JPS59171863A - 抗原抗体反応の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗原抗体反応の測定方法に関する。

従来、不溶性担体粒子に担持させた抗体又は抗原と抗原
又は抗体あるいはその混合物とを液体媒体中で反応させ
、その反応の進行に伴う反応混合物の透過率の減少（す
なわち吸光度の増加〕からその抗原抗体反応の速度を測
定し、さらにその速度から被検体中の抗原又は抗体の濃
度を定量する方法が知られている。

そして、この方法によれば、抗原又は抗体の濃度を高い
精度で、迅速に定量しうる。

しかしながら、たとえば抗体を感作した不溶性担体の場
合、抗原分子数が抗１体分子数に比して過剰な領域では
、過剰な抗原が本来ならば粒子の凝集に寄与しうる抗体
をブロックしてしまい、みかげ上、抗原抗体反応の進行
が阻害される、いわゆる抗原過剰域として知られる現象
がみられ（抗体と抗原が入れ替っても同様である）、こ
のような場合には、一つの反応速度に対応して複数の濃
度が存在することになる。

臨床検査においては、上記抗原過剰を呈するような抗体
の出現頻度は小さく、またそういう場合には、他の臨床
知見から注意書きが添えられるので、予め検体を希釈し
て検査に供するのが一般であった。しかるに、自動機械
の出現により、短時間に大量の検体を処理するときには
、出現頻度はきわめて小さいとはいえ、臨床的に重要な
この種の抗原過剰検体を発見する技術が必要とされる。

たとえば、このような場合、正確な測定を行なうために
は、同一検体に対して希釈率を変えて一度以上の測定を
行なう２回希釈法等をいつも行なう必要がある。

そこで、本発明者らは、自動化による多数検体の迅速処
理にさらに好適な測定方法を見出すべく種々検討した結
果、本発明に到達した。

すなわち、本発明の要旨は、不溶性担体粒子に抗体又は
抗原を支持させ、この支持された抗体又は抗原に、抗原
又は抗体あるいはその混合物を液体媒体中で反応させて
、この反応混合物に反応開始後２以上の時点で光を照射
し、一定時間内におけるその反応混合物の透過率の減少
を測定する方法において、抗原又は抗体の濃度既知の試
料を用いて得られる反応速度と濃度の対応曲線ておいて
、一つの反応速度に複数の濃度が対応する場合に、この
対応曲線から未知試料中の抗原又は抗体の濃度を決定す
るにあたり、１）抗原又は抗体の濃度既知の試料を用い
て透過率の時間的変化を特徴づける曲率の大きさを測足
し、これと上記対応曲線とから、濃度を一義的に決定し
うる濃度測定可能領域の判定基準を設定し、ついで１１
）未知試料の透過率の時間的変化を特徴づける曲率の大
きさを測定し、その曲率の大きさからその抗原又は抗体
の濃度が上記濃度測定可能領域に属するか否かを判足し
、１１１）属する場合には、その反応速度より未知試料
中の抗原又は抗体の濃度を決定する、ことよりなること
を特徴とする抗原抗体反応の測定方法にある。

以下、本発明の詳細な説明する。

上記のとおり、本発明は不溶性担体粒子に抗体又は抗原
を支持させ、この支持された抗体又は抗原に、抗原又は
抗体ある゛いはその混合物を液体媒体中で反応させて、
この反応混合物に反応開始後ユ以上の時点で光を照射し
、一定時間内におけるその反応混合物の透過率の減少率
を測定する方法において適用される。すなわち、平均粒
径が／ｉμ程度以下、好ましくは０．７〜７．０μの不
溶性担体粒子を用い、これに抗体又は抗原を担持させ（
感作し）、これに被検体中の抗原及び／又は抗体を反応
させ、その反応混合物の透過率を、通常ｏ、ｔｉ−〜コ
、ダμ、好ましくはＯ馬〜／、りμの範囲の波長の光線
で測定してその反応速度を求めることにより、被検体中
の抗原及び／又は抗体の濃度を測定することができる。

用いる光線は、不溶性担体粒子の平均粒径の少なくとも
／、７倍の波長のものが好適である。

不溶性担体粒子としては、測定を行なう時に用いられる
液体媒体に実質的【不溶性で前記平均粒径を有する有機
高分子物質の微粒子、たとえばポリスチレン、スチレン
−ブタジェン共重合体のような乳化重合により得られる
有機高分子のラテックス、あるいはシリカ、シリカ−ア
ルミナ、アルミナのような無機酸化物等が用いられる。

