测到上清液中抗体水平的进一步增加。因此，在随后转染的情况下，在第六天收获培养物上清液。

为了研究产生的抗体是否能有效地转运至细胞上清液中，将细胞裂解物样品加到SDS PAGE，通过蛋白质印迹法进行分析。GAPDH，一种管家胞质蛋白，用于向SDS凝胶加载细胞裂解物蛋白相当量的参考。在表达抗体的CHO细胞的细胞裂解物中，一条120kDa的强条带迁移到和在细胞上清液中所检测到的相同大小的位置。

4.通过蛋白G色谱法纯化重组抗体

纯化抗体克隆#6，以研究与原始鼠源抗体相比，蛋白质的抗原结合特性。因此，产生300ml具有表达的嵌合抗体和人源化抗体的上清液，并通过蛋白质G色谱法进行纯化。因为表达的抗体的量非常低，所以在总共25μg的纯化蛋白中收率小于0.1μg/ml。将洗脱的抗体浓缩至约200μg/ml，并在考马斯亮蓝染色后将2μg蛋白加到SDS-PAGE。

5.人源化抗体的稳定细胞系生成

本发明的人源化抗体的亲本抗体是WO 2017/009459中所公开的克隆#6变体，其具有轻链可变区，所述轻链可变区具有如下氨基酸序列：

并且

具有重链可变区，所述重链可变区具有如下氨基酸序列：

选择亲本克隆#6变体的两个克隆：C06.08和C06.09，以产生稳定细胞系。为了制备产生C06.08和C06.09的中国仓鼠卵巢(CHO)DG44细胞，首先制备了包含两种抗体的重链和轻链基因序列的表达质粒。将质粒线性化，通过异丙醇沉淀纯化，在10mM Tris pH 8.0中重构，并按如下所述用于转染：将1x 10⁶CHO-DG44细胞悬浮于100μL Nucleofector溶液V(Lonza)中，并与10μg线性化的载体DNA混合。悬浮液用电穿孔仪Amaxa Nucleofector II(Lonza)脉冲。随后，添加500μL CD CHO培养基(Invitrogen)，并将转染的细胞池(cellpool)培养24小时。

为了生成稳定的微型池(mini pool，MP)，转染后一天合并转染的细胞池，转移至CD CHO培养基中并分别以2000个细胞/孔和4000个细胞/孔接种在96孔板中，或转移至含2.5nM甲氨蝶呤(MTX)的CD CHO培养基中并以4000个细胞/孔接种在96孔板中。培养21(C06.08)或27(C06.09)天后，将20个MP转移至24孔板中。在转染后第22天或第28天，将MP转移至12孔板，并在第34天或第48天将MP扩增至6孔板中。在第34天(C06.08)或第48天(C06.09)，将池转移至具有30nM MTX的选择性培养基中以诱导扩增过程，并通过Octet测量确定抗体表达效价。

结果

如表2和表3所总结的，所有MP均显示出较差的细胞生长、极低甚至无法检测到抗体生成(<10pg/细胞/天)，并且许多MP未在MTX扩增中存活。用一组新试剂重复转染实验可得到相似的结果，而用对照载体转染可得到正常的蛋白表达水平。这些结果表明基因组整合的C06.08和C06.09蛋白可能对CHO-DG44细胞具有固有的毒性作用，例如这些蛋白可能由于细胞核中错误折叠的C06.08和C06.09蛋白的过表达而触发细胞死亡。需要对C06.08和C06.09的一级序列进行进一步修饰，以纠正蛋白质错误折叠并消除对CHO-DG44细胞死亡的诱导。

PBD-C06修饰以改善蛋白质折叠和表达

对C06氨基酸序列的计算机分析揭示了重链框架区的几个氨基酸(点(spots))延伸，其被认为对蛋白质折叠有负面影响。为了检查这些点是否可以与改善蛋白质表达的其他氨基酸交换，首先合成四个单独的重链突变(K12V、S14P、N55D和F64V)，并在瞬时转染中分别与SEQ ID NO：17的轻链一起测试了蛋白表达。靶标结合研究表明F64V修饰阻止抗体结合。在第二组实验中，将每种突变的组合成对和三联体整合到单个重链基因中并与SEQ IDNO：17的轻链组合进行测试以进行表达和靶标结合研究(图1和2)。

