JPH02245662A - 自動免疫測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は免疫反応により生ずる化学発光を自動的に検出
する自動免疫測定装置に関するものである。

〔従来の技術］ 一般に、免疫測定として酵素免疫測定法が使用されてい
る。この酵素免疫測定法は、酵素活性をマーカーとして
抗原抗体反応の程度を知り、これから抗原または抗体の
量を定量する方法であって、酵素標識抗原、（または抗
体）と非標識抗原（または抗体）とが抗体（または抗原
）に対して競合しないサンドイツチ法や、酵素標識抗原
（または抗体）と非Ｗ識抗原（または抗体）とを競合さ
せることによってその非標識抗原量を求める競合反応法
、その他種々の方法がある。

第４図はサンドイツチ法による測定原理を説明するため
の図、第５図は競合法による測定原理を説明するための
図であり、ｅｌは固相担体、６２は抗体、８３は被測定
抗原、６４は標識物質、６５は標識抗体、６８は基質、
θ７は生成物を示す。

サンドイツチ法は、第４図に示すように、■　まず、面
相担体６１の表面に物理的な吸着や化学反応を利用した
結合により抗体ｅ２を固相状態にしておき、これに被測
定抗原６３を含むサンプルを加える。

■　その結果、サンプル中にはいろいろな東線成分があ
るものの、抗体６２と抗原θ３とが特異的に反応しく第
１反応）、被測定抗原ｅ８が固相化抗体６２に結合する
ので、その後、洗浄を行うことによりサンプル中の東線
成動恐分を廃棄する。

■　次に、酵素を標識６４として結合させた酵素標識抗
体８５を添加する。

■　その結果、抗原抗体反応（第２反応）が起こり、固
相化抗体８２に結合している抗原ｅ３の上に酵素標識抗
体ｅ６が結合する。この場合、酵素標識抗体６５は、過
剰に添加されるので、抗原６３と抗体ｅ５が結合して生
じた結合型の部分（ｂ。

ｕｎｄｌＢ）と結合していない遊離型の部分（ｆｒｅｅ
。

Ｆ）ができる。

■　そこで、洗浄を行うことによって遊離型の部分（ｆ
　ｒ’ｅｌｌｘ　　Ｆ　）の過剰酵素標識抗体を廃棄す
る。

つまり、Ｂ／Ｆ分離を行う。

■　次に酵素反応を行う。このときの酵素活性は、結合
型の部分の酵素標識抗体の量によって決まるので、その
酵素標識抗体量は固相化抗体に結合した抗原量、すなわ
ち被測定抗原量を表すことになる。

競合反応法は、第５図に示すように、 ■　抗体を固相化しておき、被測定抗原及び被測定抗原
と同じ抗原に標識を結合させた標識抗原を添加する。

■　その結果、抗原抗体反応が起こり、被測定抗原及び
標識抗原がそれぞれの量の割合に応じて固相化抗体に結
合する。

■、■　次に、サンドイツチ法と同様にＢ／Ｆ分離を行
い、酵素反応を行う。このときの酵素活性は、結合型の
部分の酵素標識抗体の量によって決まるので、添加した
標識抗原量から検量線を使って被測定抗原量を求めるこ
とができる。

上記の方法は、いずれも所謂分離法であり、これに対し
てＢ／Ｆ分離を行わない非分離法もある。

非分離法は測定時間が早く操作が簡単であるが、測定感
度が低い等の欠点がある。それに比べて分離法は、測定
感度は高いが操作が非常に複雑且つ面倒であり、自動化
が難し〈従来はほとんどの場合手作業で行われていた。

上記の免疫測定を自動化する場合は、ポリスチレンボー
ルまたはガラスピーズ等の固相に抗体または抗原を固定
して固相化したものが固相試薬として用いられている。

この固相試薬は、不安定であるため、通常は保存液を滴
たした容器の中に入れておき、酵素免疫測定を行うとき
に容器の中から固相試薬を１つずつ反応検出容器に移し
、サンプルの分注、ＩＩｌ識試薬の分注、Ｂ／Ｆ分離、
洗浄を行って、しかる後、結合型の部分を検出器へ移す
ようにしている。

ところで、酵素反応を利用して測定する場合には、例え
ば色素液を形成し、比色計により色の濃さを測定して反
応を検出するものがあるが、検出感度が低いため、免役
反応に伴う化学発光を検出することが行われている。

