CN109613274A - 一种测定肌酐的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定肌酐的试剂盒及方法,试剂盒包括第一试剂,所述第一试剂包括:磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙二胺四乙酸、Brij 35、吐温80、抗坏血酸氧化酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、TOOS、过氧化物酶、亚铁氰化钾、硫酸庆大酶素和吐温30;方法包括以下步骤:1)按原料组分及含量分别溶解第一试剂和第二试剂;2)将溶解的第一试剂加入待测样品中;3)加入溶解的第二试剂;4)测定溶液在546nm波长下的吸光率;本发明提供了精密度、准确性均较高且稳定的测定肌酐的试剂盒及方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,尤其涉及一种测定肌酐的试剂盒及方法。
背景技术
肌酐(Creatinine,Cr)检测试剂盒,供医疗机构用于体外定量检测人血清样本中的肌酐(Creatinine,Cr)的含量,作辅助诊断用。人体内肌肉代谢产生的肌酐释放进入血液后,则为血肌酐。血肌酐与肌酐清除率并不完全一致,肌酐清除率较血肌酐更为敏感。在肾功能减退早期(代偿期),肌酐清除率下降而血肌酐却正常。当肾小球滤过率下降到正常的50%以上时,血肌酐才开始迅速上升,因此当血肌酐明显高于正常时,常表示肾功能已严重损害。
由于肌酐清除率还受到肾小球浓缩功能的影响,在肾浓缩功能受损的情况下,血肌酐就是反映肾小球功能的最可靠指标。正常男性血肌酐为53-106gmol/L,女性为44.2-97.2gmol/L。血肌酐增高:见于肢端肥大症、巨人症、糖尿病、感染、进食肉类、运动、摄入药物(如维生素C、左旋多巴、甲基多巴等)、急性或慢性肾功能不全。血肌酐减低:见于重度充血性心力衰竭、贫血、肌营养不良、白血病、素食者,以及服用雄激素、噻嗪类药等。
在众多肌酐(Creatinine,Cr)检测试剂盒中,主要有以下几种方法:
1.肌酐测定试剂盒(苦味酸法)产品性能结构及组成氢氧化钠120mmol/l、苦味酸2.9mmol/l、防腐剂;但是该方法由于苦味酸法的特异性较差,影响测定值的干扰物质较多,这种干扰在测定低值标本时尤其明显,,易造成结果的重复性较差
2.同位素稀释液相色谱串联质谱法(ID-LC-MS/MS);但是该方法价格昂贵且需特定的仪器,一定程度上限制了它的应用。
3.干化学法,但是该方法对临床高值样本的结果的准确性较差。
4.肌酐测定试剂盒(酶法)产品性能结构及组成试剂1:肌酸酶,肌氨酸氧化酶,N-(3-磺丙基)-3-甲氧-5-甲基苯胺;试剂2:肌酐酶,4-氨基安替吡啉,过氧化物酶,叠氮化钠;但是该方法酚磺乙胺对肌酐酶偶联肌氨酸氧化酶法法检测肌酐有负干扰。
发明内容
针对上述技术问题,本发明提供了精密度、准确性均较高且稳定的测定肌酐的试剂盒及方法。
本发明的第一个方面,提供了一种测定肌酐的试剂盒,包括第一试剂,所述第一试剂包括:磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙二胺四乙酸、Brij 35、吐温80、抗坏血酸氧化酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、TOOS、过氧化物酶、亚铁氰化钾、硫酸庆大酶素和吐温30。
优选地,所述亚铁氰化钾在所述第一试剂中含量为1.5-3.5mg/L。
优选地,所述乙二胺四乙酸在所述第一试剂中的含量为5-15mmol/L。
优选地,所述肌酸酶在所述第一试剂中的含量为25-35U/ml,所述肌氨酸氧化酶在所述第一试剂中的含量为10-15U/ml。
优选地,还包括第二试剂,所述第二试剂包括:三氨基甲烷、3-吗啉丙磺酸、4-AAP、Brij 35、肌酐酶、吐温30、ProClin150。
优选地,所述ProClin150在所述第二试剂中的含量为0.06-0.10%。
优选地,所述肌酐酶在所述第二试剂中的含量为300-500U/ml,所述4-AAP在所述第二试剂中的含量为1-5mmol/L。
优选地,所述Brij 35在所述第一试剂和所述第二试剂中的含量均为3-8%。
本发明的第二个方面,提供了一种测定肌酐的试剂盒,包括以下原料及含量:
第一试剂:0.5-3mmol/L磷酸二氢钾、25-30mmol/L磷酸氢二钾、5-15mmol/L乙二胺四乙酸、3-8%Brij 35、0.5-1.5mmol/L吐温80、1500-2500U/L抗坏血酸氧化酶、25-35U/ml肌酸酶、10-15U/ml肌氨酸氧化酶、0.2-1.0mmol/LTOOS、4500-5500U/L过氧化物酶、1.5-3.5mg/L亚铁氰化钾、150000-170000U/L硫酸庆大酶素和0.1-0.5%吐温30;
第二试剂:25-35mmol/L三氨基甲烷、0.1-0.3mmol/L 3-吗啉丙磺酸、1-5mmol/L4-AAP、3-8%Brij 35、300-500U/ml肌酐酶、0.1-0.5%吐温30、0.06-0.10%ProClin150。
优选地,第一试剂:1.5mmol/L磷酸二氢钾、28.5mmol/L磷酸氢二钾、10mmol/L乙二胺四乙酸、5%Brij 35、1mmol/L吐温80、2000U/L抗坏血酸氧化酶、30U/ml肌酸酶、13.5U/ml肌氨酸氧化酶、0.6mmol/LTOOS、5000U/L过氧化物酶、2.5mg/L亚铁氰化钾、160000U/L硫酸庆大酶素和0.3%吐温30;
第二试剂:30mmol/L三氨基甲烷、0.1mmol/L 3-吗啉丙磺酸、2mmol/L 4-AAP、6%Brij 35、400U/ml肌酐酶、0.3%吐温30、0.08%ProClin150。
本发明的第三个方面,提供了本发明所述的试剂盒的使用方法,包括以下步骤:
1)按原料组分及含量分别溶解第一试剂和第二试剂;
2)将溶解的第一试剂加入待测样品中;
3)加入溶解的第二试剂;
4)测定溶液在546nm波长下的吸光率。
优选地,所述第一试剂、所述第二试剂的PH值均为8.0。
本发明的试剂盒能够实现精密度、准确性均较高且稳定,其主要原理包括以下内容:
1、本发明的发明人发现,本发明的乙二胺四乙酸能够与试剂中的金属离子结合,避免金属离子干扰,从而大大增加了试剂盒的准确性。
2、本发明的第一试剂和第二试剂中均加入了ProClin150,ProClin150在第一试剂和第二试剂主要起到抑制第一试剂和第二试剂自身反应、降解的功能,具有较好的稳定性和低毒性,从而大大增加了试剂盒的稳定性。
3、在本发明的试剂盒中,Brij 35可以抑制过氧化氢酶的活性,高铁氰化钾可以起到去除样胆红素干扰。庆大素属于抗生素发挥抑菌作用,维持试剂稳定性。
与现有技术相比,本发明的技术方案具有以下优点:本发明提供了精密度、准确性均较高且稳定的测定肌酐的试剂盒及方法;本发明使用方便、操作简单,参与偶联反应的成分都很稳定,不会引起内外源物质的干扰,稳定性好,可以长时间使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明测定肌酐的试剂盒的制备流程图。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明,以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
实施例1
根据图1所示的流程制备试剂盒,大体包括以下步骤:
1、主要材料及仪器
第一试剂:磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙二胺四乙酸、Brij 35、吐温80、抗坏血酸氧化酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、TOOS、过氧化物酶、亚铁氰化钾、硫酸庆大酶素、和吐温30。
第二试剂:三氨基甲烷、3-吗啉丙磺酸、4-AAP、Brij 35、肌酐酶、吐温30、ProClin150。
仪器:AL104精密电子天平(灵敏度0.1mg)、TC30K型精密电子天平(灵敏度10mg)、T1000Y型电子天平(灵敏度10mg)、磁力搅拌器(99-1型)、精密酸度计(FE20)、电子秤(灵敏度20g)、玻璃烧杯、量筒。
2、方法
1)在1L容器中加入0.8L工业用水,然后依次加入1.5mmol磷酸二氢钾、28.5mmol磷酸氢二钾、10mmol乙二胺四乙酸、50ml Brij 35、1mmol吐温80、2000U抗坏血酸氧化酶、30000U肌酸酶、13500U肌氨酸氧化酶、0.6mmolTOOS、5000U过氧化物酶、2.5mg亚铁氰化钾、160000U硫酸庆大酶素和3ml吐温30;每次加入一个原料后用磁力搅拌器2-3档搅拌均匀,总共搅拌30min。