结果

K12V、S14P和N55D突变的组合产生最佳的瞬时C06表达效价和最佳的靶标结合特性(图1和2)，并选择包含所有这三个突变的相应克隆进行CHO-DG44稳定转染研究。

人源化抗体在CHO-DG44细胞中的稳定表达

亲本CHO-DG44细胞最初获自Gibco,Life Technologies(FreedomTM DG44 Kit)，现在由Thermo Fisher Scientific管理。CHO细胞系为DHFR缺陷型并且cGMP存有文件(cGMPbanked with documentation)。

与以前的转染尝试(见上文)相比，用表达人源化抗体的载体转染CHO-DG44细胞导致CHO-DG44克隆数提高了数倍，所述人源化抗体包含SEQ ID NO：1的轻链和SEQ ID NO：2的重链(其包含K12V、S14P和N55D突变)。此外，在MTX暴露后，鉴定出具有高靶标抗体表达效价的多个克隆，表明在稳定整合入CHO-DG44基因组后，K12V、S14P和N55D突变改善了抗体折叠和表达。在分批补料条件下延长培养时间证实了长期稳定表达，这证实了亲本克隆#6重链中所选的改变(K12V、S14P和N55D)促进了在CHO-DG44细胞中的正确折叠和表达。

在进一步优化载体和电穿孔后，获得了其他稳定的细胞系。在基因扩增之前，最初的转染子在分离并在24孔板中扩增至0.5ml培养物后即表达高水平的抗体(图3)。首次MTX暴露后，第7天的生产效价进一步增加(图4)，表明这些克隆，特别是c17，将是高效得多的生产者。

总结

分别测试了四个重链突变，以观察它们是否会增加瞬时转染的HEK293细胞中的抗体表达。这些突变中的三个显著增加了抗体表达，而第四个降低了表达。还分别尝试了单个突变的组合和三重突变，它们均表达良好并通过A蛋白色谱法纯化。通过Biacore分析，发现四个突变的组合降低了结合，而特定突变K12V、S14P和N55D的组合表达良好并且具有最佳的结合特性。轻链序列的变化对于高表达是不必要的。

在稳定转染的CHO DG44细胞中进行了研究，经过初始选择和逐步增加的甲氨蝶呤(MTX)诱导的基因扩增后，获得了更高水平的抗体表达。进一步观察到较高的抗体表达水平不会阻止良好的细胞生长。总而言之，转染活动导致鉴定了几种新的CMC生产候选物。

5.表面等离子体共振测量以分析人源化和去免疫化抗体与单体Aβ肽的结合

使用表面等离子体共振测量来研究抗体的结合功效，所述抗体包含具有SEQ IDNO.1的轻链可变部分和具有SEQ ID NO.2的重链可变部分。为了防止测量过程中的传质和亲合力效应，使用了以下步骤。

首先，将多克隆α-人抗体与SPR-Chip偶联，随后加载所述抗体，直至响应单位(Response Unit)大于1000。

动力学测量是在Aβ-肽(5-1000nM的)不同浓度下进行的。测得的系列图显示为具有传感图(sensorgram)的重叠图，其通过测量运行缓冲液的传感图进行校正，在注射时对准并在注射前将基线调整为零。根据简单的1：1交互模型(Langmuir拟合)评估结果，所述模型可提高k_off和k_on速率常数。

根据1：1的Langmuir拟合得出的表观动力学常数列于表4中。由于抗体非共价结合至芯片表面，因此在测量过程中会冲洗掉少量抗体分子。因此，对于每个单独的传感图，Rmax值都被局部拟合。

表4：人源化和去免疫化抗体克隆#6的Langmuir拟合动力学统计

与Aβ(pE3-18)的结合

对所记录的传感图的定性和目视检查显示出良好的缔合和解离相形状。此外，观察到响应信号的浓度依赖性升高和缔合相中初始斜率的增加。最大SPR信号为～44RU，其在测量结合动力学的最佳范围内，而无质量传输效应或质量传输效应可忽略。没有观察到基线漂移，因此使用Langmuir 1：1结合模型评估数据，获得了这种相互作用的结合特性和拟合质量(表4)。

