JPS62269069A - 抗原又は抗体濃度の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔＃を東上の利用分野〕 本発明は、抗原又は抗体濃度の測定方法に関する。

〔従来の技内及び発明が解決しようとする問題点〕

従来、不溶性担体粒子に物理吸着あるい（＝、共有結合
の形成によりむし体重たは抗原をｖ９」定化し、該担体
粒子に固定化された抗体又は抗原に抗原又は抗体を反応
させ、その反応の進行に伴う反応混合物の吸光度の増加
すなわち透過率の減少からその抗原、抗体反応の速度を
一定し、あるいは反応の終結時点の反応混合物の吸光度
又は透過率と、反応開始前の抗原又は抗体の吸光度又は
透過率との差を測定し、さらにその速度あるいは反応開
始前と反応終結時点との吸光度又は透過率の差から被検
体中の抗原又は抗体の温度を定置する方法が知られてい
る。

そして、この方法によれば、抗原又は抗体の濃度を高い
精度で迅連に定置しつる利点を有する。しかし、以下の
ような欠点が存在する。例えば不溶性担体粒子に抗体を
固定化した場合、抗原分子数が抗体分子数に比較して少
ない領域では抗原抗体反応物が、抗原分子数の増加に比
例して増加し、抗原分子数が抗体分子数より過剰の領域
では、余剰の抗原が本来ならば凝集に寄与しつる抗体分
子を中和し、抗原分子数の増加に対して、逆に抗原抗体
反応物が減少する。

前者は一般に抗原（抗体）過少領域と呼ばれ後者は一般
に抗原（抗体）過剰領域と呼はれる。

この現象により、一般に一つの抗原抗体反応物濃度に対
して、複数の抗原又は抗体ｍ度が対応する。ここで抗体
と抗原を入れ替え又も同一現象がみ−られる。

臨床検査に於ては、上記抗原過剰領域に属する被検液は
一般にその出現頻度は小さいが、抗原過剰領域に属する
被検液１／誤まって抗原過少領域のものと評価した場合
は、臨床上本人な過失となる。さらには、この様な誤ま
りが発生する測定方法は臨床上の有意性が乏しいものと
なる。従って従来この懐な誤まりの発生を防ぐ為に、同
一被検液に対して希釈率を変えた２以上の希釈液につい
て測定な行なう方法又は測定終了後さらに抗原又は抗体
を添加し、抗原抗体反応物濃度を測定し、抗原又は抗体
の添加により抗原抗体反応物濃度が変化しない場合に被
検液が抗涼過に領域又は抗体過剰領域に属すると判ＶＪ
１する方法等が提案されている。いずれの方法に於ても
同一被検液に対して複数回の測定か必要である。

しかるに、短時間に多数の被検液を測定しうろ自動測定
機が近年出現するに及び、単−測定操作内に抗原過剰領
域又は抗体過剰領域を含めた広い濃度範囲にわたる測定
方法の開発が望まれて来た。

〔問題を解決するための手段〕

本発明者らは、自動測定機による短時間に多数の被検液
を測定しつるに好適な測定方法を確立する目的で鋭意研
究して来た。

その結果本発明者らは、詳しくは後述するが、抗体を固
定化したラテックス懸濁液に抗原過少領域に属する抗原
濃度を持つ血清及び抗原過剰領域に属する抗原濃度を持
つ血清の２種の被検液を各々別々に添加し、例えば約２
秒攪拌した後それぞれ１８秒後と１２０秒後との吸光度
の差を測定したところ両波検液の示す吸光度の差が一致
した。すなわちこの現象は、前記した如く、一つの抗原
抗体反応物ｆＩＡ度に対し２つの異なる抗ｆｆＸ濃度が
対応している事を示す。そこで被検液重加後経時時間に
対する吸光度の変化を＃細に検討したところ、被検液添
加後、短時間と比較的長時間との吸光度の差を各々求め
ろと両波検液の核差の値が大きく異なる事を見出した。

さらに池々の抗原濃度を示す血清につき測定し１例えば
＠２図に示す如く、異なる３種の特定間隔時間に於ける
吸光度の差を各々求め、吸光度の差を縦軸とし、抗原濃
度を横軸として各特定間隔時間に於けるＶ＆、ｆｔ、度
の差と抗原濃度との間の対応曲線を得た。

従来、一定濃度の抗体に対する抗原抗体反応混合物濃度
は一定濃度の抗原に対して最高値を示し、この最高値を
示す抗体と抗原との濃度比を最適比と呼び、該比は抗体
と抗原各々の特性により決定されるものと考えられてい
た。

しかるに本発明者らは、一定！１度の抗体に対し異なる
３種のある間隔時間に於ける抗原抗体反応混合物濃度の
最高値を示す抗１１；を濃度、すなわち最適化を示す抗
原濃度が上記時Ｉｕ１の設定条件により大きく知なる事
を見出した。

さらに本発明者らは、異なる間隔時間に於ける少くとも
２つの対応曲線を使用する事により、１つの対応曲線の
みを使用する従来の測定方法と比較して広いＮｉ１度範
凹にわたり測定しつる事を見出した。

