CN103257232B - 邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒，属于添加剂检测技术领域。该试剂盒包括每个微孔内包被浓度为1-5μg/mL邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原的酶标板，浓度为1-5μg/mL的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体工作液，且所述邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原与邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体的用量为2.5:1。本发明还公开了一种邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒的制备和使用方法。具有特异性高，结果准确且前处理简单，对仪器设备要求低、检测成本低的特点。适合用于快速而准确地检测大批量样品中的邻苯二甲酸二丁酯。

Description

邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒及其制备和使用方法

技术领域

本发明涉及一种添加剂检测技术，具体来说，特别是涉及一种用于邻苯二甲酸二丁酯含量检测的酶联免疫试剂盒及其制备和使用方法。

背景技术

邻苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate，DBP）是一种优良的增塑剂，由于其相对价廉且加工性好，在国内外使用非常广泛。邻苯二甲酸二丁酯对于多种树脂具有很好的溶解能力，具有色泽浅、电性能好、挥发性低、气味小和耐低温等特点。邻苯二甲酸二丁酯是硝化纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯等的理想增塑剂，具有良好的软化作用和优良的稳定性、粘着性、耐挠曲性和防水性。此外，邻苯二甲酸二丁酯也用于制造油漆、胶粘剂、人造纤维、印刷油墨、安全玻璃、染料、杀虫剂、香料的溶剂和织物润滑剂等化工产品。

但是，邻苯二甲酸二丁酯能引起中枢神经和周围神经系统的功能性变化，然后进一步引起它们组织上的改变；有趋肝性，可引起轻度致敏作用，具有中等程度的蓄积作用和轻度刺激作用，是一种可疑的内分泌干扰素。目前美国、欧盟等多国都明确禁止或限制使用邻苯二甲酸二丁酯，我国也鼓励使用其他化学品替换有毒有害的邻苯二甲酸二丁酯添加在日化用品中。因此，快速检测邻苯二甲酸二丁酯在涂料中的含量是非常必要的。

发明内容

基于此，本发明提供一种邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒和一种邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒的制备和使用方法，该试剂盒在检测邻苯二甲酸二丁酯时可一次连续检测多个样品，具有便捷，快速，灵敏、成本低的特点。

本发明的第一个目的在于提供一种邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒，主要包括：

1）包被邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原的酶标板：所述酶标板的每个微孔内邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原的浓度为1-5μg/mL；

2）邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体工作液：该邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体工作液的浓度为1-5μg/mL；

所述邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原与邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体的用量为2.5:1。

在其中一个实施例中，所述邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒还包括有酶标二抗，所述酶标二抗是浓度按1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗。

在其中一个实施例中，，所述邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原的浓度为2.5μg/mL；所述邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体的浓度为2μg/mL。

在其中一个实施例中，所述邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒还包括邻苯二甲酸二丁酯标准品溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液、封闭液和浓缩样品稀释液。

在其中一个实施例中，所述邻苯二甲酸二丁酯标准品溶液浓度分别为0，0.5μg/L，1.0μg/L，2.0μg/L，10.0μg/L，20.0μg/L，50.0μg/L；所述底物显色剂由显色剂A和显色剂B组成，所述显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，所述显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止液为1-2mol/L的硫酸溶液；所述洗涤液为含有0.05%-0.5%吐温-20的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩样品稀释液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述封闭液为含5%脱脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液。

本发明的第二个目的在于提供一种上述邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒的制备方法，主要包括以下步骤：

1）制备邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原

将邻苯二甲酸与2-乙基己醇混合于环己烷中，加入浓硫酸作为催化剂，回流反应，制得2-（2-乙基己酯）苯甲酸；将上述2-（2-乙基己酯）苯甲酸与2-乙基-6叔丁氧酰胺丙醇混合于环己烷中，加入浓硫酸，回流反应，制得邻苯二甲酸二丁酯被叔丁氧酰胺基胺化产物；随后将上述中间产物加入三氟乙酸中，回流反应，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的氨基邻苯二甲酸二丁酯的半抗原；在N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺的催化下，再与载体蛋白偶联，制得邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原；所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白或甲状腺球蛋白；

2）包被酶标板

将上述邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原包被于酶标板中，所述酶标板的每个微孔内邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原的浓度为1-5μg/mL；