与Aβ(3-18)的结合

与Aβ(1-18)的结合

对所记录的传感图的定性和目视检查显示出典型的与所用肽浓度相适应的弱结合的形状。观察到轻微的基线漂移；因此，使用Langmuir 1：1结合和漂移基线模型拟合数据。动力学数据的评估(表4)得出解离常数为23.1μM，其高于最高测得的Aβ(1-18)浓度。此外，计算得出的Rmax值明显高于最高浓度的响应值。这两个事实均表明，所获得的结合性能确切地在KD>10μM的范围内。

与Aβ(4-18)的结合

对所记录的传感图的定性和目视检查显示出典型的与所用肽浓度相适应的非常弱结合的形状。由于缔合和解离非常快，无法对数据进行动力学评估，因此使用了稳态模型。稳态下的响应信号评估(表4)得出解离常数为28.3μM，其高于最高测得的Aβ(4-18)浓度。此外，计算得出的Rmax值明显高于最高浓度的响应值。这两个事实均表明，所获得的结合性能确切地在KD>10μM的范围内。

6.与Aβ原纤维和Aβ寡聚物的结合

根据标准方案在pH 8.7和37℃下产生Aβ(1-42)肽的原纤维。完全原纤化后，将结构吸入60μl，在140μl运行缓冲液中稀释，并通过使用捕获抗体以1μl/min的流速加载到传感器芯片上。然后，清洗所述体系直到获得稳定基线。约100RU的Aβ(1-42)_原纤维被捕获到传感器芯片上。

根据ACUMEN方案，在Ham’s F12培养基中于4℃过夜生成Aβ(1-42)肽的寡聚物，并通过离心将其与聚集的Aβ分离。之后，将寡聚物吸入20μl，在60μl运行缓冲液中稀释，并通过使用捕获抗体以1μl/min的流速加载到传感器芯片上。然后，将所述体系以100μl/min的速度清洗过夜，以获得稳定基线。约300RU的Aβ(1-42)寡聚物被捕获到传感器芯片上。

对于Aβ(1-42)肽的原纤维：在获得稳定基线后，通过连续11次以30μl/min注射(10pM，30pM，90pM，270pM，810pM，2.43nM，7.29nM，21.87nM，65.61nM，196.83nM和590.49nM)亲本抗体克隆#6(如WO 2017/009459中所公开的)和本发明的人源化和去免疫化抗体克隆#6，480秒接触时间和1200秒解离时间，进行相互作用分析。使用五个连续的浓度(从显示结合的第一次注射开始)和单循环动力学模型对所获得的传感图进行评估，所述模型具有Rmax和基线漂移的全局拟合以及每次进样的总体效应的局部拟合。

对于Aβ(1-42)肽的寡聚物：在获得稳定基线后，通过连续11次以30μl/min注射(10pM，30pM，90pM，270pM，810pM，2.43nM，7.29nM，21.87nM，65.61nM，196.83nM和590.49nM)亲本抗体克隆#6(如WO 2017/009459中所公开的)和本发明的人源化和去免疫化抗体克隆#6，480秒接触时间和3600秒解离时间，进行相互作用分析。使用五个连续的浓度(从显示结合的第一次注射开始)和单循环动力学模型对所获得的传感图进行评估，所述模型具有Rmax和基线漂移的全局拟合以及每次进样的总体效应的局部拟合。