2)调整混合液PH值为8.0,并定容混合液为1L,且PH值保持8.0。
3)在1L容器中加入0.8L工业用水,然后依次加入30mmol三氨基甲烷、0.1mmol 3-吗啉丙磺酸、2mmol 4-AAP、60mlBrij 35、400000U肌酐酶、3ml吐温30、0.8ProClin150;每次加入一个原料后用磁力搅拌器2-3档搅拌均匀,总共搅拌30min。
4)调整混合液PH值为8.0,并定容混合液为1L,且PH值保持8.0。
5)分别分装第一试剂溶液和第二试剂溶液。
实施例2
采用实施例1制备的第一试剂和第二试剂检测人血方法简述如下:
1、将溶解的第一试剂加入待测样品中;
2、加入溶解的第二试剂;
3、测定溶液中在546nm波长处比色,吸光率(△A)。
上述方法的原理如下:
实施例3
分别制作不同批次的实施例1所述的试剂盒,根据批次命名,分别为样品1(20141119)、样品2(20140918)、样品3(20140721),作为实验组;
用于性能评估的校准品:RANDOX-Calibrator SERUM CAL 2,Lot:900UN,标示值137μmol/L;
用于准确度性能评估的参考物质:Cobas-Calibrator for automated systems,Lot:171650,标示值:340μmol/L;
质控品为:RANDOX公司HUM ASY CONTROL,Lot:844UN,target:129μmol/L,range:104-154μmol/L;Lot:506UE,target:372μmol/L,range:297-447μmol/L。
实验方法参照GB/T26124-2011《中华人民共和国国家标准-临床化学体外诊断试剂(盒)》。
实验仪器:西门子1200型全自动生化分析仪。
1、产品外观
样品1、样品2和样品3的溶液均为透明液体,无沉淀和絮状物。
2、试剂空白
测试3个样品在主波长546nm下,记录测试启动时的吸光度(A1)和约5分钟(T)后的吸光度(A2),A2测试结果即为试剂空白吸光度测定值;结果如下表:
样本 | 吸光度 |
样品1 | 0.0088 |
样品2 | 0.0097 |
样品3 | 0.0081 |
根据结果可知,3个样本试剂空白吸光度为0.0081-0.0097,远小于临界值A546nm(1cm)≤0.02;上述数据反应了样品内的各试剂相互作用导致的降解,从上述实验数据可以看出,本发明的试剂盒的各试剂间具有较稳定的协同作用,这也为本发明的试剂盒监测肌酐的有效性奠定了基础。
3、灵敏度检测
用已知浓度的样品测试试剂盒,记录在试剂盒规定参数下产生的吸光度变化,本试验测定137μmol/L样品,吸光度变化率要求>0.03/min;具体结果如下表所示:
从上表可知,三个批号的试剂盒分别在西门子1200生化仪测定,实验结果表明测定理论值在137μmol/L样品,吸光度变化率满足要求>0.0300A。
4、线性范围
用接近线性范围上限的高浓度样品和接近线性范围下限的低浓度样品,混合成6个稀释浓度(xi)。分别测试试剂盒,每个稀释度测试3次,分别求测定均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量,以测定均值(yi)为因变量求出线性回归方程及相关系数(r)。按如下公式计算相关系数(r):
实验结果如下表所示:
依据上表可知,三个样本的试剂盒分别在西门子1200生化仪测定,实验结果表明在0μmol/L-1760μmol/L测定范围内,线性误差均未出现线性异常状况,所有R2值均大于行业普遍认可的0.990的标准,线性相对偏差均<±15%。
5、精密度检测
用质控品(RANDOX公司HUM ASY CONTROL,Lot:844UN,target:129μmol/L,range:104-154μmol/L;Lot:506UE,target:372μmol/L,range:297-447μmol/L)测试样本1、样本2和样本3试剂盒。重复测试10次,分别计算测量值的平均值和标准差,按公式计算变异系数(CV):
实验结果如下表所示:
3个样本经过10次重复,在高低两个不同浓度水平的质控血清测试下,测得的批内不精密度为1.90%-4.35%,均小于6%的临界值。可见,本发明的试剂盒测试结果非常准确,具有临床参考价值。