化学発光の検出には、連続的に反応生成１物を流して計
測するフローセルタイプと試験管等を利用して試験管単
位で測定するバッチ式測定タイプのものがあるが、化学
発光における光量が微弱であるため、いずれのタイプの
ものでも発光反応液の部位にフォトマルチプライヤ等の
検出素子を近接設置することにより発光検出を行ってい
た。

〔発明が解決すべき課題］ しかしながら、前述したように化学発光は極めて微弱で
あり、しかもその発光時間はかなり短い時間であるため
、発光検出の開始時点や終了時点の決定は検出精度に対
して重要な問題となるが、従来は、発光検出の開始時点
については化学発光の開始時点とは特に関係をもたせず
に発光試薬を注入する前の適当な時点に手動で設定する
のが一般的であり、また発光検出の終了時点についても
、化学発光の進行状況とは関係なく一定時間で検出を終
了させるなど、精度の高い発光検出が行えないという問
題があった。

また、化学発光は非常に短い時間内に集中して発生する
ため、検出系に存在する測定限界からピ−り値付近では
真の検出値が得られていないことも予想されるが、この
ような状況に対して補正を施すことは従来行われておら
ず、このような面からも精度の高い発光検出が行い得な
いという問題があった。

さらには、検出されたデータを監視する機構がないため
、異常データが発生していてもそれに対する迅速な対応
ができず、上記のような問題点と合わせて、免疫測定を
自動化することが困難であるという問題もあった。

本発明は上記課題を解決するためのもので、精度の高い
発光検出が行えるとともに、自動化が可能な免疫測定装
置を提供することを目的とする。

［課題を解決するための手段］ そのために本発明は、反応管内の免疫反応により生ずる
化学発光を検出する自動免疫測定装置において、前記化
学発光の検出開始時点を前記反応管内への発光試薬の注
入時点に同期させる検出開始制御手段と、発光検出器の
検出値を所′定時間ごとに計数して出力する計数手段と
、前記計数手段の出力値が所定の状態になったときに前
記化学発光の検出を終了させる検出終了制御手段と、前
記計数手段の出力が異常な値となったとき出力を発生す
る異常検出手段とを備えたこと、さらには計数手段の計
数値に対して不感時間補正を施す手段を設けたことを特
徴とする。

〔作用〕

本発明はまず化学発光の検出開始時点を反応管内への発
光試薬の注入時点に同期させ、また検出終了時点を計数
手段の出力値が所定の状態になったとき、すなわち化学
発光があらかじめ定めた所定の状態まで進行したときに
設定するようにしているので、化学発光を過不足な（正
確に検出することができ、検出精度を高めることができ
る。

また、計数手段の出力があらかじめ定めた異常な値とな
ったとき出力を発生する異常判定手段を備えたので、異
常状態に対して警報を出したりまたは発光検出を自動的
に停止させることが可能となり、上記点と相まって発光
検出の自動化が可能となる。

さらには、計数手段の検出値に対して発光検出器の測定
限界に基づく不感時間補正を施す手段を設けているので
、検出精度をより一層向上させることが可能となる。

［実施例］ 以下、実施例を図面を参照して説明する。

第１図は本発明の自動免疫測定装置の一実施例構成を示
す図で、図中、１は反応管、２は発光検出器（フォトマ
ルチプライヤ）、３は容器、４は計数手段、６は計数手
段の計数部、ｅは計数手段の補正部、７は検出開始制御
手段、８は検出終了制御手段、９は異常検出手段、１０
は表示手段、１１はポンプ駆動手段、１２は送液ポンプ
、１３は発光試薬である。

第１図の詳細な説明に入る前に、第３図に基づいて本発
明の自動免疫測定装置に使用して好適な発光検出装置の
一実施例構成を説明する。第３図中、第１図と同じ番号
で示したものは、同じ構成要件を表しており、１４は積
分球、１５は遮光板、１８は支持部材、１７は発光反応
物、１Ｂは蓋、１９は分注ピペットである。

第３図において、容器３内には積分球１４が配置され、
その中に支持部材１８により反応管１が支持されており
、容器上部は蓋１８により密閉し、容器な暗箱にするよ
うにしている。反応管ｌ内には分注ピペット１８が連通
し、送液ポンプ１２により発光試薬１３が注入できるよ
うになっており、発光試薬を反応管１内に注入すること
により試料と混合させて発光反応物１７が生成される。