结果

表5：与原纤维Aβ(1-42)肽的结合

表6：与Aβ(1-42)肽寡聚物的结合

在表5和表6中，

A为WO 2017/009459中所公开的亲本抗体克隆#6，其具有SEQ ID NO：1的轻链可变区和SEQ ID NO：49的重链可变区；以及

B为本发明的人源化和去免疫化抗体克隆#6，其具有SEQ ID NO：1的轻链可变区和SEQ ID NO：2的重链可变区。

从这些结果可以看出，本发明提供了抗体及其片段，其中所述抗体显示出对Aβ肽的寡聚物和/或原纤维的增加的选择性。与现有技术中已知的可比单克隆抗体相比，特别是与WO 2017/009459中所公开的亲本抗体相比，本发明的抗体显示出与Aβ(1-42)的寡聚物和/或原纤维结合的结合常数(K_D值)低了非常多，诸如低10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、250倍或超过250倍。因此，被建立以选择性结合AβN3pE肽的本发明抗体对AβN3pE肽更具特异性，并显示出与除AβN3pE以外的Aβ肽的降低的交叉反应性。

7.与Fcγ受体的结合

将两种抗体(其包含SEQ ID NO：19的重链或其K324A突变变体(SEQ ID NO：18))与不同的Fcγ受体(CD16A、CD32A、CD32B和CD64)的结合进行了对比。

K324A突变体是通过定点诱变产生的。在基于FACS的生物测定中测量与稳定表达全长人CD16A、CD32A、CD32B或CD64的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的结合。将两种抗体与每种细胞系在7种不同浓度下温育1小时，然后洗涤。用荧光染料缀合的抗Fab'检测到受体结合的H6或H67。通过FACS测量结合能力，并且通过非线性回归计算Kd和Bmax。

结果：两种抗体均显示出与所有受体的相当的结合。

8.与C1q的结合

为了更好地表征抗体的效应子功能，将两种抗体(其包含SEQ ID NO：19的重链或其K324A突变变体(SEQ ID NO：18))与C1q的结合进行了对比。

测试了多种抗体与C1q结合的测定形式，包括

a)将两种抗体直接结合到板上，然后与溶液中的C1q结合；以及

b)链霉抗生物素蛋白包被的板首先与生物素化的pE-Aβ肽温育，与抗体结合，然后与C1q结合。

总之，形式a)产生了最佳结果。所述过程总结如下：

将ELISA板用10、8、6、4、3、2、1和0μg/ml的抗体包被，一式三份，并在4℃温育过夜，所述抗体包含SEQ ID NO：19的重链、其K324A突变变体(SEQ ID NO：18)以及不结合C1q的K324A对照。第二天，将板用1x PBS洗涤3次，然后用1x PBS中的1％BSA以50μl/孔封闭。将C1q(Sigma，Cat.#C1740)以2μg/ml的浓度加入封闭缓冲液的每个孔中并在室温下温育1小时。然后将板用200μl 1x PBS洗涤3次。将抗C1q-HRP(Thermo，Cat.#PA1-84324)加入板中，以1：250的稀释度在封闭缓冲液(50μl/孔)中检测结合1小时。然后将板再用200μl 1x PBS洗涤3次。将50μl TMB(Invitrogen，Cat.#002023)加入到每个孔中，观察相互作用2分钟(Invitrogen，Cat.#002023)。向每个孔中加入50μl终止溶液(1M硫酸)，然后读取450nm的吸光度。

结果：包含SEQ ID NO：19的野生型重链的抗体确实与C1q结合。其K324A突变变体(包含SEQ ID NO：18的重链)与C1q不结合。

9.免疫组织化学

通过IHC，抗原AβN3pE可以在脑组织切片中定位。因此，本发明的抗体用于检测AβN3pE。

对于IHC，可以使用来自AD患者的海马和额叶皮层的人脑组织切片以及来自现有的阿尔茨海默病动物模型的海马脑组织切片，如本文所述。这些小鼠模型显示出大脑Aβ水平升高，随后形成神经炎性斑块。将组织切片用石蜡包埋并连续切片。将切片用苏木精染色至细胞的细胞核有色，然后用本发明的抗AβN3pE抗体进行免疫染色。根据标准方法进行组织切片制备和染色。