しかしなから、本発明者らはある間隔時間の設定条件に
よっては異なるｔｉｌｌ隔時間に於ける対応曲線であっ
ても、極大値を示す抗原濃度が間隔時間に於ける対応曲
線と比較して実質的に変化しない場合がある事も同時に
見出した。

本発明者らは、上記のような種々のケースの現象に基づ
き、更に種々の間隔時間に於ける対応曲線な得て、各対
応曲線上の極大値を示す抗原濃ｐｉを求めたところ特定
の条件を満たす少くとも２つの対応曲線ヲ使用する事に
より巾広い抗原又は抗体濃度につき測定しうることを見
出し本発明を完成させ、ここに提案するに至った。

即ち、本発明は、不溶性担体粒子に抗体又は抗原を固定
化し、該担体粒子に固定化された抗体又は抗原に既知ｍ
度の抗原又は抗体を反応させ、反応開始後の２点以上の
、ｉ！過した時点で上記反応に於ける反応物の光の吸光
度又は６高率の変化なｍｒ定し、一定間隔時間に於ける
吸光度又は６−過率の差と抗原又は抗体濃度との間の対
応曲線（Ａ）と上記一定間隔時間とは異なる特定間層時
間に於ける吸光度又は透過率の差と抗原又は抗体ｍｙｔ
との間の対応面１ｎ（ＢＪとの少なくとも２つの対応曲
線を求め、対応曲線（Ａ）と対応曲線（６）とを使用し
て未知濃度の被検液の抗原又は抗体濃度を測定するに際
し、対応面′１Ｍ因と対応曲線（Ｂ）との間に、対応曲
線穴の極大値が対応曲線（Ｂ）の−大値より低濃度側に
＃在し、対応曲線（Ａ）の極大値に相当する抗原又は抗
体濃度に於ける対応曲線中）の吸光度又は透過率の差は
該対応曲線穴の極大値の吸光度又は透過率の差の２分の
１以下であり、且つ対応面ｈ（２）の極大値に相当する
抗原又は抗体１１度に於ける対応曲線穴と対応曲線（Ｂ
）の池定単位時閣当たりの傾きは対応面Ｍ囚の方が対応
面＆１■よりも小さい関係を有する対応曲線（Ａ）及び
対応曲線（Ｂ）を使用することな特徴とするＢＬ原又は
抗体濃度の測定方法である。

本発明においては不溶性担体粒子に抗体又は抗原を固定
化し、該担体粒子に固定化された抗体又は抗原に抗原又
は抗体を反応させ、２点以上の経時的変化した時点で光
を照射し、上記反応における反工６物の光の吸光度又は
透過率の変化を測定し、一定時間に於ける該吸光度又は
透過率の差を求めることを行う。

一般に上記不溶性担体粒子は抗原、抗体反応に使用され
る公知のものが特に限定されず使用される。例えばその
平均粒子毬は１．０ｐｍ程度以下、好ましくはα０５〜
０．４μ讃の不溶性担体粒子が好適に用いられる。これ
に抗体又は抗原を固定化し、次いで被検液中の抗原又は
抗体を反応させ、その反応混合物の吸光度又は透過率を
例えば４００〜ｌＯＱＯｎｍ好筐しくは５００〜９５０
　ｎｆｌｌ　の範囲の波長の光線で測定し、その反応速
度ないしは反応開始前と反応終結時点との吸光度又は透
過率の差を求める。上記の方法に於いて被検液中の抗原
又は抗体はそのいずれかが含まれるのが一般的であるが
抗原及び抗体の混合物として使用することも出来ろ。

測定に用いる光線は反応の進行に対する＠光度又は透過
率が比較的大きく感度に優れかつ、被検液中に通常共存
する乳と、ヘモグロビン。

ビリルビン等の干渉が比較的少ない上記波長域が好適で
ある。

不溶性担体粒子の粒子径については、粒子径が大きい場
合凝集に伴う粒子径の変装置は大きいが凝集反応速度が
遅く、粒子径が小さいとブラウン運動性が活発で凝集反
応速度は速いが一次粒子径が小さい為にｋＰ集反応にと
もなう粒子径の変化波は小さい。本発明に於て以上の理
由より上記粒子径と測定波長との組み合せが好適である
。

前記不溶性担体粒子としては測定を行なう時に用いられ
る液体媒体に実質的に不溶性で、Ｔ！１記平均粒子径を
有する物質の粒子が使用される。

これらの粒子はすでに抗原抗体反応に反出されるものが
種々知られていて本発明にあってもこれらの公知の微粒
子が符に限定されず使用出来ろ。特に好適に使用される
もの？：例示すると例えＧｉ＋Ｈ’Ｊスチレン、スチレ
ン−ブタジェン共真曾体、スチレンーメタクリル酸共重
合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレインー
エチレンダリコールジメタクリレート共本合体の悼な乳
化重合により得られるｌｉＩ１ｍ高分子ラテックス等の
有機高分子物質の微粒子あるいはシリカ、シリカ−アル
ミナ、アルミナの優な無機酸化物又は該無ｍ［化物等に
シランカップリング処理等の操作で官能基を導入した無
機粒子等である。