本発明方法においてはこのような不溶性担体粒子（たと
えばラテックス粒子）に、測定しようとする被検体中の
抗原及び／又は抗体と反応しうる抗体又は抗原を担持さ
せる（感作する〕。

この場合、担体に対し抗体又は抗原を物理的に吸着させ
てもよいし、化学的に吸着させてもよい。抗体ば蛋白質
で構成されており、一方抗原はたとえば蛋白質、ポリペ
プチド、ステロイド、多糖類、脂質、花粉等種々のもの
からなる。不溶性担体粒子にこのような抗体又は抗原を
担持させる方法はすでに多くの方法が提案されている。

不溶性担体にたとえばハプテンのような不完全抗ぶを担
持させる場合は、その担体をたとえばカップリング剤に
より化学的に変性して、その抗原を化学的に吸着させる
のが有利である。

上記抗体又は抗原を感作した不溶性担体粒子（たとえば
ラテックス粒子）のａ度が通常０．０７重量係以上の懸
濁液、好ましくはｏ、ｉ　−１重量係程度の懸濁液を用
いる。

前記感作担体を液体媒体中において、抗原又は抗体ある
いはその混合物と実質的に一定条件下で反応させ、反応
開始後の一定時間後の反応混合物の単位時間当りの透過
率の減少率を測定することにより抗原抗体反応を定量的
に測定しうる。この減少率の測定は、反応混合物の構成
成分である感作担体と被検液中の抗原又は抗体あるいは
その混合物（又はそれらの反応生成物）との反応開始後
、抗原抗体反応の進行が少なくとも安定した時点以後に
おいて行うのが望ましい。

このためには、感作担体と、抗原又は抗体を含む被検液
とを、好ましくは攪拌下に混合し、好ましくは混合後た
とえば、２〜３秒以、後の反応混合物について、その透
過率を測定するのが好適である。

このような抗原抗体反応の測定方法は、たとえば以下の
ようにして実施しうる。

まず、ある一定の平均粒径を有する不溶性担体にある一
定の抗原又は抗体を感作して感作担体を調製する。他方
、実際に測定しようとする被検液中に含有される抗体又
は抗原あるいはその混合物と同一の抗体又は抗原を用い
て、それを種々の既知濃度で被検液の媒体と同−又はほ
ぼ同一の液体媒体中に含有する種々の濃度の標準被検液
を調製する。

次に、上記感作担体と上記標準被検液とを用いて、両者
を混合させ、両者の抗原抗体反応の進行状態が安定した
段階で、経時的に上記反応混合物の透過率を測定する。

たとえば、反応温合物の透過率が定常的に減少する段階
において、前記各種ａ度の被検液について、その各反応
混合物の単位時間当りの透過率の減少率を測定する。

次に、この減少率を、たとえば、標準被検液中の抗原又
は抗体濃度を横軸とし、たとえば減少率を縦軸としたグ
ラフにプロットすると、標準被検液中の抗原又は抗体濃
度と、反応混合物の透過率の単位時間当りの減少率（反
応速度）との対応曲線が得られる。

そこで・、特定の抗原又は抗体について、予め上記のよ
うな対応曲線を作成しておき、それと同一の抗体又は抗
原を含有する濃度未知の被検液について、上記と同様の
反応速度を測定し、これを前記対応曲線と対比すること
により、被検液中に含有されろ抗体又は抗原の濃度を定
量的に測定しうる。

本発明は、上記の測定法において、既知濃度の試料を用
いて、得られる反応速度と濃度の対応曲線において、一
つの反応速度に複数のａ度が対応する場合に、この対応
曲線から未知試料の濃度を決定するのに有用である。

すなわち、抗原濃度未知の試料の反応速度を測定して、
濃度を決定するためには、 ／）予め既知試料の測定によって、抗原濃度と反応速度
の対応曲線が求められていること、ツ）未知試料の反応
速度と、この対応曲線から、濃度が一義的に求まること
、 が必要であるが１．ｌ）は一般的には成立しない。