10.阿尔茨海默病小鼠的体内治疗

在这项研究中总共使用了62只雄性小鼠。在免疫开始前，处死现有的阿尔茨海默病小鼠模型(平均5.6mo±0.45)小鼠中的四只小鼠，作为基线对照，以评估治疗开始时脑Aβ斑块负荷。将其余小鼠分为四组并接受以下治疗：250μl无菌PBS(n＝12；平均5.89mo±0.13)，200μg本发明的抗体。向一组年龄和性别匹配的Wt同窝幼仔注射250μl PBS(n＝12；平均5.80mo±0.12)并作为行为对照。将小鼠通过腹膜内注射用250μl(抗体或PBS)的总体积处理28周。

安乐死和组织制备

对小鼠实施安乐死、灌注并在6个月(基线)或13个月大时收获血浆。提取大脑并矢状分裂。从一个半球解剖海马、皮层和小脑，然后速冻以进行生化分析。另一个半球在4℃在4％多聚甲醛中(Electron Microscopy Sciences)点滴固定(drop-fixed)24小时，在4℃在分级蔗糖溶液中冷冻保护并包埋在OCT化合物中(Tissue Tek)。

序列表

<110> 维沃永治疗股份公司

<120> 人源化和去免疫化抗体

<130> PBD135WO

<160> 49

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant Polypeptide

<400> 1

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Thr Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 2

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant Polypeptide

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asp Gly Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val His

65 70 75 80

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant peptide

<400> 3

Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 4

Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant peptide

<400> 5

Val Gln Gly Thr His Phe Pro

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant peptide

<400> 6

Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His Thr Met Asn

1 5 10

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant peptide

<400> 7

Leu Ile Asn Pro Ser Asp Gly Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant peptide

<400> 8

Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr

1 5 10

<210> 9

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant nucleic acid

<400> 9

gacgtggtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60

atctcctgca agtcaagtca gagcctcctg cactccgacg gcaagaccta cttgaactgg 120

ttccagcaga ggccaggcca gtctccaagg cgcctgacct atctggtgtc taagctggac 180

tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgacttcac actgaagatc 240

agcagggtgg aggctgagga tgtcggagtc tactactgcg tgcaaggtac acacttccca 300

ttcacgttcg gcggagggac caaggtggaa atcaaa 336

<210> 10

<211> 357

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic nucleic acid

<400> 10

caggtgcagc tcgtgcagtc tggggctgag gtggtgaagc caggtgcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg catctggtta ctcattcact ggtcacacca tgaactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggactc atcaatcctt ccgatggtgt tactaggtac 180

aaccagaagt tccagggcag agtcaccatc accagggaca cgtccacgac caccgttcac 240

atggagctga ccagcctgac atctgaggac acggccacct actactgtac gagagaggcg 300

aaacgggagt gggacgagac ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant nucleic acid

<400> 11

tcaagtcaga gcctcctgca ctccgacggc aagacctact tgaac 45

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant nucleic acid

<400> 12

ctggtgtcta agctggactc t 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant nucleic acid

<400> 13

gtgcaaggta cacacttccc a 21

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant nucleic acid

<400> 14

ggttactcat tcactggtca caccatgaac 30

<210> 15

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant nucleic acid

<400> 15

ctcatcaatc cttccgatgg tgttactagg tacaaccaga agttccaggg c 51

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant nucleic acid

<400> 16

gaggcgaaac gggagtggga cgagacttac 30

<210> 17

<211> 219

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant polypeptide

<400> 17

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Thr Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 18

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant polypeptide

<400> 18

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asp Gly Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val His

65 70 75 80

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 19

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant polypeptide

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asp Gly Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val His

65 70 75 80

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 20

<211> 657

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant nucleic acid

<400> 20

gacgtggtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60

atctcctgca agtcaagtca gagcctcctg cactccgacg gcaagaccta cttgaactgg 120

ttccagcaga ggccaggcca gtctccaagg cgcctgacct atctggtgtc taagctggac 180

tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgacttcac actgaagatc 240

agcagggtgg aggctgagga tgtcggagtc tactactgcg tgcaaggtac acacttccca 300

ttcacgttcg gcggagggac caaggtggaa atcaaaagga ccgtggccgc accctctgtg 360

ttcatcttcc cccccagcga cgagcagctg aagagcggca ctgcatctgt cgtgtgtctg 420

ctgaacaact tctacccaag ggaggcgaaa gtgcagtgga aggtagacaa cgccttgcaa 480

tccggcaact cccaggagag cgtgaccgag caggacagca aagactcaac ctacagcctg 540

agcagtactt tgaccctgtc taaggccgat tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgag 600

gtaacccacc agggactgag ctctcccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgc 657

