CN111235222A - 一种甘油三酯检测试剂盒 - Google Patents

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CN111235222A CN202010049934.XA CN202010049934A CN111235222A CN 111235222 A CN111235222 A CN 111235222A CN 202010049934 A CN202010049934 A CN 202010049934A CN 111235222 A CN111235222 A CN 111235222A
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Shanghai High Track Medical Equipment Co ltd
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/61—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving triglycerides

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Abstract

本发明公开了一种甘油三酯检测试剂盒，涉及甘油三酯检测试剂盒技术领域，包括第一试剂，所述第一试剂包括第一原辅料以及所述R‑1原料，所述R‑1原料包括以下成分：40‑60mmol/L的PIPES、0.5‑1.5g/L的叠氮钠、1‑3g/L的乙二胺四乙酸、0.05‑0.15mmol/L的吐温20、1.40‑1.50mmol/L的5’‑三磷酸腺苷二钠。本发明灵敏度高、线性范围、重复性、批间差、准确度等各项指标，符合该产品拟定的产品技术要求，能够满足临床实际需要，且使用方便，操作简单；参与偶联反应的成分都很稳定，不会引起内外源物质的干扰，稳定性好，可以长时间使用。

Description

一种甘油三酯检测试剂盒
技术领域
本发明涉及甘油三酯检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种甘油三酯检测试剂盒。
背景技术
血清甘油三酯(TG)是一项重要的临床血脂常规测定指标，特别是随着对其致动脉粥样硬化(AS)作用研究的深入，TG作为冠心病的一项独立的危险因素日益受到重视。越来越多的临床与实验证据提示，富含TG脂蛋白(TRL)在AS病因学中扮演重要角色，可能作用于AS病变早期。
血清甘油三酯(TG)其测定方法需要较高的灵敏度和特异性。由最初血清TG测定方法一般分为物理化学法、化学法及酶法三大类。
血清中TG的化学组成并不单一，准确求其分子量较为困难。因标准不同，测定结果存在差异。化学法多采用三棕榈精(软脂精)(分子量807.3)、三油精(分子量895.4)，按摩尔浓度计算。酶法测定以三油精为标准物进行换算。1.法化学测定法包括：①TG的抽提分离；②皂化；③甘油糖的氧化；④氧化生成甲撑显色定量等四个阶段。操作较为繁杂，影响测定因素太多，共法准确性差，一般很少用。2.测定酶法测定包括：①TG的抽提与皂化；②加水分解生成甘油糖定量两个阶段。
目前常规检测应用的方法有甘油激酶(glycerolkinase，GK)法和甘油氧化酶(glyceroloxidase，glyod，GOD)法。操作简便，快速准确，并能在自动化生化分析仪上进行批量测定。但是上述存在灵敏度，精密度、准确性、线性范围等方面的问题，在临床应用上存在着差异性，为此我们设计出了一种甘油三酯检测试剂盒来解决以上问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种甘油三酯检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种甘油三酯检测试剂盒，包括第一试剂，所述第一试剂包括第一原辅料以及所述R-1原料，所述R-1原料包括以下成分：40-60mmol/L的PIPES、0.5-1.5g/L的叠氮钠、1-3g/L的乙二胺四乙酸、0.05-0.15mmol/L的吐温20、1.40-1.50mmol/L的5’-三磷酸腺苷二钠、0.7-0.8mmol/L的ADPS、2500-3500U/L的脂蛋白酯酶、800-1200U/L的抗坏血酸氧化酶、2500-3500U/L的过氧化物酶、8-12ml/L的庆大霉素。
优选的，所述R-1原料包括以下成分含量：50mmol/L的PIPES、1g/L的叠氮钠、2g/L的乙二胺四乙酸、0.1mmol/L的吐温20、1.49mmol/L的5’-三磷酸腺苷二钠、0.75mmol/L的ADPS、3000U/L的脂蛋白酯酶、1000U/L的抗坏血酸氧化酶、3000的过氧化物酶、10ml/L的庆大霉素。
优选的，还包括第二试剂，所述第二试剂包括第二原辅料以及R-2原料，所述R-2原料包括以下成分：40-60mmol/L的PIPES、0.5-1.5g/L的叠氮钠、0.94-0.95mmol/L的4-氨基安替比林、0.05-0.15mmol/L的甘露醇、2500-3500U/L的甘油激酶、20000-30000U/L的L-α-磷酸甘油氧化酶。
优选的，所述R-2原料包括以下成分：50mmol/L的PIPES、1g/L的叠氮钠、0.945mmol/L的4-氨基安替比林、0.1mmol/L的甘露醇、3000U/L的甘油激酶、24000U/L的L-α-磷酸甘油氧化酶。