すなわち、抗原濃度の増加とともにはじめは反応速度も
増加するが、途中から反応速度の増加の度合いが低下す
る領域が出現し、さらに抗原濃度が増大すると、むしろ
反応速度が減少する領域が現われる（第ｑ図、第７図の
破線部）。

また、減少してから再度増加、減少する場合もある（第
１図の破線部）。

このような場合には、一つの反応速度に複数の濃度が対
応するため、未知試料の濃度が一義的に足まらない。

この現象は、たとえば次のような原因によると考えられ
る。

ラテックス試薬が凝集するには、７つの抗原分子に対し
て、異なったラテックス粒子表面に吸着している抗体分
子が結合することが必要である。ところが、抗体分子数
に比して大過剰の抗原分子が存在すると、それぞれの抗
体分子が単独に一分子ずつの抗原と結合して、粒子間の
結合が成立しない状態となるため、抗原は増加するにも
かかわらず、むしろ反応速度は低下するという結果にな
る。

同様の現象は、多価抗原と抗体との、凝集物（抗原抗体
複合物）の生成量と抗原濃度との関係において広く知ら
れており、こうした現象のおこる抗原濃度域は、抗原過
剰域とよばれている。

このような現象がおこる領域においては、存在する抗原
量に見合ったラテックス凝集反応が期待できないか、又
は、抗原量に見合った透過率変化が期待できないわけで
あるから、未知試料の０度測定には不適当な領域ともい
えろ。

したがって、未知試料の濃度測定に際しては、その抗原
濃度が、濃度測定可能領域にあるかどうかをまず、判定
ずろ必要がある。判定の結果、その領域内であることが
わかれば、反応速度と対応曲線から濃度を一義的に定め
ることができる。濃度測定不能の領域であることがわか
れば、試料を希釈して測定可能領域になるようにして測
定することができろ。

そこで、本発明の測定方法についてさらに説明するに、
まず、既知６度の試料を用いて透過率の時間的変化を特
徴づける曲線の大きさを測定する。この曲率は透過率が
反応の進行とともに減少する程度及びその時間に対する
依存性から定量的に導ｌｉｔされる値であって、この定
量化は、反応曲線の時間的変化を表わす種々のパラメー
ター（たとえば、特定時間内での平均変化速度、その−
次及び二次差分値、％定時刻での透過率、あるいはその
％定時刻での一次または二次の微分値、又は上記パラメ
ーターの加減乗除による組み合せ〕によって適宜決定す
ることができる。

透過率の時間的変化速度が抗原抗体反応の進行どともに
減少する割合、及びその時間依存性から反応曲線の曲率
な求め、濃度測定可能領域を判定するための具体的な手
順はたとえば以下のとおりである。

（１）一定間隔Δｔで（ｎ　−／　）個に区切られたあ
る時間区間ＣｔＩＩ　ｔ２＋・・・・・ｔｑ　］　（ｊ
ｉ　−’ｕ１−１−Δｔ）において、各時刻’Ｌｉ　　
Ｋおける透過率の値をｔ、（ｉ＝／、ユ、・・・・・・
、ｎ）としたとき、ｎ個の（ｔＩＩｘ、）の組を使って
透過率（Ｘ）を時間（１））の二次式で最小二乗近似し
た近似式 ｘ＝ａｔ２−１−ｂｔ−４−ｃ　（ａ、　ｂ、ｃは定数
〕を求める。このとき、反応曲線の曲率は係数ａの　（
大きさによって表わされるので、濃度測定可能領域の判
別基準として測定された反応曲線に対する近似式の係′
ｌｙ、ａが ｈくｋ（ｋは定数） のとき得られる反し曲線は測定可能領域に属する。

なお、ここでｋは、濃度既知の試料を同一測定条件下で
反応させた時の反応速度と濃度との対応曲線及び上記手
順で求められろ近似２次式の係数ａとから予め定められ
る定数である。

また反応速度とは、ｎ個の（ｔｌ、　Ｘｔ　）の組を使
って常法に従い求められた透過率の時間変化速度であっ
て、最も簡単にはＶ　＝　（Ｘｎ　”ｌ）／Ｃｔｎ”ｌ
）として平均値を求めてもよく、あるいは、ｎ個の（ｔ
Ｈ，Ｘｔ）から■＝αｔ＋βの形の一次近似式を最小コ
乗法によって求めてもよく、その他、通常考えられる一
般に知られた如何なる手順によって定めてもよい。