3）动物免疫

以步骤1）中合成的邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原为免疫原免疫小鼠，取免疫小鼠的血清，检测该血清抗邻苯二甲酸二丁酯的效价和抑制价，选取效价和抑制价最高的免疫小鼠；

4）细胞融合与筛选

取步骤3）所得免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株，并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体；制备浓度为1-5μg/mL的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体工作液。

在其中一个实施例中，上述步骤1）中，制备邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原的具体方法为：将1.66g邻苯二甲酸与1.44g2-乙基己醇混合于30mL环己烷中，加入浓硫酸1mL作为催化剂，回流分水反应3小时，制得2-（2-乙基己酯）苯甲酸；将上述2-（2-乙基己酯）苯甲酸与2.45g2-乙基-6叔丁氧酰胺丙醇混合于35mL环己烷中，加入浓硫酸1mL，回流分水反应3小时，制得邻苯二甲酸二丁酯被叔丁氧酰胺基所胺化产物；随后将上述中间产物加入15mL三氟乙酸中，回流搅拌1小时，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的氨基邻苯二甲酸二丁酯的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合后反应，与牛血清白蛋白偶联制备得到邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原；

上述步骤3）中，动物免疫的具体方法为：以步骤1)中合成的邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫，首次免疫使用完全弗氏佐剂与邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原溶液乳化，抗原浓度为0.5mg/mL，剂量为100-150μg/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原溶液乳化，剂量同初次免疫；初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫10-13次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫；最后一次不加免疫佐剂直接用邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原水溶液直接腹腔注射，剂量同初次免疫；尾部取血检测血清效价；

上述步骤4）中，细胞融合与筛选的具体方法为：在无菌条件下，取血清效价高的小鼠的脾细胞按5:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0.5mL/只；将细胞浓度为2.0万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0.5mL/只；接种杂交瘤细胞6-10天后，收集腹水，反复收集数次；存于4℃冰箱保存；经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体。

本发明的第三个目的在于提供一种上述邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒的使用方法，主要包括以下步骤：

1）样品前处理

准确称取涂料样品，有机溶剂溶解后，用水稀释至样品重量：溶液体积比为1：10⁶，例如：1g样品最终稀释至1000L，0.1g样品最终稀释至100L，定容，超声提取10-30min，得到样品检测液；

2）检测

用上述的试剂盒进行检测，向包被有邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原的酶标板中加入标准品或样品检测液，再加入邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体工作液，温育后洗板，加入酶标二抗工作液进行酶活性的放大，再次洗板，加入显色液、终止液，酶标仪测定OD值；

3）结果分析

以抑制率I%为纵坐标，以邻苯二甲酸二丁酯浓度的对数lg[邻苯二甲酸二丁酯(μg/L)]为横坐标，绘制邻苯二甲酸二丁酯竞争抑制曲线；将样品的抑制率代入标准曲线回归方程，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中邻苯二甲酸二丁酯的实际含量；

所述抑制率计算公式如下：

$I=\frac{{B-B}_N}{B_0-B_N}\×100\%$

其中：I——抑制率

B——（样品检测液的平均吸光度值）

B₀——（0μg/L标准溶液的平均吸光度值）

B_N——（参比空白对照平均吸光度值）。

在其中一个实施例中，步骤1）中，所述有机溶剂为甲醇；

步骤2）中，检测的具体方法为：首先用2.5μg/mL的邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原包被96孔酶标板，100μL/孔，放置于4℃冰箱包被过夜，用250μL/孔封闭液（即5%脱脂奶粉）封闭后用洗涤液洗涤，并拍干；然后加入邻苯二甲酸二丁酯标准品溶液或样品溶液50μL，再加入浓度为2μg/mL的邻苯二甲酸二丁酯特异性抗体工作液50μL，混合均匀，37℃温育1h；随后洗涤拍干后，加入用稀释液按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗工作液，100μL/孔，37℃温育1h；最后洗涤拍干，每孔加入50μL显色剂B、10μL显色剂A显色15min，加入浓度为2mol/L的硫酸溶液，50μL/孔，终止反应，设定酶标仪于450nm处，（优选用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定OD值。