优选的，所述第一试剂的制作规程包括如下步骤：
S1、称量所述第一试剂以及R-1试剂中的对应成分，称量时一人称量一人复核，称量误差控制在0.5％范围内；
S2、于1升容器内加水约0.8L，加入称量好的PIPES，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的叠氮钠，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，得到溶液A；
S3、将步骤S2中的溶液A调PH值至7.0，搅拌加入称量好的乙二胺四乙酸，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的吐温20，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的5’-三磷酸腺苷二钠，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的ADPS，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的脂蛋白酯酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的抗坏血酸氧化酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的过氧化物酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的庆大霉素，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，得到溶液B；
S4、用工艺用水将步骤S3中得到的溶液B稀释至1L，用磁力搅拌器2-3档搅拌2h，得到溶液C；
S5、将步骤S4中得到的溶液C PH值在7.0室温。
优选的，所述第一试剂的制作规程的所述S2中，搅拌时间为27-33min。
优选的，所述第二试剂的制作规程包括如下步骤：
S1、称量所述第二试剂以及R-2试剂中的对应成分，称量时一人称量一人复核，称量误差控制在0.5％范围内；
S2、于1L容器内加水约0.8L，加入称量好的PIPES，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的叠氮钠，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，得到溶液D；
S3、将步骤S2中的溶液D调PH值6.75室温,加入称量好的4-氨基安替比林，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的甘露醇，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的甘油激酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的L-α-磷酸甘油氧化酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，得到溶液E；
S4、用工艺用水将步骤S3中得到的溶液E稀释至1L，用磁力搅拌器2-3档搅拌2h，得到溶液F；
S5、将步骤S4中得到的溶液F PH值在6.75室温。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提出的一种甘油三酯检测试剂盒，灵敏度高、线性范围、重复性、批间差、准确度等各项指标，符合该产品拟定的产品技术要求，能够满足临床实际需要，且使用方便，操作简单；参与偶联反应的成分都很稳定，不会引起内外源物质的干扰，稳定性好，可以长时间使用。
附图说明
图1为本发明提出的一种甘油三酯检测试剂盒的制备工艺流程图；
图2为本发明提出的一种甘油三酯检测试剂盒的生产工艺流程图。
具体实施方式
下面结合实施例及对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不仅限于此。
参考图1-2，其中，图2中灰色图示代表10万级净化生产区域；无色图示代表清洁生产区域；
制备例
1、主要材料以及仪器
第一试剂：50mmol/L的PIPES、1g/L的叠氮钠、2g/L的乙二胺四乙酸、0.1mmol/L的吐温20、1.49mmol/L的5’-三磷酸腺苷二钠、0.75mmol/L的ADPS、3000U/L的脂蛋白酯酶、1000U/L的抗坏血酸氧化酶、3000的过氧化物酶、10ml/L的庆大霉素；
第二试剂：40-60mmol/L的PIPES、0.5-1.5g/L的叠氮钠、0.94-0.95mmol/L的4-氨基安替比林、0.05-0.15mmol/L的甘露醇、2500-3500U/L的甘油激酶、20000-30000U/L的L-α-磷酸甘油氧化酶。
仪器：AL104精密电子天平：灵敏度0.1mg，用于称量工序；
TC30K型精密电子天平：灵敏度10mg,用于称量工序；
T1000Y型电子天平：灵敏度10mg,用于称量工序；
磁力搅拌器：99-1型，用于溶解工序。
精密酸度计：FE20,用于PH工序。
电子秤：灵敏度20g,用于定容工序。
其中，玻璃烧杯等玻璃器皿。使用前确认玻璃烧杯等玻璃器皿已经按照《配制用容器清洗规程》处理完毕。
定量加量器：1ml、100-1000ul、20-200ul。
移液管：10ml、5ml。
2、制备步骤
2.1第一试剂的制作规程