２）　　（１）と同様に定められた時間区間ＣｔＩＩ　
”２１・・・・”　］　（１−’　Ｉ　”””　、ｎｇ
　ｔｌ　　ｔ、、−Δｔ）において、時刻〔ｔｉ、ｔｉ
−１〕（１＝２．・・・・・・、ｎ）における透過率の
平均変化率をＶ、（ｉ＝Ｊ。

−・・＋　ｎ）とするとき。

ｖｋ〉Ｖｋ−１（）、≦に≦ｎを６４だす定数５）が成
り立つならば、得られた反応開破は濃度測定Ｄｆ能領領
域属する。

なオ６、ここでｋば【４度既知の試、料を同一判定条件
下で反応さセたとぎの反応速度と４度との対応曲線及び
上記手順で定められろ平均変化率■１から＞Ｚめら７′
１．る定数である。

（３）　　Ｃ２）において Ｖｌ−Ｖｎ’）α が成り立つンよらば、得られた反応曲房１・土測定可能
領域に属する。

ここでαは濃度既知の試料を同一測定条件下で反応させ
た時の反応速度と濃度との対ｋ。

曲線及び上記手順で定められろ平巧変化率（”＋　＋　
■ｎ　）の各組（測定した濃度既知の試料の数だけ得ら
れる）から躍められる定数である。

（４）　　（２）において （ｔｎ−ｔ、　）　Ｖ、　＝Ｘｎ）β が成り立つならば、得られた反応曲線は測定可能領域に
属する。

ここでβは濃度既知の試料を同一測定条件で反応させた
時の反応速度と濃度との対応曲線及び上記手順で定めら
れろ平均変化率（ｖｌ。

”ｎ）の各組（測定した濃度既知の試料の数だけ得られ
る〕から定められる定数である。

（５）　　（１）において透過率ｘＩ（１−／、・・・
・・・、ｎ）の中から一連のｍ個のｘｌによって定めら
れろ移動平均ｙ１ ３’ｔ　＝　（ｘｔ　＋　ｘｔ−１＋　−−＋　ｘｔ−
ｍ＋＋　）　／　ｍ（ｉ　””ｍ＋・・・・、ｎ） を求めて不規則ノイズによるバラツキを除去した後、（
ｎ−ｍ＋／）個の（ｔｔ、ｙｔ）の組を得る。ついで、
ある時間区間ＣｔＳ＋・・・・・・＋ｔｆ〕（／≦ｓ　
（ｔ≦ｎ）に対応する（　ｔｔ　＋　ｙｔ　）の組につ
いて透過率ｙを時間上の一次式で最小−乗近似した近似
式 ％式％） を求めろ。係数ａが ａ（ｋ（ｋは定数） のとき、得られた反応曲線は測定可能領域に属する。

ここでには、濃度既知の試料を同一測定条件下で反応さ
せた時の反応速度とＣｋ　Ｉｆとの対応曲線及び上記手
順で求められろ近似２次式の係数ａとから予め定められ
る定数である。

（６）　　（５）に述べた手順で求められた係数ａと（
１）に述べた手順で求められた反応速１ｉＶとから、新
たな曲率の指標として Ｒ＝　−ａ　／　Ｖ　　　を求める。

指標Ｒが Ｒ）ｋ　　（ｋは定数〕 のとき、得られた反応曲線は測定可能領域に属する。

ここでｋは濃度既知の試料を同一測定条件下で反応させ
たときの反応速度と濃度との対応曲線及び上記手順で得
られた指標Ｒとから定めろｈる定数である。

（７）　　（１”ｌと同様にして定められた時間区間〔
ｔｌ。

・・・・・・＋ｔｎｌにおいて、各時刻１．における透
過率の値をＸｌ　（＋　−／　、・・・・・、ｎ）とし
たとき、一連のｍ個のｘｌ　　によって定められる移動
平均Ｙ＋　　な ７１　＝　（Ｘｔ　十Ｘ＋−１＋　・−・・＋　Ｘｔ−
ｍ＋＋　）／ｍ（＋　”ｎｔ　、　”””、　　ｎ　）
として定めろ。次にｙｌの差分り、を ＋＋＋ Ｄ＋　＝　７＋　　３’ｉ−ｔ　　　（ｌｌ：ｍ＋１　
、−・＝、　ｎ　）及びＤ（））の差分Ｄ（（）を Ｄ（−）−粛）　−Ｄ（Ｈｌ、　　　（、−−＋、　、
、、、、、。。