本发明的邻苯二甲酸二丁酯检测原理为：

将邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原吸附于固相载体上，加入样品或邻苯二甲酸二丁酯的标准溶液及邻苯二甲酸二丁酯特异性抗体工作液，待测样品中邻苯二甲酸二丁酯和固相载体上包被的邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原竞争结合邻苯二甲酸二丁酯特异性抗体，孵育后，加入酶标二抗进行酶活性的放大作用，孵育，显色后终止，测定样品的吸光度，该值与样品中邻苯二甲酸二丁酯的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出邻苯二甲酸二丁酯浓度范围。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒和一种邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒的制备和使用方法，利用竞争酶联免疫测定法检测邻苯二甲酸二丁酯，具有特异性高，结果准确且前处理简单，对仪器设备要求低、检测成本低的特点。同时，本试剂盒中的试剂以工作液形式提供，操作简单、快捷，为使用者节省了时间并减少因步骤复杂造成的误差。适合用于快速而准确地检测大批量样品中的邻苯二甲酸二丁酯。

具体实施方式

下面对本发明的实施例进行详细说明，但不对本发明的内容造成任何限制。

实施例1

本实施例所述的邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒的主要组成成份如下：

1）邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原工作液；

通过以下方法制得：将1.66g（0.01mol）邻苯二甲酸与1.44g（0.01mol）2-乙基己醇混合于30mL环己烷中，加入浓硫酸1mL作为催化剂，回流分水反应3小时，制得2-（2-乙基己酯）苯甲酸；将上述2-（2-乙基己酯）苯甲酸与2.45g（0.01mol）2-乙基-6叔丁氧酰胺丙醇混合于35mL环己烷中，加入浓硫酸1mL，回流分水反应3小时，制得邻苯二甲酸二丁酯被叔丁氧酰胺基胺化的中间产物；随后将上述中间产物加入15mL三氟乙酸中，回流搅拌1小时，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的氨基邻苯二甲酸二丁酯的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺（NHS）和碳二亚胺（EDC）混合，与牛血清白蛋白混合，室温搅拌1h，偶联制备邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原，并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为2.5μg/mL。

2）邻苯二甲酸二丁酯特异性抗体工作液；

通过以下方法制得：将合成得到的邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫。首次免疫使用完全弗氏佐剂与邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液乳化，抗原浓度为0.5mg/mL，剂量为150μg/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液乳化，剂量同初次免疫。初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫10-13次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫。最后一次不加免疫佐剂直接用邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液直接腹腔注射，剂量同初次免疫。尾部取血检测血清效价。取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株。

单克隆抗体的制备与纯化：Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0.5mL/只。将细胞浓度为1.5万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0.5mL/只。接种杂交瘤细胞6-10天后，收集腹水，反复收集数次。存于4℃冰箱保存。经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化。具体方法：每1份腹水中加入3份乙酸钠缓冲液（浓度0.05mol/L,pH4.0），用浓度0.1mmol/L NaOH调整pH至4.5，在4℃下搅拌30min，期间缓慢加入辛酸，按稀释前腹水体积计算40μL/mL；在4℃静止3h，离心（8000r/min,30min），取上清液，保持在4℃环境中，30min内加入（NH₄)₂SO₄使终浓度为0.3g/mL，静止1h，4℃离心（8000r/min，30min），弃上清液，得到单克隆抗体沉淀，并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为2μg/mL。

3）辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗；

由商业公司提供的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗；

4）邻苯二甲酸二丁酯标准品溶液7瓶；

浓度分别为：0，0.5，1.0，2.0，10.0，20.0，50.0μg/L；

5）酶标板；

96孔聚苯乙烯酶标板，由商业公司提供；

6）底物显色剂；

由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为浓度为30%的过氧化氢水溶液，显色剂B为浓度为10mg/mL的四甲基联苯胺DMSO溶液；

7）洗涤液；

为含有重量比为0.05%-0.5%吐温-20的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；

8）终止液；

为2mol/L的硫酸溶液；

9）封闭液；

为含5%脱脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；

10）浓缩样品稀释液；

为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液（即磷酸根浓度为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液）；

11）自封袋；

由商业公司提供。

实施例2

1.最佳抗原包被浓度的选择

1）标准品浓度的筛选

选取市售涂料，按照申请号为201210039969.0中的方法检测其中邻苯二甲酸二丁酯的含量，结果如下表1。

表1市售涂料和化妆品中邻苯二甲酸二丁酯的含量

样品	涂料1	涂料2	涂料3	涂料4	涂料5	涂料6	涂料7	涂料8
									含量	0.48	2.17	0.17	3.68	1.63	0.57	3.01	2.21