本発明に於て抗体又は抗原は、特に限定的でなく、公知
のものが使用できる。好適に使用される代表的なものを
例示すれば、例えば、変性ガンマグロブリン、抗核因子
、ヒトアルブミン。

杭ヒトアルブミン抗体、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）
、抗ヒトＩｇＧ抗体、イムノグロブリンＡ　（ＩｇＡ）
、抗ヒトＩｇＡ抗体、イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）、
杭ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＥ　抗体、ストレプトリ
ジンＯ，ストレプト千ナーゼ、ヒアルロニターゼ、Ｃ−
反応性伽白（ＣＲＰ）、抗ヒトＣＲＰ抗体、アルファー
フエトブロテ、イン（ＡＦＰ）、抗ＡＦＰ抗体、＆胎児
性抗ｍ　（ＣＥＡ）、抗ヒトＣＥＡ抗体、ヒト紙毛性ゴ
ナドトロピン（ＨＣＧ）、抗）１ｃＧ　抗体、抗エスト
ロゲン抗体、抗インシュリン抗体、Ｂ型肝炎表向抗原（
ＨＢ、）、抗ＨＢｌｌ抗体、梅毒トレボネマ抗原、風鉢
抗涼、インフルエンザ抗原。

補体Ｃ１ｑ、抗Ｃ１，抗体、抗Ｃ１抗体、抗Ｃ４抗体、
抗トランスフェリン抗体２等である。

本発明にたてはこの様な不溶性担体粒子に測定対象の被
検液中の抗原又は抗体と反応しつる抗体又は抗原を固定
化する。

この場合上記固定化方法は物理的吸イｉ、化学的共有結
合の形成のいずれでも良いが、物理的吸着能の高い蛋白
例えは抗体や高分子Ｍ蛋白の固定には物理的吸着が好適
であり、物理的吸着能ノ低い水ルモン類、ハプテン類の
固定化ニハ化学的共有結合の形成が好適に用いられろ。

固定化方法について（ゴすでに多くの方法が提案されて
おり、固定化する抗体又は抗原の特性に合わせ公知の方
法から固定化方法を愈択すると良い。一般には分散媒中
で抗体又は抗原を必要に応じて緩衝液又は架橋剤存在下
に不溶性担体粒子を混合すれはよい。上記抗体又は抗原
を固定化した不溶性担体粒子の分散媒は特に限定されな
いが、不溶性担体粒子の保存中の安定性と、凝集灰石時
の反応の再現性の観点からみて、グリシン−水酸化ナト
リウム緩衡液、トリスー塩酸緩＆液、塩化アンモニウム
−アンモニアａｈ液、リン酸緩衝液等の緩衝液が好適に
使用される。

上記抗体又は抗原を固定化した不溶性担体粒子［ｊは符
に限定されるものではないが一般には該濃度が抗原抗体
灰石時点でｏ、ｏｏｓ　友社％以上好１しくは０．０２
〜０．２０真敞％となる様に選ぶのが好適である。

該Ｍ濁液を用いて被＠准甲の抗原又は抗体濃Ｆ！Ｌを測
定する方法（ま、筐ず該懸濁液と被検液とを実質的に一
定条件下で反応させ、反応開始後一定時ｎｕを経過した
後の一定ｆｉ１１隔時閣内に於けるｇ＆光度又は迫過軍
の差を求める方法である。

この方法に艷ては該懸濁液と被検液とを、好ましくは一
定条件の攪拌下に混会し、好ましくは攪拌終了後２〜３
抄以後の２以上の時点で沖Ｊ定するのが望ヱしい。

勿−被検液中の抗原又は抗体はこれらの混合物の状態で
便用してもよい。

この様な抗原又は抗体：濃度の測定方法は例えば以下の
如〈実施しつる。

１ず一定の平均粒子径を有する不溶性担体粒子にある一
定の抗体又は抗原を固定化し、該懸濁液を調製する。次
いで被検液中にＳ；まれろ抗原又は抗体と同−又はほぼ
同一の抗原又は抗体を、被検液の媒体と同−又はほは同
一の媒体な市いて希釈しあるいは濃細し、櫨々の既知ね
度の標準Ｖ検液を調製する。次いで一定条件）に於て該
懸濁液と該標準被検欣とを混会し、反応開始後の２点以
上の経過した時点で上記ズ応に展ける反応物の光の吸光
度又は透過率の変化を測定し、一定間隔時間に於ける吸
ｆｔ、ｇｔ又は透過率の差を得る。次にこの吸光度又は
透過率の差を例えば縦軸に、標準被検液中の抗原又は抗
体濃度を例えば横軸としたグラフにプロットする。

例えば、第２図には後述する実施例２のデータケプロッ
トした。核第２（Ａ）の曲線１に示すような被検液中の
抗原又は抗体濃度と反応混合物の吸光度又は透過率の差
の対応−１ｌｉＡ（２）即ち検蝕曲珈囚が得られる。