として求め、Ｄ、の最大値Ｍを求める。

Ｍ＝＝ｍａｘ　（Ｄ、）　　　（１＝ｍ＋２．−・・、
　ｎ　）この最大値Ｍに対して Ｍ（ｋ（ｋは定数） のとき、得られた反応曲線は測定可能領域に属する。

ここでｋは濃度既知の試料を同一測定クシ件下で反応さ
ぜたときの反応速度と濃度との対応曲線及び上記手順で
得られた最大値Ｍとから定められろ定数である。

以上のよ５　ＩＣ５本発明方法においては、既知濃度の
試料な用いて曲率の大きさ乞測定し、反応測定と濃度と
の対応曲線とより、濃度測定可能領域の判定基準が設定
される。

ついで本発明方法においては、未知試料について上記曲
部の大きさを測定し、上記判定基準により、未知試料の
濃度が測定可能領域に属するか否かを判定することがで
きろ。属する場合にはその反応速度より＠度を一義的に
決定することができろ。−万、属さない場合には、試料
を希釈して測定可能領域に属するようにして測定後、濃
度を決定することができろ。

本発明に係る抗原抗体反応の測定方法は、上記のとおり
、短時間に大量の検体を処理する場合に峙て有用である
。

以下、実施例によりさらに本発明の詳細な説明する。

実施例／ （１）抗α−フェトプロティン（ＡＦＰ）抗体感作ラテ
ックス試薬の調製 ＡＦＰに対する抗体をラテックス粒子（粒径０．２．２
０μｍ、ダウケミカル社製品〕肖りｔＯＯ〜／Ａ：００
個相当量となるように０．２Ｍトリス緩衝液に溶解し、
等量のラテックス−トリス緩衝液と室温で堺拌下に混合
し、充分感作させる。遠心分離後上清を除去し、適当量
の牛血清アルブミンで処理し、感作ラテツクス試薬を得
る。

（２）測定方法 測定は免疫血清検査装置”ＬＰ工Ａ’″システム（三菱
化成工業社製）を用いて行なった。

アクリル樹脂製角セル（光路長７間）に種々の抗原濃度
の試料溶液ＳＯμｌをとり、０．７係牛血清アルブミン
を含む０．２Ｍトリス緩衝液、２００　ｒｒＬｌを加え
混合する。これをセルホルダー疋装着して、測定装置に
セットする。また、装置側には、（１）で調製したラテ
ックス試薬と上記トリス緩衝液をセットしてお（。

測定を開始すると、装置は自動的にラテックス試薬５０
μｌと緩衝液２００μｌをセルに注入し攪拌（１０００
ｒｐｍ）Ｌ、測光を開始する。

測光データは、２秒おきに４００口ｅ　ｓ　ｃ　間の透
過名に対応する陽圧の積算値（Ａ）として得られる。測
定は７分間行なうので、３０点のデータ（Ａ（７〕〜Ａ
　（３ｏ）　）が得られろ。

（３）データ処理 （反応速度■の計算） Ａ　（Ｌ）と時間ｔ（１）との間にＡ（ｉ）−ｐ／ｌ　
（ｉ）　＋　（１なる形の回帰式を仮定し、ｔ−，３０
〜ＡＯ秒に対応するＡ　（ｉｓ）　〜Ａ　（３０）の値
から最小７乗法によりｐ、ｑの値を決定し、次式 ％式％（１） から、反応速度を計算する。

（曲率ａ′値の計算） Ａ（１）と時間ｔとの間に ｐ−（１）　＝　ａ中ｔ（Ｊ２−４−ｂ＠ｔ（１）−１
−ｃなる形の回帰式を仮定し、ｔ＝、７０〜６０秒に対
応するＡ（／幻〜Ａ（３０）の値から係数ａ、ｂ、ｃを
求め次式 ％式％（） からａ′値を計算する。