S1、称量所述第一试剂以及R-1试剂中的对应成分，称量时一人称量一人复核，称量误差控制在0.5％范围内；
S2、于1升容器内加水约0.8L，加入称量好的PIPES，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的叠氮钠，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，得到溶液A；
S3、将步骤S2中的溶液A调PH值至7.0，搅拌加入称量好的乙二胺四乙酸，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的吐温20，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的5’-三磷酸腺苷二钠，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的ADPS，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的脂蛋白酯酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的抗坏血酸氧化酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的过氧化物酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的庆大霉素，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，得到溶液B；
S4、用工艺用水将步骤S3中得到的溶液B稀释至1L，用磁力搅拌器2-3档搅拌2h，得到溶液C；
S5、将步骤S4中得到的溶液C PH值在7.0室温。
2.2第二试剂的制作规程：
S1、称量所述第二试剂以及R-2试剂中的对应成分，称量时一人称量一人复核，称量误差控制在0.5％范围内；
S2、于1L容器内加水约0.8L，加入称量好的PIPES，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的叠氮钠，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，得到溶液D；
S3、将步骤S2中的溶液D调PH值6.75室温,加入称量好的4-氨基安替比林，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的甘露醇，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的甘油激酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的L-α-磷酸甘油氧化酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，得到溶液E；
S4、用工艺用水将步骤S3中得到的溶液E稀释至1L，用磁力搅拌器2-3档搅拌2h，得到溶液F；
S5、将步骤S4中得到的溶液F PH值在6.75室温。
在对第一试剂盒第二试剂制备后，均对第一试剂和第二试剂进行分装、包装和物料平衡。
其中：第一试剂试用的工序：1配制(称重、溶解、调ph、定容)、2分装、3包装、4物料平衡；
第二试剂试用的工序：1配制(称重、溶解、调ph、定容)、2分装、3包装、4物料平衡。
需要说明的是，分装：见《生产过程作业指导书》中分装操作程序；
包装：见《生产过程作业指导书》中包装操作程序；
物料平衡：领料单领出料配制后的重量之和与成品的重量之和的差值应该在领料的15％范围之内。
实施例
3、性能测试
3.1甘油三酯(TG)试剂盒批次和规格
分别制作不同批次的前述的制备例中的试剂盒，根据批次命名，分别为样品1、样品2、样品3，本产品共有12种包装规格，只是大小包装不同，对性能评估结果没有影响，因此只对其中一种最常用规格进行了测定，规格采用60ml(第一试剂:1×40ml,第二试剂:1×20ml)。
3.2校准品和质控品
用于性能评估的校准品：RANDOX Calibrator SERUM CAL 2，Lot:900UN，标示值:1.36mmol/L；
用于准确度性能评估的参考物质：Cobas公司的Calibrator for automatedsystems，Lot:171650，标示值:1.39mmol/L；
质控品为：RANDOX-HUM ASY CONTROL，Lot:844UN，target:1.14mmol/L，range:0.96-1.33mmol/L；Lot:578UE，target:2.88mmol/L，range:2.42-3.34mmol/L。
3.3实验仪器以及原理
实验仪器：西门子1200型全自动生化分析仪。
实验原理：
Figure BDA0002370768130000091
Figure BDA0002370768130000092
Figure BDA0002370768130000093
Figure BDA0002370768130000094
在一定波长处比色，吸光率(△A)与TG浓度成正比。
3.4产品性能指标
外观:试剂盒外观应整洁，文字符号标识清晰；试剂R1和R2为透明液体，不得有沉淀和絮状物；
装量：各规格试剂瓶装量应不少于标示量；
试剂空白吸光度：A546nm(1.0cm)≤0.2；
分析灵敏度:测定理论浓度2.26mmol/L样品，吸光度变化要求>0.100A；