次いで標準被検液中の抗原又は抗体と同−又はほぼ同一
の抗原又は抗体を含む濃度未知の被恢液につき、上記対
応−８囚ｔｔ？また条件と同一条件Ｆで吸光度又は透過
率の差を得、上記対応曲Ｍ囚と対比する拳により被検液
中に含まれる抗原又は抗体１ｔｔｌ：一定しつる。しか
しながら、前記した如く一般には一つの抗原抗体反応物
濃度に複数の抗原又は抗体濃度が対応し、抗原又は抗体
ｍ度が一義的に決定できず、広い濃度分布を有する抗原
又は抗体濃度を単一操作により決定する事が困難である
。

そのために本発明にあっては次のような操作で対応−Ｎ
（Ｂ）を作成する。

すなわち、上記対応曲線（２）を得たと同一の測定操作
内に於て、反応開始後、好ましくは該懸滴液と被検液と
を攪拌し、混合した後さらに２〜３秒以上Ｍ過し実質的
に反応系が安定化した彼の上記一定ｒｌＩ隔時間とは異
なる特定間隔時１１」を下記の条件を満たす徐に設定す
る。すなわち、上記特定間隔時間の表定に当たり、まず
対応曲線囚の極大値に相当する抗原又は抗体濃度に於け
る特定間隔時開に対する＠光度又はカ過率の差が該対応
曲１Ｍ囚の極大値の吸光度又は透過率の差の２分の１以
下であり、且つ対応曲線囚の極大値に相当する抗原又は
抗体濃度に於けるＪ−一定間隔時間と特定間隔時 間内の測定単位時間当たりの吸光度又は透過率の変化蓋
すなわちＭｆ！が、一定間隔時間の場合の方が特定間隔
時間よりも小さい関係を有する徐に特定間隔時開１に設
定する。

上記条件を満たす限り上記特定間隔時間の設定は特に限
定的ではないが一般には、上記反応が開始した時点な０
秒とし、反応開始後８秒後とａ秒よりさらに経過した１
秒後との間を一定間隔時間とし、特定間隔時開を反応開
始後０秒後と０秒よりさらに経過した４秒後との間の特
定時間とした場合に、０秒が１秒以前にあり、４秒が６
秒以前にある場合すなわち特定間隔時間を一定間隔時間
よりも反応開始時点に近く設定する事によりｌｌＪ記特
記聞定間隔時間定が容易に行なえる。なお、０秒がａ秒
より後であっても削紀特定間隔時聞の条件を満たす限り
本発明は実施しつる。また０秒をａ秒と同一とした場合
本発明に於ける一定間隔時間と特定間隔時間に於ける吸
光度又は透過率の差は反応開始後の最低３時点の＠九反
又は透過率を測定することで求めつる。また４秒とａ秒
とを同一とした場合も同礒して最低３時点の測定で良い
。

樟準被検液について得た上記特定間隔時間に於ける吸光
度又は透過率の差を例えば縦軸に、標準被検液中の抗原
又は抗体濃度を例えは横軸としたグラフにプロットする
と、被検液中の抗原又は抗体′ｍ曳と反応混合物の吸光
度又は透過率の差の対応−！１ｉｔ（Ｂ）が得られろ。

かくして得られた対応−１１Ａ（Ｂ）の極大値に比して
対応曲線（Ａ＋の極大値は低濃度側にある。

本発明の抗原又は抗体濃度の測定に際しては前記対応曲
線囚と対応曲線田ンとの少くとも２つの対応曲線を使用
する。

２つの対応曲線の使用方法については特に限定的ではな
く、例えば以下の方法により組み合わせて使用できる。

まず対応曲線（Ｂ）上に、判別に用いる基準となるｇ！
ｋＪＪｔ度又は透過率の差の基準値を設ける。基準値は
対応面ｔｉｊ囚の極大値よりも低濃度側に存在し、且つ
基準値が測定する度毎に再現できろ抗原又は抗体濃度に
ついて任意に設定する事ができろ。即ち濃度未知の被検
液の測定につき、上記対応曲線囚及び対応曲線（Ｂ）？
：得た条件と同一条件ドで吸光度又は透過率の差を得、
上記対応曲線因及び対応曲線（Ｂ）と対比する。次に対
応曲線（Ｂ）との対比より該被検液に於ける吸光度又は
西過率の差の値と上記基準飴との大小を比較し、該層の
値が基準値以上であれば対応曲線（Ｂ）により検討し、
該層の値が基準値未満であれば対応面ｆｉｔ（Ａｌによ
り横置する。

ここで、基準値は対応曲線固止に設定しても良く、また
対応曲線面及び対応曲糎■以外の変化量に基準値を設定
しても良い。

抗原又は抗体濃度の臨床上必要とする濃度範囲を上記２
つの対応曲線では測定し得ない場合はさらに対応曲線を
追加することができる。新たに対応曲線を対応曲線（２
）よりも低濃度側に設ける場合は上記対応曲線（Ａ）を
対応曲線（Ｂ）とし、新たに設ける対応曲釧を対応曲線
（２）として、前記の対応曲線面と対応曲線（Ｂ）との
闇の条件を満たす様にする。