また、作業性を向上させるために蓋１８と分注ピペット
１４とは一体にしてワラタッチ動作で蓋と分注ピペット
をセットしたり、取り外したりすることができるように
している。

積分球１４の内面はアクリル系の樹脂、酸化マグネシア
の粉末等の反射材が塗布され、はぼ１００％の反射率に
なるように形成され、積分球１４からの光はフォトマル
チプライヤ２で検出される。

また、積分球１４内には遮光板ＩＳが配置されて発光反
応物１７からの直接光がフォトマルチプライヤ２に入射
しないように構成されている。もちろん遮光板１５も反
射率がほぼ１００％になるように表面に反射材が塗布さ
れている。

このような構成において、所定の免役反応を行って得ら
れた試料を入れた反応管を積分球１４内に設置し、分注
ピペット１８を通して発光試薬１３を注入すると発光反
応物１７が生成されて化学発光が生ずる。この化学発光
は四方六方に放射される。積分球の内面は反射材が塗布
しであるため、全ての化学発光はここで反射され、理想
的には無限回の反射を繰り返し、完全に方向性が無（な
った形でフォトマルチプライヤ２で検出される。したが
って、反応管の中での発光位置あるいは反応管自身の位
置、反応管の管壁等に多少の傷がある等により反応管か
らの光の出射の形態が多少変化しても、積分球により完
全に平滑化され、その影響を受けずに検出することがで
きる。

このように、積分球は光を無限回反射して無方向性にす
る作用をし、その結果直接光を検出するのに比べ感度は
落ちるものの発光位置のずれ等の影響を完全に無くすこ
とが可能であり、安定したデータの収集を行うことが可
能となる。

次に、第１図に戻り、本発明の自動免疫測定装置の一実
施例構成について、その動作の順を追って詳細に説明す
る。

（１）検出開始制御 まず、反応管１を容器３内にセットし、検出準備が整っ
たところで、ポンプ駆動手段１１に対して作動指令ａを
入力する。ポンプ駆動手段１１からは、送液ポンプ１２
に対して駆動信号すが与えられ、反応管１に発光試薬１
３が注入される。

反応管１内では、発光試薬１３が注入されると、そのと
きから所定の発光種による化学発光が始まる。その発光
Ｃは１つ１つが発光検出器２で検出され、その検出信号
ｄが計数手段１に入力される。

一方、ポンプ駆動手段１１からの駆動信号すは検出開始
制御手段７にも入力され、当該信号すに同期した検出開
始指令信号ｅが出力される。この検出開始指令信号ｅは
そのまま計数手段４に与えられるので、反応管１に発光
試薬１３が注入されるのと同期して、計数手段４により
発光検出器２からの検出信号ｄの計数が開始される。

（２）発光計数 計数手段４では、発光検出器２からの検出信号ｄを計数
部５で微小な所定時間ごとに計数し、当該所定時間ごと
に計数信号ｆを出力する。

すなわち、発光Ｃの１つ１つに対応して入力される検出
信号ｄの数を、当初リセットされたカウンタで所定時間
にわたって計数（積算）シ、所定時間経過後に当該カウ
ンタの計数値を計数信号ｆとして出力するとともに、カ
ウンタの値をリセットシ、再び検出信号のカウントを行
うという動作を繰り返し行う。ここで、上記所定時間と
しては、Ｌｏｏｔり秒程度を設定することができる。

そして、この計数動作は、後述する検出終了指令信号り
が入力されるまで続けられる。

（３）発光計数値の補正 ここで、本発明の好適な実施例では、上記計数部５から
の計数信号ｆに対して、補正部６で不感時間補正が施さ
れる。

この不感時間について説明すると、発光量をフォトマル
チプライヤ、増幅器、計数回路からなる検出系で検出し
ようとしたとき、２つの発光が近接して発生した場合に
それを別々のものとして認識できない、すなわちカウン
ト値は本来２となるべきところが１となってしまうとい
う測定限界が存在する。この２つの発光を別々のものと
して検出できない限界の時間幅（そのときの発光と発光
との間の時間幅）が不感時間であり、各検出系に固育の
数値として存在する。特に免疫測定における化学発光は
非常に短い時間幅の中に集中して発生するので、とりわ
けピーク値付近ではこの不感時間に起因するいわばカウ
ント漏れがある程度存在する。上記補正部６では、計数
部５の計数信号ｆに対して、このような不感時間に起因
する誤差に対する補正を施すようにしている。

