CN106918710A - 一种人载脂蛋白c-ⅲ的双抗体夹心elisa检测试剂盒及应用 - Google Patents

一种人载脂蛋白c-ⅲ的双抗体夹心elisa检测试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人载脂蛋白C-III双抗体夹心ELISA试剂盒及其应用。所述试剂盒包括包被抗体的酶标板、生物素标记的检测抗体、HRP标记的链霉亲合素、载脂蛋白C-III标准品、样品稀释液、洗涤液、底物显色液及终止液。检测方法为将载脂蛋白C-III标准品和待测样品加入包被抗体的酶标板中，再依次加入生物素标记的检测抗体、HRP标记的链霉亲合素后加底物显色，检测OD值，通过标准曲线计算待测样品中载脂蛋白C-III的浓度。本发明采用单克隆抗体作为包被抗体，多克隆抗体作为检测抗体，并采用生物素-链霉亲合素放大系统，特异性强，灵敏度高，且操作简便，为高甘油三酯血症患者的临床辅助诊断提供了有效方法。

Description

一种人载脂蛋白C-Ⅲ的双抗体夹心ELISA检测试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体而言，本发明涉及一种人载脂蛋白C-III的双抗体夹心ELISA检测试剂盒及其应用。
背景技术
载脂蛋白C-III是由79个氨基酸组成的小分子糖蛋白，是载脂蛋白C族中含量最丰富的一类，主要在肝脏中合成，仅小部分在小肠合成，载脂蛋白C-III主要分布于乳糜微粒、极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白中。载脂蛋白C-III基因位于11号染色体长臂q23区，在载脂蛋白A-I和载脂蛋白A-IV之间，三者共同组成一个基因家族。载脂蛋白C-III的转录受胰岛素及过氧化物酶体增殖物激活受体等多种因素调控。
载脂蛋白C-III具有抑制脂蛋白脂酶和肝脂酶活性的功能，可抑制肝脏摄取富含甘油三酯的脂蛋白及脂类分解，是血浆甘油三酯水平的主要调节因子。载脂蛋白C-III在血浆高密度脂蛋白和极低密度脂蛋白之间相互转移，在血脂正常个体的血清中，载脂蛋白C-III大部分与高密度脂蛋白结合，而在高甘油三酯血症患者血清中，则大部分与极低密度脂蛋白结合。高甘油三酯血症是我国最常见的脂质代谢异常疾病，是引起冠心病的独立危险因素之一。随着我国肥胖人群的增加，高甘油三酯血症患者的数量也在逐年增加，其发病主要是由于富含甘油三酯的脂蛋白代谢障碍引起，患者血浆中载脂蛋白C-III含量显著高于正常人群，载脂蛋白C-III已成为高甘油三酯血症发生发展的有效标志物。获得灵敏度高的载脂蛋白C-III ELISA检测试剂盒对高甘油三酯血症的临床诊断和科学研究具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种载脂蛋白C-III双抗体夹心ELISA检测试剂盒；
本发明的另一个目的是提供载脂蛋白C-III双抗体夹心ELISA检测试剂盒的使用方法；
本发明的又一个目的是提供载脂蛋白C-III双抗体夹心ELISA检测试剂盒在检测高甘油三酯血症患者血浆中载脂蛋白C-III含量中的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方式实现：
提供一种人载脂蛋白C-III的双抗体夹心ELISA检测试剂盒，其组成包括预包被单克隆抗体的酶标板、生物素标记的检测抗体、辣根过氧化物酶标记的链霉亲合素(HRP-Streptavidin)、载脂蛋白C-III标准品、样品稀释液、洗涤液、TMB底物显色液及终止反应液。
所述包被单克隆抗体为人载脂蛋白C-III单克隆抗体，由保藏号为CCTCC NO.C2015191的杂交瘤细胞株WLC001分泌获得。杂交瘤细胞WLC001保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏日期为2015年11月18日；
所述生物素标记的检测抗体为人载脂蛋白C-III多克隆抗体，由纯化的人血浆载脂蛋白C-III免疫新西兰兔后分离血清纯化后经生物素标记得到；
所述载脂蛋白C-III标准品为Sigma公司生产的纯化的人血浆载脂蛋白C-III；
所述TMB底物显色液由10ml A液、100μl B液和5μl C液按比例混合，其中A液为柠檬酸0.255g与NaHPO4.12H2O 0.92g溶于50ml水，B液为0.01g TMB溶于500μl DMSO，C液为30％H2O2。
所述样品稀释液为1％PBS，所述洗涤液为PBST溶液，由1000mlPBS与500μl Tween-20配制而成，所述终止反应液为2M H2SO4。
一种载脂蛋白C-III的双抗体夹心ELISA检测方法，包括以下步骤：
将100μl不同浓度标准品或待测样品加入到预包被载脂蛋白C-III单克隆抗体的酶标板中，37℃孵育1h，洗涤后加入生物素标记的载脂蛋白C-III多克隆抗体，37℃孵育1h，洗涤后加入HRP标记的链霉亲和素，37℃孵育1h，洗涤后加入TMB底物显色液，37℃避光孵育15min，加入2M H2SO4终止液后用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值。绘制载脂蛋白C-III标准曲线，通过标准曲线计算待测样品中载脂蛋白C-III的浓度。
本发明在传统的ELISA基础上采用了生物素-链霉亲合素放大系统，能显著提高载脂蛋白C-III的检测灵敏度，为高甘油三酯血症患者的临床诊断提供帮助。
附图说明
图1为人载脂蛋白C-III标准品检测标准曲线
