CN111157724A - 一种磷酸肌酸激酶同工酶检测试剂盒 - Google Patents

一种磷酸肌酸激酶同工酶检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种磷酸肌酸激酶同工酶检测试剂盒，涉及生物医药技术领域，包括第一试剂，第一试剂包括如下成分：124‑126mmol/L的咪唑、2‑3mmol/L的醋酸镁、12‑13mmol/L的乙二胺四乙酸、34‑34.3mmol/L的甘露醇、6‑6.5mmol/L的单磷酸腺苷、0.01‑0.015mmol/L的二腺苷五磷酸锂、2‑3mmol/L的还原性辅酶Ⅱ、0.8‑1.2g/L的Proclin150、3.5‑4ku/L的已糖激酶、24‑26mmol/L的N‑乙酰半胱氨酸、2‑3mmol/L的亚硫酸钠、2‑3ml/L的抗人CK‑M抗体，本发明提供一种改进型的磷酸肌酸激酶同工酶检测试剂盒，灵敏度更高、重复性更好、准确性更高、稳定性更好。

Description

一种磷酸肌酸激酶同工酶检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地说，它涉及一种磷酸肌酸激酶同工酶检测试剂盒。
背景技术
磷酸肌酸激酶同工酶(CKMB)存在于人体细胞的胞浆和线粒体中，不同组织中含量不同，心肌含量最高。CK-MB属于特异性较强的一种心肌标志物。肌酸激酶具有3种同工酶，CK-BB，CK-MB，CK-MM。CK-MB是至今为止诊断心肌梗塞最佳的血清酶指标。人体各组织除腓肠肌外，只有心肌含有较高的CK-MB，可达40％以上，故此同工酶对诊断心肌梗塞的特异性可高达100％。心梗发生时，血清CK-MB可增高10-25倍，超过CK总活力增高的倍数(10-12)倍。
磷酸肌酸激酶同工酶(CKMB)测定方法需要较高的灵敏度和特异性。由最初免疫电泳的定性检测，到单克隆胶体金法和酶法的定量检测，发展十分迅速。目前，酶法的定量检测是最为普遍通用的方法，但是胶乳颗粒增强比浊法存在灵敏度较低，精密度、准确性、线性范围等方面的问题，在临床应用上存在着局限性，因此，存在待改进之处。
发明内容
针对现有技术中所存在的不足，本发明目的在于提出一种磷酸肌酸激酶同工酶检测试剂盒，具体方案如下：
一种磷酸肌酸激酶同工酶检测试剂盒,包括第一试剂，所述第一试剂包括如下成分：
124-126mmol/L的咪唑、2-3mmol/L的醋酸镁、12-13mmol/L的乙二胺四乙酸、34-34.3mmol/L的甘露醇、6-6.5mmol/L的单磷酸腺苷、0.01-0.015mmol/L的二腺苷五磷酸锂、2-3mmol/L的还原性辅酶Ⅱ、0.8-1.2g/L的Proclin150、3.5-4ku/L的已糖激酶、24-26mmol/L的N-乙酰半胱氨酸、2-3mmol/L的亚硫酸钠、2-3ml/L的抗人CK-M抗体。
进一步的，所述咪唑、醋酸镁、乙二胺四乙酸、甘露醇、单磷酸腺苷、二腺苷五磷酸锂、还原性辅酶Ⅱ、Proclin150、已糖激酶、N-乙酰半胱氨酸、亚硫酸钠、抗人CK-M抗体在所述第一试剂中的含量分别为：125mmol/L、2.5mmol/L、12.5mmol/L、34.1mmol/L、6.25mmol/L、0.0125mmol/L、2.5mmol/L、1g/L、3.75ku/L、25mmol/L、2.5mmol/L、2.5ml/L。
进一步的，还包括第二试剂，所述第二试剂包括如下成分：
19-21mmol/L的磷酸盐缓冲液、1g/L的Proclin150、149.76-149.8mmol/L的磷酸肌酸、54.87-54.91mmol/L的葡萄糖、11.85-11.89mmol/L的5‘-腺苷二磷酸二钠盐、1-3g/L的牛血清白蛋白、28-32ku/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、0.1-0.3ml/L的庆大霉素。
进一步的，所述磷酸盐缓冲液、Proclin150、磷酸肌酸、葡萄糖、5‘-腺苷二磷酸二钠盐、牛血清白蛋白、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、庆大霉素在所述第二试剂中的含量分别为：20mmol/L、1g/L、149.78mmol/L、54.89mmol/L、11.87mmol/L、2g/L、30ku/L、0.2ml/L。
进一步的，所述第一试剂的制作规程包括如下步骤：
S1：称量所述第一试剂中的对应成分，
S2：于容器内加水0.8L，加入称量好的咪唑，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的醋酸镁，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，搅拌加入称量好的乙二胺四乙酸，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的甘露醇，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的单磷酸腺苷，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的二腺苷五磷酸锂，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的还原性辅酶Ⅱ，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的Proclin150，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的已糖激酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的N-乙酰半胱氨酸，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，