由上述结果可知，市售涂料中的邻苯二甲酸二丁酯含量一般为0.17-3.68%之间，将样品稀释10⁶倍后，待测溶液中壬基酚聚氧乙烯醚的浓度为0.17-3.68μg/L，因此以2μg/L的邻苯二甲酸二丁酯标准品溶液作为最佳抗原包被浓度选择的加入溶液。

2）用1000μg/mL、100μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1μg/mL的邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原包被96孔酶标板，100μL/孔，放置于4℃冰箱包被过夜，用250μL/孔封闭液（即5%脱脂奶粉）封闭后用洗涤液洗涤，并拍干；

2）加入2μg/L的邻苯二甲酸二丁酯标准品溶液，再加入浓度为2μg/mL的邻苯二甲酸二丁酯特异性抗体工作液50μL，混合均匀，37℃温育1h；

3）洗涤拍干后，加入用稀释液按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗工作液，100μL/孔，37℃温育1h；

4）洗涤拍干，每孔加入50μL显色液B液、10μL显色液A液显色15min，加入浓度为2mol/L的硫酸溶液，50μL/孔，终止反应，设定酶标仪于450nm处（优选用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定OD值。

同时设置空白对照孔（不如抗血清，只加其稀释液）和平行重复孔，取OD值为1.0左右时的包被浓度为最佳浓度，试验数据列于表1。

表1不同包被浓度的OD值

由表1的数据中可以确定，最佳的包被浓度为2.5μg/mL。

2间接ELISA检测抗体效价

以2.5μg/mL浓度包被酶标板，从4000倍开始倍比稀释抗血清，按2.1的ELISA步骤操作。以两倍于阴性血清OD值的抗血清OD值对应的抗血清稀释度为抗血清效价。抗血清效价检测结果见表2

表2抗血清效价检测结果

由表2的数据中可以确定，本发明制备的抗血清的效价在128000以上。

3间接竞争ELISA方法的建立

采用间接竞争ELISA法检测邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体的竞争抑制率，方法如下：

1）用2.5μg/mL的邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原包被96孔酶标板，100μL/孔，放置于4℃冰箱包被过夜，用250μL/孔封闭液（即5%脱脂奶粉）封闭后用洗涤液洗涤，并拍干；

2）加入邻苯二甲酸二丁酯标准品溶液（浓度分别为：0，0.5，1.0，2.0，10.0，20.0，50.0μg/L）或样品溶液50μL，再加入浓度为2μg/mL的邻苯二甲酸二丁酯特异性抗体工作液50μL，混合均匀，37℃温育1h；

3）洗涤拍干后，加入用稀释液按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗工作液，100μL/孔，37℃温育1h；

4）洗涤拍干，每孔加入50μL显色剂B、10μL显色剂A显色15min，加入浓度为2mol/L的硫酸溶液，50μL/孔，终止反应，设定酶标仪于450nm处（优选用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定OD值。

以抑制率I%为纵坐标，以邻苯二甲酸二丁酯浓度的对数lg[邻苯二甲酸二丁酯(μg/L)]为横坐标，绘制邻苯二甲酸二丁酯竞争抑制曲线。将样品的抑制率代入标准曲线回归方程，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中邻苯二甲酸二丁酯的实际含量。

抑制率计算公式如下：

$I=\frac{{B-B}_N}{B_0-B_N}\×100\%$

其中：I——抑制率

B——（样本溶液的平均吸光度值）

B₀——（0μg/L标准溶液的平均吸光度值）

B_N——（参比空白对照平均吸光度值）

实施例3

试剂盒灵敏度、特异性、准确度。

1.灵敏度测定。

利用实施例2的间接竞争ELISA法测定结果建立邻苯二甲酸二丁酯检测的标准工作曲线。邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体在0.028μg/L～43.5μg/L范围内有良好的线性，IC₅₀=10.2μg/L，最低检测限为0.6μg/L，检测范围（抑制20%～80%之间）为3.2μg/L～43.5μg/mL。涂料的检测限为0.06%。