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于解释本发明，并非用于限定本发明。在不脱离本发明的技术方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1：人载脂蛋白C-III单克隆抗体的制备
人载脂蛋白C-III单克隆抗体由杂交瘤细胞株WLC001分泌得到。杂交瘤细胞株WLC001是以载脂蛋白C-III多肽作为抗原制备得到，载脂蛋白C-III的多肽序列为：KFSEFWDLDPEVRPTS(如SEQ ID NO：1所示)。杂交瘤细胞株WLC001保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2015年11月18日，保藏编号为CCTCC NO.C2015191，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学。杂交瘤细胞株WLC001的具体制备方法记载于申请号为201510860436.2的专利中，专利名称为：载脂蛋白C-III单克隆抗体的制备及应用。
实施例2：人载脂蛋白C-III多克隆抗体的制备
人载脂蛋白C-III多克隆抗体是由纯化的人载脂蛋白C-III(购自Sigma公司)与弗氏佐剂等体积混匀后免疫新西兰兔，期间进行5次免疫，时间分别为第1天、第22天、第36天、第50天、第57天，待ELISA检测血清抗体效价达1∶16000后，颈动脉采血，分离血清，亲和层析法纯化，SDS-PAGE电泳鉴定载脂蛋白C-III多克隆抗体，分光光度计测定抗体浓度为3.8mg/ml。
实施例3：载脂蛋白C-III单克隆抗体-抗原饱和曲线的建立
用包被液稀释人载脂蛋白C-III抗原为不同浓度，分别为1、5、20、50、100ng/ml，4℃包被过夜，洗涤3次，3％BSA封闭1h。重复洗涤后每孔加入100μl稀释不同浓度的载脂蛋白C-III单克隆抗体，37℃孵育1h，再加入HRP标记的IgG(1∶5000)孵育1h，洗涤后，加底物显色；终止反应；酶标仪检测450nm处OD值。结果显示当抗原稀释至50ng/ml时，OD值趋于稳定，说明抗原抗体的结合已达到饱和，得出载脂蛋白C-III单克隆抗体-抗原饱和浓度为50ng/ml。
实施例4：包被抗体和检测抗体最佳工作浓度的选择
包被缓冲液将人载脂蛋白C-III单克隆抗体稀释至20、10、5、2.5、1.25μg/ml，包被微孔板，4℃过夜。多抗浓度选取20、10、5、2.5、1.25μg/ml，按照方阵进行加样，用人载脂蛋白C-III标准品做阳性对照，以PBS作为阴性对照，进行双抗体夹心ELISA，每组设3个复孔，选择阳性孔OD450/阴性孔OD450(P/N)最大值所对应的包被抗体和检测抗体工作浓度为最佳工作浓度。结果显示，包被抗体最佳工作浓度为10μg/ml，检测抗体最佳工作浓度为5μg/ml。
实施例5：预包被抗体的酶标板和生物素标记的检测抗体的制备
用人载脂蛋白C-III单克隆抗体包被固相载体：用包被液将抗体稀释至最佳工作浓度，加入96孔酶标板(购自Corning公司)中，每孔100μl，4℃过夜，洗板3次，拍干孔中液体，3％BSA封闭液封闭2h，每孔300μl，拍干孔中液体，晾干后铝箔袋真空密封包装，-20℃保存。
用人载脂蛋白C-III多克隆抗体制备生物素标记的检测抗体：将人载脂蛋白C-III多克隆抗体与NHS活化的生物素(购自Sigma公司)以1：20摩尔比混合，室温静置1h后超滤去除过量未标记上的生物素。
实施例6：构建载脂蛋白C-III双抗体夹心ELISA检测体系
(1)加入稀释后的不同浓度的载脂蛋白C-III标准品和待测样品至包被载脂蛋白C-III单克隆抗体的酶标板中，每孔100μl，同时设置阴性对照孔，加入等体积样品稀释液，盖上封板膜，37℃孵育1h，洗涤3次，拍干；
(2)加入生物素标记的载脂蛋白C-III多克隆抗体，每孔100μl，盖上封板膜，37℃孵 育1h，洗涤3次，拍干；
(3)加入HRP标记的链霉亲合素(购自Thermo Fisher公司)，每孔100μl，盖上封板膜，37℃孵育1h，洗涤3次，拍干；
(4)加入TMB底物显色液，每孔100μl，37℃避光孵育15min，加入2M H2SO4终止液终止反应，每孔100μl；
(5)酶标仪于450nm处读取各孔OD值。
实施例7：试剂盒的灵敏度检测
按照选定的最佳工作浓度检测不同浓度的人载脂蛋白C-III标准品，标准品浓度分别为100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.12ng/ml、1.56ng/ml，以PBS作为阴性对照，按照实施例6中操作步骤，检测不同浓度标准品所对应的OD450值，与阴性对照OD450值相比，得到不同浓度标准品对应的P/N值，以P/N大于2.1对应的最低载脂蛋白C-III浓度为最低检测限度，为6.25ng/ml，见表1。以载脂蛋白C-III标准品及对应的OD值做标准曲线，在6.25-100ng/ml之间时，线性关系良好，见图1。
表1灵敏度检测结果
实施例8：人载脂蛋白C-III双抗体夹心ELISA试剂盒在检测人血浆载脂蛋白C-1II含量中的应用
将稀释5000倍的人血浆样本加入到包被抗体的酶标板中，每孔100μl，同时设置阳性对照和阴性对照，37℃孵育1h，洗涤后加入生物素标记的检测抗体，37℃孵育1h，洗涤后加入HRP标记的链霉亲和素，37℃孵育1h，洗涤后加入TMB底物显色液，37℃避光孵育15min，终止反应后酶标仪检测450nm处的OD值，根据标准曲线计算人血浆中载脂蛋白C-III的含量为9.52mg/100ml。