S3：对所述S2中的溶液在温度为20℃～25℃下调整PH值至6.72～6.62，加入称量好的亚硫酸钠，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的抗人CK-M抗体，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，
S4：对所述S3的溶液用工艺用水稀释至1L，用磁力搅拌器2-3档搅拌2h。
进一步的，在第一试剂的制作规程的所述S2中，搅拌时间为27-33min。
进一步的，所述第二试剂的制作规程包括如下步骤：
S1：称量所述第二试剂中的对应成分，
S2：于1L容器内加水0.8L，加入称量好的磷酸盐缓冲液，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的Proclin150，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，搅拌加入称量好的磷酸肌酸，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的葡萄糖，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的5‘-腺苷二磷酸二钠盐，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的牛血清白蛋白，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，
S3：对所述S2中的溶液在温度为20℃下调整PH值至9.3，搅拌加入称量好的庆大霉素，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，
S4：对所述S3的溶液用工艺用水稀释至1L。
进一步的，在所述第二试剂的制作规程的所述S4中，对稀释后的溶液用磁力搅拌器2-3档搅拌2h。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供一种改进型的磷酸肌酸激酶同工酶检测试剂盒，灵敏度更高、重复性更好、准确性更高、稳定性更好，参与偶联反应的成分都很稳定，不会引起内外源物质的干扰，可长时间使用，满足临床实际需要。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不仅限于此。
制备例
1、主要材料以及仪器
第一试剂：咪唑、醋酸镁、乙二胺四乙酸、甘露醇、单磷酸腺苷、二腺苷五磷酸锂、还原性辅酶Ⅱ、Proclin150、已糖激酶、N-乙酰半胱氨酸、亚硫酸钠、抗人CK-M抗体。
第二试剂：磷酸盐缓冲液、Proclin150、磷酸肌酸、葡萄糖、5‘-腺苷二磷酸二钠盐、牛血清白蛋白、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、庆大霉素。
仪器：AL104精密电子天平：灵敏度0.1mg，用于称量工序；
TC30K型精密电子天平：灵敏度10mg,用于称量工序；
T1000Y型电子天平：灵敏度10mg,用于称量工序；
磁力搅拌器：99-1型，用于溶解工序。
精密酸度计：FE20,用于PH工序。
电子秤：灵敏度20g,用于定容工序。
玻璃烧杯等玻璃器皿；
定量加量器：1ml、100-1000ul、20-200ul；
移液管：10ml、5ml。
2、制备步骤
2.1第一试剂的制作规程
S1：使用AL104精密电子天平、TC30K型精密电子天平、T1000Y型电子天平、定量加量器或者移液管称量第一试剂中的对应成分，
S2：于容器内加水0.8L，加入称量好的咪唑，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的醋酸镁，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，搅拌加入称量好的乙二胺四乙酸，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的甘露醇，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的单磷酸腺苷，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的二腺苷五磷酸锂，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的还原性辅酶Ⅱ，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的Proclin150，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的已糖激酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的N-乙酰半胱氨酸，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，搅拌时间为27-33min，