（４）結　果 Ａ　　Ｆ　　Ｐ７７％Ｑｊ、ｔ　　９　　ｎｇ／ｍｊ’
　〜　；ｌ／３，０００ｎ　ｇ／ｍｌの濃度既知試料を
用いて、反応速度と濃度との対応曲線を求めた結果を第
１図に示す。この結果よりＡＦＰ濃度９００　ｍｇ、／
ｍｌまでばＡＦＰの濃度の増力口とともに反応速度ＣＶ
）は単調に増加しているが、／　Ａ　００　Ｈｇ／ｍ１
以上で（・ｉ反応速度ははｙ一定値に停滞している。

このことは、ｑ　ｏ　ｏ　ｎｇ／ｍまでは、試料中の抗
原Ａ　Ｆ　Ｐとラテックス上の抗体との反応に伴ない、
ラテックス担体の凝集が進行ずろが、Ａ　Ｆ　Ｐ　３．
θ００ｎｇ／ｍ１以上では、抗体分子数に比して、大過
剰の抗原分子が存在するので、それぞれの抗体分子は単
独に一分子ずつの抗原と結合する結果、ラテックスの凝
集が進行し得なくなっていることを示している。

一方、上記試料により測定された曲率ａ′値は、第一図
にみられるように反応速度がＡＦＰｉ度とともに単調に
増力口している範囲では全域にわたってａ’）−３×１
０−５であり、逆に不能領域ではａ≦−３ｘ　／　ｏ−
５であった。

この結果より、ａ’　）　−３Ｘ　／　０−”が成立す
ることを、試料濃度が濃度測定可能領域に属するか否か
の判定基準とした。

また、濃度測定可能領域の反応速度ＶとＡＦＰ＠度Ｃと
の関係は、近似的に ’ｌｏｇＶ＝　０．．２ｇ０９（ｌｏｇＯ）２−０．１
０／Ａ１０ｇＣ−０，２０１０］：ｉ） （ただし、Ｓ≦Ｃ≦ｌ弘００） で表わされる。

次に、第３図のフローチャートに従って未知試料を測定
し、データ処理を行なったところ、ａ／　＝＝　　Ｚ、
乙／　Ｘ　／　０−５となったので、濃度測定可能領域
と判定した。Ｖ　＝　２！；、３　Ａ　／を（ｉＨ）式
に代入して、試料の濃度Ｃ−３７ｑ　ｎｇ／ｍｌを得た
。

実施例コ （１）抗Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）抗体感作ラテックス試
薬の調製 抗体として抗ＯＲ？抗体を用いたり外は、実施例／と同
様に調製した。

（２）　　１ｆｌ１１定方法 実施例１に同じ （３）データ処理 （反応速度■の計算） 実施例／と同様である。

（曲率Ｍ値の計算） Ａ（＜７）〜ＡＣ３０）のユク点のデータ（Ａ（／ン〜
Ａ（３）は反応初期の不均一性がデータに反映されてい
るので除く）を３つ毎に平均値をとって、ｙ（／〕〜ｙ
（９）とする０すなわち・（ｋ−７〜９、ｉ＝３に＋３
） 次に、ｙ（１）〜ｙ（９）のコ次差分値Ｄ（２′（３）
〜Ｄ（２）（デ〕を求める。

すなわち、 ｄｌｌ（ｊ＞−ｙ＜ｊ）−ｙ（ｊ−／）　　　　（ｊ−
ユ〜りンＤ１２１　（ｊ）−伊’（ｊ）−ｒＪ”＜、＋
−７）（、＋＝−３〜９．）　（Ｖ）さらに、このＤ１
２１　＜　３）〜Ｄ（２）　（９，値のうち、最大のも
のをＭ値とする。

（４）結果 ＣＲＰＡｕ、５ｎｇ〜：１２９，０００ｎｇ／ｍｌの濃
度既知まλ：料を用い゛（、反応速度と濃度との対応曲
線を求めた結果をｖｌ１図に示す。

一方、曲不Ｍ値と８度との対応曲線は、箪ＳＭのよ、う
になる。坏９とｐｓ図を比較して、判定基準をＭ（ｊ　
Ｏが成立することとすると、濃度測定可能領域を、不能
領域と区別できることを見出した。