用质控品分别测试3个样本的试剂盒。每个样本测试3次,分别计算每个样本的3次检测的均值(i=1,2,3),以及总计9次的均值按公式(计算相对偏差(R):
实验结果如下表所示:
从上表可以看出3个样本相对偏差为4.60%,小于临界值6%。可见,本发明的试剂盒的试剂间以及生产方法具有稳定性,使本发明的试剂盒能够得到稳定的结果,且结果的准确性高,具有重要的临床参考价值。
6、准确度检测
以Cobas-Calibrator for automated systems,Lot:171650,标示值:340μmol/L,为对照组,用测定Cr Cobas-Calibrator for automated systems测定3次,计算3次结果平均值为标准值,用3个样本进行检测,并按照公式计算:
式中:
---测试结果均值;
X靶---有证参考物质的标示值。
结果如下表所示:
根据上表可见,本发明样本的相对偏差为-4.90,远小于临界值±15%,可见,本发明的试剂盒的检测结果具有较高的准确性。
综上所述,本发明实施例部分采用大量的试验证明本发明试剂盒的产品性能稳定、检测结果准确性强,在西门子1200型全自动生化仪上检测试剂空白、分析灵敏度、线性范围、重复性、批间差、准确度等各项指标,符合该产品预设的产品技术要求,并且,该预设指标均大于现有技术较佳水平,因此,本发明的试剂盒能够满足临床实际需要。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种测定肌酐的试剂盒,其特征在于,包括第一试剂,所述第一试剂包括:磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙二胺四乙酸、Brij 35、吐温80、抗坏血酸氧化酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、TOOS、过氧化物酶、亚铁氰化钾、硫酸庆大酶素和吐温30。
2.如权利要求1所述的测定肌酐的试剂盒,其特征在于,所述亚铁氰化钾在所述第一试剂中含量为1.5-3.5mg/L。
3.如权利要求1所述的测定肌酐的试剂盒,其特征在于,所述乙二胺四乙酸在所述第一试剂中的含量为5-15mmol/L。
4.如权利要求1所述的测定肌酐的试剂盒,其特征在于,所述肌酸酶在所述第一试剂中的含量为25-35U/ml,所述肌氨酸氧化酶在所述第一试剂中的含量为10-15U/ml。
5.如权利要求1所述的测定肌酐的试剂盒,其特征在于,还包括第二试剂,所述第二试剂包括:三氨基甲烷、3-吗啉丙磺酸、4-AAP、Brij 35、肌酐酶、吐温30、ProClin150。
6.如权利要求5所述的测定肌酐的试剂盒,其特征在于,所述ProClin150在所述第二试剂中的含量为0.06-0.10%。
7.如权利要求5所述的测定肌酐的试剂盒,其特征在于,所述肌酐酶在所述第二试剂中的含量为300-500U/ml,所述4-AAP在所述第二试剂中的含量为1-5mmol/L。
8.如权利要求5所述的测定肌酐的试剂盒,其特征在于,所述Brij 35在所述第一试剂和所述第二试剂中的含量均为3-8%。
9.一种测定肌酐的试剂盒,其特征在于,包括以下原料及含量:
第一试剂:0.5-3mmol/L磷酸二氢钾、25-30mmol/L磷酸氢二钾、5-15mmol/L乙二胺四乙酸、3-8%Brij 35、0.5-1.5mmol/L吐温80、1500-2500U/L抗坏血酸氧化酶、25-35U/ml肌酸酶、10-15U/ml肌氨酸氧化酶、0.2-1.0mmol/LTOOS、4500-5500U/L过氧化物酶、1.5-3.5mg/L亚铁氰化钾、150000-170000U/L硫酸庆大酶素和0.1-0.5%吐温30;
第二试剂:25-35mmol/L三氨基甲烷、0.1-0.3mmol/L 3-吗啉丙磺酸、1-5mmol/L 4-AAP、3-8%Brij 35、300-500U/ml肌酐酶、0.1-0.5%吐温30、0.06-0.10%ProClin150。
10.如权利要求1-9任意一项所述的试剂盒的使用方法,包括以下步骤:
1)按原料组分及含量分别溶解第一试剂和第二试剂;
2)将溶解的第一试剂加入待测样品中;
3)加入溶解的第二试剂;
4)测定溶液在546nm波长下的吸光率。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190412 |