S3：对S2中的溶液在温度为20℃～25℃下调整PH值至6.72～6.62，加入称量好的亚硫酸钠，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的抗人CK-M抗体，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，
S4：对S3的溶液用工艺用水稀释至1L，用磁力搅拌器2-3档搅拌2h。
2.2第二试剂的制作规程
S1：使用AL104精密电子天平、TC30K型精密电子天平、T1000Y型电子天平、定量加量器或者移液管称量第二试剂中的对应成分，
S2：于1L容器内加水0.8L，加入称量好的磷酸盐缓冲液，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的Proclin150，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，搅拌加入称量好的磷酸肌酸，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的葡萄糖，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的5‘-腺苷二磷酸二钠盐，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的牛血清白蛋白，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，
S3：对S2中的溶液在温度为20℃下调整PH值至9.3，搅拌加入称量好的庆大霉素，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，
S4：对S3的溶液用工艺用水稀释至1L，对稀释后的溶液用磁力搅拌器2-3档搅拌2h。
实施例
3、性能测试
3.1磷酸肌酸激酶同工酶检测试剂盒(简称CKMB试剂盒)批号和规格
分别制作不同批次的前述的制备例中的试剂盒，根据批次命名，分别为样品1、样品2、样品3，本产品共有6种包装规格，只是大小包装不同，对性能评估结果没有影响，因此只对其中一种最常用规格进行了测定，规格采用50ml(第一试剂:1×40ml,第二试剂:1×10ml)。第一试剂和第二试剂为透明液体，不得有沉淀和絮状物。
3.2校准品和质控品
用于性能评估的校准品：用因子定标，K因子值8360；
用于准确度性能评估的参考物质：日本东洋纺，Lot:J234，标示值:179U/L；
质控品为：日本东洋纺公司精度管理血清，Lot:E234A1，target:36U/L，range:30-42U/L；Lot:E234A2，target:165U/L，range:133-197U/L。
3.3实验仪器以及原理
实验仪器：西门子1200型全自动生化分析仪。
实验原理：CK由M和B二个亚单位组成三种的二聚体，CK1(BB)、CK2(MB)、CK3(MM)主要存在于胞浆中，另外血清中还有少量的线粒体同功酶(CKm)。心肌中CK活力较高(仅次于骨骼肌)，其中CK-MB约占13～22％(骨骼肌中＜1％)，因此其作为心肌损伤的指标具有特异性。本试剂盒采用免疫抑制法，用抗人M血清，抑制M亚单位，然后测定剩余的B亚单位活性，乘2即得CK-MB活力。
Figure BDA0002370769490000081
Figure BDA0002370769490000082
Figure BDA0002370769490000083
在340nm测定NADPH的生成速率，计算出CK-MB活力。
3.4试剂空白检测
产品技术要求：
试剂空白吸光度：A340nm(1cm)≤0.6；
试剂空白吸光度变化率：A340nm(1cm)≤0.002/min
用纯水测试样品1、样品2、样品3在主波长340nm下，记录测试启动时的吸光度(A1)和约5分钟(T)后的吸光度(A2)，A2测试结果即为试剂空白吸光度测定值；用纯水测试样品1、样品2、样品3在主波长340nm下，计算出吸光度变化值(︱A2－A1︱/T)的值，即为试剂空白吸光度变化率(△A/min)，实验结果如下表：
Figure BDA0002370769490000091
结论：样品1、样品2、样品3的试剂分别在西门子1200生化仪测定，实验结果符合试剂空白吸光度：A340nm(1cm)≤0.6；试剂空白吸光度变化率：A340nm(1cm)≤0.002/min。
3.5灵敏度检测
用已知浓度的人血样品分别测试样品1、样品2、样品3中的试剂盒，记录在试剂盒规定参数下产生的吸光度变化，本试验测定40U/L样品，吸光度变化率要求>0.002/min。
采用样品1、样品2、样品3中第一试剂和第二试剂检测人血样品的方法简述如下：
1、将溶解的第一试剂加入待测样品中；
2、加入溶解的第二试剂；
3、测定溶液中在340nm波长处比色，进而得到吸光度变化率。
实验结果如下：
Figure BDA0002370769490000092
Figure BDA0002370769490000101
结论：样品1、样品2、样品3的CKMB试剂盒分别在西门子1200生化仪测定，实验结果表明测定理论值在40U/L样品，吸光度变化率要求>0.002/min。