濃度測定可能領域におけろ反応速度ＶとＣＲＰ没度Ｃと
の関係は近似的に次式で表わされる。

］、ｏｇＶ＝　ａｏｔｘｇｂｃｌｏｇｃ）”＋ｏ、ｇｇ
／３１ｏｇｃ−／乙６６（■１） ｃｌ１ｇ≦Ｃ≦３ダＯθン 続いて未知試料を第６図のフローチャートに従って測定
、データ処理を行なったところ）・クー５７Ｓとなり、
濃度測定不能領域であった。そこで試料な２０倍希釈し
、再測定したところＭ＝／ｇと測定可能領域に入ったの
で、反応速度Ｖを計算し、Ｖ＝４．７７左となった。

この結果と（ｖｌ）式よりＯＲＰ濃度はｃ＝３Ａ３×、
２０＝７２ＡＯｎｇ／ｍノと計算される。

実施例３ （１）抗β２−ミクログロブ１１ン抗体感作ラテックス
試薬の調製 抗体として抗β２−ミクログロブリン抗体を用いた以外
は実施例／と同様にして調製した。

（２）測定方法も実施例１と同様である。

（３）　　データ処理 （反応速度■の計算） 実施例／と同様である。

（曲率Ｒの言」算） Ａ（ｌＩ）〜Ａ　（３０）の３謂の移動平均ｙ（１）を
求め、ｙ（２幻〜ｙ（３０）の反応終期のデータと時間
ｔ（１）との間に ｙ　（１）　＝　ａｔ（ｊ１２＋　ｂ＝ｆ’　（ｉ）　
＋　ｃなる回帰式を仮定し最小二乗法によって２次の係
数ａ値を求める。

（４）結　果 Ａ２−ミクロフロプリ：ｙ　３　／、　３　ｎｇ／ｍｌ
　〜ノ汐７．０００　Ｊａｎ／’の濃度既知試料を用い
て、反応速度と製団との対応曲線を求めた結果を第７図
に示す。曲率ａ値と抗原濃度との対応曲線（・ｉＺｇ図
のようＶＣなる。第７、ｇ図からａ　）　Ｏを濃度測定
可能領域の判定基準と定めた。

濃度測定可能領域における反応速度Ｖと抗原濃度Ｃとの
間には、次式が近似的に成立した。

’ｌｏｇ　Ｖ　＝　０．０００．ｔ：２９（ｌｏｇ　Ｏ
）２＋１１０７１０ｇ、Ｃ−／１１／１０（ｖｉｉ） Ｃ２０≦Ｃ≦／ワ００） ３つの未知試料Ａ、Ｂ、Ｃを第７図のフローチャートに
従って測定し、濃度を求めた結果を次に示す。

試料名　　ａ値　　希釈　反応速度　β２ミクログロブ
リン濃度Ａ　　　−／／、／θ　なし Ａ２０倍希釈　　（ｒ、、２／　　２０倍　／左９０２
　２１１；ｒ×２０＝ｌＩｇ１０痔）ｎｌＢ　　　　Ｏ
，，３ｇ　　なし　　７／　／　５　　　　／　／　７
　ｎｇＡ／Ｃ／１０　なし　乙’Ａ、２！ｒ９　　　　
ｇ左Ｏｎｇ７ｍｌ実施例グ （１）　　ラテックス試薬、測定試料、データ及び得ら
Ｐｃた反応速度は実施例３と同様である。

（２）　　曲率Ｒの計算 Ａ　（４１）〜Ａ　（３０）の３項の移動平均ｙ（１）
と時間ｔ（１）との間に ｙ（１）＝ａｔ（ｉ）２＋ｂｔ（ｉ）＋ｃなる回帰式を
仮定し、１−乙〜１０の反応初期データから最小２乗法
によりユ次の係数ａを求め、さらに反応速度Ｖとから Ｒ：　　ｈ／ｖ×１０３（Ｖｆｉり を求めろ。

（３）　　　結　　　果 第７０図に、試料中の抗原（濃度と曲率Ｒの対応曲線な
示した。濃度測定可能領域にはＲ＞／　ｓが対応するこ
とが見出されたので、これ’ａ：　’Ｉ！ｌｌ　ｉ　、
占ワ了仏としブ、二。

実施例３で損（１足した未知試料Ａ、Ｂ、Ｃを曲率Ｒを
用いて、第１／図のフローチャー１′に従って４′４４
足した結果は、下記のように実施例３と一致した。

試料名　　　Ｒ値 〕＼　　　　　／３７　　濃度測定不能領域Ａ２０倍希
釈　　　３５０　　濃度測定可能領域Ｂ　　　　　　　
　　　　Ａ９　　弘 Ｃ！　　　　　　　　　　　、２１　　’ｌ　　　　　
　　　　　　　　／／