この不感時間補正は、真の計数値をｇｌ　検出系の不感
時間をＴ１、計数部５における所定時間（計数値ｆを得
るための時間幅）をＴとしたとき、計数値ｆに対して次
の計算式で行うことができる。

ｇ＝　　ＣＴ／　　（Ｔ−ｆ　　ＸＴ＠）　　コ　×　
ｆ　　　　　・・・・・・　（１）したがって、ｆｘＴ
ｅの値がＴに比較して十分小さいときには、ｇ＋ｆとな
る。また、ｆｘＴ−の値がＴに近い値となるようなとき
はダイナミックレンジ・オーバーとなる。

このような不感時間補正を行うことにより、正確な計数
値ｇを得ることができる。

（４）計数値の表示 上記のようにして得た計数値ｇを、時間軸を横軸にとっ
て連続した曲線として模式的に表したのが第２図である
。なお、厳密には、計数値ｇは上記所定時間Ｔごとに発
生する不連続な点である。

すなわち、発光試薬の注入時点ｔ＠から化学発光が始ま
ると同時に発光検出（計数）が開始され、短時間の間に
ピーク値ｇ、まで上昇したのち、再び減少するという経
過をたどる。

このような時間経過に沿ったｇの値及び第２図のような
グラフを、ＣＲＴやプリンタ等の表示手段１０にリアル
タイムで表示できるようにすれば、測定データの管理や
測定データの詳細な検討を行ううえで非常に好都合とな
る。

（５）検出終了制御 計数手段４の計数信号ｇは検出終了制御手段８に入力さ
れる。

ここで、第２図（ａ）及び（ｂ）を参照しながら前述し
た従来のものにおける検出終了制御に話しを戻せば、従
来は検出開始時点ｔｓから一定時間経過した例えば時点
１＋　で検出を終了するようにしていたので、第２図（
ａ）のような場合には一応正確な検出が期待できる。し
かしながら、発光検出値の変化は一様ではなく、同図（
ｂ）に示したような場合には時点１＋　ではまだ発光種
による発光が続いており、時点１＋で検出を終了したの
では正確な発光検出は期待できない。このような場合に
は、もっと遅れた時点ｔ２まで検出終了を遅らせること
が必要であるが、従来はそのようなケースごとに検出終
了時点を可変制御するようなことは行われていなかった
。

これに対して本発明では、検出終了制御手段８によって
ケースごとに最適な検出終了時点を決定するようにして
いる。

より具体的には、検出終了制御手段８で計数手段４の計
数信号ｇを監視し、その計数信号ｇが例えば次のような
状態になったとき、検出終了指令信号りを出力させる。

■　計数信号ｇがあらかじめ定めた一定レベル以下にま
で低下したとき ■　計数信号ｇがピーク値ｇ、の一定割合以下にまで低
下したとき ■　計数信号ｇの変化率があらかじめ定めた一定値以下
にまで低下したとき この検出終了指令信号りは計数手段４に入力され、計数
部５での計数動作をストップさせる。

なお、免疫測定において万が一発光種が存在しなかった
ような場合には、上記のような制御態様をとったときピ
ーク値等が存在しないことによって検出終了指令信号が
しなくなるような事態も考えられ得るが、これを防止す
るためには、あらかじめ検出時間の制限値（ｆｉ大検出
時間幅）を設定しておくようにするとよい。

このように、本発明によれば、第２図（ｂ）の場合には
検出終了時点がｔ２まで延ばされるため、常に正確な検
出を行うことができる。

（６）異常検出 また、計数手段４の計数信号ｇは、異常検出手段８にも
入力される。この異常検出手段９では、計数信号ｇを監
視し、あらかじめ定めた異常状態に相当するデータが入
力されてきたとき、異常検出出力ｌを出すようにしてい
る。

この異常検出出力ｌによって、例えば、その計数信号ｇ
を表示手段１０に表示する際に異常データであることを
示すマークをつけて表示したり、図示しない警報装置に
よって異常状態に対する警報を発生させたり、あるいは
計数手段４やポンプ駆動手段１１等の動作を自動的に停
止させたりすることができる。

ここで、計数信号ｇの異常判断の具体的手法の例を、第
２図（Ｃ）を参照して説明する。

■　発光試薬注入（検出開始）時点ｔ１からピークトッ
プ時点ｔ、までの時間幅ＴＩが第１の所定範囲に入って
いないとき。例えば、発光試薬が反応管の管壁を伝わっ
て注入されたようなときには、迅速な発光反応が起こら
ず、ピークトップの発生が正常な場合に比べて遅くなる
。このようなときには正確な検出は期待できない。