3.6线性范围
用接近线性范围上限的高浓度样品和接近线性范围下限的低浓度样品，混合成6个稀释浓度(xi)。分别测试试剂盒，每个稀释度测试3次，分别求测定均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定均值(yi)为因变量求出线性回归方程及相关系数(r)。按如下公式计算相关系数(r)。
Figure BDA0002370769490000102
用上述方法中稀释浓度xi代入线性回归方程，计算yi的估算值与yi的线性偏差，应符合如下产品技术要求的规定。
产品技术要求：
要求试剂盒在样本浓度0U/L-400U/L范围内，整个反应呈线性，r≥0.990，线性相对偏差<±15％。
实验结果如下：
Figure BDA0002370769490000103
Figure BDA0002370769490000111
结论：样品1、样品2、样品3的CKMB试剂盒分别在西门子1200生化仪测定，实验结果表明在0U/L-400U/L测定范围内，线性误差均未出现线性异常状况,所有R2值均大于行业普遍认可的0.990的标准，线性相对偏差均<±15％。
3.7精密度检测
在重现性条件下，用前述的质控品测试样品1、样品2、样品3的试剂盒，测试10次，分别计算测量值的平均值和标准差，按以下公式计算变异系数(CV)，应符合产品技术要求。
Figure BDA0002370769490000112
产品技术要求：
批内精密度：CV≤6.0％
实验结果如下：
Figure BDA0002370769490000121
结论：在高低两个不同浓度水平的质控血清测试下，使用西门子1200生化分析仪测得的批内不精密度均小于6％，可见，本发明的试剂盒测试结果准确高，具有临床参考价值。
用质控品分别测试样品1、样品2、样品3的试剂盒，每个批号测试3次，分别计算每批3次检测的均值
Figure BDA0002370769490000131
(i＝1,2,3)，以及总计9次的均值
Figure BDA0002370769490000132
按如下公式计算相对偏差(R)，结果应符合产品技术要求的规定。
Figure BDA0002370769490000133
Figure BDA0002370769490000134
产品技术要求：
批间相对偏差≤10.0％
实验结果如下:
Figure BDA0002370769490000135
结论：用质控品分别测试样品1、样品2、样品3的试剂盒，使用西门子1200生化分析仪测得的批间相对偏差小于10％，本发明的试剂盒的试剂间以及生产方法具有稳定性，使本发明的试剂盒能够得到稳定的结果，且结果的准确性高，具有重要的临床参考价值。
3.8准确度检测
测定日本东洋纺公司CKMB校准品3次，计算3次结果平均值，按如下公式计算相对偏差，结果应符合产品技术要求：
Figure BDA0002370769490000141
式中：
Figure BDA0002370769490000142
---测试结果均值，X靶---有证参考物质的标示值。
产品技术要求：与有证参考物质的相对偏差不超过±15％。
实验结果如下：
Figure BDA0002370769490000143
结论：使用西门子1200生化分析仪测得的相对偏差均小于±15％，本发明的试剂盒的检测结果具有较高的准确性。
综上所述，本发明实施例部分采用大量的试验证明本发明试剂盒的产品性能，磷酸肌酸激酶同工酶(CKMB)检测试剂盒(免疫抑制法)在西门子1200型全自动生化仪上检测试剂空白、灵敏度、线性范围、重复性、批间差、准确度等各项指标，符合该产品拟定的产品技术要求，能够满足临床实际需要。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种磷酸肌酸激酶同工酶检测试剂盒,其特征在于，包括第一试剂，所述第一试剂包括如下成分：
124-126mmol/L的咪唑、2-3mmol/L的醋酸镁、12-13mmol/L的乙二胺四乙酸、34-34.3mmol/L的甘露醇、6-6.5mmol/L的单磷酸腺苷、0.01-0.015mmol/L的二腺苷五磷酸锂、2-3mmol/L的还原性辅酶Ⅱ、0.8-1.2g/L的Proclin150、3.5-4ku/L的已糖激酶、24-26mmol/L的N-乙酰半胱氨酸、2-3mmol/L的亚硫酸钠、2-3ml/L的抗人CK-M抗体。
2.根据权利要求1所述的磷酸肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，所述咪唑、醋酸镁、乙二胺四乙酸、甘露醇、单磷酸腺苷、二腺苷五磷酸锂、还原性辅酶Ⅱ、Proclin150、已糖激酶、N-乙酰半胱氨酸、亚硫酸钠、抗人CK-M抗体在所述第一试剂中的含量分别为：125mmol/L、2.5mmol/L、12.5mmol/L、34.1mmol/L、6.25mmol/L、0.0125mmol/L、2.5mmol/L、1g/L、3.75ku/L、25mmol/L、2.5mmol/L、2.5ml/L。
3.根据权利要求1所述的磷酸肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，还包括第二试剂，所述第二试剂包括如下成分：