2.特异性测定。

采用实施例2的间接竞争ELISA法测定邻苯二甲酸二丁酯结构类似物（邻苯二甲酸、邻苯二甲酸酐、苯甲酸乙酯、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二正丁酯）与单抗混合物的交叉反应。将系列浓度（1×10⁷μg/L、1×10⁶μg/L、1×10⁵μg/L、1×10⁴μg/L、1×10³μg/L、1×10²μg/L、1×10¹μg/L）的上述物质分别与抗体同时加入到已包被封闭好的酶标板中，具体步骤同实施例2，分别计算各类似物的抑制率。利用单克隆抗体对邻苯二甲酸二丁酯的IC₅₀值与单克隆抗体对各类似物的IC₅₀值的比值得到交叉反应率（CR%），公式如下：

结果表明邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体与邻苯二甲酸、邻苯二甲酸酐、苯甲酸乙酯、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二正丁酯的交叉反应率分别为0.1%、0.3%、0.1%、9.4%、8.5%，符合要求。

3.准确度测定。

向涂料样品中添加0.02%和1.00%的邻苯二甲酸二丁酯，重复三次，每次做三个平行，采用实施例2的间接竞争ELISA法测定抑制率，然后将抑制率（三个平行的平均值）代入标准曲线回归方程，算出含量，并计算回收率。

回收率公式如下：

结果表明涂料的回收率为94.1%～105%。

实施例4

检测涂料中的邻苯二甲酸二丁酯。

1.样品的前处理。

根据实施例2中检测得到的市售涂料中邻苯二甲酸二丁酯的含量范围在0.17-3.68%之间,可知将样品将样品稀释10⁶倍后，样品检测液中含有的邻苯二甲酸二丁酯浓度在实施例1所述试剂盒的检测范围内，有较准确的检测效果。

准确称取0.1g（精确至0.001g）样品于100mL具塞玻璃比色管中，加入5mL甲醇，超声20s，然后加水定容，于漩涡振荡器上振荡2min，超声提取20min。取50μL溶液于50mL玻璃比色管中，加水定容后于漩涡振荡器上振荡2min，取清液50μL进行分析。

2.间接竞争ELISA法检测样品中邻苯二甲酸二丁酯含量。

采用实施例2的方法进行检测，根据测定结果，计算出抑制率，代入标准曲线方程求出邻苯二甲酸二丁酯的含量，见下表1。

表1涂料中的邻苯二甲酸二丁酯含量。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒，其特征在于，主要包括：

1)包被邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原的酶标板：所述酶标板的每个微孔内邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原的浓度为1-5μg/mL；

2)邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体工作液：该邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体工作液的浓度为1-5μg/mL；

所述邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原与邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体的用量为2.5:1；

所述邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原通过以下方法制备：将邻苯二甲酸与2-乙基己醇混合于环己烷中，加入浓硫酸作为催化剂，回流反应，制得2-(2-乙基己酯)苯甲酸；将上述2-(2-乙基己酯)苯甲酸与2-乙基-叔丁氧酰胺丙醇混合于环己烷中，加入浓硫酸，回流反应，制得邻苯二甲酸二丁酯被叔丁氧酰胺基胺化产物；随后将上述中间产物加入三氟乙酸中，回流反应，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的氨基邻苯二甲酸二丁酯的半抗原；在N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺的催化下，再与载体蛋白偶联，制得邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原；所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白或甲状腺球蛋白；

所述邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体通过以下方法制备：以上述合成的邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原为免疫原免疫小鼠，取免疫小鼠的血清，检测该血清抗邻苯二甲酸二丁酯的效价和抑制价，选取效价和抑制价最高的免疫小鼠；取所得免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株，并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒，其特征在于，还包括有酶标二抗，所述酶标二抗是浓度按1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗。

3.根据权利要求1所述的邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒，其特征在于，所述邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原的浓度为2.5μg/mL；所述邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体的浓度为2μg/mL。

4.根据权利要求1所述的邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒，其特征在于，还包括邻苯二甲酸二丁酯标准品溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液、封闭液和浓缩样品稀释液。

5.根据权利要求4所述的邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒，其特征在于，所述邻苯二甲酸二丁酯标准品溶液浓度分别为0，0.5μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L，10.0μg/L，20.0μg/L，50.0μg/L；所述底物显色剂由显色剂A和显色剂B组成，所述显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，所述显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止液为1-2mol/L的硫酸溶液；所述洗涤液为含有0.05％-0.5％吐温-20的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩样品稀释液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述封闭液为含5％脱脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液。