<210> 21

<211> 1347

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant nucleic acid

<400> 21

caggtgcagc tcgtgcagtc tggggctgag gtggtgaagc caggtgcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg catctggtta ctcattcact ggtcacacca tgaactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggactc atcaatcctt ccgatggtgt tactaggtac 180

aaccagaagt tccagggcag agtcaccatc accagggaca cgtccacgac caccgttcac 240

atggagctga ccagcctgac atctgaggac acggccacct actactgtac gagagaggcg 300

aaacgggagt gggacgagac ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagcc 360

agcactaagg gcccgagcgt gttccccctc gcccctagca gtaagagcac cagcggtggc 420

acggcggcac ttggctgctt ggttaaggac tacttcccag agcccgtgac cgtgtcctgg 480

aactctgggg cacttaccag tggcgtgcac accttccccg ctgtactgca gagcagcggc 540

ttgtacagct tgtcttccgt cgtaacggtg cccagcagca gcttgggaac ccagacctac 600

atctgcaacg taaaccacaa gccatccaac accaaggtag acaaaaaggt cgaacccaag 660

tcctgcgaca agacccacac ctgtccaccc tgtcctgcac ccgagctcct gggaggtccc 720

agcgttttcc tgttccctcc aaagccaaag gataccctga tgatcagcag gacccccgag 780

gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840

gttgatgggg tggaggtaca caatgccaag accaaacctc gagaggagca atacaacagc 900

acctaccgag ttgtgagcgt gcttaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960

tacaagtgcg ctgtgagcaa caaggctctg ccggctccca tcgagaagac catcagcaag 1020

gccaagggcc agcccaggga gccacaggtt tacacgttgc ccccctcaag ggacgagttg 1080

accaagaacc aggtttccct cacgtgcctt gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 1140

gtggaatggg agagcaacgg gcagcccgag aacaactaca agacgacccc ccctgttctg 1200

gacagcgacg gctctttctt cctgtattca aagctcaccg tggacaaaag caggtggcag 1260

cagggtaatg tgttctcctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcataacca ctacacccaa 1320

aagagcttga gcctctcccc cggtaag 1347

<210> 22

<211> 1347

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant nucleic acid

<400> 22

caggtgcagc tcgtgcagtc tggggctgag gtggtgaagc caggtgcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg catctggtta ctcattcact ggtcacacca tgaactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggactc atcaatcctt ccgatggtgt tactaggtac 180

aaccagaagt tccagggcag agtcaccatc accagggaca cgtccacgac caccgttcac 240

atggagctga ccagcctgac atctgaggac acggccacct actactgtac gagagaggcg 300

aaacgggagt gggacgagac ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagcc 360

agcactaagg gcccgagcgt gttccccctc gcccctagca gtaagagcac cagcggtggc 420

acggcggcac ttggctgctt ggttaaggac tacttcccag agcccgtgac cgtgtcctgg 480

aactctgggg cacttaccag tggcgtgcac accttccccg ctgtactgca gagcagcggc 540

ttgtacagct tgtcttccgt cgtaacggtg cccagcagca gcttgggaac ccagacctac 600

atctgcaacg taaaccacaa gccatccaac accaaggtag acaaaaaggt cgaacccaag 660

tcctgcgaca agacccacac ctgtccaccc tgtcctgcac ccgagctcct gggaggtccc 720

agcgttttcc tgttccctcc aaagccaaag gataccctga tgatcagcag gacccccgag 780

gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840

gttgatgggg tggaggtaca caatgccaag accaaacctc gagaggagca atacaacagc 900

acctaccgag ttgtgagcgt gcttaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960

tacaagtgca aggtgagcaa caaggctctg ccggctccca tcgagaagac catcagcaag 1020

gccaagggcc agcccaggga gccacaggtt tacacgttgc ccccctcaag ggacgagttg 1080

accaagaacc aggtttccct cacgtgcctt gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 1140