19-21mmol/L的磷酸盐缓冲液、1g/L的Proclin150、149.76-149.8mmol/L的磷酸肌酸、54.87-54.91mmol/L的葡萄糖、11.85-11.89mmol/L的5‘-腺苷二磷酸二钠盐、1-3g/L的牛血清白蛋白、28-32ku/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、0.1-0.3ml/L的庆大霉素。
4.根据权利要求3所述的磷酸肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液、Proclin150、磷酸肌酸、葡萄糖、5‘-腺苷二磷酸二钠盐、牛血清白蛋白、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、庆大霉素在所述第二试剂中的含量分别为：20mmol/L、1g/L、149.78mmol/L、54.89mmol/L、11.87mmol/L、2g/L、30ku/L、0.2ml/L。
5.根据权利要求1所述的磷酸肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，所述第一试剂的制作规程包括如下步骤：
S1：称量所述第一试剂中的对应成分，
S2：于容器内加水0.8L，加入称量好的咪唑，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的醋酸镁，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，搅拌加入称量好的乙二胺四乙酸，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的甘露醇，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的单磷酸腺苷，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的二腺苷五磷酸锂，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的还原性辅酶Ⅱ，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的Proclin150，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的已糖激酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的N-乙酰半胱氨酸，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，
S3：对所述S2中的溶液在温度为20℃～25℃下调整PH值至6.72～6.62，加入称量好的亚硫酸钠，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的抗人CK-M抗体，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，
S4：对所述S3的溶液用工艺用水稀释至1L，用磁力搅拌器2-3档搅拌2h。
6.根据权利要求5所述的磷酸肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，在第一试剂的制作规程的所述S2中，搅拌时间为27-33min。
7.根据权利要求3所述的磷酸肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，所述第二试剂的制作规程包括如下步骤：
S1：称量所述第二试剂中的对应成分，
S2：于1L容器内加水0.8L，加入称量好的磷酸盐缓冲液，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的Proclin150，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，搅拌加入称量好的磷酸肌酸，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的葡萄糖，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的5‘-腺苷二磷酸二钠盐，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的牛血清白蛋白，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，加入称量好的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，
S3：对所述S2中的溶液在温度为20℃下调整PH值至9.3，搅拌加入称量好的庆大霉素，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，
S4：对所述S3的溶液用工艺用水稀释至1L。
8.根据权利要求7所述的磷酸肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，在所述第二试剂的制作规程的所述S4中，对稀释后的溶液用磁力搅拌器2-3档搅拌2h。
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