线性区间：在0mmol/L-11.3mmol/L线性区间内，r≥0.990；
准确度：使用参考物质进行测定，实测值与标示值的相对偏差应在±15％内；
重复性：批内精密度CV≤5.0％；批间差≤10.0％；
稳定性:产品在2℃～8℃条件下存放至有效期末，检测指标符合以上1～7的指标要求。
3.5试剂空白检测
3.5.1产品技术要求
试剂空白吸光度：A546nm(1cm)≤0.10
3.5.2实验方法
用纯水测试样品1、样品2、样品3在测试主波长546nm下，记录测试启动时的吸光度(A1)和约5分钟(T)后的吸光度(A2)，A2测试结果即为试剂空白吸光度测定值。
3.5.3实验结果
Figure BDA0002370768130000101
3.5.4结论
样品1、样品2、样品3的TG试剂盒分别在西门子1200生化仪测定，实验结果符合试剂空白吸光度：A546nm(1cm)≤0.10。
3.6分析灵敏度
3.6.1产品技术要求
用已知浓度的样品测试样品1、样品2、样品3，记录在试剂盒规定参数下产生的吸光度变化；本试验测定2.26mmol/L样品，吸光度变化要求>0.100A。
3.6.2实验方法
测定理论浓度约2.26mmol/L样本。
3.6.3实验结果
Figure BDA0002370768130000111
3.6.4结论：样品1、样品2、样品3的TG试剂盒分别在西门子1200生化仪测定，实验结果表明测定理论值在2.26mmol/L样品，吸光度变化要求>0.100A。
3.7线性范围
3.7.1要求及制备方法
用接近线性范围上限的高浓度样品和接近线性范围下限的低浓度样品，混合成6个稀释浓度(x i)。分别测试试剂盒，每个稀释度测试3次，分别求测定均值(yi)。以稀释浓度(x i)为自变量，以测定均值(yi)为因变量求出线性回归方程及相关系数(r)。按公式(1)计算相关系数(r)。
Figure BDA0002370768130000112
用上述方法中稀释浓度xi代入线性回归方程，计算yi的估算值与yi的线性偏差，应符合产品技术要求的规定。
3.7.2产品技术要求
要求试剂盒在样本浓度0mmol/L-11.3mmol/L范围内，整个反应呈线性，r≥0.990，线性相对偏差<±15％。
3.7.3实验结果
Figure BDA0002370768130000121
3.7.4结论：样品1、样品2、样品3的TG试剂盒分别在西门子1200生化仪测定，实验结果表明在0mmol/L-11.3mmol/L测定范围内，线性误差均未出现线性异常状况,所有R2值均大于行业普遍认可的0.990的标准，线性相对偏差均<±15％。
3.8测量精密度
3.8.1重复性
在重现性条件下，用质控品测试试剂盒。测试10次，分别计算测量值的平均值和标准差，按公式(2)计算变异系数(CV)，应符合产品技术要求。
Figure BDA0002370768130000131
3.8.2产品技术要求
批内精密度 CV≤4.0％
3.8.3实验结果
Figure BDA0002370768130000132
Figure BDA0002370768130000141
3.8.4结论
在高低两个不同浓度水平的质控血清测试下，使用西门子1200生化分析仪测得的批内不精密度均小于4％，属于可接受范畴。
3.8.5批间差
用质控品分别测试3个不同批次的试剂盒。每个批次测试3次，分别计算每批3次检测的均值
Figure BDA0002370768130000142
以及总计9次的均值
Figure BDA0002370768130000143
按公式(3)、(4)计算相对偏差(R)，结果应符合产品技术要求的规定。
Figure BDA0002370768130000144
Figure BDA0002370768130000145
3.8.6产品技术要求
批间相对偏差≤5.0％
3.8.7实验结果
Figure BDA0002370768130000146
Figure BDA0002370768130000151
3.8.8结论
用质控品分别测试3个不同批次的样品1、样品2、样品3，使用西门子1200生化分析仪测得的批间相对偏差小于5％，属于可接受范畴。
3.9准确度
3.9.1产品技术要求
与有证参考物质的相对偏差不超过±15％。
3.9.2实验方法
测定TG Cobas公司的Calibrator for automated systems 3次，计算3次结果平均值，按公式(5)计算相对偏差，结果应符合产品技术要求：
Figure BDA0002370768130000152
式中：
Figure BDA0002370768130000161
---测试结果均值；
X靶---有证参考物质的标示值。
3.9.3实验结果
Figure BDA0002370768130000162
3.9.4结论：
使用西门子1200生化分析仪测得的相对偏差均小于±15％，属于可接受范畴。
其中，产品配方工艺与此次进行性能分析的试剂无改变，本发明的试剂盒的检测结果具有较高的准确性。