gtggaatggg agagcaacgg gcagcccgag aacaactaca agacgacccc ccctgttctg 1200

gacagcgacg gctctttctt cctgtattca aagctcaccg tggacaaaag caggtggcag 1260

cagggtaatg tgttctcctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcataacca ctacacccaa 1320

aagagcttga gcctctcccc cggtaag 1347

<210> 23

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<400> 23

Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val

1 5 10 15

<210> 24

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<400> 24

Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu

1 5 10 15

<210> 25

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<400> 25

Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10

<210> 26

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<400> 26

Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln

1 5 10

<210> 27

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<400> 27

Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His

1 5 10

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<400> 28

Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His

1 5 10

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<400> 29

Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val

1 5 10

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<400> 30

Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu

1 5

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<400> 31

Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr

1 5

<210> 32

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<400> 32

Glu Phe Arg His Asp Ser Gly

1 5

<210> 33

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<400> 33

Glu Phe Arg His Asp Ser

1 5

<210> 34

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<400> 34

Glu Phe Arg His Asp

1 5

<210> 35

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<400> 35

Glu Phe Arg His

1

<210> 36

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<400> 36

Glu Phe Arg

1

<210> 37

<211> 42

<212> PRT

<213> Human

<400> 37

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

35 40

<210> 38

<211> 40

<212> PRT

<213> Human

<400> 38

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val

35 40

<210> 39

<211> 38

<212> PRT

<213> Human

<400> 39

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly

35

<210> 40

<211> 40

<212> PRT

<213> Human

<400> 40

Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val

1 5 10 15

Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu

20 25 30

Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

35 40

<210> 41

<211> 38

<212> PRT

<213> Human

<400> 41

Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val

1 5 10 15

Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu

20 25 30

Met Val Gly Gly Val Val

35

<210> 42

<211> 36

<212> PRT

<213> Human

<400> 42

Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val

1 5 10 15

Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu

20 25 30

Met Val Gly Gly

35

<210> 43

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 43

actgtggctg caccatctgt cttc 24

<210> 44

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 44

ctaacactct cccctgttga agctc 25

<210> 45

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 45

agggaaccct ggtcaccgtc tcc 23

<210> 46

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 46

tcatttaccc ggagacaggg agagg 25

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 47

caagtcagag cctcttatat agtg 24

<210> 48

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer

<400> 48

gtaccttgca cgcagtaata aac 23

<210> 49

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Recombinant polypeptide

<400> 49

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val His

65 70 75 80

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

Claims

1.一种抗体或其功能变体，其中所述抗体的轻链的可变部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：

并且

2.权利要求1的抗体，其轻链中包含如下CDR区：

V_L CDR1:SSQSLLYSDGKTYLN(SEQ ID NO:3)；

V_L CDR2:LVSKLDS(SEQ ID NO:4)；以及

V_L CDR3:VQGTHFP(SEQ ID NO:5)。

3.权利要求1的抗体，其重链中包含如下CDR区：

V_H CDR1:GYSFTGHTMN(SEQ ID NO:6)；

V_H CDR2:LINPSDGVTRYNQKFQG(SEQ ID NO:7)；以及

V_H CDR3:EAKREWDETY(SEQ ID NO:8)。

4.前述权利要求任一项的抗体，其中所述轻链包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:17)。

5.前述权利要求任一项的抗体，其中所述重链包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：

QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSDGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:18)。

6.前述权利要求任一项的抗体，其中所述重链包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：

QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSDGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:19)。