【図面の簡単な説明】

第１図は抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス試薬による試料中
の抗原濃度と、反応速度との対応曲線を示したものであ
る。図中の実線部は、濃度測定可能領域に、破線部は濃
度測定不能領域に対応している。 第２図は抗Ａ、　Ｆ　Ｐ抗体感作ラテックス試薬による
試料中抗原儂度と、実施例／で定義した曲率ａ′値との
対応曲線である。図中の実線部、破線部の対応は厘／図
と同様である。 第３図は抗Ａ、　Ｆ　Ｐ抗体感作ラテックス試薬を用い
て未知試料の濃度を求める手順を示したフローチャート
である。 第９図は抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス試薬による試料中
の抗原ｅ度と、反応速度との対応曲線ケ示す（ｔ）２＋
中の実線部、破線部の対応は算１図と同位・。）。 第Ｓ図は、同試薬による抗原濃度と実施例スで定義した
曲率Ｍ値との対応曲線である（実線部、破線部は前記と
同様。ン。 かろ図は、同試薬を用いて未知試料中のＧＲＰ濃度を求
める手順を示したフローチャートである。 第７図は抗Ａ２−ミクログロブリノ抗体感作ラテックス
試薬による対応曲線であり（実線部、第９図は、同試築
を用いて未知試料中のβ２−ミクログロブリン濃度を、
実施例３に従って求める手順を示したフローチャートで
ある。 第１０図は笛７、ｇ図と同一のデータから実施例ダに従
って求めた曲率Ｒと試料中抗原濃度との対応曲線である
（実線部、破線部の対応は前記と同様）。 第１／図は実施例ダに従って、未知試料中のβ２−ミク
ログロブリン濃度を求めろ手順を示したフローチャート
である。 出願人　三菱化成工業株式会社 代理人　弁理士　長谷用　　− ほか７名 口ｊｉ；ｊのン′ρ１１’ｉ、’ご１″二更なし）勇　
１　図 ＡＦＰ（り／献） 第　２図 ＡＦＰ（りｋｌ） 第　３　図 第４ｔ２１ ＣＲｐ（ダんｌ） 第５　図 Ｃｌ；ＦＰ（勺／ｎｌ） 民７　図 ／３２ｍ（り／ｍｌ　） 第　６０ ／（２２ツ（ｎβ／ｎｊｌン タ９図 第　１０図 ／３．（グ／ｍ１） ３１１　　図 手しｔネ市正書く方式） ％式％ ２　発明の名オ８１ 抗原抗体反応の測定方法 ３　　？＋Ｉｉ正をする者 事件との関係　　特許出願人 （５９６）三菱化成工業株式会社 ４代理人　〒ｉｏ。 東京都千代田区丸の内二丁目５番２号 三菱化成工業株式会社内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　不溶性担体粒子に抗体又は抗原を支持させ、
   この支持された抗体又は抗原に、抗原又は抗体あるいは
   その混合物を液体媒体中で反応させて、この反応混合物
   に反応開始後コ以上の時点で光を照射し、一定時間内に
   おけるその反応混合物の透過率の減少を測定する方法に
   おいて、抗原又は抗体の濃度既知の試料を用いて得られ
   る反応速度と濃度の対応曲線において、一つの反応速度
   に複数の濃度が対応する場合に、この対応曲線から未知
   試料中の抗原又は抗体の濃度を決定す７）てあたり、ｉ
   〕　抗原又は抗体の濃度既知の試料を用いて透過率の時
   間的変化を特徴づける曲率の大きさを測定し、これと上
   記対応曲線とから、濃度を一義的に決定しうる濃度測定
   可能領域の判定基準を設定し、 ついで１θ未知試料の透過率の時間的変化を特徴づける
   曲率の大きさを測定し、その曲率の大きさからその抗原
   又は抗体の濃度が上記濃度測定可能領域に属するか否か
   を判定し、１１１）属する場合にはその反応速度より未
   知試料中の抗原又は抗体の濃度を決定する、ことよりな
   ることを特徴とする抗原抗体反応の測定方法。