综上所述，本发明实施例部分采用大量的试验证明本发明试剂盒的产品性能，甘油三酯(TG)检测试剂盒(酶比色法)在西门子1200型全自动生化仪上检测试剂空白、分析灵敏度、线性范围、重复性、批间差、准确度等各项指标，符合该产品拟定的产品技术要求，能够满足临床实际需要，且使用方便，操作简单；参与偶联反应的成分都很稳定，不会引起内外源物质的干扰，稳定性好，可以长时间使用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种甘油三酯检测试剂盒，其特征在于，包括第一试剂，所述第一试剂包括第一原辅料以及所述R-1原料，所述R-1原料包括以下成分：40-60mmol/L的PIPES、0.5-1.5g/L的叠氮钠、1-3g/L的乙二胺四乙酸、0.05-0.15mmol/L的吐温20、1.40-1.50mmol/L的5’-三磷酸腺苷二钠、0.7-0.8mmol/L的ADPS、2500-3500U/L的脂蛋白酯酶、800-1200U/L的抗坏血酸氧化酶、2500-3500U/L的过氧化物酶、8-12ml/L的庆大霉素。
2.根据权利要求1所述的一种甘油三酯检测试剂盒，其特征在于，所述R-1原料包括以下成分含量：50mmol/L的PIPES、1g/L的叠氮钠、2g/L的乙二胺四乙酸、0.1mmol/L的吐温20、1.49mmol/L的5’-三磷酸腺苷二钠、0.75mmol/L的ADPS、3000U/L的脂蛋白酯酶、1000U/L的抗坏血酸氧化酶、3000的过氧化物酶、10ml/L的庆大霉素。
3.根据权利要求1所述的一种甘油三酯检测试剂盒，其特征在于，还包括第二试剂，所述第二试剂包括第二原辅料以及R-2原料，所述R-2原料包括以下成分：40-60mmol/L的PIPES、0.5-1.5g/L的叠氮钠、0.94-0.95mmol/L的4-氨基安替比林、0.05-0.15mmol/L的甘露醇、2500-3500U/L的甘油激酶、20000-30000U/L的L-α-磷酸甘油氧化酶。
4.根据权利要求3所述的一种甘油三酯检测试剂盒，其特征在于，所述R-2原料包括以下成分：50mmol/L的PIPES、1g/L的叠氮钠、0.945mmol/L的4-氨基安替比林、0.1mmol/L的甘露醇、3000U/L的甘油激酶、24000U/L的L-α-磷酸甘油氧化酶。
5.根据权利要求1所述的一种甘油三酯检测试剂盒，其特征在于，所述第一试剂的制作规程包括如下步骤：
S1、称量所述第一试剂以及R-1试剂中的对应成分，称量时一人称量一人复核，称量误差控制在0.5％范围内；
S2、于1升容器内加水约0.8L，加入称量好的PIPES，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的叠氮钠，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，得到溶液A；
S3、将步骤S2中的溶液A调PH值至7.0，搅拌加入称量好的乙二胺四乙酸，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的吐温20，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的5’-三磷酸腺苷二钠，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的ADPS，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的脂蛋白酯酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的抗坏血酸氧化酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的过氧化物酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的庆大霉素，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，得到溶液B；
S4、用工艺用水将步骤S3中得到的溶液B稀释至1L，用磁力搅拌器2-3档搅拌2h，得到溶液C；
S5、将步骤S4中得到的溶液C PH值在7.0室温。
6.根据权利要求1所述的一种甘油三酯检测试剂盒，其特征在于，所述第一试剂的制作规程的所述S2中，搅拌时间为27-33min。
7.根据权利要求3所述的一种甘油三酯检测试剂盒，其特征在于，所述第二试剂的制作规程包括如下步骤：
S1、称量所述第二试剂以及R-2试剂中的对应成分，称量时一人称量一人复核，称量误差控制在0.5％范围内；
S2、于1L容器内加水约0.8L，加入称量好的PIPES，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的叠氮钠，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，得到溶液D；
S3、将步骤S2中的溶液D调PH值6.75室温,加入称量好的4-氨基安替比林，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的甘露醇，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的甘油激酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解；加入称量好的L-α-磷酸甘油氧化酶，用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解，得到溶液E；
S4、用工艺用水将步骤S3中得到的溶液E稀释至1L，用磁力搅拌器2-3档搅拌2h，得到溶液F；
S5、将步骤S4中得到的溶液F PH值在6.75室温。
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