Claims (4)

1.一种人载脂蛋白C-III双抗体夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，其组成包括包被抗体的酶标板、生物素标记的检测抗体、辣根过氧化物酶标记的链霉亲合素(HRP-Streptavidin)、载脂蛋白C-III标准品、样品稀释液、浓缩洗涤液、TMB底物显色液及2M H2SO4终止反应液。
2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述包被抗体为人载脂蛋白C-III单克隆抗体，由保藏号为CCTCC NO.C2015191的杂交瘤细胞株WLC001分泌获得。
3.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的检测抗体为人载脂蛋白C-III多克隆抗体，制备方法为：用纯化的人血浆载脂蛋白C-III与弗氏佐剂等体积混匀后免疫新西兰兔，期间进行5次免疫，时间分别为第1天、第22天、第36天、第50天、第57天，待ELISA检测血清抗体效价达1∶16000后，颈动脉采血，分离血清，亲和层析法纯化后进行生物素标记获得。
4.根据权利要求1-3所述的载脂蛋白C-III双抗体夹心ELISA试剂盒在人载脂蛋白C-III体外检测中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将稀释后的待测样品加入包被载脂蛋白C-III单克隆抗体的酶标板中，每孔100μl，同时设置阳性对照和阴性对照孔，37℃孵育1h，洗涤3次，拍干；
(2)加入生物素标记的检测抗体，每孔100μl，37℃孵育1h，洗涤3次，拍干；
(3)加入HRP标记的链霉亲合素，每孔100μl，37℃孵育1h，洗涤3次，拍干；
(4)加入TMB底物显色液，每孔100μl，37℃避光孵育15min，加入2M H2SO4终止液终止反应；
(5)酶标仪于450nm处读取各孔OD值。
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