一方、新たに対応曲線を対応面１１３（Ｂ）よりも高濃
度仰に設定する場合は、上記対応面１ＩＩＪ１（Ｂ）を
対応曲線（Ａ）として、ｍＪ記の条件な肩た丁球に新た
に対応曲線（Ｂ）を得る。

なお、一定間隔時間及び特定間隔時間の設定については
吸光度又は透過率の変化ｋを勘案し、測定する抗原又は
抗体ごとに好適な条件を選択すれば良い。

以上の説明で明らかなように、例えば第】図に示す如く
一定間隔時間に於ける光の吸光度又は透過率の差が同一
でかつ抗原濃度が異なる２種の被検液について特定間隔
時間に於ける光の吸光度又は透過率の差を求めると両者
は明らかに異なる。そして少くとも２つの対応曲線を組
み合わせて使用する事により被検液中の抗原又は抗体ｍ
度を一義的に決定する事が可能となる。

ｌｔｌ記したように第２図は後述する実施例２のｖＮ２
表に示したデータをプ四ットしたものである。

すなわち、第２図に於ける３種の対応曲線につき図中左
上に位置する対応曲線より順に曲線１、曲線２２曲！１
３とした場合、本発明でいうところの対応面１Ｍ（ＡＪ
と対応面Ｍ（Ｂ）に該当する組み合せは以下の如くなる
。

組み合せ例１として対応曲線面が曲線１であり、対応曲
線（Ｂ）が曲線２の場合、組み合せ例２として対応曲線
面が曲線１であり対応面＃ｊ（Ｂ）が曲＆ｉ３の場合、
組み合せ例３として対応曲線面が曲線２であり、対応曲
線（６）が曲線３の場合がある。しかも対応曲線面と対
応面ｍｌ　（Ｂ）とに該当する各曲線の間には、対応面
１Ｍ（Ａ）の極大値が対応曲線のンの極大値より低濃度
側に存在し、対応曲線面の極大値に相当する抗原又は抗
体濃度に於ける対応面Ｎ（Ｂ）の吸光度又は透過率の差
は核吋応曲線囚の極大値の吸光度又は透過率の差の２分
の１以下であり、且つ対応面！（ＡＪの極大値に相当す
る抗原又は抗体濃度にたける対応曲線■と対応曲線（段
の測定単位時間当たりの傾きは対応曲線面の方が対応面
！’ｊ（Ｂ）よりも小さい関係がある。

従って、抗原又は抗体濃度の測定に際しては必要に応じ
て上記各組合せ側を適宜選択すればよい。

前記説明の現象の説明として本発明者らは、この現象が
以下の叉部過程に従っているものと推定している。すな
わち不溶性担体が凝集に到るまでにまず遊離の抗原と不
溶性担体に固定化された抗体との間の反応（１）が生じ
、次いで不溶性担体と反応した抗原と他の不溶性担体に
固定化された反応にを与しつる抗体との間の反応（２）
とから成る。各反応はそれぞれの抗原と抗体との一突頻
度すなわち抗原濃度と抗体濃度の禎に依存しており、第
１ｒ！ＸＪに示した抗原過少領域に於ては抗原過剰領域
に於ける場合と比較して反応（１）に於ける遊離抗原濃
度が低く反応（１）の速度が相対的に低いのに対し、反
応（２）に於ける反応に寄与しつる抗体の濃度が扁い為
に反応（２）の速度が相対的に高くなる。この為反応初
期に於ては反応物の濃度が抗原過！１１＋１領域に属す
る被検液について高く反応の進行とともに抗原過少領域
に属する被検液について反応物の濃度が増し、結果とし
て一定間隔時間に展ける光の吸光度又は透過率の差が、
両波検液で一致したものと考えている。本発明に於ては
一定ｉｔ＋隔時間と比較して、反応が開始した時点によ
り近い特定間隔時間を設定する事により、高濃度側へ測
定範囲が拡大できたものと考えている。上記説明に於て
抗原と抗体とを入れ替えても同じである。

〔発明の効果〕

本発明による抗原又は抗体濃度の測定方法は、従来技術
に於いて抗原過剰又は抗体過剰か否かの判別が必要であ
った被検液中の抗原又は抗体濃度範囲に対し、抗原過剰
又は抗体過剰か否かの繁雑な判定操作を用いず被検液中
の抗原又は抗体濃度を一義的に決定でき、再検査の必要
もない。

さらに、本発明による測定方法に於いては吸光度又は透
過率の測定は最低３回で実施できる。

従って、本発明による抗原又は抗体濃度の測定方法は、
短時間に多数の被検液を処理する自動測定の場合に特に
有用であり、かつ、自動測定機に対する制約も少なく、
広く一般の自動測定機への実施ができる。