6.权利要求1-5任一项的邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

1)制备邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原

将邻苯二甲酸与2-乙基己醇混合于环己烷中，加入浓硫酸作为催化剂，回流反应，制得2-(2-乙基己酯)苯甲酸；将上述2-(2-乙基己酯)苯甲酸与2-乙基-叔丁氧酰胺丙醇混合于环己烷中，加入浓硫酸，回流反应，制得邻苯二甲酸二丁酯被叔丁氧酰胺基胺化产物；随后将上述中间产物加入三氟乙酸中，回流反应，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的氨基邻苯二甲酸二丁酯的半抗原；在N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺的催化下，再与载体蛋白偶联，制得邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原；所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白或甲状腺球蛋白；

2)包被酶标板

将上述邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原包被于酶标板中，所述酶标板的每个微孔内邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原的浓度为1-5μg/mL；

3)动物免疫

以步骤1)中合成的邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原为免疫原免疫小鼠，取免疫小鼠的血清，检测该血清抗邻苯二甲酸二丁酯的效价和抑制价，选取效价和抑制价最高的免疫小鼠；

4)细胞融合与筛选

取步骤3)所得免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株，并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体；制备浓度为1-5μg/mL的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体工作液。

7.根据权利要求6所述的邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤1)中，制备邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原的具体方法为：将1.66g邻苯二甲酸与1.44g 2-乙基己醇混合于30mL环己烷中，加入浓硫酸1mL作为催化剂，回流分水反应3小时，制得2-(2-乙基己酯)苯甲酸；将上述2-(2-乙基己酯)苯甲酸与2.45g 2-乙基-叔丁氧酰胺丙醇混合于35mL环己烷中，加入浓硫酸1mL，回流分水反应3小时，制得邻苯二甲酸二丁酯被叔丁氧酰胺基所胺化产物；随后将上述中间产物加入15mL三氟乙酸中，回流搅拌1小时，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的氨基邻苯二甲酸二丁酯的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合后反应，与牛血清白蛋白偶联制备得到邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原；

步骤3)中，动物免疫的具体方法为：以步骤1)中合成的邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫，首次免疫使用完全弗氏佐剂与邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原溶液乳化，抗原浓度为0.5mg/mL，剂量为100-150μg/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原溶液乳化，剂量同初次免疫；初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫10-13次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫；最后一次不加免疫佐剂直接用邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原水溶液直接腹腔注射，剂量同初次免疫；尾部取血检测血清效价；

步骤4)中，细胞融合与筛选的具体方法为：在无菌条件下，取血清效价高的小鼠的脾细胞按5:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0.5mL/只；将细胞浓度为2.0万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0.5mL/只；接种杂交瘤细胞6-10天后，收集腹水，反复收集数次；存于4℃冰箱保存；经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体。

8.权利要求1-5任一项的邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒的使用方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

1)样品前处理

准确称取涂料样品，有机溶剂溶解后，用水稀释至样品重量：溶液体积比为1：10⁶，定容，超声提取10-30min，得到样品检测液；

2)检测

用权利要求1-5任一项所述的试剂盒进行检测，首先用2.5μg/mL的邻苯二甲酸二丁酯特异性抗原包被96孔酶标板，100μL/孔，放置于4℃冰箱包被过夜，用250μL/孔封闭液封闭后用洗涤液洗涤，并拍干；然后加入邻苯二甲酸二丁酯标准品溶液或样品溶液50μL，再加入浓度为2μg/mL的邻苯二甲酸二丁酯特异性抗体工作液50μL，混合均匀，37℃温育1h；随后洗涤拍干后，加入用稀释液按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗工作液，100μL/孔，37℃温育1h；最后洗涤拍干，每孔加入50μL显色剂B、10μL显色剂A显色15min，加入浓度为2mol/L的硫酸溶液，50μL/孔，终止反应，设定酶标仪于450nm处，测定OD值；

3)结果分析

以抑制率I％为纵坐标，以邻苯二甲酸二丁酯浓度的对数lg[邻苯二甲酸二丁酯]为横坐标，绘制邻苯二甲酸二丁酯竞争抑制曲线；将样品的抑制率代入标准曲线回归方程，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中邻苯二甲酸二丁酯的实际含量；

所述抑制率计算公式如下：

$I=\frac{B-B_N}{B_0-B_N}\×100\%$

其中：I——抑制率

B——样品检测液的平均吸光度值

B₀——0μg/L标准溶液的平均吸光度值

B_N——参比空白对照平均吸光度值。

9.根据权利要求8的邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤1)中，所述有机溶剂为甲醇。