■　半値幅Ｔ會、即ち計数信号ｇがピーク値ｇ、の１／
２となる部分の時間幅、が第２の所定範囲に入っていな
いときには上記の異常が考えられる。

■　検出開始時点ｔ１から検出終了時点ｔｉ　までの時
間幅Ｔｓが第３の所定範囲に入うていないとき。

■　パックグランド発光に対応する部分の計数信号ｇｓ
が第４の所定値以上のとき。このときには容器の蓋がし
っかり閉じられていない、あるいは発光試薬の注入量が
おかしい等の異常が考えられる。

■　計数信号ｇが検出系の測定限界ｇ、、８を超える値
を示したとき。発光検出系には前述したように、フォト
マルチプライヤの測定可能最小時間やカウンタ回路上の
計数の限界等に起因する不感時間があり、前記（１）式
のところでも説明したように計数信号ｇが非常に大きい
場合には不感時間補正も効かなくなる測定限界が存在す
る。この測定限界ｇ１１．を超えたデータについては、
もはや真の計数データではないので、異常データとして
扱う必要がある。

なお、第３図の実施例では積分球を用いた発光検出器に
ついて説明したが、本発明はこれに限定されるものでは
なく、積分球を用いない発光検出器も適用可能であるこ
とは言うまでもない。また、積分球を用いた発光検出器
についても、必ずしも球形である必要はなく、箱型、円
筒形等地の形状のものでもよく、また遮光板を使わな（
でも一定程度安定な測定ができる。さらには、本発明の
発光検出は、反応管等を用いたバッチ式に限らず、フロ
ー式タイプのものに適用しても同様の効果が得られるこ
とは言うまでもない。

［発明の効果］ 以上のように本発明によれば、まず化学発光の検出開始
時点を反応管内への発光試薬の注入時点に同期させ、ま
た検出終了時点を計数手段の出力値が所定の状態になっ
たとき、すなわち化学発光があらかじめ定めた所定の状
態まで進行したときに設定するようにしているので、化
学発光を過不足なく正確に検出することができ、検出精
度を高めることができる。

また、計数手段の出力があらかじめ定めた異常な値とな
ったとき出力を発生する異常判断手段を備えたので、異
常状態に対して警報を出したり、または発光検出を自動
的に停止させることが可能となり、上記点と相まって発
光検出の自動化が可能となる。

さらには、計数手段の検出値に対した発光検出器の測定
限界に基づく不感時間補正を施す手段を設けているので
、検出精度をより一層向上させることが可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の自動免疫測定装置の一実施例構成を示
す図、第２図は本発明の自動免疫測定装置による発光検
出計数信号の波形図、第３図は本発明の自動免疫測定装
置に使用して好適な発光検出装置の一実施例構成を説明
するための図、第４図はサンドイツチ法による測定原理
を説明するための図、第５図は競合法による測定原理を
説明するための図である。 １・・・反応管、２・・・発光検出器、３・・・容器、
４・・・計数手段、６・・・計数手段の計数部、６・・
・計数手段の補正部、７・・・検出開始制御手段、８・
・・検出終了制御手段、９・・・異常検出手段、１０・
・・表示手段、１１・・・ポンプ駆動手段、１２・・・
送液ポンプ、１３・・・発光試薬。 出　　願　　人　日本電子株式会社 代理人　弁理士　菅　井　英　雄（外５名）第１図 第２図 （ｃ） 工３ 第２図 第３ 図 遮見才反

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）反応管内の免疫反応により生ずる化学発光を検出
   する自動免疫測定装置において、前記化学発光の検出開
   始時点を前記反応管内への発光試薬の注入時点に同期さ
   せる検出開始制御手段と、発光検出器の検出値を所定時
   間毎に計数して出力する計数手段と、前記計数手段の出
   力値が所定の状態になったときに前記化学発光の検出を
   終了させる検出終了制御手段と、前記計数手段の出力が
   異常な値となったとき出力を発生する異常検出手段とを
   備えたことを特徴とする自動免疫測定装置。
2. （２）計数手段の計数値に対して不感時間補正を施す手
   段を設けたことを特徴とする請求項１記載の自動免疫測
   定装置。