〔実施例〕

以下、実施例によりさらに本発明の詳細な説明するが本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施Ｎ１ （１）Ｃ−反応性蛋白質測定試薬の調製平均直径０．１
２３μｍのポリスチレンラテックス粒子を塩化アンモニ
ウム−アンモニア緩衝液（ＰＨ＝＆Ｏ）で希釈しラテッ
クス濃度が１重１１％の懸濁液を調製する。次いでＣ−
反応性蛋白質（以下ＣＲＰ　　と略す）をヤギに免疫し
て得た抗ＣＲＰ血清より塩析処理により分画した抗ＣＲ
ＰヤギＩｇＧ分画を塩化アンモニウム−アンモニア緩衝
液（ＰＨ＝ａｏ）で希釈し、蛋白濃度２ｍｙ／ＩＬｔの
溶液を調製する。

上記ラテックス懸濁液１容に抗ＣＲＰヤギＩｇＧ分画の
溶液１容を加え３７℃で２時間反応させた。次いで遠心
分離し、上清を除去した後洗でんをウシ血清アルブミン
を０，０５重量％の濃度で添加した塩化アンモニウム−
アンモニア緩衝液（ＰＨ＝８．ｏ）で再分数しラテック
ス濃度を０．０５重社％にｇ４製し、ＣＲＰ測定試薬を
得た。

Ｌ２）　　測定方法 日立製作所製Ｕ−３２００屋自記分光元度計の測光部に
、温度調節器及びマグネット式攪拌装置！２１に取り付
けた装置により吸光度を測定した。光路長１（ｌｏ＋の
ガラス製光学セルに円筒状の攪拌子を入れ、次いで（１
）で得たＣＲＰ測定用試薬１９９０μｊを分注し、測光
部に挿入し、３７℃に保濁した。

次いで、該攪拌装置によりＣＲＰｍ定用試薬用試薬しつ
つ、被検液１０ｐ１　を添加した。

添加と同時に＠尤度の測定を開始した。＠光度の測定は
、５８０　ｍｍ　の波長の光線を用いて行なった。なお
攪拌は被検液添加後３秒で停止した。

（３）　　既知試料の測定 ＣＲＰ濃度２４０ＩＩ９／ｄｔの精製ＣＲＰ溶液をＣＲ
Ｐを吸収処理して実質的にＣＲＰを含まない状態とした
ＣＲＰ不♂不活血清り希釈し、ＣＲＰ　濃度がα１０．
０．２５．０．５０．１．０．２．５．５．０゜ｔ　　
ｏ、　　】　５．　２０．　３０．　４０．　６　ｏｍ
ｙ／ｄｊの被検液を得た。

（２）の測定条件下で上記１２８ｍの被検液及び塩化ア
ンモニウム−アンモニア緩衝液につき吸光度を各５回測
定した。

得られた吸光度のうち、被検液添加後１分後と５分後の
吸光度より一定ｆｉｌｌ隔時重Ｉ１．：対する吸光度の
差Ｙ得た。このｋｊ果を第１表に示した。

次に、第】表に示した一定時間に対する吸光度の差の平
均値を縦軸とし、添加被検液中のＣＲＰｉｌＰＩＫを横
軸として第３図に示す対応曲線（５）を得た。

対応−ｇＡ囚に於て、極大値を示す抗原濃度は２０１１
９／＃である。該濃度に於ける一定間隔時間内の吸光度
の差は、６１表より０．５５０８であり、−盲側定単位
時間当たりの傾きは０２１３７７７分である。

次いで、抗原濃度２ｏｘｙ／ｄｉの測定データにもとづ
き吸光度の差が０．５５０８の２分の１゜すなわち０．
２７５４以下で、且つ測定単位時間当たりの傾きが０．
１３７７／分を越す特定間隔時間を検討した結果、特定
間隔時間として被検液添加後１２秒後と１分後の間の４
８秒間を得た。

上記特定間隔時間に対する吸光度の差を求め、結果を第
１表に示した。第１表に示した如く抗原１１度２０１９
／ｄｉに於ける特定間隔時間内の吸光度の差は０．２６
８０であり、上記０．２７５４　　よりも小であり、且
つ特定間隔時間内の測定単位時間当たりの傾きは０．６
７００／分であり、上記０．１３７７／分より大を示し
、本発明でいうところの特定間隔時間の要件を満たして
いる。

次いで第１表に示した特定間隔時間に対する吸光度の差
の平均値を縦軸とし、添加被検液中のＣＲＰ　１ｕｌｌ
を横軸として、第３図に示す対応−ｌＩＩ但】を得た。

対応面ｍ（Ｂ）に於て極大値を示す抗原濃度は４０１１
９７ｄｌであり、対応曲線（Ａ）に於ける極大値よりも
高濃度側にある。

ここに於て該第の籠をＸ、該抗原濃度をＹｍｇ　／　ｄ
ｌとすると、対応曲線囚については抗原濃度】Ｏ叩／ｄ
以下の範囲で Ｙ＝　６ＸＰ　（１０１１ｌｎ：ｃ＋１２０４）　　（
式１）により良好に近似できた。