7.前述权利要求任一项的抗体，其中所述人源化抗体特异性结合AβN3pE的携带焦谷氨酸的N-末端。

8.前述权利要求任一项的抗体，其中所述人源化抗体特异性结合选自如下的表位：

pEFRHDSGYEVHHQKLV(SEQ ID NO:23)、

pEFRHDSGYEVHHQKL(SEQ ID NO:24)、

pEFRHDSGYEVHHQK(SEQ ID NO:25)、

pEFRHDSGYEVHHQ(SEQ ID NO:26)、

pEFRHDSGYEVHH(SEQ ID NO:27)、

pEFRHDSGYEVH(SEQ ID NO:28)、

pEFRHDSGYEV(SEQ ID NO:29)、

pEFRHDSGYE(SEQ ID NO:30)、

pEFRHDSGY(SEQ ID NO:31)、

pEFRHDSG(SEQ ID NO:32)、

pEFRHDS(SEQ ID NO:33)、

pEFRHD(SEQ ID NO:34)、

pEFRH(SEQ ID NO:35)、和

pEFR(SEQ ID NO:36)。

9.权利要求1至6任一项的抗体，其中本发明的所述人源化抗体结合AβN3pE变体，其中所述AβN3pE变体定义为pE-Aβ_3-X，其中x定义为19至42之间的整数。

10.权利要求9的抗体，其中所述AβN3pE变体选自：

pE-A_3-38、

pE-A_3-40、

pE-A_3-42。

11.前述权利要求任一项的抗体，其中所述抗体不结合在N-末端不携带焦谷氨酸的表位。

12.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求任一项的抗体。

13.权利要求12的药物组合物，其还包含其它生物活性物质和/或药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。

14.权利要求13的药物组合物，其中所述其他生物活性物质选自神经元传递增强剂、精神病治疗药物、乙酰胆碱酯酶抑制剂、钙通道阻滞剂、生物胺、苯二氮卓类镇静剂、乙酰胆碱合成、储存或释放增强剂、乙酰胆碱突触后受体激动剂、单胺氧化酶-A或-B抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸谷氨酸受体拮抗剂、非甾体抗炎药、抗氧化剂和5-羟色胺能受体拮抗剂。

15.权利要求14的药物组合物，其中所述其它生物活性物质选自：有效抗氧化应激的化合物、抗凋亡化合物、金属螯合剂、DNA修复抑制剂如哌仑西平和代谢物、3-氨基-1-丙磺酸(3APS)、1,3-丙二磺酸盐(1,3PDS)、α-分泌酶激活剂、β-和γ-分泌酶抑制剂、tau蛋白、神经递质、β片层断裂剂、用于淀粉样蛋白β清除/消耗细胞成分的引诱剂、包括焦谷氨酸化淀粉样蛋白β3-42的N端截短的淀粉样蛋白β的抑制剂例如谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂、抗炎分子或胆碱酯酶抑制剂(ChEI)例如他克林、卡巴拉汀、多奈哌齐和/或加兰他敏、M1激动剂以及其他药物，包括任何淀粉样蛋白或tau修饰药物和营养补充剂、胆碱酯酶抑制剂(ChEI)、美金刚或谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂。

16.前述权利要求任一项的抗体或药物组合物，其用于诊断、治疗淀粉样变性，尤其是用于治疗选自轻度认知损害(MCI)、阿尔茨海默病(AD)例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默痴呆症(FAD)例如家族性英国型痴呆症(FBD)和家族性丹麦型痴呆症(FDD)、唐氏综合症中的神经变性以及临床或临床前脑淀粉样血管病的神经退行性疾病；和/或治疗选自前驱期AD、轻度AD、中度AD和重度AD的病症和/或减缓诊断为患有选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合症以及临床或临床前脑淀粉样血管病的病症的患者的认知衰退。

17.权利要求24的用于所述用途的抗体或药物组合物，其中所述抗体或所述药物组合物的施用导致在诊断为患有轻度认知损害(MCI)、阿尔茨海默病(AD)例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默痴呆症(FAD)例如家族性英国型痴呆症(FBD)和家族性丹麦型痴呆症(FDD)、唐氏综合症中的神经变性以及临床或临床前脑淀粉样血管病和/或选自前驱期AD、轻度AD、中度AD和重度AD的病症的对象中逆转认知衰退、改善认知或预防认知衰退；或

其中所述抗体或所述药物组合物的施用导致从斑块或其他生物复合体中清除或去除AβN3pE；或

其中所述抗体或所述药物组合物的施用导致从受影响的组织，例如脑组织中减少斑块负荷和/或去除完整斑块。