一方対応曲線■）については抗原濃度３０叩／ａ以下の
範囲で Ｙ＝ｅｚｐ（１，０８４Ａ！ｎｘ＋４．４３４）Ｃ式２
）により良好に近似できた。

次に（式１）及び（式２）により、良好に測定しつる抗
原濃度の′Ｆ限を測定ごとに得られる吸光度の差の再現
性と、（式１）及び（式２）により得られろ抗原ｉ！１
度の正確性から次の様に判断した。すなわち、再現性の
指標として第１表に示した変動係数を用いて、変動ｇｆ
、ｅ！１．が５％以下の場合を高度の再現性を有する抗
原濃度、５％を越し１０％未満の場合を中程度の再現性
を有する抗ＭＡ：ｌａ良、ｌＯ％′ｌｔ越す場合ｖｔ度
の再現性を有する抗原濃度とすると、高度の再現性を有
する抗原濃度の下限は一定間隔時間に対する吸光度の差
についてはｏ、ｚｓｍｇ／ｄ／となり、一方特定間隔時
間に対する吸光度の差については１．０■／ａとなる。

この画濃度に於ける（式ｌ）及び（式２）に対する正確
性は第３図からも明らかな如く良好であった。従って（
式］）及び（式２）により、良好に測定できろ抗原ｌｓ
ｉ度の範囲は各々０．２５から１０藁ｑ／ｄｔ及び３０
から３ＯＮ９７ｄｌとなった。さらに測定上限の抗原濃
度を測定下限の抗原濃度で除した値は（式１）について
は４０倍となり、（式２）については３０倍であった。

しかしながら、ヒト血清中のＣＲＰ濃度は０１９７ｄｌ
から３ｏｍｙ／ｄｌの濃度範囲に分布しており、健常人
と異常との境界濃度が０．３■／ａである。臨床上はａ
常人を誤まって崇常としたり、異常を健常と判断した場
合、及び極めて高い抗原Ｓ１度を比較的低い抗原濃度と
判断した場合は極めて重大な過失となる。

従来測定技術である単一の対応曲線のみを用いて測定す
る方法に於いて、例えは第３（Ａ）の対応面ｍ（Ａ）Ｙ
用いた場合では、ＣＲＰ濃度３０１９／ｄｉ（１）ｆｆ
Ｊｉ清ヲ１ｌＫ１　ツテ１５Ｑ／＃ト判〜１する可能性
があり、一方対応曲線■】のみを用いた場合では健常人
と異常との境界濃度付近の再現性　び正確性が劣ってお
り、健常と異常を精良良く判断し得ない。

しかしながら、不発明による少くとも２りの対応曲線を
用いる測定方法として、例えば第３（Ａ）の対応曲ｆＪ
！囚と対応曲線（ト）とを用い、対応曲線（Ｂ）につい
て抗原１１度５■／ａに対応する該吸光度の差０．０７
４３１基準値とし、（式］）と（式２）と基準値とな組
み合わせて使用する場合では、抗原濃ｙ１０．２５Ｑ／
＃から３０ｍｇ／ｄｉの間の１２０倍の範囲で良好に測
定ができる。本発明による方法では、臨床上は極めて柿
ではあるが存在する３０１９／ａ１に越す抗原濃度の場
合も６ｏｗｒｙ／ｄｉであれば誤まって低値と判１５１
する事がなく、６０即／ａを越す抗原濃度は実質的に存
在しない。

一方抗原濃度の測定下限は抗原濃度０．２５８９／ｃＬ
ｔまで高度の測定再現性を示し、さらにｏ、　１ｏ　１
９／ｄｌに於いても中程度の定量性を有している為、健
常と異常の判別が精度良く行なえろ。

（Ａ）　未知試料の測定 ＣＲＰ濃度宋知の血清を（２）の測定方法で測定したと
ころ一定間隔時間に対する吸光度の差は０．５１２４で
あり、特定１ｊ１９１１時間に対する吸光度の差は０．
３２１２であった。後者は基準値０．０７４３　　より
大であったので（式２）により検ＭＬ、ＣＲＰ濃度２４
．６属ｑ／ｄｌを得た。

次いで上記血清をＣＲＰ　　不含血清で５倍希釈した血
清を被検液として（２］の測定方法で測定したところ、
一定間隔時開に対する＠光度の差は０．２０２９　　で
あり、特定間隔時間に対する吸光度の差は０．０７２６
であった。後者は基準値α０７４３　より小であった為
、（式１）により検量し、ＣＲＰ濃度４．９１１１９７
ｄｌを得た。

さらに上記５倍希釈被検液をＣＲＰ　　不含血清により
さらに５４＠並びに２５倍希釈して得た被検液も同球に
測定した結果ＣＲＰ　　Ｉｌｉ度は各々α９７．０．２
０であった。

本実験とは別に上記ｃｈ、ｐ　　ｍ度未知の血清をＣＲ
Ｐ不含皿消で５倍希釈した。被検液をヘキスト社製−元
免疫拡散法によるＣＲＰ定置試薬であろＬＣパルチゲン
ＣＲＰによりＣＲＰ濃度を測定したところ４８ｇ９／ｃ
ｕを示し、本発明による方法により皿清甲の濃度が広範
囲に分布するＣＲＰ　　の測定に於て抗原過少領域から
抗ｆＩＡ過刺領域にわたり良好に測定する事を示した。

実施例　２ （１）　　Ｃ−反応性蛋白質測定′＃、薬の調製平均直
径０．１４２μ扉のポリスチレンラテックス粒子を用い
た以外は実施例１と同様にしてＣＲＰ油定試薬Ｖ得た。

（２）測定方法 実施例１と同様にして測定した。

（３）既知試料の測定 実施例１と同様にしてＣＲＰ　　濃度が０．１０゜０．
２５．０．５０．１０．２５．５．０．１０．１５゜２
０．３Ｇ、４０．ｓｏ、ｓｏ、ｘｏｏｍｇ／ｄｊの被検
液を得た。（２］の測定条件下で上記１４種の被検液及
び塩化アンモニウム−アンモニア緩衡液につ１１吸光度
ｌ各５回測定した。反応開始１分後と５分後の吸光度よ
り一定間隔時間に対する吸光度の差を得た。この結果な
第２表に示した。

次に第２表に示した一定間隔時間に対する吸光度の麦の
平均ｔＩｔｔ−縦軸とし、添加被検液子のＣＲＰ　　濃
度すなわち抗原濃度を横軸として第２図に示す曲線】を
得た。次いで実施例１と同様に特定間隔時間として反応
開始０．２分と２分後の間の１．８分間を得た。

上記特定間隔時間に対する吸光度の差を求め、結果を第
２表に示し、第２（Ａ）の曲線２を得た。

さらに上記特定間隔時間部ち反応開始０，２分と２分後
の間の１．８分間を一定間隔時間とした場合の特定間隔
時間を、実施例１と同様にして求め特定間隔時間として
反応開始０．１分後とα５分後の間の０．４分間を得た
。かくして得られた特定間隔時間に対する吸光度の差を
求め、結果を第２表に示し、第２（Ａ）の曲＃ｉＩ３’
！’得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗体を固定化した不溶性粒子担体の懸濁液に、
対応する抗原を添加し、添加後の時間に対する！ｌｋ光
度の変化量を示すグラフである。 １中実線は抗原過少領域に属する被検液の場合で点線は
抗原過剰領域に属する被検液の場合の結果を示す。 第２図は、実施例２のＩａ２表に示したデータにつぎ横
軸を抗原濃度とし、縦軸を吸光度の差としてプロットし
て得た対応曲線を示す。曲線１は反応開始ｖｋ１分と５
分１曲線２は反応開始、後α２分と２分９曲義３は反応
開始後０．１分と０．５分の各間隔時間に対応する。 第３図は、実施例１のａＳ１表に示したデータにつき横
軸を抗原濃度とし、縦軸を（ｉ！光度の差としてプロッ
トして得た対応曲線を示す。曲線Ａは対応曲線Ａｔｔ曲
線Ｂは対応曲線Ｂを示す。 特粁出纏人 徳山曹達株式公社 ＃旋え４々ａ邊０紅免翳間（制 ヴ硬・−Ｃ− ヴ〈懺Ｃ−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 不溶性担体粒子に抗体又は抗原を固定化し、該担体粒子
   に固定化された抗体又は抗原に既知濃度の抗原又は抗体
   を反応させ、反応開始後の２点以上の経過した時点で上
   記反応に於ける反応物の光の吸光度又は透過率の変化を
   測定し、一定間隔時間に於ける吸光度又は透過率の差と
   抗原又は抗体濃度との間の対応曲線（Ａ）と上記一定間
   隔時間とは異なる特定間隔時間に於ける吸光度又は透過
   率の差と抗原又は抗体濃度との間の対応曲線（Ｂ）との
   少なくとも２つの対応曲線を求め、対応曲線（Ａ）と対
   応曲線（Ｂ）とを使用して未知濃度の被検液の抗原又は
   抗体濃度を測定するに際し、対応曲線（Ａ）と対応曲線
   （Ｂ）との間に、対応曲線（Ａ）の極大値が対応曲線（
   Ｂ）の極大値より低濃度側に存在し、対応曲線（Ａ）の
   極大値に相当する抗原又は抗体濃度に於ける対応曲線（
   Ｂ）の吸光度又は透過率の差は該対応曲線（Ａ）の極大
   値の吸光度又は透過率の差の２分の１以下であり、且つ
   対応曲線（Ａ）の極大値に相当する抗原又は抗体濃度に
   於ける対応曲線（Ａ）と対応曲線（Ｂ）の測定単位時間
   当たりの傾きは対応曲線（Ａ）の方が対応曲線（Ｂ）よ
   りも小さい関係を有する対応曲線（Ａ）及び対応曲線（
   Ｂ）を使用することを特徴とする抗原又は抗体濃度の測
   定方法。